CN112641921B - 一种治疗溃疡性结肠炎的蜚蠊多肽有效部位及其制备方法和用途 - Google Patents

一种治疗溃疡性结肠炎的蜚蠊多肽有效部位及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种治疗溃疡性结肠炎的蜚蠊多肽有效部位及其制备方法和用途。所述蜚蠊多肽有效部位从蜚蠊粗提物中富集的分子量大于300道尔顿(>300Da)且小于5000道尔顿(<5KDa)的活性物质有效部位，所述蜚蠊粗提物为蜚蠊经水提醇沉后得到。本发明还提供了含有所述蜚蠊多肽有效部位的剂型及其在制备治疗溃疡性结肠炎的药物、日化用品和/或医疗器械的用途。本发明制备得到的蜚蠊多肽有效部位产品收率高、生物活性好，且便于操作、易于大规模生产操作；蜚蠊多肽有效部位灌肠对溃疡性结肠炎具有显著的治疗效果。

Description

一种治疗溃疡性结肠炎的蜚蠊多肽有效部位及其制备方法和 用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种治疗溃疡性结肠炎的蜚蠊多肽有效部位及其制备方法和用途。
背景技术
溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性炎性疾病，属于炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)中的一种，其病理特征为结直肠黏膜炎症和上皮损伤，发病机制主要与遗传因素、肠道共生微生物区系紊乱、上皮屏障缺陷、免疫反应失调和环境影响等有关，临床多表现为腹痛、腹泻、粘液脓血便和里急后重。随着人们生活水平不断提高，环境因素不断改变，饮食结构更加多样化，UC的发病率和患病率逐年呈增长趋势，且具有癌变倾向，已被世界卫生组织(WHO)列为世界性现代难治病之一。目前临床上常使用单一抗炎药物对轻中度UC进行治疗，长期使用毒副作用大，易反复发作，且5-ASA等传统抗炎药在结肠黏膜愈合方面的劣势日益凸显，致使UC的治疗目标已经从症状的临床缓解转变为内窥镜缓解，即内镜下的黏膜愈合。然而，在临床治疗UC时没有直接针对促进肠黏膜损伤修复的药物。
中药蜚蠊又称为美洲大蠊(Periplaneta americana L.)，味咸，性寒，归心、肝、脾、肾经，功能活血散瘀、健脾消疳、利水消肿、敛疮生肌。《神农本草经》列为中品，云其“主血瘀，症坚，寒热，破积聚，喉咽痹”。现代药理学研究主要有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫、保肝、促进组织修复等作用。其主要化学成分为信息素、蛋白多肽类、氨基酸类、脂肪运动激素和二氢异香豆素。2017年“溃疡性结肠炎中西医结合诊疗共识意见”指出以蜚蠊干燥虫体为原料药精制的乙醇提取物康复新液具有通利血脉养阴生肌的功效用于各证型UC患者，临床上采用美沙拉嗪联合康复新液、柳氮磺胺吡啶联合康复新液、益生菌联合康复新液通过联合用药保留灌肠的方式治疗轻中度UC患者，能够明显改善患者腹痛、腹泻、粘液血便等症状，修复受损肠黏膜。
CN107812016B公开了美洲大蠊提取物在制备具有调节免疫作用的食品或药品中的应用，所述美洲大蠊提取物为美洲大蠊经水提醇沉后的产物。但该方法及其获得的产物活性较差。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种治疗溃疡性结肠炎的蜚蠊多肽有效部位及其制备方法和用途。
本发明的目的是提供一种从蜚蠊粗提物中富集的分子量大于300道尔顿(>300Da)且小于5000道尔顿(<5KDa)的活性物质有效部位。
进一步的，所述蜚蠊提取物为蜚蠊经水提醇沉后得到粗提物。
进一步的，所述蜚蠊通过石油醚脱脂、干燥后，水煎煮提取，将提取液合并过滤浓缩得到蜚蠊水提取物，再将蜚蠊水提取物醇沉，弃去沉淀后，将溶液过滤浓缩，得到蜚蠊粗提物。
进一步的，所述蜚蠊粗提物按如下方法提取：
(1)将蜚蠊浸泡于石油醚(30℃～60℃)，过夜；
(2)将所述步骤(1)的样品加热提取，弃去提取液，残渣于40℃～50℃干燥，备用；
(3)将所述步骤(2)得到的干燥残渣与水混合后于多功能提取罐中煎煮，多次提取后，收集并合并提取液过滤后于60℃浓缩至密度为1.10～1.20g/mL，即得蜚蠊水提物；
(4)将所述步骤(3)得到的蜚蠊水提物与乙醇混合，调节含醇量，搅拌静置后，滤过，将得到的滤液于60℃减压浓缩至密度为1.25～1.35g/mL，冷冻干燥后即得蜚蠊粗提物。
