CN115558690A - 一种蜚蠊多肽部位及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域,具体涉及一种蜚蠊多肽部位及其制备方法和用途。本发明提供了一种从蜚蠊鲜品酶解产物中富集的分子量大于500道尔顿(>500Da)且小于10000道尔顿(<10KDa)的蜚蠊多肽有效部位,本发明的制备得到的蜚蠊多肽有效部位产品收率高、生物活性好,且便于操作、易于大规模生产操作。本发明还提供了一种蜚蠊多肽泡沫剂,该泡沫剂对溃疡性结肠炎具有显著的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体而言,本发明涉及一种蜚蠊多肽部位及其制备方法和用途。
背景技术
溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)是以黏膜上皮细胞凋亡和炎症浸润为病理基础,并伴随巨噬细胞极化、淋巴细胞功能障碍、氧化应激、肠道菌群失调等特征的免疫功能紊乱性疾病。临床表现以腹泻、黏液脓血便、里急后重为主,易反复发作。目前我国患病率已经达11.6/10万人,并有逐年增高的趋势。临床一线药物(氨基水杨酸类)有效率低,用药周期长,副作用大,而生物制剂虽然疗效显著但价格昂贵和高脱靶率也难以在临床推广,致使患者生活质量每况愈下。因UC的难治愈以及致癌性等特点,已成为国际消化领域的研究热点,也是我国亟待解决的重大医学和社会问题。
虽然治疗溃疡性结肠炎的药物种类较多,但临床应用疗效缺不尽如人意。临床一线药物氨基水杨酸类药物的首过效应大,头痛、恶心及胃肠不适等副作用明显;糖皮质激素类药物口服首过效应大、生物利用度低,长期服用会导致代谢紊乱、机体抵抗力下降、胃肠细菌紊乱等;而免疫抑制剂因为有骨髓抑制、淋巴瘤等较强的副作用,仅作为无法使用氨基水杨酸类和糖皮质激素类药物患者的辅助药物;生物制剂的高效性为UC的治疗模式带来了新曙光,主要用于中、重度患者,但临床较高的脱靶率、耐药性及高昂价格让多数患者望而却步,导致生物制剂的的应用及发展停滞不前。因此,加强溃疡性结肠炎药物研发仍是解决当今人口健康问题的迫切需要。
中药蜚蠊又称为美洲大蠊(Periplaneta americana L.),现代药理学研究主要有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫、保肝、促进组织修复等作用。其主要化学成分为信息素、蛋白多肽类、氨基酸类、脂肪运动激素和二氢异香豆素。2017年“溃疡性结肠炎中西医结合诊疗共识意见”指出以蜚蠊干燥虫体为原料药精制的乙醇提取物康复新液具有通利血脉养阴生肌的功效用于各证型UC患者,临床上采用美沙拉嗪联合康复新液、柳氮磺胺吡啶联合康复新液、益生菌联合康复新液通过联合用药保留灌肠的方式治疗轻中度UC患者,能够明显改善患者腹痛、腹泻、粘液血便等症状,修复受损肠黏膜。
目前,蜚蠊有关上市制剂中的提取物制备均为高浓度乙醇加热提取获得,高度乙醇不仅在提取时能够对蜚蠊药材表面的细菌、寄生虫等病原微生物其杀灭作用,还能降低大分子蛋白、淀粉类多糖的溶出,加热条件使得过敏原蛋白质分子变性、破坏,同时获得更多的具有高活性的次生代谢产物。但是生产作业时,高浓度乙醇高温加热的安全系数低,对生产车间的防爆性能要求高,且乙醇提取物的收率较低,具有生物活性的多肽类物质未被大量的提取出来,造成药物资源的浪费。
CN102743739B也公开了一种蟑螂的多肽活性组分,但其组分种类多,制备工艺复杂,不利于产业化。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明通过优化提取方法和成分,提供了一种有效治疗溃疡性结肠炎的蜚蠊多肽部位及其制备方法和用途。
本发明的目的是提供一种分子量大于500道尔顿(>500Da)且小于10 000道尔顿(<10KDa)的蜚蠊多肽有效部位,所述的蜚蠊多肽有效部位为蜚蠊鲜品酶解产物精制得到。
本发明提供了所述蜚蠊多肽有效部位的提取方法,包括以下步骤:蜚蠊通过除杂、粉碎,酶解后滤过,调节pH后,弃去上层油脂和下层沉淀,过滤,收集滤液即为蜚蠊鲜品酶解产物,滤液装入0.5KD的透析袋透析;透析结束后将袋内溶液用10KD超滤离心管离心,收集下层离心液,冷冻干燥,即得蜚蠊多肽(PAP)有效部位。
进一步的,所述蜚蠊鲜品酶解产物按如下方法制备:
(1)将蜚蠊浸泡于清水中浸泡2h;
(2)将所述步骤(1)的样品洗净残渣,滤干蜚蠊表面水分,加入1~5倍量纯水,粉碎成肉泥,备用;
(3)将所述步骤(2)得到的肉泥与3~8倍0.1mol/L的盐酸水溶液混合后,加入0.5%~10%胃蛋白酶(m/V),37℃保温条件下200rpm搅拌4h,粗滤,收集滤液;
