CN107669625A - 抗肺纤维化药物、制备方法、应用及动物模型构建方法 - Google Patents

抗肺纤维化药物、制备方法、应用及动物模型构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，公开了一种抗肺纤维化药物、制备方法、应用及动物模型构建方法，所述抗肺纤维化药物由龙胆苦苷组成；动物模型的构建方法包括：实验动物分组与处理，肺纤维化模型建立。本发明可为进一步的抗肺纤维化药物研发提供的强有力的理论基础和实践基础，具有重要的研发价值和开发意义；本发明证实了龙胆苦苷能够明显减轻肺纤维化病理程度，延缓肺纤维化进展，可为龙胆苦苷抗肺纤维化的应用，研发出了具有我国自主知识产权的经济、高效、低毒的抗肺纤维化药物。

Description

抗肺纤维化药物、制备方法、应用及动物模型构建方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种抗肺纤维化药物、制备方法、应用及动物模型构建方法。
背景技术
肺纤维化(Pulmonary fibrosis，PF)是多种原因引起的慢性间质性肺疾病，治疗困难，病人预后差，5年生存率仅20％。长期以来，肺纤维化一直缺乏有效治疗药物，临床多采用糖皮质激素进行控制症状，但糖皮质激素不良反应多，不宜长期使用。直到2014年，美国FDA同时批准了两个治疗特发性肺纤维化的新药：分别为InterMune Inc.公司研发的Esbriet(pirfenidone:吡非尼酮)和Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals,Inc公司研发的Ofev(nintedanib：尼达尼布)。然而，这两种治疗肺维化新药价格昂贵，长期服药对于普通患者难以承受，服药繁琐(吡非尼酮胶囊每日3次，尼达尼布胶囊每日2次)导致患者依从性不理想，同时还存在肝毒性等不良反应。因此，研发具有我国自主知识产权的经济、高效、低毒的抗肺纤维化药物十分必要。
龙胆苦苷是一种裂环烯醚萜苷类化合物，分子式为C16H20O9，广泛分布于龙胆属植物中。我国龙胆属植物资源丰富，可以从中获得大量的天然龙胆苦苷，因此制成药物的成本较低。研究发现，龙胆苦苷具有抗炎、镇痛、抗氧化、保肝利胆、健胃、抗病毒、抗肿瘤等多种药理活性。然而，龙胆苦苷是否对肺纤维化有治疗作用，目前文献未见报道。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)现有抗肺纤维化药物吡非尼酮和尼达尼布价格昂贵，普通患者难以承受长期服用。
(2)服药繁琐(吡非尼酮胶囊每日3次，尼达尼布胶囊每日2次)，患者依从性较差。
(3)现有抗肺纤维化药物吡非尼酮和尼达尼布都存在肝毒性，长期服用易导致冬氨酸基转移酶(AST)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高而出现肝功能损害。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抗肺纤维化药物、制备方法、应用及动物模型构建方法。
本发明是这样实现的，一种抗肺纤维化药物，所述抗肺纤维化药物为龙胆苦苷。
本发明的另一目的在于提供一种如抗肺纤维化药物的制备方法包括：
(1)将龙胆苦苷用微量分析天平准确称量后,用医用无菌生理盐水配制成0.05％的龙胆苦苷注射液。
(2)采用0.22μm微孔滤膜(Millipore)将配制的龙胆苦苷注射液进行过滤除菌。
(3)将滤过除菌的龙胆苦苷注射液分装于高压灭菌的容器内。
(4)将分装的龙胆苦苷注射液置于-20℃冰箱保存，临用前取出融化。
本发明的另一目的在于提供一种验证所述抗肺纤维化药物疗效的动物模型的构建方法，包括：
实验动物分组与处理：
SPF级健康雄性昆明小鼠150只，体重20±2g；随机分为5组；每组30只，于术后7d、14d和28d分3期各处死10只，其中5只行气管灌洗收集肺泡灌洗液检测，另5只取肺组织行病理学、HYP及Western blot检测；
