CN114632146A - 一种用于子宫内膜修复的温敏型复合水凝胶制剂的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于子宫内膜修复的温敏型复合水凝胶制剂的制备方法及其应用，包含如下步骤：S1，制备胶原蛋白溶液，并在低温条件下保存备用；S2，制备自体PRP；S3，培养和扩增间充质干细胞；S4，将PRP和间充质干细胞混合制得PRP和间充质干细胞悬浮液，并置于低温条件下保存备用；S5，在低温下，将胶原蛋白溶液与PRP和间充质干细胞悬浮液混合制得温敏型胶原蛋白复合水凝胶制剂，并置于低温下保存，同时还公开了该制剂的应用。该发明的制剂可以有效促进子宫内膜的修复，缩短子宫内膜修复时间，提高修复效果，减少瘢痕组织形成，同时温敏性的特点，提高了操作的方便性。
Description
技术领域
本发明涉及用于子宫内膜的治疗药剂，尤其是一种用于子宫内膜修复的温敏型复合水凝胶制剂的制备方法及其应用。
背景技术
子宫内膜损伤是妇产科非常常见的组织病变，一般是由于手术损伤或炎症引起，如刮宫术、流产术、子宫内膜炎症等。子宫内膜损伤常见于宫腔粘连、薄型子宫等妇产科疾病。子宫内膜损伤会导致继发性闭经、不孕、习惯性流产等。据文献报道，人工流产术、刮宫术导致的宫腔粘连的发生率高达25％-30％。且术后再粘连复发的概率非常高。目前国内外宫腔粘连的标准疗法是宫腔镜下粘连分离术联合术后人工周期促进内膜再生。这种治疗方法可以有效恢复宫腔形态，缓解临床症状，但对重度粘连的患者效果有限。术后主要是由于子宫内膜再生障碍而导致粘连复发。因此，目前对于重度宫腔粘连和子宫内膜较薄导致的不孕和反复流产治疗是一个非常大的挑战。解决问题的关键在于防止粘连，同时促进损伤内膜的再生。内膜损伤会导致基底层干细胞减少和功能受损，子宫内膜无法完全再生，导致内膜瘢痕性修复，久而久之引发宫腔粘连的发生。因此治疗的关键是促进内膜的再生和修复，而内膜的再生需要良好的微环境，包括种子细胞、细胞赖以生存的架构和营养等。本发明公开了一种促进子宫内膜修复的温敏型胶原蛋白水凝胶制剂，胶原蛋白水凝胶温敏性的特点可以实现低温条件下注射，生理温度下固化，固化后可以起到物理隔离的作用，防止粘连的再发生，同时高度的生物活性和再生能力可以有效促进子宫内膜的再生，解决因内膜修复不完善引起的宫腔粘连、子宫内膜薄等问题，从而从根源上解决久治不孕、反复流产的问题。
发明内容
针对现有的不足，本发明提供一种用于子宫内膜修复的温敏型复合水凝胶制剂的制备方法及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于子宫内膜修复的温敏型复合水凝胶制剂的制备方法，包含如下步骤：
S1，制备胶原蛋白溶液，并置于0-10℃条件下保存备用；
S2，制备血小板含量在300-1000*103/ul的自体PRP；
S3，培养和扩增间充质干细胞；
S4，将PRP和间充质干细胞混合制得PRP和间充质干细胞悬浮液，并置于0-10℃条件下保存备用；
S5，在0-10℃温度下，将胶原蛋白溶液与PRP和间充质干细胞悬浮液混合制得温敏型胶原蛋白复合水凝胶制剂，并置于0-10℃条件下保存。
作为优选，所述胶原蛋白溶液通过如下步骤制得:
S1a,采集动物身体含有胶原蛋白的组织；
S1b，对采集的动物身体组织依次进行脱脂、酶解、盐析、透析后在酸性条件下溶解，并将其用纯水稀释成重量百分比浓度为1％-4％的溶液；
S1c，将S1b制得的溶液进行pH值的调节，调节其pH值为6.5-7.8。