(4)将所述步骤(3)得到的滤液,10mM氢氧化钠溶液调节pH至7.4,加入0.5%~10%的胰蛋白酶(m/V),37℃保温条件下200rpm搅拌2h,8000rpm 4℃离心15min,弃去上层油脂和下层沉淀,0.45μm滤头过滤,收集滤液,即得蜚蠊鲜品酶解产物。
优选的,所述步骤(1)中蜚蠊为新鲜活虫或新鲜虫体,更优选为新鲜活虫。
优选的,所述步骤(2)中加入纯水的量为1~2倍,更有选为加入纯水的量为1倍。
优选的,所述步骤(3)中蜚蠊肉泥与盐酸水溶液的质量比1∶(3~5),更有选为1:5。
优选的,所述步骤(3)中胃蛋白酶的比例为0.5%~3%,更优选为1.5%。
优选的,所述步骤(3)酶解时间为2~6h;更优选为4h。
优选的,所述步骤(4)中胰蛋白酶的比例为0.5%~3%,更优选为1%。
优选的,所述步骤(4)酶解时间为1~4h;更优选为2h。
所述蜚蠊多肽有效部位按如下方法制备:
(1)将蜚蠊鲜品酶解产物装入0.5KD的透析袋,磁力搅拌300rpm,透析;
(2)将所述步骤(1)中透析袋内的溶液转移至10KDa的超滤离心管中,8000rpm条件下离心30min,收集下层离心液,冷冻干燥,即得蜚蠊多肽(PAP);
优选的,所述步骤(1)中溶液的透析次数为1~10次,单次透析时间为1~10h;更优选为透析次数为4次,单次透析时间为2h。
优选的,所述步骤(2)中超滤离心的温度为4~25℃,离心转速6 000~12 000rpm,离心时间15~60min;更优选地,超滤离心温度为4~8℃,离心转速8 000~10 000rpm,离心时间30~45min。
本发明的另一个目的在于提供一种蜚蠊多肽泡沫剂,包括以下组分:0.3-0.5份所述的蜚蠊多肽有效部位,0.4~0.8份发泡剂、0.4~0.5份增溶剂、1~2份增稠剂、0.4~0.8份稳定剂、0.01~1份抑菌剂。
进一步的,所述发泡剂选自十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、烷基糖苷类、吐温-80、大豆磷脂、卵磷脂中的一种或几种,优选十二烷基磺酸钠或烷基糖苷。
进一步的,所述增溶剂选自司盘-60、泊洛沙姆188中的一种或几种,优选泊洛沙姆188。
进一步的,所述增稠剂选自甘油、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)或卡波姆940中的一种或几种,优选甘油。
进一步的,所述稳定剂选自阿拉伯胶、甲基纤维素、硬脂酸中的一种或几种,优选阿拉伯胶或甲基纤维素。
进一步的,所述抑菌剂选自苯甲酸钠、苯甲酸、泥泊金甲酯、泥泊金乙酯中的一种或几种,优选苯甲酸。
进一步的,所述蜚蠊多肽泡沫剂,包括以下组分:0.3份所述的蜚蠊多肽有效部位,0.45份泊洛沙姆188、0.48份烷基糖苷、1.51份甘油、0.45份阿拉伯胶和0.03份苯甲酸。
进一步的,所述蜚蠊多肽泡沫剂,包括以下组分:0.3份所述的蜚蠊多肽有效部位,0.45份泊洛沙姆188、0.75份十二烷基硫酸钠、1.51份甘油、0.45份阿拉伯胶和0.03份苯甲酸。
进一步的,所述蜚蠊多肽泡沫剂,包括以下组分:0.3份所述的蜚蠊多肽有效部位,0.45份泊洛沙姆188、0.75份十二烷基硫酸钠、1.51份甘油、0.75份甲基纤维素和0.03份苯甲酸。
进一步的,所述蜚蠊多肽泡沫剂按如下方法制备:
(1)将蜚蠊多肽有效部位溶于水中;
(2)加入适量增溶剂,混匀,使溶解;
(3)再加入适量发泡剂、增稠剂、稳定剂和抑菌剂,用水补足至所需体积;
(4)超声10~60min,匀质,过滤得棕色澄清液体,灌入容器内,旋盖上泡沫泵,通过手压乳液泵产生泡沫,即得。
进一步的,所述蜚蠊多肽直肠泡沫剂体积膨胀比为25~40,优选为25~35,最优选为30。
本发明的另一目的在于提供所述的蜚蠊多肽有效部位或其组合物用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物、日化用品和/或医疗器械的用途。
本发明的另一目的是提供了含有所述的蜚蠊多肽有效部位的泡沫剂用于制备治疗溃疡性结肠炎药物中的用途。
本发明的有益效果:本发明的蜚蠊多肽有效部位,选用新鲜活虫粉碎打浆经胃蛋白酶、胰蛋白酶先后酶解蜚蠊的蛋白质,并利用分子截留技术得到的分子量大于0.5KDa且小于10KDa的多肽类活性有效部位,经冷冻干燥后即得蜚蠊多肽(PAP)产品。本发明的制备得到的蜚蠊多肽有效部位产品收率高、生物活性好,且便于操作、易于大规模生产操作。本发明通过对蜚蠊多肽有效部位进行研究发现,含有蜚蠊多肽有效部位的直肠泡沫剂灌肠对溃疡性结肠炎具有显著的治疗效果。
相关定义
泡沫剂体积膨胀比为泡沫膨胀后的体积与未发泡的起始材料的起始体积之比。
m/V代表质量体积比
附图说明
图1不同发泡剂添加制备的蜚蠊多肽泡沫剂的外观图,A,B:泡沫剂I号;C,D:泡沫剂Ⅳ号;E,F:泡沫剂Ⅴ号