肺纤维化模型建立：
实验小鼠用4％水合氯醛10μl/g体重腹腔注射麻醉，仰卧固定；无菌条件下，颈前正中切开颈部皮肤、暴露气管，用无菌注射器经气管软骨环间隙注入BLM5mg/kg，注药后将小鼠直立左右抖动并旋转使BLM均匀分布于肺内，缝合切口，置于SPF动物室内饲养分析；分别于术后7d、14d和28d后处死，检测各项指标。
进一步，所述检测各项指标，包括：
肺组织HYP含量测定：
于术后7d、14d及28d，每组各取5只小鼠，麻醉后开胸取出左肺上叶称取50mg湿重肺组织，采用碱水解法测定肺组织HYP含量，严格按试剂盒说明书操作；
肺组织形态学分析：
将麻醉处理的小鼠在活体状态下，于冰上快速切取左肺下叶薄片组织，2.5％戊二醛溶液固定后行电子显微镜分析；余下左肺组织以10％中性甲醛固定24h后，常规石蜡包埋、切片，HE及Masson染色行光学显微镜分析；
Western blot检测肺组织TGF-β及CTGF蛋白含量：
将各组小鼠的右肺叶组织取出，标本离体后冰上常规匀浆、离心制备组织蛋白抽提液，以BCA法检测总蛋白含量并定量变性；40μg/孔上样变性蛋白于12％SDS-PAGE电泳，半干式转膜，5％脱脂奶粉TBST封闭液封闭2h，TBST缓冲液充分振荡清洗，分别滴加一抗及二抗，DAB显色，FluorChem E System拍照，ScnImage软件进行图像分析，与内参条带灰度比值表示其蛋白相对表达量；先行CTGF显影后，stripping buffer洗膜5min后继续5％脱脂奶粉封闭过程，再次显影GAPDH蛋白；
ELISA测定BALF中TNF-α、IL-1β含量：
每组另取5只小鼠分别于术后7d、14d及28d处理，麻醉后，剪开颈部皮肤，暴露气管，气管远心端剪一小口，插入导管固定，注入预冷的生理盐水1ml，停留约30s后回抽，灌洗3次；BALF回收率70％-90％，将灌洗液1500r/min离心10min，取上清液行ELISA检测BALF中TNF-α、IL-1β水平，按说明书操作。
进一步，所述检测各项指标后，进行统计学处理，
计量资料以均数士标准差(x±s)表示，采用SPSS17.0for windows软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，LSD法进行进一步组间两两比较；P＜0.05为差异显著性有统计学意义。
进一步，所述随机分的5组包括：
(1)假手术组A：小鼠暴露气管后，气管滴入生理盐水；
(2)模型组B：一次性气管内缓慢滴入BLM 5mg/kg；
(3)阳性对照组C：一次性气管注入BLM 5mg/kg，每天1次腹腔注射2.5mg/kg/d的地塞米松磷酸钠生理盐水稀释液；
(4)GPS低剂量组D2.5：一次性气管注入BLM 5mg/kg，每天行腹腔注射2.5mg/kg.d的GPS生理盐水稀释液；
(5)GPS高剂量组D10：一次性气管注入BLM 5mg/kg，每天行腹腔注射10mg/kg.d的GPS生理盐水稀释液。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述抗肺纤维化药物制备的龙胆苦苷片剂。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述抗肺纤维化药物制备的龙胆苦苷丸剂。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述抗肺纤维化药物制备的龙胆苦苷注射剂。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述抗肺纤维化药物制备的龙胆苦苷吸入剂。
本发明的优点及积极效果为：