作为优选，所述步骤S4中PRP和间充质干细胞的体积比为0.2-5:1。
作为优选，所述步骤S5中胶原蛋白溶液与PRP和间充质干细胞悬浮液的体积比为1-10:1。
作为优选，所述步骤S3中制得的间充质干细胞是间充质干细胞含量为0.3-5*107/ml的干细胞悬浮液。
作为优选，所述胶原蛋白复合水凝胶制剂在4℃温度下制备并保存，所述胶原蛋白溶液、PRP和间充质干细胞悬浮液均在4℃温度下保存。
作为优选，所述胶原蛋白复合水凝胶制剂是0-10℃温度下成液态的、在生理温度下固化成固态的凝胶。
作为优选，所述自体PRP的制备通过如下步骤制得：
S2a，采集自体血液至预先装有肝素钠或枸橼酸钠的血液采集管；
S2b，对采集的血液进行离心分离，去除下层的红细胞和上层的低浓度血小板血清，留取中间白膜层和少量红细胞获得自体PRP。
作为优选，所述间充质干细胞的培养和扩增包括如下步骤：
S3a，将P3-P8代次中任意一代次的间充质干细胞以1-2*106的密度接种于细胞培养瓶中，然后向其中加入完全培养基，在温度为37℃下，5％CO2培养箱中进行培养，并周期性进行换液，直到细胞生长融合度达到85％-90％；
S3b，用胰酶对间充质干细胞消化，之后离心进行计数并传代培养至P5-P10；
S3c，收集间充质干细胞悬浮液，经离心后用完全培养基稀释到含量为0.3-5*107/ml的间充质干细胞悬浮液。
一种用于子宫内膜修复的温敏型复合水凝胶制剂的应用,将前述任意一项所制得的胶原蛋白复合水凝胶制剂在制备后12小时内注射进子宫。
本发明的有益效果在于：该发明的温敏型胶原蛋白复合水凝胶制剂可以有效促进子宫内膜的修复和再生，其中胶原蛋白经过多重工艺制得，保留了胶原蛋白完整的三螺旋结构和生物活性，同时高度去端肽的特性，使其免疫原性非常低，提高了使用的安全性和有效性，可以为细胞的黏附和内膜的再生提供空间支架，胶原蛋白复合凝胶中富含丰富的支架、因子和细胞，为内膜再生创造了良好的再生微环境，加快内膜再生和微血管的再生，防止子宫内膜的纤维化；PRP作为大量细胞因子和生长因子的来源，降低成本、提高效果，同时也可避免不必要的免疫排斥反应的发生，可以有效抑制局部炎症，在激活后分泌细胞因子和生长因子等，增强内膜修复效果；间充质干细胞作为再生的种子细胞，具有高度增殖能力和低免疫原性，可以弥补内源性干细胞的不足，促进内膜再生、血管再生等，可以有效促进子宫内膜的修复，缩短子宫内膜修复时间，提高修复效果，同时温敏型凝胶可注射的特点提高了操作的方便性，注射后可快速固化，提高临床操作的可行性，缩短手术时间，复合凝胶可固化的特点可以实现凝胶在病变部位的留存，为子宫内膜修复提供足够的时间，成胶后可以用于子宫内膜损伤，如常见的宫腔粘连，薄型子宫等，防止再生粘膜的粘连，预防宫腔粘连的复发，减少临床手术操作次数：胶原蛋白复合凝胶制剂植入后可以留存在子宫内膜损伤部位，促进修复的同时避免粘连的再发生，同时无需二次手术取出，克服传统治疗如宫内防止节育器、球囊导管等需多次手术的缺点。
附图说明
图1是本发明实施例的凝胶制剂在不同时间下促进负载干细胞生长和增殖的对比图；
图2是本发明实施例胶原蛋白溶液与PRP和间充质干细胞悬浮液不同混合比例下成胶情况比较图；
图3是本发明实施例凝胶制剂促进大鼠子宫内膜修复的对比图；
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例的目的、技术方案和优点，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明中，如图1中所示，种用于子宫内膜修复的温敏型复合水凝胶制剂的制备方法，包含如下步骤：