图2蜚蠊多肽脂质体的外观图,A:第0天脂质体、B:第3天脂质体、C:第14天脂质体
图3不同给药组的小鼠结肠病理切片,A:正常组、B:模型对照组、C:美沙拉嗪组、D:PAP组、E:PAP泡沫剂I号组、F:PAP泡沫剂II号组、G:PAP泡沫剂III号组
具体实施方案
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明中,所用药材为新鲜全虫,本发明对蜚蠊的来源为美洲大蠊,可以采用市售产品。
实施例1不同胃蛋白酶用量下蜚蠊多肽的质量及活性指标评价
新鲜蜚蠊50g,加1L清水浸泡2h后洗净残渣,取出蜚蠊,加入等量纯水,粉碎,加5倍量pH 1.0的盐酸水溶液(0.1mol/L),加入一定比例的胃蛋白酶(%,m/V),37℃保温条件下200rpm搅拌4h,粗滤,弃去残渣;滤液用10mM氢氧化钠溶液调节pH至中性,8000rpm 4℃离心15min,弃去上层油脂和下层沉淀,0.45μm滤头过滤,滤液装入0.5KD的透析袋透析4次,每次2h;透析袋内溶液于10KD超滤离心管,8000rpm条件下离心30min,收集下层离心液,冷冻干燥,即得蜚蠊多肽(PAP)。
表1不同加酶量(胃蛋白酶)下蜚蠊多肽的质量及活性指标评价
根据表1结果,随着胃蛋白酶比例的增加,蜚蠊酶解物质量逐渐升高,体外活性IC50值逐渐降低,当加酶量超过1%时,体外变化未见显著性的区别。为了富集更多量的蜚蠊多肽,因此优选胃蛋白酶加酶量为1.5%。
实施例2胃蛋白酶不同酶解时间下蜚蠊多肽的质量及活性指标评价
新鲜蜚蠊50g,加1L清水浸泡2h后洗净残渣,取出蜚蠊,加入等量纯水,粉碎,加5倍量pH 1.0的盐酸水溶液(0.1mol/L),加入1.5%的胃蛋白酶(m/V),37℃保温条件下200rpm搅拌一定的时间,粗滤,弃去残渣;滤液用10mM氢氧化钠溶液调节pH至中性,8000rpm 4℃离心15min,弃去上层油脂和下层沉淀,0.45μm滤头过滤,滤液装入0.5KD的透析袋透析4次,每次2h;透析袋内溶液于10KD超滤离心管,8000rpm条件下离心30min,收集下层离心液,冷冻干燥,即得蜚蠊多肽(PAP)。
表2不同酶解(胃蛋白酶)时间下蜚蠊多肽的质量及活性指标评价
根据表2结果,随着酶解时间的延长,蜚蠊酶解物质量呈先升高后降低,体外活性IC50值呈先降低后升高,当酶解时间超过4h时,蜚蠊多肽含量降低且体外活性下降。为了富集更多量的活性蜚蠊多肽,优选胃蛋白酶酶解时间为4h。
实施例3胰蛋白酶不同用量下蜚蠊酶解物的收率及活性指标评价
新鲜蜚蠊50g,加1L清水浸泡2h后洗净残渣,取出蜚蠊,加入等量纯水,粉碎,加5倍量pH 1.0的盐酸水溶液(0.1mol/L),加入1.5%的胃蛋白酶(m/V),37℃保温条件下200rpm搅拌4h,粗滤,弃去残渣;滤液用10mM氢氧化钠溶液调节pH至7.4,加入一定比例的胰蛋白酶(%,m/V),37℃保温条件下200rpm搅拌2h,8000rpm 4℃离心15min,弃去上层油脂和下层沉淀,0.45μm滤头过滤,滤液装入0.5KD的透析袋透析4次,每次2h;透析袋内溶液于10KD超滤离心管,8000rpm条件下离心30min,收集下层离心液,冷冻干燥,即得蜚蠊多肽(PAP)。
表3不同加酶量(胰蛋白酶)下蜚蠊酶解物的收率及活性指标评价
根据表3结果,随着胰蛋白酶比例的增加,蜚蠊多肽质量呈先升高后降低,体外活性IC50值呈先降低后升高,蜚蠊多肽质量逐渐升高,体外活性IC50值逐渐降低,当加酶量超过1%时,多肽质量及活性均下降。因此优选胰蛋白酶加酶量为1.0%。
实施例4胰蛋白酶不同酶解时间下蜚蠊多肽的质量及活性指标评价
新鲜蜚蠊50g,加1L清水浸泡2h后洗净残渣,取出蜚蠊,加入等量纯水,粉碎,加5倍量pH 1.0的盐酸水溶液(0.1mol/L),加入1.5%的胃蛋白酶(m/V),37℃保温条件下200rpm搅拌4h,粗滤,弃去残渣;滤液用10mM氢氧化钠溶液调节pH至7.4,加入1.0%的胰蛋白酶(%,m/V),37℃保温条件下200rpm搅拌一定的时间,8000rpm 4℃离心15min,弃去上层油脂和下层沉淀,0.45μm滤头过滤,滤液装入0.5KD的透析袋透析4次,每次2h;透析袋内溶液于10KD超滤离心管,8000rpm条件下离心30min,收集下层离心液,冷冻干燥,即得蜚蠊多肽(PAP)。
表4不同酶解(胰蛋白酶)时间下蜚蠊多肽的质量及活性指标评价
根据表4结果,随着酶解时间的延长,蜚蠊多肽质量呈先升高后降低,体外活性IC50值呈先降低后升高,当酶解时间2h时,蜚蠊多肽质量最高,体外活性IC50值最低。为了富集更多量的蜚蠊多肽,因此优选胰蛋白酶的酶解时间为2h。
实施例5不同制备工艺的蜚蠊提取物的质量及活性指标评价