本发明提供的龙胆苦苷是一种裂环烯醚萜苷类化合物，分子式为C16H20O9，广泛分布于龙胆属植物中。本发明在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠动物模型上，证实了龙胆苦苷能够明显减轻肺纤维化病理改变，降低支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β水平，降低肺组织羟脯氨酸含量，下调肺组织促纤维化因子TGF-β和CTGF的表达，减轻肺组织胶原纤维沉积，延缓肺纤维化进程，并呈一定的时间和剂量依赖性。本发明可为进一步的抗肺纤维化药物研发提供的强有力的理论基础和实践基础，具有重要的研发价值和开发意义。
本发明证实了龙胆苦苷能够明显减轻肺纤维化病理程度，延缓肺纤维化进展，可为龙胆苦苷抗肺纤维化的应用，研发出了具有我国自主知识产权的经济、高效、低毒的抗肺纤维化药物。
(1)本发明采用龙胆苦苷制备的抗肺纤维化药物成本较低(我国龙胆属植物资源丰富，龙胆苦苷易于获取)。
(2)本发明采用龙胆苦苷制备的抗肺纤维化药物每日给药1次即可明显减轻小鼠肺纤维化病理程度，延缓肺纤维化进展。
(3)本发明采用龙胆苦苷制备的抗肺纤维化药物不会引起肝毒性，而且龙胆苦苷本身还具有保肝作用，因此采用龙胆苦苷制备的抗肺纤维化药物还可用于伴有肝脏疾病的肺纤维化。
附图说明
图1是本发明实施例提供的验证抗肺纤维化药物疗效的动物模型构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的龙胆苦苷减轻肺纤维化小鼠肺组织病理改变图(HE×100)；
图中：A:假手术组；B:肺纤维化模型组；C:阳性对照组(地塞米松)；D 2.5：龙胆苦苷低剂量组(GPS 2.5mg/kg)；D 10：龙胆苦苷高剂量组(GPS 10mg/kg)。
图3是本发明实施例提供的龙胆苦苷减轻肺纤维化小鼠肺组织胶原纤维沉积图(Masson×200)；
图中：A:假手术组；B:肺纤维化模型组；C:阳性对照组(地塞米松)；D 2.5：龙胆苦苷低剂量组(GPS 2.5mg/kg)；D 10：龙胆苦苷高剂量组(GPS 10mg/kg)。
图4是本发明实施例提供的龙胆苦苷减轻肺纤维化小鼠肺组织超微病理改变图(电镜)；
图中：A:假手术组；B:肺纤维化模型组；C:阳性对照组(地塞米松)；D 10：龙胆苦苷高剂量组(GPS 10mg/kg)。
图5是本发明实施例提供的龙胆苦苷下调肺纤维化小鼠肺组织CTGF及TGF-β蛋白表达图。
图中：(a)是龙胆苦苷下调肺纤维化小鼠肺组织TGF-β蛋白表达定量图；(b)是龙胆苦苷下调肺纤维化小鼠肺组织CTGF蛋白表达定量图；(c)是各组肺组织TGF-β和CTGF蛋白印记原始图；其中，A:假手术组；B:肺纤维化模型组；C:阳性对照组(地塞米松)；D 2.5：龙胆苦苷低剂量组(GPS 2.5mg/kg)；D 10：龙胆苦苷高剂量组(GPS 10mg/kg)。与A组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与B比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与C组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型上，首次评价了龙胆苦苷的抗肺纤维化作用，结果发现龙胆苦苷能够明显减轻小鼠肺纤维化程度，延缓肺纤维化进程。本发明可为龙胆苦苷抗肺纤维化的应用，以及进一步的抗肺纤维化药物研发提供的强有力的理论基础和实践基础，有望研发出具有我国自主知识产权的经济、高效、低毒的抗肺纤维化药物。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。
本发明实施例提供的抗肺纤维化药物，所述抗肺纤维化药物由龙胆苦苷组成。
本发明实施例提供的如抗肺纤维化药物的制备方法包括：
如图1所示，本发明实施例提供的验证抗肺纤维化药物疗效的动物模型的构建方法，包括：
S101：实验动物分组与处理：SPF级健康雄性昆明小鼠150只，体重20±2g；随机分为5组；每组30只，于术后7d、14d和28d分3期各处死10只，其中5只行气管灌洗收集肺泡灌洗液检测，另5只取肺组织行病理学、HYP及Western blot检测。