S1，制备胶原蛋白溶液，并置于0-10℃条件下保存备用，首先采集动物身体含有胶原蛋白的组织，可以是猪皮、牛肌腱等，将采集的动物身体组织经过脱脂、酶解、盐析、透析步骤后制得初步的胶原蛋白溶液，然后将该溶液在酸性条件下溶解，随后用纯水将其稀释到1％-4％的浓度，最后用适宜浓度的碱液调节其pH为6.5-7.8，置于4℃条件下保存备用，脱脂可以采用碱溶液或酸溶液浸泡实现；
S2，制备血小板含量在300-1000*103/ul的自体PRP，采集自体血液10-20ml至预先装有肝素钠或枸橼酸钠的血液采集管中，在3700rpm条件下离心，去除下层的红细胞和上层的低浓度血小板血清，留取中间白膜层和少量红细胞，最终获得PRP,其中血小板的含量为300-1000*103/ul；
S3，培养和扩增间充质干细胞，采用间充质干细胞为P3-P8代次中任意一代次的间充质干细胞，可以是脐带、胎盘、脂肪、骨髓、子宫内膜干细胞的一种或几种，将间充质干细胞用培养基悬浮，形成含量为0.3-5*107/ml的干细胞悬浮液，将间充质干细胞P3以1-2*106的密度接种于75cm2的细胞培养瓶中，然后向其中加入15-20ml DMEM/F12完全培养基，于37℃，5％CO2培养箱中进行培养，每2-3天换液一次，直到细胞生长融合度达到85％-90％，之后用含0.02％的0.25％的胰酶消化，然后进行1000rpm的离心，离心5min后进行计数和传代培养至P5-P10,收集细胞悬浮液，经离心后用完全培养基稀释到浓度为1-5*107/ml的间充质干细胞悬浮液；
S4，将PRP和间充质干细胞混合制得PRP和间充质干细胞悬浮液，并置于0-10℃条件下保存备用，将上述制备的PRP和间充质干细胞细胞悬浮液以体积比0.2-5：1的比例充分混合吹打均匀，制得PRP/干细胞悬浮液，置于4℃条件下保存备用；
S5，在0-10℃温度下，将胶原蛋白溶液与PRP和间充质干细胞悬浮液混合制得温敏型胶原蛋白复合水凝胶制剂，并置于0-10℃条件下保存，将上述制备的胶原蛋白溶液和PRP/干细胞悬浮液在4℃条件下预冷，然后将胶原蛋白溶液和PRP/干细胞悬浮液以1-10：1的比例混合，制得胶原蛋白复合水凝胶制剂，将其置于4℃条件下保存备用，即得到温敏型胶原蛋白复合凝胶制剂，其在0-10℃温度下成液态，在生理温度下固化成固态。这样胶原蛋白、PRP、干细胞就构建成了一种温度敏感响应性的凝胶系统，实现应用时的可注射性及注射后的固化，提高了临床操作的方便性，同时可固化的特点提高凝胶在内膜损伤部位的留存，起到物理隔离的同时，可促进子宫内膜的再生和修复，其中，胶原蛋白可以为内膜再生提供支架，招募内源性和外源性干细胞的迁移和增殖，促进损伤内膜的修复，PRP可以为再生提供多种生长因子和细胞因子，促进再生效果，外源性补充的干细胞可以解决因子宫内膜损伤导致的内源性干细胞的不足，如子宫内膜干细胞，从再生医学的角度重建子宫内膜再生微环境，从根本上解决久治不愈，易复发的问题，克服传统治疗方法促内膜再生能力差，需二次手术等的问题。
在使用时就在制备好凝胶制剂后的12h内，通过注射将其注入子宫，成胶后可以用于子宫内膜损伤，如常见的宫腔粘连，薄型子宫等，防止再生粘膜的粘连，预防宫腔粘连的复发，胶原蛋白复合物水凝胶制剂经宫腔镜手术植入到子宫内膜损伤部位后可以快速固化，黏附于子宫内膜损伤部位，起到物理隔离的同时，可有效促进子宫内膜的修复，促进内膜再生、微血管再生，重建子宫内膜功能层及基底层，解决现有临床子宫内膜损伤治疗效果差、瘢痕增生严重、易反复粘连等的问题，同时可注射和温敏的特点可显著提高临床的可操作性及缩短临床手术时间。