优选的，所述步骤(1)中蜚蠊为新鲜活虫、干燥全虫或干燥全虫粉末(过3号筛)，更优选为新鲜活虫。
优选的，所述步骤(2)中提取温度40℃～55℃，更优选为45℃～50℃。
优选的，所述步骤(3)中干燥残渣与水的质量比为1∶(6～15)，更优选为1∶(8～11)。
优选的，所述步骤(3)中提取温度为70～100℃，更优选为85～95℃。
优选的，所述提取次数为1～5次，单次提取时间为1～6h；更优选为提取次数为2～3次，单次提取时间为1～3h。
本发明对过滤及浓缩方法没有特殊限定，采用本领域的常规方法即可。
优选的，所述步骤(4)中乙醇含量40％～65％，更优选为48％～58％后去除沉淀。
优选的，所述步骤(4)中静置12～48h，静置温度10～25℃后滤过。更优选的，于13～18℃静置36h后去除沉淀。
优选的，所述减压浓缩的压力为-0.085Pa。
进一步的，所述蜚蠊粗提物以一定分子量范围的透析膜进行分子截留，得到分子量大于300道尔顿小于5000道尔顿(>300Da且<5KDa)的部位，即蜚蠊多肽有效部位。
进一步的，所述蜚蠊多肽有效部位按如下方法制备：
(1)将蜚蠊粗提物溶解于无菌双蒸水，5％的氨水调节pH；
(2)将所述步骤(1)中的蜚蠊粗提物溶液置于分子量为500Da的透析袋，磁力搅拌300rpm，透析；
(3)将所述步骤(2)中透析袋内的溶液转移至5KDa的透析袋中，磁力搅拌300rpm，继续透析，收集透析液，滤过，合并滤液，于50℃浓缩，冷冻干燥后即得蜚蠊多肽有效部位。
优选的，所述步骤(1)中蜚蠊粗提物溶液的pH值为8.0～11.0，更优选为8.5～9.5。
优选的，所述透析温度4℃～20℃，透析次数为1～10次，单次透析时间为1～10h；更优选为透析温度8℃～15℃，透析次数为3～6次，单次透析时间为3～6h。
进一步的，所述蜚蠊多肽有效部位剂型选自片剂、颗粒剂、溶液剂、脂质体溶液、凝胶剂或脂质体凝胶剂；优选的，所述剂型为脂质体凝胶剂。
本发明的蜚蠊多肽脂质体凝胶除了含有蜚蠊多肽有效部位外，还包括辅料或辅助成分。本发明对辅料的种类和比例没有特殊限定，采用本领域常规方法即可。
进一步的，所述蜚蠊多肽脂质体凝胶由脂质体和凝胶材料组成，所述脂质体的组成为蜚蠊多肽有效部位、大豆磷脂和胆固醇，所述凝胶材料选自卡波姆和/或泊洛沙姆和/或壳聚糖。
进一步的，所述蜚蠊多肽有效部位、所述大豆磷脂和所述胆固醇的用量为(1-10)∶(20-30)∶(2-10)；优选的，所述用量比为5∶25∶5。
进一步的，所述蜚蠊多肽脂质体凝胶中，所述凝胶基质的质量百分含量为1％～20％；优选为泊洛沙姆，百分含量为13％～18％。
所述的蜚蠊多肽脂质体凝胶采用薄膜分散法制备。
本发明的另一个目的在于提供一种蜚蠊多肽脂质体凝胶的制备方法。
进一步的，所述蜚蠊多肽脂质体凝胶按如下方法制备：
(1)将蜚蠊多肽有效部位0.2g溶解于10mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液；另取大豆磷脂1.0g，胆固醇0.2g于乙醇溶液中溶解，减压旋转蒸发出去溶剂，使磷脂在容器壁上形成一层均匀薄膜；
(2)将所述步骤(1)中的蜚蠊多肽有效部位溶液加入含有磷脂薄膜的容器中，旋转，溶解，静置后冰浴超声，得到脂质体溶液；
(3)将所述步骤(2)中的脂质体溶液，2℃～10℃高速离心，弃去上清，加入10mL pH7.4的磷酸盐缓冲液重悬沉淀，得到蜚蠊多肽有效部位的脂质体溶液；
(4)将泊洛沙姆F127 7.5g，置于烧杯中，加入甘油2.5g、吐温1g、磷酸盐缓冲液25mL，搅拌均匀，4℃～10℃静置使泊洛沙姆充分溶胀；
(5)将所述步骤(2)中的脂质体溶液加入泊洛沙姆溶液中，搅拌均匀，用磷酸盐缓冲液补足至50g，搅匀，静置，得到蜚蠊多肽脂质体凝胶。
优选的，所述步骤(1)和步骤(2)中旋转蒸发的温度为4℃～40℃，更优选为10℃～20℃。
优选的，所述步骤(2)中超声功率为100W～600W，超声时间为2min～10min，更优选为超声功率为250W～400W，超声时间为3min～6min。
优选的，所述步骤(3)中离心转速为15000rpm～40000rpm，离心时间为30min～150min，更优选为离心转速20000rpm～30000rpm，离心时间为60min～120min。
蜚蠊多肽有效部位的脂质体的包封率79％。
每1g蜚蠊多肽有效部位的脂质体凝胶剂中，多肽含量为3.16mg。
