CN118141984A - 一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents
一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶及其制备方法与应用。本发明的氧化还原敏感性生物活性水凝胶可实现干细胞有效递送和PRP生长因子的局部控释,调节内膜微环境,防止小鼠子宫内膜粘连并加速损伤内膜的修复。采用经巯基改性修饰的天然生物大分子tChi和tHA制备的水凝胶具有无免疫原性、可生物降解性和高生物活性等优点。与现有的临床上治疗宫腔粘连的商业化透明质酸钠水凝胶(G‑HA)相比,本发明制备的生物活性水凝胶在动物实验中表现出更优异的促子宫内膜修复能力。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料领域,特别涉及一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
多次宫内手术、感染、内膜炎症等易引起内膜损伤、子宫肌层病变并形成顽固型薄型子宫内膜,导致不孕、反复胚胎种植失败、习惯性流产及妊娠并发症患病风险增加等。药物如雌激素、促性腺激素、来曲唑、枸橼酸西地那非、己酮可可碱、维生素E和他莫西芬等可一定程度上提高子宫内膜厚度和胚胎着床率,但药物副作用明显且疗效有限,无法有效促进中重度损伤子宫内膜再生或改善妊娠结局,内膜粘连复发率高。
炎症、活性氧、pH等微环境是影响子宫内膜修复的主要因素,而O2-、H2O2、OH-等ROS上调导致内膜微环境中H2O2异常升高加剧炎症水平,导致内膜生理性修复无法正常完成,进而转向以纤维化为主的瘢痕修复。近年来,干细胞疗法和宫腔局部药物灌注已成为薄型子宫内膜治疗的研究热点。干细胞是一类具有自我更新和多向分化能力的细胞,在组织损伤修复过程中发挥旁分泌、免疫调节和促进再生修复等关键作用。局部注射可将干细胞直接输送至损伤部位,但细胞活力低、局部驻留时间短等问题极大的限制了其应用。PRP灌注治疗因其能够提供超过生理量的必要生长因子,可为愈合潜力低的组织修复提供再生刺激的作用,但生长因子突释及超生理剂量引起的安全性问题逐渐受到重视。随着组织工程与再生医学的发展,利用生物材料递送干细胞、生物活性因子或药物用于子宫内膜损伤修复治疗取得了显著效果,开辟了生物材料与传统治疗相结合的子宫内膜损伤修复新途径。
水凝胶是一类具有良好生物相容性、吸水性和包封性的亲水三维高分子网络,可为子宫内膜修复提供物理抗粘连屏障,其类细胞外基质结构可作为理想的细胞递送载体和宫内控释给药体系,具有广阔的应用前景。针对重度宫腔粘连、子宫氧化微环境及内膜再生障碍等关键问题,亟需一种具备氧化微环境响应并可同时作为干细胞和生物活性因子缓释作用的多功能水凝胶产品解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶的制备方法。
本发明的另一目的在于,提供上述制备方法制备得到的具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶。
本发明的再一目的在于,提供上述水凝胶的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶前驱液的制备方法,包括如下步骤:
(1)将壳聚糖溶于溶液,加入EDAC和NHS,避光搅拌,调节pH后反应,加入L-半胱氨酸后继续避光搅拌反应,透析,离心,干燥后得到巯基化壳聚糖(tChi);
(2)将透明质酸钠搅拌溶于溶液,加入EDAC搅拌,加入NHS继续搅拌,调节pH后避光反应,之后加入半胱氨酸反应,调节pH后继续避光搅拌反应,透析,干燥后得到巯基化透明质酸(tHA);
(3)将巯基化壳聚糖、巯基化透明质酸和β-GP分别溶解得到溶液,在β-GP溶液中加入巯基化透明质酸溶液并同时快速涡旋,再加入巯基化壳聚糖溶液,再次快速涡旋,得到具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶前驱液。
优选的,所述的制备方法中的步骤(3)为:
(3)将巯基化壳聚糖、巯基化透明质酸和β-GP分别溶解得到溶液,在β-GP溶液中加入巯基化透明质酸溶液并同时快速涡旋,再加入巯基化壳聚糖溶液,再次快速涡旋,之后加入活性物质,快速涡旋混匀,即得到具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶前驱液。