新鲜蜚蠊50g,50℃烘干后,粉碎,加入3倍石油醚室温浸泡24h,重复浸泡3次,取出蜚蠊虫体60℃烘干后备用。向蜚蠊粉末中加入5倍量的蒸馏水和1.0%的胰蛋白酶(%,m/V),37℃保温条件下200rpm搅拌2h,然后将温度升高至80℃杀灭胰蛋白酶,冷却后过滤,滤液40℃干燥,即得蜚蠊提取物(PAP-11)。
新鲜蜚蠊50g,50℃烘干后,粉碎,加入3倍石油醚室温浸泡24h,重复浸泡3次,取出蜚蠊虫体60℃烘干后备用。向干燥后的蜚蠊粉末中加0.5L水,90℃加热提取,提取3次,每次2h,滤过,滤液浓缩至密度1.14~1.16g/mL(60℃)。加入95%乙醇,调节醇含量,于15℃静置48h,滤过,回收乙醇,浓缩至相对密度1.28~1.30g/mL(60℃),冷冻干燥后即得蜚蠊提取物(PAP-12)。
表5不同制备工艺的蜚蠊提取物的质量及活性指标评价
根据表5结果,不同制备工艺获得的蜚蠊多肽质量及体外活性的作用,发现单用胰蛋白酶酶解工艺(PAP11)获得蜚蠊多肽含量虽然显著高于水提醇沉工艺(PAP12),但是该提取物的体外抗炎、抗氧化、促修复能力的IC50值较高,活性作用均弱于水提醇沉工艺,同时也较其他实施例中活性多肽部位的作用弱。
实施例6空白泡沫剂的制备及评价
将0.45g泊洛沙姆188溶于水中,再加入1.20mL甘油、0.48g烷基糖苷0810、0.45g阿拉伯胶、0.3g苯甲酸,用水补足至15mL后,超声30min匀质,过滤得棕色澄清液体,灌入容器内,旋盖上泡沫泵,通过手压乳液泵产生泡沫,即得空白泡沫剂。
空白泡沫剂的评价方法:
现有外用泡沫剂均属于药用气雾剂,应满足气雾剂本身的质量标准。但由于泡沫剂独特的物理性质,在其处方和工艺开发过程中,需针对泡沫的特殊性,采用适当的性能评价指标,以更好的满足外用泡沫剂的质量标准。起泡性能和泡沫稳定性是泡沫剂评价中最基本的2个指标。其中起泡性能常用发泡量、发泡倍率以及发泡时间等参数来表征,反映泡沫量的大小以及泡沫是否易于形成。泡沫的稳定性是指生成泡沫的持久性,即消泡的难易,通常用半衰期来表征。
综合考虑,对泡沫剂的微观形态、泡沫密度、膨胀率、消泡率和综合指数按权重系数10、10、20、20、40进行总加权评分。
表6泡沫剂的评价方法
注:外观评分包括原液均匀度、泡沫韧性、泡沫细腻度及泡沫分布。原液均匀度:原液有不溶物且不透明为差,原液无不溶物但不澄清为一般,原液无不溶物且均一澄清为好;泡沫韧性:用手搓泡沫,泡沫干涩易破为差,泡沫微湿润,久搓泡沫直径变大不破为一般,泡沫湿润,久搓泡沫形状无较大变化为好;泡沫细腻度:单个泡沫明显易见而且直径大为差,单个泡沫直径稍小,可区分单个泡沫为一般,单个泡沫不易分辨,直径无法目测为好;泡沫分布:泡沫液膜薄,液体几乎集中在Plateau通道中为差,气泡分布适当、泡沫液膜较厚为一般,气泡分布窄,均匀,泡沫中的液体在液膜和Plateau通道分布均匀为好。
泡沫密度=m泡/v泡 泡沫膨胀率=(v泡-v液)/v液
泡沫消泡率=(h1-h2)/h1*100% 泡沫综合指数=v泡*t半衰期
其中:m泡为喷出泡沫的质量,v泡为相对应的泡沫体积;
v液为形成相应体积泡沫剂所需的液体体积;
h1为泡沫剂的初始高度,h2为10min后泡沫剂的高度;
t半衰期为泡沫体积衰减一半所需的时间。
实施例7PAP泡沫剂I号的制备
取蜚蠊多肽(PAP)0.3g溶于水中;加入0.45g泊洛沙姆188,混匀,使溶解,再加入1.20mL甘油、0.48g烷基糖苷0810、0.45g阿拉伯胶、0.03g苯甲酸,用水补足至15mL后,超声30min匀质,过滤得棕色澄清液体,灌入容器内,旋盖上泡沫泵,通过手压乳液泵产生泡沫,即得PAP泡沫剂I号。
实施例8PAP泡沫剂II号的制备
将蜚蠊多肽(PAP)0.3g溶于水中;加入0.45g泊洛沙姆188,混匀,使溶解,再加入1.20mL甘油、0.75g十二烷基硫酸钠(SDS)、0.45g阿拉伯胶、0.03g苯甲酸,用水补足至15mL后,超声30min匀质,过滤得棕色澄清液体,灌入容器内,旋盖上泡沫泵,通过手压乳液泵产生泡沫,即得PAP泡沫剂II号。
实施例9PAP泡沫剂III号的制备
将蜚蠊多肽(PAP)0.3g溶于水中;加入0.45g泊洛沙姆188,混匀,使766溶解,再加入1.20mL甘油、0.75g十二烷基硫酸钠(SDS)、0.75g甲基纤维素(MC)、0.03g苯甲酸,用水补足至15mL后,超声30min匀质,过滤得棕色澄清液体,灌入容器内,旋盖上泡沫泵,通过手压乳液泵产生泡沫,即得PAP泡沫剂III号。
根据泡沫剂的评价方法比较PAP泡沫剂I~III号的物理性质如表7所示。
表7PAP泡沫剂I~III号的综合评价
对比例1
取蜚蠊多肽(PAP)0.3g溶于水中;加入0.45g泊洛沙姆188,混匀,使溶解,再加入1.20mL甘油、0.15g吐温-80、0.45g阿拉伯胶、0.03g苯甲酸,用水补足至15mL后,超声30min匀质,过滤得棕色澄清液体,灌入容器内,旋盖上泡沫泵,通过手压乳液泵产生泡沫,即得PAP泡沫剂Ⅳ号。