本发明的另一目的在于提供上述蜚蠊中提取的分子量>300Da且<5KDa的活性物质有效部位用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物、日化用品和/或医疗器械的用途。
本发明的另一目的是提供了一种含有从蜚蠊中提取的分子量>300Da且<5KDa的活性物质有效部位用于制备治疗溃疡性结肠炎的脂质体水凝胶。
本发明的又一个目的在于提供上述蜚蠊多肽有效部位在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明的蜚蠊多肽有效部位，经用水提取经石油醚脱脂后未粉碎或粉碎的蜚蠊干燥虫体，浓缩提取回收溶剂，加入乙醇沉淀大分子的多糖、蛋白、淀粉等，滤过，滤液浓缩回收乙醇，浓缩液经超滤膜分离纯化；得到的分子量大于300Da且小于5KDa的多肽类活性有效部位，经减压浓缩后冷冻干燥，粉碎即得产品。本发明的制备得到的蜚蠊多肽有效部位产品收率高、生物活性好，且便于操作、易于大规模生产操作。
本发明通过对蜚蠊多肽有效部位进行研究发现，蜚蠊多肽有效部位灌肠对溃疡性结肠炎具有显著的治疗效果，并经试验证实可应用于制备结肠原位凝胶制剂。
附图说明
图1是蜚蠊多肽有效部位脂质体凝胶对UC大鼠结肠组织的影响(HE，×200)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。应该强调的是：下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
本发明中，所用药材为新鲜蜚蠊全虫或干燥蜚蠊全虫，本发明中蜚蠊的来源为美洲大蠊，可以采用市售产品。
实施例1
新鲜蜚蠊虫体500g，加石油醚5L于多功能提取罐中浸泡过夜，50℃加热回流提取，提取3次，每次3h，滤过，弃去滤液，残渣于50℃干燥6h，干燥残渣约150g。将干燥后的残渣150g置于多功能提取罐，加1.5L水，90℃加热提取，提取3次，每次2h，滤过，滤液浓缩至密度1.14～1.16g/mL(60℃)。加入95％乙醇，调节醇含量至50％，于15℃静置48h，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.28～1.30g/mL(60℃)，冷冻干燥后即得蜚蠊粗提物PA1。
干燥蜚蠊虫体180g，加石油醚5L于多功能提取罐中浸泡过夜，50℃加热回流提取，提取3次，每次3h，滤过，弃去滤液，残渣于50℃干燥6h，干燥残渣约150g。将干燥后的残渣150g置于多功能提取罐，加1.5L水，90℃加热提取，提取3次，每次2h，滤过，滤液浓缩至密度1.14～1.16g/mL(60℃)。加入95％乙醇，调节醇含量至50％，于15℃静置48h，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.28～1.30g/mL(60℃)，冷冻干燥后即得蜚蠊粗提物PA2。
表1新鲜蜚蠊和干燥蜚蠊粗体物的收率及活性指标评价
根据表1结果，相同投料量时新鲜蜚蠊提取率、总肽质量均较干燥虫体高，同时PA1体外抗炎作用及Caco-2细胞24h相对迁移能力均优于PA2，因此优选新鲜蜚蠊全虫用于提取工艺有利于蜚蠊多肽有效部位的制备。
实施例2
新鲜蜚蠊500g，加石油醚5L于多功能提取罐中浸泡过夜，50℃加热回流提取，提取3次，每次3h，滤过，弃去滤液，残渣于50℃干燥6h，干燥残渣约150g。将干燥后的残渣150g置于多功能提取罐，加1.5L水，90℃加热提取，提取3次，每次2h，滤过，滤液浓缩至密度1.14～1.16g/mL(60℃)。加入95％乙醇，调节醇含量，于15℃静置48h，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.28～1.30g/mL(60℃)，冷冻干燥后即得蜚蠊粗提物。
表2不同醇含量下蜚蠊粗体物的收率及活性指标评价
根据表2结果，随着醇含量比例增加，总肽质量及Caco-2细胞24h相对迁移能力减小，体外抗炎活性增加，但含醇量在50％和60％时收率及活性并无显著性的区别，因此优选醇含量为50％进行下一步蜚蠊多肽有效部位的工艺优化。
实施例3
将蜚蠊粗提物溶解于无菌双蒸水，5％的氨水调节pH置于分子量为500Da的透析袋中，磁力搅拌300rpm，透析4次，每次5h；后将透析袋内的溶液转移至5KDa的透析袋中，磁力搅拌300rpm，继续透析，透析4次，每次5h；收集透析液，滤过，合并滤液，于50℃浓缩，冷冻干燥后即得蜚蠊多肽有效部位。