步骤(1)所述的溶液为乙酸溶液;优选为1%乙酸溶液。
步骤(1)所述的溶液与壳聚糖的比例为300~500mL﹕1g;优选为400mL﹕1g。
步骤(1)所述的EDAC的加入量以终浓度20~30mM计;优选为25mM。
步骤(1)所述的NHS的加入量以终浓度20~30mM计;优选为25mM。
步骤(1)所述的半胱氨酸与壳聚糖的质量比为0.5~1﹕1;优选为0.66﹕1。
步骤(1)所述的避光搅拌的时间为30~90min。
步骤(1)所述的避光搅拌的条件为室温,800~1000rpm。
步骤(1)所述的调节pH为调节pH至4.5~5.5。
步骤(1)所述的第一次反应的条件为反应1~3h。
步骤(1)所述的第二次反应的条件为反应20~30h。
步骤(1)所述的透析为使用MW 3000~4000的透析袋在pH 3~4的去离子水中透析。
步骤(1)所述的离心为3000~5000rpm离心。
步骤(2)所述的溶液为去离子水。
步骤(2)所述的溶液与透明质酸钠的比例为100~300mL﹕1g;优选为200mL﹕0.8g。
步骤(2)所述的EDAC的加入量以终浓度20~30mM计;优选为25mM。
步骤(2)所述的NHS的加入量以终浓度20~30mM计;优选为25mM。
步骤(2)所述的半胱氨酸与透明质酸钠的质量比为0.5~1﹕1;优选为0.5﹕1。
步骤(2)所述的第一次搅拌的条件为搅拌1~2h。
步骤(2)所述的第二次搅拌的条件为搅拌10~20min。
步骤(2)所述的第三次搅拌的条件为搅拌30~90min。
步骤(2)所述的第一次调节pH为调节pH至5~6。
步骤(2)所述的第二次调节pH为调节pH至4~5。
步骤(2)所述的第一次反应的条件为反应1~3h。
步骤(2)所述的第二次反应的条件为反应30~90min。
步骤(2)所述的第三次反应的条件为反应20~30h。
步骤(2)所述的透析为使用MW 3000~4000的透析袋,分别用pH 3.5的去离子水透析一天,用pH 3.5的1% NaCl水溶液透析一天,用pH 3.5的去离子水透析一天。
步骤(3)所述的巯基化壳聚糖溶液为将巯基化壳聚糖溶于乙酸溶液得到的;优选为0.1M的乙酸溶液。
步骤(3)所述的巯基化壳聚糖溶液的浓度为15~30mg/mL。
步骤(3)所述的巯基化透明质酸溶液为将巯基化透明质酸溶于水得到的。
步骤(3)所述的巯基化透明质酸溶液的浓度为15~30mg/mL。
步骤(3)所述的β-GP溶液为将β-GP溶于水得到的。
步骤(3)所述的β-GP溶液中β-GP与溶液的质量体积比为0.5~1﹕1;优选为0.58﹕1。
步骤(3)所述的巯基化透明质酸溶液、巯基化壳聚糖溶液、58%β-GP的体积比为1~2﹕1~2﹕1~2;优选为2﹕1﹕1。
步骤(3)中所述的快速涡旋为使用漩涡混匀仪快速涡旋10~15s。
步骤(3)所述的活性物质为PRP生长因子复合物和小鼠脂肪间充质干细胞(mADSCs)中的至少一种。
所述的PRP生长因子复合物与凝胶前驱液的体积比为1﹕4~10。
所述的PRP生长因子复合物的制备方法包括如下步骤:
小鼠外周血1000rpm离心10min后取上层清液、中间白膜层和下层3mm红细胞,继续3000rpm离心10min去除下层红细胞和上层的低浓度血小板血清,留取中间白膜层和少量红细胞,每毫升添加20U牛凝血酶,与10% CaCl2溶液按9:1体积混合,置于37℃培养箱中孵育40min,取出2000rpm离心10min,即得到PRP生长因子复合物。
所述的小鼠脂肪间充质干细胞与凝胶前驱液的比例为400~1500个﹕1微升。
所述的小鼠脂肪间充质干细胞为细胞融合度70~90%的对数期小鼠脂肪间充质干细胞。
一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶的制备方法,包括如下步骤:
(4)将具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶前驱液置于合适温度成胶后,即得到具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶。
步骤(4)中所述的成胶为置于35~40℃下成胶3~10min。
一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶或水凝胶前驱液,根据上述制备方法制备得到。
上述具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶或水凝胶前驱液在制备可递送活性物质的生物修复支架中的应用。