S102：肺纤维化模型建立：实验小鼠用4％水合氯醛10μl/g体重腹腔注射麻醉，仰卧固定；无菌条件下，颈前正中切开颈部皮肤、暴露气管，用无菌注射器经气管软骨环间隙注入BLM 5mg/kg，注药后将小鼠直立左右抖动并旋转使BLM均匀分布于肺内，缝合切口，置于SPF动物室内饲养分析；分别于术后7d、14d和28d后处死，检测各项指标。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
1主要试剂及仪器
BLM(浙江省海正辉瑞制药有限公司，批号16033811)，GPS(上海金穗生物科技有限公司，HPLC≥98％，批号20160922)，地塞米松磷酸钠注射液(遂成药业股份有限公司，批号20160910)。羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)试剂盒(碱水解法)(南京建成生物工程研究所，批号20170602)，Masson三色染色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司，批号1612168008)，ELISA检测试剂盒为小鼠TNF-α(invitrogen,Cat No.BMS607-3，LotNo.150362013)和小鼠IL-1β(ProteinTech Group,Inc.Cat No.KE10003)，Western blot抗体为兔抗小鼠TGF-β抗体(abcam，Cat No.ab179695，Lot No.GR262076-7)及CTGF抗体(abcam，Cat No.ab6992)，GAPDH(ProteinTech Group,Inc.Cat No.10494-1-AP)，二抗HRP-IgG(ProteinTech Group,Inc.Cat No.SA00001-2)，Stripping buffer(beyotime,CatNo.P0025)。微量进样器(50ul，上海安亭微量进样器厂)，Multiskan GO酶标仪(Thermoscientific)，FluorChem E System凝胶成像系统(American Protein Simple)，日本JEM-1011型透射电镜，Nikon eclipse Ni自动显微镜。
2实验动物分组与处理
SPF级健康雄性昆明小鼠150只，体重(20±2)g，由昆明医科大学实验动物中心提供。随机分为5组：(1)假手术组(Group A)：小鼠暴露气管后，气管滴入生理盐水；(2)模型组(Group B)：一次性气管内缓慢滴入BLM 5mg/kg；(3)阳性对照组(Group C)：一次性气管注入BLM 5mg/kg，每天1次腹腔注射地塞米松磷酸钠(2.5mg/kg/d)生理盐水稀释液；(4)GPS低剂量组(Group D2.5)：一次性气管注入BLM 5mg/kg，每天行腹腔注射GPS(2.5mg/kg.d)生理盐水稀释液；(5)GPS高剂量组(Group D10)：与低剂量组处理方法相似，其GPS给药剂量为10mg/kg.d。每组30只，于术后7d、14d和28d分3期各处死10只，其中5只行气管灌洗收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)检测，另5只取肺组织行病理学、HYP及Western blot等检测。
3肺纤维化模型建立
实验小鼠用4％水合氯醛10μl/g体重腹腔注射麻醉，仰卧固定。无菌条件下，颈前正中切开颈部皮肤、暴露气管，用无菌注射器经气管软骨环间隙注入BLM5mg/kg，注药后将小鼠直立左右抖动并旋转使BLM均匀分布于肺内，缝合切口，置于SPF动物室内饲养观察。分别于术后7d、14d和28d后处死，检测各项指标。
4肺组织HYP含量测定
于术后7d、14d及28d，每组各取5只小鼠，麻醉后开胸取出左肺上叶称取50mg湿重肺组织，采用碱水解法测定肺组织HYP含量，严格按试剂盒说明书操作。
5肺组织形态学观察