表3不同pH下蜚蠊多肽有效部位的收率及活性指标评价
根据表3结果，随着pH的增加，收率、多肽质量、Caco-2细胞24h相对迁移能力均增加，体外抗炎活性变化不明显，考虑大规模产业化的成本控制，优选pH 8.5，进行下一步蜚蠊多肽有效部位的工艺优化。
实施例4
将蜚蠊粗提物溶解于无菌双蒸水，1.0mM的氢氧化钠调节pH 8.5后置于分子量为500Da的透析袋中，磁力搅拌300rpm，透析多次，每次5h；后将透析袋内的溶液转移至5KDa的透析袋中，磁力搅拌300rpm，继续透析，透析多次，每次5h；收集透析液，滤过，合并滤液，于50℃浓缩，冷冻干燥后即得蜚蠊多肽有效部位。
表4不同pH下蜚蠊多肽有效部位的收率及活性指标评价
根据表4结果，随着透析次数的增加，收率、多肽质量、体外抗炎活性、Caco-2细胞24h相对迁移能力均增加，考虑到成本控制，优选透析4次，进行下一步蜚蠊多肽有效部位的工艺优化。
实施例5
将蜚蠊粗提物溶解于无菌双蒸水，1.0mM的氢氧化钠调节pH 8.5后置于分子量为500Da的透析袋中，磁力搅拌300rpm，透析4次，每次数小时；后将透析袋内的溶液转移至5KDa的透析袋中，继续透析，磁力搅拌300rpm，透析4次，每次数小时；收集透析液，滤过，合并滤液，于50℃浓缩，冷冻干燥后即得蜚蠊多肽有效部位。
表5不同pH下蜚蠊多肽有效部位的收率及活性指标评价
根据表5结果，随着透析时间的增加，收率、多肽质量、体外抗炎活性、Caco-2细胞24h相对迁移能力均增加，考虑到成本控制，优选透析时间5h。
实施例6
将蜚蠊多肽有效部位(PA多肽)0.2g溶解于10mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液；另取大豆磷脂1.0g，胆固醇0.2g于乙醇溶液中溶解，减压旋转蒸发出去溶剂，使磷脂在容器壁上形成一层均匀薄膜；将蜚蠊多肽有效部位溶液加入含有磷脂薄膜的容器中，旋转，溶解，静置后冰浴超声，得到脂质体溶液。将脂质体溶液于2℃～10℃，20000g超高速离心1h，吸取上清，利用BCA试剂盒测定多肽含量，并以等浓度的蜚蠊多肽有效部位溶液为总量进行比较，计算包封率。
表6不同超声功率下蜚蠊多肽有效部位脂质体的包封率评价
根据表6结果，不同超声功率和超声时间搭配制备的蜚蠊多肽有效部位脂质体的平均粒径和包封率均不相同，相同超声功率条件下超声时间越长平均粒径缩短，包封率会先升高后降低，但当超声功率大于300W时，脂质体平均粒径变化不大，包封率增加很小。综合考虑制备效率，优选超声功率为300W，超声时间为5min。
实施例7
将蜚蠊多肽有效部位脂质体溶液于2℃～10℃，20000g超高速离心1h，弃去上清，加入10mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液重悬沉淀，得到蜚蠊多肽有效部位的脂质体溶液(PA多肽脂质体)；将泊洛沙姆F127 7.5g，置于烧杯中，加入甘油2.5g、吐温1g、磷酸盐缓冲液25mL，搅拌均匀，4℃～10℃静置使泊洛沙姆充分溶胀；再将PA多肽脂质体溶液加入泊洛沙姆溶液中，搅拌均匀，用磷酸盐缓冲液补足至50g，搅匀，静置，得到蜚蠊多肽脂质体凝胶(PA多肽脂质体凝胶)。
实施例8
本发明蜚蠊多肽有效部位脂质体凝胶通过原位灌肠对溃疡性结肠炎大鼠的治疗作用。
1.实验材料
1.1实验动物
SPF级SD雄性大鼠50只，200±20g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2016-0004，批号：20190423
1.2受试药物
本发明PA、PA多肽、PA多肽脂质体、PA多肽脂质体凝胶。
美沙拉嗪，(批号：11032-206，香港丽晶科学工业有限公司，规格：25g)。
1.3实验试剂