上述具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶或水凝胶前驱液在制备子宫内膜修复药物中的应用。
上述具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶或水凝胶前驱液在制备治疗宫腔粘连药物中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明的氧化还原敏感性生物活性水凝胶可实现干细胞有效递送和PRP生长因子的局部控释,调节内膜微环境,防止小鼠子宫内膜粘连并加速损伤内膜的修复。采用经巯基改性修饰的天然生物大分子tChi和tHA制备的水凝胶具有无免疫原性、可生物降解性和高生物活性等优点。PRP激活后血小板可释放血小板衍生生长因子(Platelet-derivedgrowth factor,PDGF)、表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)等多种生长因子和分化因子,促进组织坏死消退和趋化、细胞再生、增殖和迁移、细胞外基质合成、重构和血管生成。但在生理条件下,生长因子的半衰期短,而本发明制备的水凝胶可作为PRP来源的生长因子控释载体,通过体内透明质酸酶的酶解作用逐步降解水凝胶,从而实现生长因子的缓慢释放,有效延长PDGF、EGF和VEGF等PRP来源生长因子的作用时间。
(2)水凝胶的类细胞外基质结构可作为干细胞的理想载体,为子宫内膜修复提供外源性干细胞以促进损伤修复,而生长因子的有效控释可进一步维持干细胞在体内的高活性水平,加速内膜再生。另外,该水凝胶的温度敏感性及自愈合特点使其在室温条件可注射并在生理温度下加速凝胶化,为子宫内膜提供物理隔离屏障,大大提高了临床可操作性;壳聚糖良好的生物相容性、粘附性和抗菌性能,有利于水凝胶在宫腔内膜附着并降低宫内再次感染风险;透明质酸具有吸收创面分泌物、促进间充质干细胞迁移和调节损伤部位炎症反应的作用;而水凝胶提供的巯基经体内自由基氧化脱氢形成二硫键,从而减轻氧化微环境对蛋白质巯基的氧化作用并维持蛋白巯基的功能状态,维持子宫内较低水平的炎症和氧化微环境,为组织再生创造有利条件,促进功能性子宫内膜再生并减少疤痕形成,进而增加胚胎着床率,恢复生育能力。
(3)与现有的临床上治疗宫腔粘连的商业化透明质酸钠水凝胶(G-HA)相比,本发明制备的生物活性水凝胶在动物实验中表现出更优异的促子宫内膜修复能力。综上所述,本发明的氧化还原敏感性生物活性水凝胶通过提供外源性干细胞、生长因子持续释放并主动调控子宫内膜微环境,从而为子宫内膜损伤修复创造有利条件,加速子宫内膜再生修复,防止子宫内膜纤维化,抑制子宫疤痕形成并提高胚胎着床率。
附图说明
图1是水凝胶理化性能表征:水凝胶红外结构图谱(A)、外观(B)、形貌(C)、水凝胶压缩前后外观(D)、力学性能(E)、溶胀比(F)和均一性(G);H~I:流变仪测定水凝胶凝胶化时间(H)和结构恢复(I);自愈合性能(J)及组织粘附(K)测试。
图2是水凝胶对PRP来源生长因子的控释:水凝胶可显著延长PRP来源生长因子VEGF(A)、PDGF(B)和EGF(C)的释放时间。
图3是生物活性水凝胶对不同类型细胞增殖活性的影响:负载PRP生长因子的生物活性水凝胶可显著促进人静脉内皮细胞(hUVECs,A)及小鼠脂肪间充质干细胞(mADSCs,B)的细胞增殖活性。(数据显示为mean±SD;*P<0.05,***P<0.001,n=3)
图4是生物活性水凝胶对hUVECs的血管生成能力:不同处理组孵育6h后hUVECs的成管数(A)、节点数(B)、结点数(C)、成管总长度(D)和分支长度(E);24h后检测VEGF和HIF-1α的mRNA(F)和蛋白表达(G)。(数据显示为mean±SD;**P<0.01,****P<0.0001,n=3)
图5是小鼠子宫内膜组织学分析:(A)小鼠子宫大体观;(B)子宫内膜厚度、面积及腺体数量的HE染色结果;(C)Masson染色结果评估子宫内膜纤维化情况;(D)、(E)、(F)、(G)分别为为子宫内膜平均厚度、内膜面积、腺体数量、平均纤维化面积分析。纤维化面积的比值=子宫内膜纤维化面积/子宫内膜面积。(数据显示为mean±SD;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,n=6)