将麻醉处理的小鼠在活体状态下，于冰上快速切取左肺下叶薄片组织，2.5％戊二醛溶液固定后行电子显微镜观察；余下左肺组织以10％中性甲醛固定24h后，常规石蜡包埋、切片，HE及Masson染色行光学显微镜观察。
6Western blot检测肺组织TGF-β及CTGF蛋白含量
将各组小鼠的右肺叶组织取出，标本离体后冰上常规匀浆、离心制备组织蛋白抽提液，以BCA法检测总蛋白含量并定量变性。上样变性蛋白(40μg/孔)于12％SDS-PAGE电泳，半干式转膜(PVDF膜，15v恒压30min)，5％脱脂奶粉TBST封闭液封闭2h，TBST缓冲液充分振荡清洗，分别滴加一抗(TGF-β1:1000，CTGF 1：1000，GAPDH 1：10000)及二抗(HRP-IgG，1:10000)，DAB显色，FluorChem E System拍照，ScnImage软件进行图像分析，与内参条带灰度比值表示其蛋白相对表达量。先行CTGF显影后，stripping buffer洗膜5min后继续5％脱脂奶粉封闭等过程，再次显影GAPDH蛋白。
7ELISA测定BALF中TNF-α、IL-1β含量
每组另取5只小鼠分别于术后7d、14d及28d处理，麻醉后，剪开颈部皮肤，暴露气管，气管远心端剪一小口，插入导管固定，注入预冷的生理盐水1ml，停留约30s后回抽，灌洗3次。BALF回收率70％-90％，将灌洗液1500r/min离心10min，取上清液行ELISA检测BALF中TNF-α、IL-1β水平，按说明书操作。
8统计学处理
计量资料以均数士标准差(x±s)表示，采用SPSS17.0for windows软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，LSD法进行进一步组间两两比较。P＜0.05为差异显著性有统计学意义。
本发明采用气管滴入博来霉素制备肺纤维化小鼠动物模型，此模型是一种经济、稳定、可靠的经典肺纤维化急性动物模型，在此模型上采用多个检测指标包括肺组织病理形态、超微结构变化、胶原纤维沉积、肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β以及肺组织羟脯氨酸含量和TGF-β1、CTGF蛋白表达，证实了龙胆苦苷能够明显减轻肺纤维化病理程度，延缓肺纤维化进展，技术方法成熟、稳定、可靠，结果客观真实，可行性和重复性好。本发明可为龙胆苦苷抗肺纤维化的应用，以及进一步的抗肺纤维化药物研发提供的强有力的理论基础和实践基础，研发出了具有我国自主知识产权的经济、高效、低毒的抗肺纤维化药物。
下面结合具体分析对本发明作进一步描述。
1)各组小鼠肺组织HYP含量变化
与A组比，气管内滴入BLM 7d、14d及28d后，B组小鼠肺组织中HPY含量均明显增加(P＜0.01)。与B组相比，术后14d及28d，D2.5及D10干预组肺组织中HYP含量均显著降低(P＜0.01)且高剂量组下降更明显、疗效与C组相当(P＞0.05)，见表1。结果表明小鼠肺纤维化模型制备成功，GPS能减轻小鼠肺纤维化程度且疗效随剂量增高而增强。
表1龙胆苦苷降低肺纤维化小鼠肺组织HYP含量
A:假手术组；B:肺纤维化模型组；C:阳性对照组(地塞米松)；D 2.5：龙胆苦苷低剂量组(GPS 2.5mg/kg)；D 10：龙胆苦苷高剂量组(GPS 10mg/kg)。与A组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与B组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与C组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。
2)各组小鼠肺组织形态学变化