2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid sol，TNBS)，(批号：026K5006，美国sigma公司)；无水乙醇，AR(批号：2017，天津市福晨化学试剂厂)；异氟烷，(批号：20190701，山东科源制药股份有限公司)；水合氯醛，AR(批号：20170203，国药集团化学试剂有限公司)；甲醛溶液，AR(批号：20170523，天津市风船化学试剂科技有限公司)；磷酸氢二钠，AR(批号：20171008，天津市风船化学试剂科技有限公司)；磷酸二氢钠，AR(批号：20160318，天津市风船化学试剂科技有限公司)；生理盐水，NS(批号：A15031602，贵州天地药业有限公司)；隐血试剂盒，(批号：20190323，南京建成生物工程研究所)；大鼠血清IL-1β试剂盒，批号：LOT20200707A；大鼠血清IL-10试剂盒，批号：LOT20200707A；大鼠血清IL-18试剂盒，批号：LOT20200710A；大鼠结肠IL-17A试剂盒，批号：LOT20200716A；大鼠结肠IL-6试剂盒，批号：LOT20200716A；大鼠结肠IFN-γ试剂盒，批号：LOT20200710A；大鼠结肠EGF试剂盒，批号：LOT20200716A；均购自上海酶联生物科技有限公司。
1.4主要仪器
高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，型号：HC-30118R；电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，型号：AL204-IC；精密电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，型号：METTLERAE240；涡旋仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，型号：VORTFX-5；冷冻干燥机(美国Cold-Sim公司)，型号：FD8-4a；普通光学显微镜(重庆光学仪器厂)，型号：OLYMPUS CX31；小动物呼吸麻醉机(RWD Life Science CO)，型号：Ltd D01429-015；大鼠代谢笼(苏州市冯氏实验动物备有限公司)，型号：DXL-D；医用电子体温计(杭州欧汇科技有限公司)，型号：PT-01A；病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)，型号：PHY-Ⅲ；石蜡切片机(Leica公司)，型号：RM2245；冷冻台(常州市中威电子仪器有限公司)，型号：BMJ-C；生物组织包埋机(孝感市宏业医用仪器有限公司)，型号：BM-Ⅷ；生物组织摊烤片机(湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司)，型号：YT-7FB；自动脱水机(德国Leica公司生产)，型号：Leica ASP-300S；医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)，型号：BI-2000；微距相机，型号：DIGITAI CAMERA D7100，微距镜头，型号：AF-S Micro 60/2.8G ED均购自尼康。
2.实验方法
2.1实验动物模型建立
将50只大鼠适应性喂养1周，然后随机选取6只作为正常组，其余44只大鼠进行溃疡性结肠炎造模。即造模大鼠禁食不禁水24h后，10％(W/V)水合氯醛溶液腹腔注射(3mL/kg)轻度麻醉，俯卧位，将连有直径2.0mm聚乙烯管的注射器经大鼠肛门轻轻插入至8cm处，缓慢注入TNBS乙醇溶液(15mg TNBS溶于30％(V/V)乙醇溶液0.6mL中)，拔出导管，使大鼠保持倒立姿态15s。正常对照组用生理盐水代替TNBS乙醇溶液按上述方法平行操作。
2.2实验动物分组与给药
TNBS造模后第7d，参照文献标准进行疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分，并根据DAI评分分值剔除极轻度及重度炎症的大鼠8只。将剩余36只模型大鼠分为6组，分别为生理盐水组(NS组)、美沙拉嗪组(300mg/kg)、PA组(300mg/kg)、PA多肽组(9.12mg/kg)、PA多肽脂质体组(9.12mg/kg，以PA含量计)、PA多肽脂质体凝胶组(9.12mg/kg，以PA含量计)，每组6只。于分组的当天开始灌肠给药，连续给药14d。
2.3指标观察及检测方法
2.3.1疾病活动指数
于实验第1d、7d、11d、14d、18d、21d称量大鼠体重，观察大鼠粪便性状及粪便隐血测试情况进行DAI评分，计算每只大鼠的DAI分值评估疾病活动情况。
2.3.2结肠黏膜损伤指数
给药14d后，10％(W/V)水合氯醛麻醉大鼠(3.0mL/kg)，腹主动脉采血，处死大鼠后进行解剖，截取距离肛门约1cm至盲肠末端的整个结肠，延肠系膜剪开，冰生理盐水洗净肠腔内容物，平铺于白瓷板上，用钢尺测量结肠的长度和宽度，并参照文献标准进行结肠黏膜损伤指数评分(Colon mucocal damage index,CMDI)；随后用滤纸吸干结肠表面水分，称重，计算结肠指数。