图6是小鼠子宫内膜免疫组织化学(IHC)染色分析:IHC分别检测血管内皮生长因子VEGF(A、F)、波形蛋白VIM(B、G)、细胞增殖核抗原Ki67(C、H)、血管内皮细胞表面标志物CD31(D、I)及细胞角蛋白CK19(E、J)在子宫内膜的表达。(数据显示为mean±SD;**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,n=6)
图7是妊娠第10天的小鼠子宫胚胎植入数量。(数据显示为mean±SD;**P<0.01,****P<0.0001,n=3)
图8是Western blot检测小鼠子宫内膜VEGF、VEGFR2、AKT、P-AKT以及BAD蛋白的表达(A)及定量分析(B)。(数据显示为mean±SD;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001n=3)
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
下面实施方案中若未注明具体试验条件,则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等,若无特殊说明,均为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1巯基化壳聚糖的制备及表征
1.1壳聚糖巯基化改性修饰
称取1g壳聚糖加入至400ml 1%乙酸溶液搅拌至充分溶解,往反应体系中分别加入1.917g EDAC和1.1509g NHS(工作浓度25mM),避光、室温搅拌反应1h后调节pH至5.0,待反应2h后加入0.660g L-半胱氨酸,避光、室温搅拌反应24h,pH维持在4.5~5.0;整个反应过程中搅拌速度控制在800~1000rpm。反应完成后,将反应液转移至透析袋(MW 3500)用pH3.5去离子水透析3~5天,每天至少换液2次,4000rpm低速离心去除沉淀,冷冻干燥后获得巯基化壳聚糖(tChi)并于4℃保存。
实施例2巯基化透明质酸的制备及表征
2.1透明质酸的巯基化改性修饰
将0.8g透明质酸钠加至200ml去离子水中,搅拌溶解1.5h后,室温避光加入0.96gEDAC(工作浓度25mmol/L),搅拌15min后加入0.576g NHS(工作浓度25mmol/L),继续搅拌1h后,调节pH至5.5,避光反应2h;往反应体系中按透明质酸钠与半胱氨酸1:1的投料比加入半胱氨酸0.8g,反应1h后,用0.1M HCl调节pH至4.75,室温避光反应24h;整个反应过程中搅拌速度控制在800~1000rpm。待反应完成后,将反应液转移至透析袋(MW 3500),用pH3.5的去离子水透析一天后更换为pH 3.5的1% NaCl水溶液透析一天,第三天再次更换为pH 3.5的去离子水透析,透析完成后冷冻干燥,得到巯基化透明质酸(tHA),4℃保存。
实施例3PRP的提取及活化
将小鼠外周血收集至枸橼酸钠抗凝管中,在1000rpm条件下离心10min,取上层清液,中间白膜层和下层3mm红细胞于另一离心管,3000rpm条件下离心10min去除下层的红细胞和上层的低浓度血小板血清,留取中间白膜层和少量红细胞,即为未激活的PRP。经检测,PRP的血小板含量≥1000×103/ul,约为全血血小板计数的4倍。将PRP与10% CaCl2溶液、牛凝血酶按9:1体积混合,每毫升PRP添加20U牛凝血酶,置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内40min,2000g/min离心10min,取富含生长因子复合物上清液于-80℃保存备用。
实施例4水凝胶的制备及表征
4.1水凝胶前驱液各组分的配制
4.1.1巯基化壳聚糖溶液的配制
称取适量实施例1制备的巯基化壳聚糖加入至0.1M乙酸溶液中,搅拌溶解3h后获得20mg/ml巯基化壳聚糖溶液。
4.1.2巯基化透明质酸溶液的配制
称取适量实施例2制备的巯基化透明质酸用去离子水搅拌溶解3h后,获得20mg/ml巯基化透明质酸溶液。
4.1.3β-GP溶液的配制
称取适量β-GP粉末,按58%的质量体积比将β-GP溶解于去离子水中,获得58%β-GP溶液。
4.2制备水凝胶
将巯基化透明质酸溶液、巯基化壳聚糖溶液、58%β-GP按2﹕1﹕1的体积比进行混合配成凝胶前驱液。具体操作为:
(1)取1份58%β-GP溶液,快速涡旋的同时加入2份巯基化透明质酸溶液,涡旋10~15s;