实施例的具体制备步骤如下：
(1)将猪皮肤组织进行清洗，然后经过酸处理、酶解、盐析、透析等步骤获得胶原蛋白溶液，最终将其溶解在酸溶液中，用纯水将其稀释到1％-4％的浓度，最后用适宜浓度的碱液调节其pH为6.5-7.8；
(2)取新鲜自体血液10mL于加有肝素钠或枸橼酸钠的血液采集管中，小心上下颠倒混合，然后在3700rpm条件下离心15min；用加长注射针小心吸除下层的红细胞，保留下层0.2-0.8ml的红细胞，随后小心吸除上层的血清，保留白膜层以上0.2-0.5ml的上清，即制得PRP,PRP中血小板计数约为300-1000*103/ul，约为全血血小板计数的2-4倍；
(3)将间充质干细胞复苏后接种于75cm2的培养瓶中，用DMEM/F12全培养基进行培养，至90％的融合度后用含0.02％的0.25％的胰酶消化，1000rpm离心5min后进行计数，然后加入适量培养基配成5*107/ml的细胞悬浮液；
(4)将步骤2制备的PRP和步骤3制备的间充质干细胞以1：1，及0.5：1的比例混合均匀，制得PRP/干细胞悬浮液；
(5)用1ml注射器小心吸取上述2.5％的胶原蛋白溶液，然后用200ul枪头吸取上述PRP/干细胞悬浮液适量加入到上述胶原蛋白溶液中，在注射器内反复抽拉混合均匀，其中胶原蛋白和PRP/干细胞的混合比例为1：1，2：1，3：1，4：1；
(6)上述溶液混合均匀后取1ml加入到西林瓶中，然后置于37℃水浴锅加热，不定时观察成胶情况，其成胶情况如图2中所示；
(7)每隔1分钟倒置西林瓶，观察溶液流动和成胶情况；约3min后即可观察到以2：1，3：1；4：1比例混合的成胶性良好，1：1混合的可成胶，凝胶强度稍低；
(8)将上述注射器中混合均匀的胶原蛋白复合水凝胶10ul加入到96孔板中，然后加入190ul DMEM/F12完全培养基，分别培养0，1，3，5，7天，到设定的时间，将培养基吸出，其中2-3天更换一次培养基，加入100ul新鲜培养基，让后向其中加入10ul CCK8溶液，置于培养箱中孵育1-2小时，然后将其内的溶液转移至新孔内，并用酶标仪测量450nm波长处的吸光度，通过吸光值判定细胞在其中的生长和增殖情况，结果如图1中所示；
(9)按照上述过程对大鼠进行眼角取血2ml,制备胶原蛋白复合水凝胶；通过95％的酒精灌注的方法构建大鼠宫腔粘连子宫损伤模型，然后向损伤子宫内注入200ul的胶原蛋白复合水凝胶，观察大鼠子宫内膜修复情况和怀孕情况，结果胶原加干细胞加PRP组表现出了更好的修复和怀孕情况，结果如图3中所示。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于子宫内膜修复的温敏型复合水凝胶制剂的制备方法，其特征在于:包含如下步骤：
S1，制备胶原蛋白溶液，并置于0-10℃条件下保存备用；
S2，制备血小板含量在300-1000*103/ul的自体PRP；
S3，培养和扩增间充质干细胞；
S4，将PRP和间充质干细胞混合制得PRP和间充质干细胞悬浮液，并置于0-10℃条件下保存备用；
S5，在0-10℃温度下，将胶原蛋白溶液与PRP和间充质干细胞悬浮液混合制得温敏型胶原蛋白复合水凝胶制剂，并置于0-10℃条件下保存。
2.根据权利要求1所述用于子宫内膜修复的温敏型复合水凝胶制剂的制备方法，其特征在于:所述胶原蛋白溶液通过如下步骤制得:
S1a,采集动物身体含有胶原蛋白的组织；
S1b，对采集的动物身体组织依次进行脱脂、酶解、盐析、透析后在酸性条件下溶解，并将其用纯水稀释成重量百分比浓度为1％-4％的溶液；
S1c，将S1b制得的溶液进行pH值的调节，调节其pH值为6.5-7.8。
3.根据权利要求1所述用于子宫内膜修复的温敏型复合水凝胶制剂的制备方法，其特征在于:所述步骤S4中PRP和间充质干细胞的体积比为0.2-5:1。
4.根据权利要求1所述用于子宫内膜修复的温敏型复合水凝胶制剂的制备方法，其特征在于:所述步骤S5中胶原蛋白溶液与PRP和间充质干细胞悬浮液的体积比为1-10:1。
5.根据权利要求1所述用于子宫内膜修复的温敏型复合水凝胶制剂的制备方法，其特征在于:所述步骤S3中制得的间充质干细胞是间充质干细胞含量为0.3-5*107/ml的干细胞悬浮液。
6.根据权利要求1所述用于子宫内膜修复的温敏型复合水凝胶制剂的制备方法，其特征在于:所述胶原蛋白复合水凝胶制剂在4℃温度下制备并保存，所述胶原蛋白溶液、PRP和间充质干细胞悬浮液均在4℃温度下保存。
7.根据权利要求1所述用于子宫内膜修复的温敏型复合水凝胶制剂的制备方法，其特征在于:所述胶原蛋白复合水凝胶制剂是0-10℃温度下成液态的、在生理温度下固化成固态的凝胶。
8.根据权利要求1所述用于子宫内膜修复的温敏型复合水凝胶制剂的制备方法,其特征在于:所述自体PRP的制备通过如下步骤制得：
S2a，采集自体血液至预先装有肝素钠或枸橼酸钠的血液采集管；
S2b，对采集的血液进行离心分离，去除下层的红细胞和上层的低浓度血小板血清，留取中间白膜层和少量红细胞获得自体PRP。
9.根据权利要求1所述用于子宫内膜修复的温敏型复合水凝胶制剂的制备方法,其特征在于:所述间充质干细胞的培养和扩增包括如下步骤：
S3a，将P3-P8代次中任意一代次的间充质干细胞以1-2*106的密度接种于细胞培养瓶中，然后向其中加入完全培养基，在温度为37℃下，5％CO2培养箱中进行培养，并周期性进行换液，直到细胞生长融合度达到85％-90％；
S3b，用胰酶对间充质干细胞消化，之后离心进行计数并传代培养至P5-P10；
S3c，收集间充质干细胞悬浮液，经离心后用完全培养基稀释到含量为0.3-5*107/ml的间充质干细胞悬浮液。
10.一种用于子宫内膜修复的温敏型复合水凝胶制剂的应用,其特征在于:将权利要求1至9任意一项所制得的胶原蛋白复合水凝胶制剂在制备后12小时内注射进子宫。
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|---|---|---|---|---|
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Cited By (8)
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|---|---|---|---|---|
| CN115531622A (zh) * | 2022-09-28 | 2022-12-30 | 四川师范大学 | 一种prp复合可注射水凝胶及其制备方法和用途 |
| CN115531622B (zh) * | 2022-09-28 | 2024-04-19 | 四川师范大学 | 一种prp复合可注射水凝胶及其制备方法和用途 |
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