对比例2
取蜚蠊多肽(PAP)0.3g溶于水中;加入0.45g泊洛沙姆188,混匀,使溶解,再加入1.20mL甘油、0.15g大豆磷脂、0.45g阿拉伯胶、0.03g苯甲酸,用水补足至15mL后,超声30min匀质,过滤得棕色澄清液体,灌入容器内,旋盖上泡沫泵,通过手压乳液泵产生泡沫,即得PAP泡沫剂Ⅴ号。
根据泡沫剂的评价方法比较PAP泡沫剂I、Ⅳ、Ⅴ号的物理性质差别:
表8PAP泡沫剂I、Ⅳ、Ⅴ号的综合评价
将处方中的发泡剂烷基糖苷(APG0810)换作等量的吐温-80、大豆磷脂,其他成分不变,制成泡沫剂。如图1所示,根据外观可知:PAP泡沫剂I号的溶液澄清,泡沫剂Ⅳ号的溶液较粘稠、澄清度差,泡沫剂Ⅴ号的溶液浑浊;PAP泡沫剂I号的泡沫丰富细腻均匀,泡沫剂Ⅳ号的泡沫有明显的孔洞,有明显的分层现象。泡沫剂Ⅴ号的泡沫瞬间消散,几乎形不成泡沫。根据泡沫剂的加权评分。得:PAP泡沫剂I号>PAP泡沫剂Ⅳ号>PAP泡沫剂Ⅴ号。因此,并不是所有的表面活性剂均可与其他辅料形成起泡性强、稳定性强的泡沫。
对比例3
分别精密称取大豆卵磷脂12mg和胆固醇2.4mg,置于100mL茄型瓶中,加入5mL二氯甲烷使其充分溶解,在旋转蒸发仪上以200rpm旋转蒸发除去二氯甲烷,在瓶壁上形成均匀的类脂薄膜。称取PAP 3.0mg,用PBS(pH=7.4)配成1.0mg/mL溶液,倒入上述茄形瓶中,于30℃恒温振荡器200rpm振荡水化0.5h,得到Lipo-PAP初品。将Lipo-PAP初品经过0.20μm微孔滤膜的脂质体挤出仪挤出2次,得到的乳色Lipo-PAP混悬液,即为PAP脂质体。
将PAP泡沫剂I号和PAP脂质体放于常温环境下14天,观察两者的外观性状差异,考察其稳定性。放于常温环境下14天后,PAP泡沫剂I号溶液澄清透明,未产生沉淀;而脂质体脂质体从第3天起有轻微的白色沉淀,当到第14天时产生大量白色絮状沉淀(图2)。
测试例1蜚蠊多肽泡沫剂通过原位灌肠对溃疡性结肠炎小鼠的治疗作用
1.实验材料
1.1实验动物
健康SPF级C57BL/6小鼠48只,雄性,6-8周龄,体质量18-22g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2021-0006;于南京中医药大学动物实验中心IVC系统中饲养,温度20~25℃,湿度40~70%RH,12h明暗交替,实验单位使用许可证编号:SYXK(苏)2018-0049。
1.2受试药物
本发明空白泡沫剂、PAP、PAP泡沫剂I号、PAP泡沫剂II号、PAP泡沫剂III号;
美沙拉嗪,(批号:1902002,天津力生制药股份有限公司,规格:0.25g)。
1.3实验试剂
葡聚糖硫酸钠,(批号:11032-222,深圳丽晶公司);
无水乙醇,AR(批号:2017,天津市福晨化学试剂厂);
异氟烷,(批号:20190701,山东科源制药股份有限公司);
水合氯醛,AR(批号:20170203,国药集团化学试剂有限公司);
甲醛溶液,AR(批号:20170523,天津市风船化学试剂科技有限公司);
磷酸氢二钠,AR(批号:20171008,天津市风船化学试剂科技有限公司);
磷酸二氢钠,AR(批号:20160318,天津市风船化学试剂科技有限公司);
生理盐水,NS(批号:A15031602,贵州天地药业有限公司);
隐血试剂盒,(批号:20190323,南京建成生物工程研究所);
小鼠白介素6(IL-6)试剂盒,批号:20220207-20188A;小鼠白介素17A(IL-17A)试剂盒,批号:20220207-20171A;小鼠髓过氧化物酶(MPO)试剂盒,批号:20220207-28122A;小鼠表皮生长因子(EGF)试剂盒,批号:20220207-20203A;均购自上海酶联生物科技有限公司。
1.4主要仪器
高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司),型号:HC-30118R;
电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司),型号:AL204-IC;
精密电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司),型号:METTLERAE240;
涡旋仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司),型号:VORTFX-5;
冷冻干燥机(美国Cold-Sim公司),型号:FD8-4a;
普通光学显微镜(重庆光学仪器厂),型号:OLYMPUS CX31;
病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司),型号:PHY-Ⅲ;