(2)往步骤(1)得到的溶液中加入1份巯基化壳聚糖溶液,再次快速涡旋10~15s,将各组分充分混匀获得凝胶前驱液(tHA-tChi);
(3)以1/8的体积比往步骤(2)得到的前驱液中加入实施例3制备的PRP生长因子复合物(PRP﹕tHA-tChi=1﹕8),得到含PRP生长因子复合物的凝胶前驱液,再次涡旋混匀后置于37℃5min加速成胶,得到具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶(tHA-tChi/PRP),为了使水凝胶形状更适合用于后续表征,将水凝胶前驱液直接注入合适的模具内,在37℃成胶5min并继续在37℃定型3h。
4.3水凝胶的理化性能表征
4.3.1水凝胶的红外吸收光谱分析
取适量冷冻干燥的水凝胶样品,用傅立叶变换红外光谱仪IRAffinity-1S(日本,岛津)检测水凝胶的红外吸收光谱。如图1(A)所示,tHA与tChi成功交联形成水凝胶。
4.3.2水凝胶外观及形貌
采用4.2的方法制备水凝胶,由图1(B)可见,交联成型的水凝胶呈光滑、规整的半透明果冻状。将水凝胶冷冻干燥后,扫描电镜观察水凝胶支架的横截面形貌,如图1(C)所示,水凝胶呈疏松多孔的结构。
4.3.3水凝胶的力学性能、溶胀比及均一性试验
(1)采用4.2的方法制备合适大小的圆柱形水凝胶,计算水凝胶的含水量及使用万能材料试验机进行水凝胶抗压强度测试。
(2)溶胀比测定:将冷冻干燥的水凝胶称重后(Wd)浸入37℃的PBS中在15min、30min、1h及之后每隔1小时对水凝胶样品进行称重,直至达到溶胀平衡(Ws)。通过以下公式计算溶胀率(SR):
(3)水凝胶均一性测定:将新鲜水凝胶均匀切成4块,称重并记录(Ww),将水凝胶样品冷冻干燥后再次称重并记录(Wd),计算水凝胶的干湿比。
压缩应力-应变曲线如图1(E)所示,当水凝胶被压缩至80%应变时,压缩应力能够维持一段时间而未发生快速下降,说明水凝胶具有良好的弹性性能。在PBS缓冲液中溶胀2小时后,水凝胶基本达到溶胀平衡。干湿比结果显示水凝胶均一性良好,见图1(G)。
4.3.4凝胶化时间及结构恢复测试
利用流变仪检测水凝胶的凝胶化时间及结构恢复情况。凝胶化时间测定:在37℃、5%应变和10rad/s角频率下,检测水凝胶储能模量及损耗模量随时间的变化曲线,监测凝胶化时间点。结构恢复测试方式:在一定的时间和温度(37℃)程序下,检测交替应变分别为5%和1000%、角频率为10rad/s时水凝胶的振荡剪切应变动态变化,以时间为横坐标绘制测试模量的动态变化图。结果如图1(H)所示,水凝胶预混后成胶时间约为5min,成胶后用高应变(1000%)破坏水凝胶分子链的网络结构,并考察其在恢复低应变(5%)条件时的自修复性能。在三个断裂和恢复循环中,水凝胶断裂的内部结构能够快速恢复(图1I),提示水凝胶具有一定的自修复性能。
4.3.5水凝胶自愈合试验
采用4.2的方法制备水凝胶,成胶后将其断成2段,随后将2段水凝胶拼接在一起,15min后施加外力,观察凝胶结界处是否产生断裂。如图1(J)所示,在水凝胶接触15min后,凝胶结界处自行愈合,无断裂。
4.3.6水凝胶的组织粘附性检测
采用4.2的方法制备水凝胶,将片状水凝胶置于皮肤组织表面,待其完全成胶后,弯曲、扭动水凝胶,然后将水凝胶完全浸入PBS溶液中,观察水凝胶的组织粘附状态。如图1(K)所示,在施加弯曲和扭动外力后,水凝胶仍能维持表面的平整并牢固粘附于皮肤表面不脱落,表明其具有良好的粘附性能。
实施例5水凝胶负载生长因子的缓释作用评估
采用实施例4中4.2的方法制备水凝胶,用连续加样器将水凝胶平铺于24孔板(每孔水凝胶的体积为200μl,PRP﹕tHA-tChi=1﹕8,即PRP体积为22.2μl),置于37℃成胶并稳定3h左右,随后加入500μl无血清培养基并放入37℃培养箱,分别于第1天、第2天、第3天、第5天、第10天收集80μl培养基用于生长因子测定,每次取样后重新补充80μl培养基。对照组为单纯PRP,即在24孔板里每孔加入500μl无血清培养基和与tHA-tChi/PRP组中PRP含量相当的PRP(22.2μl)。用ELISA试剂盒检测生长因子(PDGF、EGF、VEGF)的含量,计算生长因子累积释放量。单纯PRP生长因子在第1天即达到最大释放量,而水凝胶内负载的PRP生长因子释放量呈缓慢增长趋势,在2~4天内累计释放量超过单纯PRP的累计释放(见图2),表明该水凝胶具有良好的PRP生长因子控释能力。
实施例6水凝胶的生物活性评估
6.1细胞增殖试验