HE染色发现：A组及C组肺组织基本正常，少数肺泡壁轻微增厚及炎性细胞浸润。B组局部肺叶呈片状实变，肺泡腔广泛性缩小甚至消失，肺泡壁明显增宽，大量炎性细胞浸润肺泡间质及肺泡腔，肺泡壁毛细血管扩张、淤血，以术后28d尤为明显。GPS干预组可见散在小片状肺泡壁增宽，肺泡壁内细胞数增多，可见淋巴细胞、浆细胞、泡沫细胞，肺泡壁毛细血管扩张、淤血，细支气管上皮增生、部分腔内可见脱落坏死的上皮细胞；其中高剂量组病变较轻且术后28天明显好转。见图2。
Masson染色发现：A组及C组肺内胶原纤维分布基本正常，肺泡壁及血管周围可见少量的胶原纤维(蓝色)；B组，肺内胶原纤维大量增生，部分呈片状分布，肺泡间隔增厚，28d时肺外周带纤维组织增生尤为明显。龙胆苦苷干预组(D2.5和D10组)，与A组及C组相比，其肺内网状纤维数量增多、分布更广，但较B组明显减轻且高剂量组病变更轻微。见图3。
肺组织电子显微镜结果发现：A组肺泡上皮细胞结构完整、细胞微绒毛丰富、细胞间连接紧密，血管内皮细胞及基膜完整。B组，Ⅰ型肺泡上皮细胞变性，部分细胞浆变窄或崩解脱落；Ⅱ型肺泡上皮细胞数量减少、细胞微绒毛稀少，肺泡间隔明显；毛细血管内皮细胞肿胀、管腔淤血、细胞间连接减少；在纤维化较重者，部分区域内皮细胞与基底膜的连续性破坏、纤维条索向肺泡上皮下和毛细血管基底膜内生长。D10组可改善以上病变，但不及C组改善明显。见图4。
3 ELISA检测小鼠BALF中TNF-α、IL-1β含量
与A组相比，同期B组小鼠BALF中TNF-α、IL-1β含量均明显升高，尤其术后14d升高最明显(P＜0.05)。与B组相比，同期龙胆苦苷干预组小鼠BALF中TNF-α、IL-1β含量则明显降低，且高剂量组比低剂量组降低更为显著(P＜0.01)，D10组与C组疗效接近(P＞0.05)，见表2。结果表明GPS可减轻模型小鼠肺支气管组织炎症病变，且呈现一定的时间及量效关系。
表2龙胆苦苷降低肺纤维化小鼠BALF中TNF-α、IL-1β含量
A:假手术组；B:肺纤维化模型组；C:阳性对照组(地塞米松)；D 2.5：龙胆苦苷低剂量组(GPS 2.5mg/kg)；D 10：龙胆苦苷高剂量组(GPS 10mg/kg)。与A组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与B比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与C组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。
4 Western blot检测小鼠肺组织TGF-β及CTGF蛋白含量
与A组和C组相比，同期B组小鼠肺组织中TGF-β及CTGF蛋白相对含量均明显增加(P＜0.01)。与B组相比，D10组于术后各时期，以上蛋白的表达均显著降低(P＜0.01)；但D2.5组，仅术后28d可明显下调TGF-β的表达(P＜0.01)。与C组相比，D10组多数疗效与其接近(P＞0.5)。见表3、图5。结果表明PF模型小鼠肺组织中TGF-β及CTGF蛋白明显升高，高剂量GPS可显著降低两者的含量。
表3龙胆苦苷下调肺纤维化小鼠肺组织TGF-β及CTGF蛋白表达
A:假手术组；B:肺纤维化模型组；C:阳性对照组(地塞米松)；D 2.5：龙胆苦苷低剂量组(GPS 2.5mg/kg)；D 10：龙胆苦苷高剂量组(GPS 10mg/kg)。与A组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与B比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与C组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗肺纤维化药物，其特征在于，所述抗肺纤维化药物为龙胆苦苷。
2.一种如权利要求1所述抗肺纤维化药物的制备方法，其特征在于，所述抗肺纤维化药物的制备方法包括：
(1)将龙胆苦苷用微量分析天平准确称量后,用医用无菌生理盐水配制成0.05％的龙胆苦苷注射液；
(2)采用0.22μm微孔滤膜将配制的龙胆苦苷注射液进行过滤除菌；
(3)将滤过除菌的龙胆苦苷注射液分装于高压灭菌的容器内；