石蜡切片机(Leica公司),型号:RM2245;
冷冻台(常州市中威电子仪器有限公司),型号:BMJ-C;
生物组织包埋机(孝感市宏业医用仪器有限公司),型号:BM-Ⅷ;
生物组织摊烤片机(湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司),型号:YT-7FB;
自动脱水机(德国Leica公司生产),型号:Leica ASP-300S;
医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司),型号:BI-2000;
微距相机,型号:DIGITAI CAMERA D7100,微距镜头,型号:AF-S Micro 60/2.8GED均购自尼康。
2.实验方法
2.1实验动物模型建立
C57BL/6小鼠适应性饲养7d后,除正常对照组给予纯净水外,其余小鼠给予3%(w/v)葡聚糖硫酸钠盐(DSS)水溶液自由饮用7d,溶液2d一换,造模结束后改用纯净水饲养7d,共计14d。
2.2实验动物分组与给药
随机选取6只小鼠作为正常对照组,剩余小鼠按上述方法造模,于造模第7d对模型小鼠进行疾病活动指数(Disease activity index,DAI)评分(以0~3分极轻度炎症,4~6分轻度炎症,7~9分中度炎症,10~12分为重度炎症分层),剔除极轻度炎症的小鼠后,其余小鼠按先DAI分层再随机抽样分组的方法,分为模型对照组、美沙拉嗪组(200mg/kg)、PAP组、PAP泡沫剂I号组、PAP泡沫剂II号组、PAP泡沫剂III号组,每组6只。分组次日,各给药组按0.1mL/20g·d灌肠给予相应药物,正常对照组和模型对照组按0.1mL/20g·d给予空白泡沫剂,连续给药7d。
2.3指标观察及检测方法
2.3.1疾病活动指数
实验期间每日称量小鼠体重,观察小鼠粪便性状及粪便隐血情况,计算每只小鼠的DAI分值评估疾病活动情况。
2.3.2结肠黏膜损伤指数
末次给药后禁食不禁水24h,颈椎脱臼处死小鼠后进行解剖,截取距离肛门约1cm至盲肠末端的整个结肠,平铺于白瓷板上,用钢尺测量结肠长度后,延肠系膜剪开,冰生理盐水洗净肠腔内容物,并参照文献标准进行结肠黏膜损伤指数评分(Colon mucocaldamage index,CMDI)。
2.3.3病理组织学评分
将结肠组织纵向截取一半,用10%(W/V)中性福尔马林固定,脱水后用石蜡进行包埋,常规制作5μm病理切片,苏木精-伊红(HE)染色,中性树胶封片,显微镜下观察其病理变化,参照文献标准进行结肠病理组织学(Histoligical score,HS)评分。
2.3.4结肠组织细胞因子测定
结肠组织纵向截取的另一半,用预冷的生理盐水制备10%(W/V)组织匀浆液,于4℃,3000r/min离心10min,取上清液,严格按照相关试剂盒操作说明书检测结肠组织中TNF-α、IL-6、MPO、EGF的含量。
3.结果
3.1对溃疡性结肠炎(UC)小鼠一般状况的影响
正常对照组小鼠饮食饮水正常,毛发光滑、干净,精神状态良好,粪便为黑色、质地硬呈椭球形,尿液呈淡黄色,颜色正常。模型对照组小鼠随时间推移精神状态有一定改善,进食量稍有增加,但尾部仍附着稀便,或便中带血。美沙拉嗪组小鼠精神状态明显好转,活动增多,未见黄色黏稠大便,粪便基本成型转为黑色。PAP组小鼠精神状态好转,扎堆蜷卧现象减少,肛门污秽减少,粪便基本成型且颜色转为黑色,体重逐渐回升。PAP泡沫剂I号组、II号组、III号组小鼠精神状态良好,活动量增多,肛门未见粘连粪便,粪便成型且颜色转为黑色,体重逐渐增加。
3.2对UC小鼠DAI评分的影响
Mauchly’s球形度检测结果显示各组小鼠在第0~14d的DAI评分数据不符合球形假设(P<0.05),因此采用Greenhousc-Geisser方法校正自由度后分析结果。重复测量方差分析结果显示:(1)交互作用(时间*分组):小鼠DAI评分的交互作用有统计学意义(P<0.01),说明时间因素对不同组别小鼠DAI评分的影响有差别。(2)时间效应:小鼠DAI评分的时间效应有统计学意义(P<0.01),说明不同时间点小鼠DAI评分有差别。(3)组间效应:小鼠DAI评分的组间效应有统计学意义(P<0.01),说明各组小鼠的DAI评分有差异。为了评价同一时间点上的组间差异情况,根据单因素方差分析结果显示,实验第0d,各组之间DAI评分均较低且无显著性差异(P>0.05),即所有小鼠正常且处于同一水平。实验第7d,造模最后一天,正常对照组DAI评分较低,所有造模小鼠DAI评分较正常组显著升高(P<0.01),且各造模组之间无显著性差异,提示UC模型复制成功。实验第14d,药物治疗结束,与正常对照组比较,模型对照组及各药物治疗组DAI评分均显著升高(P<0.01),与模型对照组比较,所有治疗组均能有效降低DAI评分(P<0.01),其中除了I号组分别与美沙拉嗪组和PAP组相比有差异外(P<0.05),其余各治疗组无明显差别,DAI评分均明显降低。