6.1.1分别用含10% FBS的DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基重悬人脐带静脉内皮细胞(hUVECs)、小鼠脂肪间充质干细胞(mADSCs)并接种于T25细胞培养瓶;培养2~3天后,hUVECs、mADSCs细胞生长至对数期、细胞融合度接近70%~90%时备用。
6.1.2采用实施例4中4.2的方法制备tHA-tChi和tHA-tChi/PRP水凝胶并平铺于96孔板底部(50μl/孔),置于37℃成胶5min并放置3h左右,成胶后接种细胞前,每孔加入200μl完全培养基平衡30min。
6.1.3分别收集70%~90%融合度的hUVECs、mADSCs并接种于水凝胶表面,细胞接种密度分别为5000个/孔和3000个/孔,分别用含10% FBS的DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基培养24h、48h、72h后,采用CCK8检测各组细胞增殖活性。在tHA-tChi/PRP上hUVECs细胞和mADSCs细胞的增殖活性明显高于tHA-tChi上的细胞(图3)。
6.2体外细胞血管生成试验
采用孔径为3μm,6孔transwell小室进行血管生成试验,设置6个分组:1)BLANK;2)PRP;3)mADSCs;4)tHA-tChi水凝胶;5)tHA-tChi/PRP水凝胶;6)mADSCs/tHA-tChi/PRP水凝胶。
其中组1为空白对照组(BLANK),将hUVECs以1.0×105个/孔的密度接种在transwell上室;组2为PRP对照组,将含22.2μl PRP的200μl无血清培养基加至上室;组3为mADSCs对照组,将mADSCs以1.0×105个/孔的密度接种于上室;组4、5采用实施例4中4.2的方法制备tHA-tChi和tHA-tChi/PRP水凝胶(200μl)分别铺于上室;组6是将实施例4中4.2的步骤(3)制备得到的凝胶前驱液与mADSCs混合均匀后37℃成胶5min得到的水凝胶(200μl,mADSCs细胞的加入量为500个/μl)铺于上室。transwell的下室统一接种hUVECs,接种密度为2.0×105个/孔,各组transwell的上室、下室共培养24h后,分别收集各处理组的hUVECs并将细胞接种在基质凝胶包被的96孔板中,细胞接种密度为2×104个/孔,在37℃下孵育6h,倒置显微镜拍照。通过Image J计算结点数、总管长度和总分支长度评价血管生成能力。收集共培养24h后hUVECs的总蛋白和RNA,检测血管生成相关因子VEGF和HIF-1α的表达。实验结果(图4中的A)显示,生物活性水凝胶(mADSCs/tHA-tChi/PRP)与hUVECs共培养可使hUVECs表现出更优异的血管生成活性,且具有更多的连接(图4中的B、C)和更长的管长(图4中的D、E)。与生物活性水凝胶共培养的hUVECs细胞中VEGF和HIF-1α在RNA和蛋白水平的表达显著增加(图4中的F、G)。
实施例7子宫内膜损伤修复试验
子宫内膜损伤模型的建立:选用8周龄动情周期正常的昆明雌鼠建立子宫内膜损伤模型。首先用1.25%阿佛丁腹腔注射,待小鼠进入深度麻醉后,在小鼠阴道口上方1cm处开腹,逐层分离,用无齿镊拉出子宫,用0号丝线结扎两端卵巢端和近阴道端。用1ml注射器往双侧子宫分别注入50μL 95%乙醇溶液,维持1min后分别用生理盐水进行宫腔冲洗,将子宫复位,逐层缝合,关腹。
水凝胶宫腔灌注治疗:于造模10天后按以下分组:1)生理盐水;2)生理盐水;3)tHA-tChi水凝胶;4)tHA-tChi/PRP水凝胶;5)mADSCs/tHA-tChi/PRP水凝胶;6)mADSCs/G-HA/PRP水凝胶。
其中3、4组是参考实施例4中4.2的步骤(2)和(3)制备得到的水凝胶,5组是将实施例4中4.2的步骤(3)制备得到的凝胶前驱液与mADSCs混合均匀后37℃成胶5min得到的水凝胶(mADSCs细胞的加入量为1000个/μl),6组是采用商用水凝胶“宫安康”透明质酸水凝胶(G-HA,主要成分为交联透明质酸,即HA)作为原料,与PRP和mADSCs混合后得到mADSCs/G-HA/PRP水凝胶。
分别往损伤子宫内注射50μL生理盐水和不同组份水凝胶,在注射治疗2个发情周期(10天)后,HE、Masson染色评估小鼠子宫内膜厚度、面积、腺体数量、纤维化面积等,用免疫组织化学染色检测内膜修复相关分子标志物(Ki67、CD31、VEGF、VIM、CK19)的表达,综合评估子宫内膜损伤修复情况。