2.3.3病理组织学评分
将结肠组织纵向截取一半，用10％(W/V)中性福尔马林固定，脱水后用石蜡进行包埋，常规制作5μm病理切片，苏木精-伊红(HE)染色，中性树胶封片，显微镜下观察其病理变化，参照文献标准进行结肠病理组织学(Histoligical score,HS)评分。
2.3.4结肠组织细胞因子测定
结肠组织纵向截取的另一半，用预冷的生理盐水制备10％(W/V)组织匀浆液，于4℃，3000r/min离心10min，取上清液，严格按照相关试剂盒操作说明书检测结肠组织中IL-17A、IFN-γ、IL-6、EGF的含量。
2.3.5血清细胞因子测定
大鼠麻醉后使用负压采血管进行腹主动脉采血，收集的血液于4℃条件下静置凝固后，于冷冻离心机中，4℃，3000r/min离心10min，取上清液分装并于-80℃冰箱中保存。实验时分别经-20℃及4℃梯度冻融后，严格按照相关试剂盒操作说明书检测血清中IL-1β、IL-10、IL-18含量。
3.结果
3.1对UC大鼠一般状况的影响
正常组大鼠饮食饮水正常，毛发光滑、干净，精神状态良好，粪便为黑色、质地硬呈椭球形，尿液呈淡黄色，颜色正常。NS组大鼠毛色无光泽、枯乱，体重明显减轻，精神萎靡，出现拱背、扎堆等现象，大便多为黏液便和脓血便，随时间延长精神状态有一定改善，体重稍有增加，但粪便仍然多为稀软便，或便中带血。美沙拉嗪组大鼠精神状态明显好转，活动增多，未见黄色黏稠大便，粪便基本成型转为黑色；大鼠体重逐渐增加。PA、多肽部位及其制剂组大鼠精神状态好转，活动量增多，肛门未见粘连粪便，粪便成型且颜色转为黑色，体重逐渐增加。
3.2对UC大鼠DAI评分的影响
对各组大鼠在第1d～21d的DAI评分进行重复测量方差分析，Mauchly’s球形度检测结果显示数据不符合球形假设(P＜0.05)，因此采用Greenhousc-Geisser方法校正自由度后分析结果。重复测量方差分析结果显示：(1)交互作用(时间*分组)：大鼠DAI评分的交互作用有统计学意义(P＜0.05)，说明时间因素对不同组别大鼠DAI评分的影响有差别。(2)时间效应：大鼠DAI评分的时间效应有统计学意义(P＜0.01)，说明不同时间点大鼠DAI评分有差别。(3)组间效应：大鼠DAI评分的组间效应有统计学意义(P＜0.01)，说明各组大鼠的DAI评分有差异。为了评价同一时间点上的组间差异情况，根据单因素方差分析结果显示，实验第1d和第7d，与正常组比较各造模组的DAI评分高(P＜0.01)，但各造模组之间无显著性差异(P＞0.05)，即所有造模大鼠处于同一水平。实验第21d，药物治疗结束，与正常组比较，NS组及各药物治疗组DAI评分均显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，与NS组比较，美沙拉嗪组及PA各治疗组均明显降低(P＜0.01)。
表7PA各药物组对UC大鼠DAI评分的影响
注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与NS组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。
3.3对UC大鼠结肠相关指标的影响
正常组大鼠结肠黏膜无充血水肿、糜烂和溃疡现象；NS组大鼠肠壁可见重度充血和水肿，肠壁黏膜坏死及溃疡形成，面积>1cm2，以近肛端结肠病变最严重；各药物治疗组大鼠结肠黏膜病变情况均有所改善，美沙拉嗪组可见明显充血水肿，肠壁较小浅表溃疡形成；PA各治疗组可见轻度充血水肿，黏膜表面光滑，无糜烂，浅表性溃疡已结痂或愈合。与正常组比较，NS组大鼠结肠明显缩短(P＜0.01)，结肠长宽比、CMDI评分显著升高(P＜0.01)；与NS组比较，美沙拉嗪组及PA各给药组大鼠结肠长度、结肠长宽比均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，CMDI评分显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，其中PA多肽脂质体凝胶组各项指标与正常组数值相近，且无统计学差异(P>0.05)。
表8 PA各药物组对UC大鼠结肠相关指标的影响