注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,△P<0.05,△△P<0.01;与美沙拉嗪组比较,▲P<0.05,▲P<0.01;与PAP组比较,▼P<0.05,▼▼P<0.01。
3.3对UC小鼠结肠相关指标的影响
肉眼观察正常对照组小鼠结肠黏膜无充血水肿、糜烂和溃疡现象;模型对照组小鼠肠壁有充血、水肿及增厚,肠壁黏膜有坏死及溃疡形成,以近肛端结肠病变最严重;各药物治疗组小鼠结肠黏膜病变情况均有所改善,美沙拉嗪组可见充血水肿,肠壁有较小浅表溃疡形成;PAP组可见轻微充血及肠壁增厚;泡沫剂I号组、II号组和III号组充血水肿、溃疡等症状得到成不同程度缓解。与正常对照组比较,模型对照组小鼠结肠长度明显缩短(P<0.01),CMDI评分显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,所有治疗组小鼠结肠长度显著增长(P<0.05或P<0.01),CMDI评分均明显降低(P<0.05或P<0.01);与美沙拉嗪组比较,泡沫剂I号组结肠长度和CMDI评分无显著差异(P>0.05),II号、III号组结肠长度和CMDI评分与PAP组相比较,无显著性区别(P>0.05)。
注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,△P<0.05,△△P<0.01;与美沙拉嗪组比较,▲P<0.05,▲P<0.01;与PAP组比较,▼P<0.05,▼▼P<0.01。
如图3所示,镜下观察发现,正常对照组黏膜层及其下层结构完整、清晰,腺体排列整齐,有见明显的隐窝和杯状细胞,无充血水肿、炎性细胞浸润现象。模型对照组结肠黏膜层脱落、缺损,大面积的隐窝和杯状细胞缺失,炎性细胞大量聚集并浸润至黏膜肌层及肌层。美沙拉嗪组、PAP组、泡沫剂I、II、III号组结肠的杯状细胞和隐窝均有不同程度的好转,炎性细胞浸润明显减少。与正常对照组比较,模型对照组上皮细胞评分、炎细胞浸润评分及HS总分均显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,各治疗组上皮细胞评分、炎细胞浸润评分及HS总分均有不同程度的降低(P<0.01);其中,泡沫剂I号组的上皮细胞完整性和总分评价方面显著优于美沙拉嗪组和PAP组(P<0.05)。
注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,△P<0.05,△△P<0.01;与美沙拉嗪组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01;与PAP组比较,▼P<0.05,▼▼P<0.01。
3.4对UC小鼠结肠组织中细胞因子的影响
与正常组比较,模型组小鼠结肠组织中炎性因子IL-17A、IL-6和氧化应激相关活化酶MPO的表达含量显著升高(P<0.01),促进组织修复相关因子EGF的表达水平显著下降(P<0.01)。与模型组比较,各治疗组小鼠结肠组织中炎性因子IL-17A、IL-6、MPO的表达含量显著降低(P<0.01),EGF的表达水平显著升高(P<0.01);其中,泡沫剂I号组抑制炎症因子IL-17A、IL-6的表达和减少MPO含量的作用最为显著(P<0.01),且与美沙拉嗪组和PAP组比较作用更为显著(P<0.05或P<0.01)。说明了蜚蠊多肽PAP部位对UC小鼠具有治疗作用,将其制备成泡沫剂后效果更显著。
注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,△P<0.05,△△P<0.01;;与美沙拉嗪组比较,▲P<0.05,▲P<0.01;与PAP组比较,▼P<0.05,▼▼P<0.01。
本实施例研究结果提示,蜚蠊多肽部位PAP通过灌肠给药能改善小鼠疾病活动指数、促进结肠黏膜修复、减少机体炎症因子分泌发挥其对UC的治疗作用。
Claims (10)
1.一种分子量大于500道尔顿(>500Da)且小于10000道尔顿(<10KDa)的蜚蠊多肽有效部位,所述的蜚蠊多肽有效部位为蜚蠊鲜品酶解产物精制得到。
2.权利要求1所述的蜚蠊多肽有效部位的提取方法,包括以下步骤:蜚蠊通过粉碎,用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解,弃去上层油脂和下层沉淀,过滤,收集滤液即为蜚蠊鲜品酶解产物,滤液装入0.5KD的透析袋透析;透析结束后将袋内溶液用10KD超滤离心管离心,收集下层离心液,冷冻干燥,即得蜚蠊多肽有效部位。