结果显示,内膜损伤组小鼠子宫有明显水肿与畸形。经过各组水凝胶宫腔灌注治疗后,小鼠子宫外观逐渐恢复正常(图5中的A)。HE染色(图5中的B)结果显示,与其他各组相比,mADSCs/tHA-tChi/PRP水凝胶组可显著促进子宫内膜修复,内膜明显增厚,腺体数量增加,宫腔间隙变小;Masson染色显示纤维化程度降低(图5中的C)且内膜修复相关分子标志物表达升高(图6)。与mADSCs/G-HA/PRP水凝胶相比,本发明制备的生物活性水凝胶表现出更优异的促子宫内膜修复能力。
实施例8生育力恢复的评估
参照实施例7中的造模与宫内注射治疗,在2个发情周期(10天)的治疗后评估生育力。雌鼠与雄鼠以1﹕1的比例合笼,当雌性小鼠观察到阴道塞时,该天被记录为妊娠0.5天。然后,在妊娠第10天记录胚胎植入数。实验结果如图7所示,mADSCs/tHA-tChi/PRP水凝胶治疗组小鼠胚胎着床率比mADSCs/G-HA/PRP水凝胶治疗组高,生物活性水凝胶显著提高妊娠率,子宫内膜损伤小鼠生育能力改善。
实施例9VEGF信号通路对子宫内膜再生修复的影响
参照实施例7中的造模与宫内注射治疗,在2个发情周期(10天)的治疗后提取各组小鼠子宫组织蛋白,通过Western blot检测VEGF信号通路相关因子(VEGF、VEGFR2、AKT、P-AKT以及BAD)的蛋白表达。如图8,生物活性水凝胶治疗组的小鼠子宫内膜中的VEGF、VEGFR2及下游P-AKT的表达明显升高,而BAD表达显著降低。结果提示生物活性水凝胶可能通过激活VEGF及下游PI3K-AKT-BAD信号通路来促进子宫内膜血管生成和修复。
综上,本发明所制备的具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶不仅具有无免疫原性、可生物降解性和高生物活性等优点,还可实现干细胞有效递送和PRP生长因子的局部控释,调节内膜微环境,防止小鼠子宫内膜粘连并加速损伤内膜的修复。而商用的常规HA水凝胶则无法实现上述效果,无法有效负载生长因子与干细胞,本发明制备的生物活性水凝胶在动物实验中表现出更优异的促子宫内膜修复能力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶前驱液的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)将壳聚糖溶于溶液,加入EDAC和NHS,避光搅拌,调节pH后反应,加入L-半胱氨酸后继续避光搅拌反应,透析,离心,干燥后得到巯基化壳聚糖;
(2)将透明质酸钠搅拌溶于溶液,加入EDAC搅拌,加入NHS继续搅拌,调节pH后避光反应,之后加入半胱氨酸反应,调节pH后继续避光搅拌反应,透析,干燥后得到巯基化透明质酸;
(3)将巯基化壳聚糖、巯基化透明质酸和β-GP分别溶解得到溶液,在β-GP溶液中加入巯基化透明质酸溶液并同时快速涡旋,再加入巯基化壳聚糖溶液,再次快速涡旋,即得到具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶前驱液;
或;
(3)将巯基化壳聚糖、巯基化透明质酸和β-GP分别溶解得到溶液,在β-GP溶液中加入巯基化透明质酸溶液并同时快速涡旋,再加入巯基化壳聚糖溶液,再次快速涡旋,之后加入活性物质,快速涡旋混匀,即得到具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶前驱液。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
步骤(1)所述的溶液与壳聚糖的比例为300~500mL﹕1g;
步骤(1)所述的EDAC的加入量以终浓度20~30mM计;
步骤(1)所述的NHS的加入量以终浓度20~30mM计;
步骤(1)所述的半胱氨酸与壳聚糖的质量比为0.5~1﹕1。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
步骤(2)所述的溶液与透明质酸钠的比例为100~300mL﹕1g;
步骤(2)所述的EDAC的加入量以终浓度20~30mM计;
步骤(2)所述的NHS的加入量以终浓度20~30mM计;
步骤(2)所述的半胱氨酸与透明质酸钠的质量比为0.5~1﹕1。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