注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与NS组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。
3.4对UC大鼠结肠HS评分的影响
显微镜下正常组结肠结构完整、清晰，腺体排列整齐，可见明显的隐窝和杯状细胞，基本无充血水肿、炎性细胞浸润现象。NS组大鼠结肠黏膜表层脱落、缺损，隐窝和杯状细胞大面积丢失，大量炎性细胞浸润。美沙拉嗪组及PA各给药组大鼠结肠杯状细胞和隐窝均出现不同程度的修复好转，炎性细胞浸润减少。与正常组比较，NS组上皮细胞评分、炎细胞浸润评分及HS总分均显著升高(P＜0.01)；与NS组比较，美沙拉嗪组及PA各给药组上皮细胞评分、炎细胞浸润评分及HS总分均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)；其中上皮细胞评分的评分体现出了PA药物有显著的促进上皮修复的作用，其作用优于美沙拉嗪。
表9 PA各药物组对UC大鼠结肠HS评分的影响(n＝6)
注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与NS组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与美沙拉嗪组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
3.5对UC大鼠血清中细胞因子的影响
与正常组比较，NS组大鼠血清中IL-1β、IL-18的表达量均显著升高(P＜0.01)，IL-10的含量显著下降(P＜0.01)。与NS组比较，美沙拉嗪组、PA各药物组大鼠血清中IL-1β、IL-18的表达量显著降低(P＜0.01)，IL-10的含量显著升高(P＜0.01)，其中PA多肽制剂组较PA多肽组的效果更佳，说明PA多肽活性部位有治疗UC的作用，且制备成的制剂可以提高PA多肽的疗效。
表10 PA各药物组对UC大鼠血清中细胞因子的影响(n＝6)
注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与NS组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与美沙拉嗪组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
3.6对UC大鼠结肠组织中细胞因子的影响
与正常组比较，NS组大鼠结肠组织中炎性因子IL-17A、IFN-γ、IL-6表达含量显著升高(P＜0.01)，具有促进修复作用的因子EGF含量显著降低(P＜0.01)。与NS组比较，美沙拉嗪组，PA各给药组大鼠结肠组织中IL-17A、IFN-γ、IL-6的表达含量显著降低(P＜0.01)，EGF的含量显著升高(P＜0.01)，其中PA多肽制剂组较PA多肽组的效果更佳，说明PA多肽活性部位有治疗UC的作用，且制备成的制剂可以提高PA多肽的疗效。
表11 PA各药物组对UC大鼠结肠组织中细胞因子的影响(n＝6)
注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与NS组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与美沙拉嗪组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
本实施例研究结果提示，蜚蠊多肽有效部位PA及其制剂通过改善大鼠一般活动状态、促进结肠黏膜修复、减少机体炎症因子分泌发挥其对UC的治疗作用，且PA脂质体凝胶经灌肠后效果最佳。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种含有治疗溃疡性结肠炎的蜚蠊多肽有效部位的剂型，其特征在于，所述剂型为脂质体凝胶剂；
所述脂质体凝胶剂由脂质体和凝胶材料组成，所述脂质体的组成为蜚蠊多肽有效部位、大豆磷脂和胆固醇，所述凝胶材料选自卡波姆和/或泊洛沙姆和/或壳聚糖；所述蜚蠊多肽有效部位是从蜚蠊粗提物中富集的分子量大于300道尔顿(>300Da)且小于5000道尔顿(<5KDa)的活性物质有效部位，所述蜚蠊粗提物为蜚蠊经水提醇沉后得到；
所述蜚蠊粗提物按如下方法提取：
(1)将蜚蠊浸泡于30℃～60℃石油醚，过夜；
(2)将所述步骤(1)的样品加热提取，弃去提取液，残渣于40℃～50℃干燥，备用；