3.根据权利要求2的提取方法,其特征在于,所述蜚蠊鲜品酶解产物按如下方法制备:
(1)将蜚蠊浸泡于清水中浸泡2h;
(2)将步骤(1)的样品洗净残渣,滤干蜚蠊表面水分,加入1~5倍量纯水,粉碎成肉泥,备用;
(3)将步骤(2)得到的肉泥与3~8倍0.1mol/L的盐酸水溶液混合后,加入0.5%~10%胃蛋白酶(m/V),37℃保温条件下200rpm搅拌4h,粗滤,收集滤液;
(4)将步骤(3)得到的滤液,10mM氢氧化钠溶液调节pH至7.4,加入0.5%~10%的胰蛋白酶(m/V),37℃保温条件下200rpm搅拌2h,8000rpm 4℃离心15min,弃去上层油脂和下层沉淀,0.45μm滤头过滤,收集滤液,即得蜚蠊鲜品酶解产物;
优选的,所述步骤(1)中蜚蠊为新鲜活虫或新鲜虫体,更优选为新鲜活虫;
优选的,所述步骤(2)中加入纯水的量为1~2倍,更有选为加入纯水的量为1倍;
优选的,所述步骤(3)中蜚蠊肉泥与盐酸水溶液的质量比1∶(3~5),更有选为1:5;
优选的,所述步骤(3)中胃蛋白酶的比例为0.5%~3%,更优选为1.5%;
优选的,所述步骤(3)酶解时间为2~6h;更优选为4h;
优选的,所述步骤(4)中胰蛋白酶的比例为0.5%~3%,更优选为1%;
优选的,所述步骤(4)酶解时间为1~4h;更优选为2h。
4.根据权利要求2的提取方法,其特征在于,所述蜚蠊多肽有效部位提取方法如下:
S1:将蜚蠊鲜品酶解产物装入0.5KD的透析袋,磁力搅拌300rpm,透析;
S2:将所述步骤S1中透析袋内的溶液转移至10KDa的超滤离心管中,8000rpm条件下离心30min,收集下层离心液,冷冻干燥,即得蜚蠊多肽有效部位;
优选的,所述步骤S1中溶液的透析次数为1~10次,单次透析时间为1~10h;更优选为透析次数为4次,单次透析时间为2h;
优选的,所述步骤S2中超滤离心的温度为4~25℃,离心转速6 000~12 000rpm,离心时间15~60min;更优选地,超滤离心温度为4~8℃,离心转速8 000~10 000rpm,离心时间30~45min。
5.一种由权利要求1所述的蜚蠊多肽有效部位制备而成的蜚蠊多肽泡沫剂,按重量份数计包括以下组分:0.3-0.5份蜚蠊多肽有效部位,0.4~0.8份发泡剂、0.4~0.5份增溶剂、1~2份增稠剂、0.4~0.8份稳定剂、0.01~1份抑菌剂。
6.根据权利要求5所述的蜚蠊多肽泡沫剂,其特征在于,所述发泡剂选自十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、烷基糖苷类、吐温-80、大豆磷脂、卵磷脂中的一种或几种,更优选十二烷基磺酸钠或烷基糖苷;优选地,所述增溶剂选自司盘-60、泊洛沙姆188中的一种或几种,更优选泊洛沙姆188;优选地,所述增稠剂选自甘油、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素或卡波姆940中的一种或几种,更优选甘油;优选地,所述稳定剂选自阿拉伯胶、甲基纤维素、硬脂酸中的一种或几种,更优选阿拉伯胶或甲基纤维素;优选地,所述抑菌剂选自苯甲酸钠、苯甲酸、泥泊金甲酯、泥泊金乙酯中的一种或几种,更优选苯甲酸。
7.根据权利要求5所述的蜚蠊多肽泡沫剂,其特征在于,所述蜚蠊多肽泡沫剂,按重量份数计包括以下组分:0.3份所述的蜚蠊多肽有效部位,0.45份泊洛沙姆188、0.48份烷基糖苷、1.51份甘油、0.45份阿拉伯胶和0.03份苯甲酸;优选地,所述蜚蠊多肽泡沫剂,包括以下组分:0.3份蜚蠊多肽有效部位,0.45份泊洛沙姆188、0.75份十二烷基硫酸钠、1.51份甘油、0.45份阿拉伯胶和0.03份苯甲酸;优选地,所述蜚蠊多肽泡沫剂,包括以下组分:0.3份所述的蜚蠊多肽有效部位,0.45份泊洛沙姆188、0.75份十二烷基硫酸钠、1.51份甘油、0.75份甲基纤维素和0.03份苯甲酸。
8.权利要求5所述的蜚蠊多肽泡沫剂按如下方法制备:
i)将蜚蠊多肽有效部位溶于水中;
ii)加入适量增溶剂,混匀,使溶解;
iii)再加入适量发泡剂、增稠剂、稳定剂和抑菌剂,用水补足至所需体积;
iv)超声10~60min,匀质,过滤得棕色澄清液体,灌入容器内,旋盖上泡沫泵,通过手压乳液泵产生泡沫,即得;
其中,所述蜚蠊多肽泡沫剂体积膨胀比为25~40,优选为25~35,最优选为30。
9.权利要求1所述的蜚蠊多肽有效部位或其组合物用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物、日化用品和/或医疗器械的用途。
10.权利要求5所述的蜚蠊多肽泡沫剂用于制备治疗溃疡性结肠炎药物中的用途。
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