步骤(1)所述的溶液为乙酸溶液;
步骤(1)所述的避光搅拌的时间为30~90min;
步骤(1)所述的避光搅拌的条件为室温,800~1000rpm;
步骤(1)所述的调节pH为调节pH至4.5~5.5;
步骤(1)所述的第一次反应的条件为反应1~3h;
步骤(1)所述的第二次反应的条件为反应20~30h;
步骤(1)所述的透析为使用MW 3000~4000的透析袋在pH 3~4的去离子水中透析;
步骤(1)所述的离心为3000~5000rpm离心;
步骤(2)所述的溶液为去离子水;
步骤(2)所述的第一次搅拌的条件为搅拌1~2h;
步骤(2)所述的第二次搅拌的条件为搅拌10~20min;
步骤(2)所述的第三次搅拌的条件为搅拌30~90min;
步骤(2)所述的第一次调节pH为调节pH至5~6;
步骤(2)所述的第二次调节pH为调节pH至4~5;
步骤(2)所述的第一次反应的条件为反应1~3h;
步骤(2)所述的第二次反应的条件为反应30~90min;
步骤(2)所述的第三次反应的条件为反应20~30h;
步骤(2)所述的透析为使用MW 3000~4000的透析袋,分别用pH 3.5的去离子水透析一天,用pH 3.5的1%NaCl水溶液透析一天,用pH 3.5的去离子水透析一天。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
步骤(3)所述的巯基化壳聚糖溶液为将巯基化壳聚糖溶于乙酸溶液得到的;
步骤(3)所述的巯基化壳聚糖溶液的浓度为15~30mg/mL;
步骤(3)所述的巯基化透明质酸溶液为将巯基化透明质酸溶于水得到的;
步骤(3)所述的巯基化透明质酸溶液的浓度为15~30mg/mL;
步骤(3)所述的β-GP溶液为将β-GP溶于水得到的;
步骤(3)所述的β-GP溶液中β-GP与溶液的质量体积比为0.5~1﹕1;优选为0.58﹕1;
步骤(3)所述的巯基化透明质酸溶液、巯基化壳聚糖溶液、58%β-GP的体积比为1~2﹕1~2﹕1~2;
步骤(3)中所述的快速涡旋为使用漩涡混匀仪快速涡旋10~15s。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
步骤(3)所述的活性物质为PRP生长因子复合物和小鼠脂肪间充质干细胞中的至少一种;
所述的PRP生长因子复合物与凝胶前驱液的体积比为1﹕4~10;
所述的PRP生长因子复合物的制备方法包括如下步骤:
小鼠外周血1000rpm离心10min后取上层清液、中间白膜层和下层3mm红细胞,继续3000rpm离心10min去除下层红细胞和上层的低浓度血小板血清,留取中间白膜层和少量红细胞,每毫升添加20U牛凝血酶,与10%CaCl2溶液按9:1体积混合,置于37℃培养箱中孵育40min,取出2000rpm离心10min,即得到PRP生长因子复合物;
所述的小鼠脂肪间充质干细胞与凝胶前驱液的比例为400~1500个﹕1微升;
所述的小鼠脂肪间充质干细胞为细胞融合度70~90%的对数期小鼠脂肪间充质干细胞。
7.一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶前驱液,根据权利要求1~6任一所述的制备方法制备得到。
8.一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(4)将具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶前驱液置于合适温度成胶后,即得到具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶;
步骤(4)中所述的成胶为置于35~40℃下成胶3~10min。
9.一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶,根据权利要求8所述的制备方法制备得到。
10.权利要求7所述的具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶前驱液或权利要求9所述的具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶在制备可递送活性物质的生物修复支架或子宫内膜修复药物或治疗宫腔粘连药物中的应用。
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