(3)将所述步骤(2)得到的干燥残渣与水混合后于多功能提取罐中煎煮，多次提取后，收集并合并提取液过滤后于60℃浓缩至密度为1.10～1.20g/mL，即得蜚蠊水提物；
(4)将所述步骤(3)得到的蜚蠊水提物与乙醇混合，调节含醇量，搅拌静置后，滤过，将得到的滤液于60℃减压浓缩至密度为1.25～1.35g/mL，冷冻干燥后即得蜚蠊粗提物；
所述步骤(1)中蜚蠊为新鲜活虫、干燥全虫或干燥全虫过3号筛的粉末；
所述步骤(2)中提取温度为40℃～55℃；
所述步骤(3)中干燥残渣与水的质量比为1∶(6～15)；
所述步骤(3)中提取温度为70～100℃；
所述提取次数为1～5次，单次提取时间为1～6h；
所述步骤(4)中乙醇含量为40％～65％；
所述步骤(4)中静置12～48h，静置温度10～25℃后滤过；
所述减压浓缩的压力为-0.085Pa；
所述蜚蠊多肽有效部位按如下方法制备：
(a)将蜚蠊粗提物溶解于无菌双蒸水，5％的氨水调节pH；
(b)将所述步骤(a)中的蜚蠊粗提物溶液置于分子量为500Da的透析袋，磁力搅拌300rpm，透析；
(c)将所述步骤(b)中透析袋内的溶液转移至5KDa的透析袋中，磁力搅拌300rpm，继续透析，收集透析液，滤过，合并滤液，于50℃浓缩，冷冻干燥后即得蜚蠊多肽有效部位；
所述步骤(a)中蜚蠊粗提物溶液的pH值为8.0～11.0；
所述透析温度4℃～20℃，透析次数为1～10次，单次透析时间为1～10h。
2.根据权利要求1所述的剂型，其特征在于，
所述步骤(1)中蜚蠊为新鲜活虫；
所述步骤(2)中提取温度为45℃～50℃；
所述步骤(3)中干燥残渣与水的质量比为1∶(8～11)；
所述步骤(3)中提取温度为85～95℃；
所述提取次数为2～3次，单次提取时间为1～3h；
所述步骤(4)中乙醇含量为48％～58％；
所述步骤(4)中静置36h，静置温度13～18℃。
3.根据权利要求1所述的剂型，其特征在于，
所述步骤(a)中蜚蠊粗提物溶液的pH值为8.5～9.5；
所述透析温度为8℃～15℃，透析次数为3～6次，单次透析时间为3～6h。
4.根据权利要求1所述的剂型，其特征在于，所述蜚蠊多肽有效部位、所述大豆磷脂和所述胆固醇的用量比为(1-10)∶(20-30)∶(2-10)。
5.根据权利要求4所述的剂型，其特征在于，所述蜚蠊多肽有效部位、所述大豆磷脂和所述胆固醇的用量比为5∶25∶5。
6.根据权利要求1所述的剂型，其特征在于，所述蜚蠊多肽的脂质体凝胶剂中，所述凝胶材料的质量百分含量为1％～20％。
7.根据权利要求6所述的剂型，其特征在于，所述凝胶材料为泊洛沙姆，质量百分含量为13％～18％。
8.根据权利要求7所述的剂型，其特征在于，所述蜚蠊多肽的脂质体凝胶剂按如下方法制备：
将蜚蠊多肽有效部位0.1g溶解于10mLpH 7.4的磷酸盐缓冲液；另取大豆磷脂1.0g，胆固醇0.1g于乙醇溶液中溶解，减压旋转蒸发出去溶剂，使磷脂在容器壁上形成一层均匀薄膜；
将蜚蠊多肽有效部位溶液加入含有磷脂薄膜的容器中，旋转，溶解，静置后冰浴超声，得到脂质体溶液；
将脂质体溶液，2℃～10℃高速离心，弃去上清，加入10mLpH 7.4的磷酸盐缓冲液重悬沉淀，得到蜚蠊多肽有效部位的脂质体溶液；
将泊洛沙姆F1277.5g，置于烧杯中，加入甘油2.5g、吐温1g、无菌蒸馏水25mL，搅拌均匀，4℃～10℃静置使泊洛沙姆充分溶胀；
将脂质体溶液加入泊洛沙姆溶液中，搅拌均匀，用无菌双蒸水补足至50g，搅匀，静置，得到蜚蠊多肽的脂质体凝胶剂。
9.根据权利要求8所述的剂型，其特征在于，
所述旋转蒸发的温度为4℃～40℃；
所述超声功率为100W～600W，超声时间为2min～10min；
所述离心转速为15000rpm～40000rpm，离心时间为30min～150min；
所述脂质体凝胶剂中，蜚蠊多肽有效部位的脂质体包封率为85％；
每1g所述蜚蠊多肽有效部位的脂质体凝胶剂中，多肽含量为1.7mg。
10.根据权利要求9所述的剂型，其特征在于，
所述旋转蒸发的温度为10℃～20℃；
所述超声功率为250W～400W，超声时间为3min～6min；
所述离心转速20000rpm～30000rpm，离心时间为60min～120min。
11.如权利要求1-10任一所述的剂型在制备治疗溃疡性结肠炎的药物和/或医疗器械的用途。
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