(4)将分装的龙胆苦苷注射液置于-20℃冰箱保存，临用前取出融化。
3.一种验证权利要求1所述抗肺纤维化药物疗效的动物模型的构建方法，其特征在于，所述动物模型的构建方法包括：
实验动物分组与处理：
SPF级健康雄性昆明小鼠150只，体重20±2g；随机分为5组；每组30只，于术后7d、14d和28d分3期各处死10只，其中5只行气管灌洗收集肺泡灌洗液检测，另5只取肺组织行病理学、HYP及Western blot检测；
肺纤维化模型建立：
实验小鼠用4％水合氯醛10μl/g体重腹腔注射麻醉，仰卧固定；无菌条件下，颈前正中切开颈部皮肤、暴露气管，用无菌注射器经气管软骨环间隙注入BLM5mg/kg，注药后将小鼠直立左右抖动并旋转使BLM均匀分布于肺内，缝合切口，置于SPF动物室内饲养分析；分别于术后7d、14d和28d后处死，检测各项指标。
4.如权利要求3所述的动物模型的构建方法，其特征在于，所述检测各项指标，包括：
肺组织HYP含量测定：
于术后7d、14d及28d，每组各取5只小鼠，麻醉后开胸取出左肺上叶称取50mg湿重肺组织，采用碱水解法测定肺组织HYP含量，严格按试剂盒说明书操作；
肺组织形态学分析：
将麻醉处理的小鼠在活体状态下，于冰上快速切取左肺下叶薄片组织，2.5％戊二醛溶液固定后行电子显微镜分析；余下左肺组织以10％中性甲醛固定24h后，常规石蜡包埋、切片，HE及Masson染色行光学显微镜分析；
Western blot检测肺组织TGF-β及CTGF蛋白含量：
将各组小鼠的右肺叶组织取出，标本离体后冰上常规匀浆、离心制备组织蛋白抽提液，以BCA法检测总蛋白含量并定量变性；40μg/孔上样变性蛋白于12％SDS-PAGE电泳，半干式转膜，5％脱脂奶粉TBST封闭液封闭2h，TBST缓冲液充分振荡清洗，分别滴加一抗及二抗，DAB显色，FluorChem E System拍照，ScnImage软件进行图像分析，与内参条带灰度比值表示其蛋白相对表达量；先行CTGF显影后，stripping buffer洗膜5min后继续5％脱脂奶粉封闭过程，再次显影GAPDH蛋白；
ELISA测定BALF中TNF-α、IL-1β含量：
每组另取5只小鼠分别于术后7d、14d及28d处理，麻醉后，剪开颈部皮肤，暴露气管，气管远心端剪一小口，插入导管固定，注入预冷的生理盐水1ml，停留约30s后回抽，灌洗3次；BALF回收率70％-90％，将灌洗液1500r/min离心10min，取上清液行ELISA检测BALF中TNF-α、IL-1β水平，按说明书操作。
5.如权利要求3所述的动物模型的构建方法，其特征在于，所述检测各项指标后，进行统计学处理，
计量资料以均数士标准差表示，采用SPSS17.0for windows软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，LSD法进行进一步组间两两比较；P＜0.05为差异显著性有统计学意义。
6.如权利要求3所述的动物模型的构建方法，其特征在于，所述随机分的5组包括：
(1)假手术组A：小鼠暴露气管后，气管滴入生理盐水；
(2)模型组B：一次性气管内缓慢滴入BLM 5mg/kg；
(3)阳性对照组C：一次性气管注入BLM 5mg/kg，每天1次腹腔注射2.5mg/kg/d的地塞米松磷酸钠生理盐水稀释液；
(4)GPS低剂量组D2.5：一次性气管注入BLM 5mg/kg，每天行腹腔注射2.5mg/kg.d的GPS生理盐水稀释液；
(5)GPS高剂量组D10：一次性气管注入BLM 5mg/kg，每天行腹腔注射10mg/kg.d的GPS生理盐水稀释液。
7.一种利用权利要求1所述抗肺纤维化药物制备的龙胆苦苷片剂。
8.一种利用权利要求1所述抗肺纤维化药物制备的龙胆苦苷丸剂。
9.一种利用权利要求1所述抗肺纤维化药物制备的龙胆苦苷注射剂。
10.一种利用权利要求1所述抗肺纤维化药物制备的龙胆苦苷吸入剂。
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