CN115997760B - 一种外泌体凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种外泌体凝胶及其制备方法，属于生物技术领域，所述外泌体凝胶由外泌体和凝胶基质组成，每克凝胶基质中含有2.0‑9.0×1011个外泌体，所述凝胶基质主要由下列组分制成：3‑6重量份聚丙烯酸；2‑5重量份壳聚糖；2‑4重量份磷脂；以及90‑150重量份去离子水。本发明制备的外泌体凝胶具有很高的稳定性，可以用于长时间保存外泌体，使得外泌体具有很高的存活率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种外泌体凝胶及其制备方法。
背景技术
外泌体是细胞经过“内吞－融合－外排”等一系列调控过程形成并可分泌的分子直径为40-100nm的亚细胞双层膜囊泡。外泌体在透射电子显微镜下呈扁平状或球状，在蔗糖溶液中的密度为1.13～1.19g/mL，其密度与细胞来源相关，并随蛋白含量而改变。外泌体内不含有DNA片段，但含有与其来源细胞相类似的细胞因子、生长因子等蛋白质，以及脂质、编码或非编码RNA等生物活性物质，在调控细胞生理功能方面具有重要作用。外泌体的质膜含有丰富的胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺、脂；外泌体不仅可以保护这些生筏及磷脂酰丝氨酸物活性物质在细胞外环境中不被降解和稀释，也可以促进这些物质通过组织液或血液的远距离输送，同时外泌体膜上特异性的表面配体允许它与受体细胞高效率结合。
近年来，随着干细胞与再生医学迅速发展，外泌体的治疗优势日渐凸显。外泌体含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸。外泌体能与细胞膜结合，直接进入细胞内部释放多种趋化因子、生长因子等，招募血管内皮细胞、促进其增殖和迁移来促进血管再生，以改善宿主血供，进而促进组织损伤修复。在小鼠的皮肤缺损模型中还表明，外泌体可以增加Ⅲ型胶原与Ⅰ型胶原的比例、TGF－β3与TGF-β1的比例以及MMP-3与TIMP-1的比例，激活ERK/MAPK通路，抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，促进创伤区胞外基质的改建，最终抑制瘢痕的形成，可见外泌体在伤口愈合应用中具有广阔的前景。
然而，外泌体在低温保存和常温保存过程中，存在外泌体活力显著降低的问题。针对该技术问题，现有技术已经提出将外泌体制成凝胶制剂。
例如，中国授权专利CN108078912B公开了一种可长期保存的外泌体修复凝胶，该修复凝胶由外泌体和凝胶基质组成，每g所述凝胶基质中含有0.2×1012-0.5×1012个外泌体，所述凝胶基质主要由去离子水、异丙醇胺、海藻酸丙二醇酯微囊和甘油组成，该修复凝胶在凝胶基质中加入海藻酸丙二醇酯微囊可以提高修复凝胶的稳定性，可以用于长时间保存外泌体，使得外泌体具有很高的存活率。
此外，中国授权专利CN113509590B也公开了外泌体联合透明质酸的伤口敷料及其制备方法和应用，所述伤口敷料由透明质酸水凝胶包裹间充质干细胞外泌体构成，所述透明质酸水凝胶是透明质酸水溶液经过反复冷冻解冻再与碳二亚胺盐酸盐及已二酸二酰肼进行交联所获得。相应地，该发明专利还公开了上述外泌体联合透明质酸的伤口敷料的制备方法，以及其在促进伤口愈合药物或材料中的应用。该发明专利中的伤口敷料结合了间充质干细胞的外泌体和透明质酸水凝胶的特性，与伤口创面接触后，可促进血管再生、胶原合成，从而修复损伤的组织，且安全可靠，生物相容性好，对创面的愈合具有明显促进作用，不容易造成感染，愈合后不留疤痕。
现有技术中虽然报道了可以长期保存外泌体活力的凝胶，但如何在低温（0℃-4℃）和-80℃下都能够长期保存外泌体的活力，仍然是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
基于上述原因，本发明提出一种外泌体凝胶及其制备方法，以长期保存外泌体的活力。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及一种外泌体凝胶，所述外泌体凝胶由外泌体和凝胶基质组成，每克凝胶基质中含有2.0-9.0×1011个外泌体，所述凝胶基质主要由下列组分制成：
聚丙烯酸 3-6重量份（优选3-5重量份）；
壳聚糖 2-5重量份（优选2-3重量份）；
磷脂 2-4重量份（优选2-3重量份）；
去离子水 90-150重量份（优选90-120重量份）。
在本发明的一个优选实施方式中，制备凝胶基质的组分还包括醋酸和/或碱性溶液。
在本发明的一个优选实施方式中，所述磷脂选自卵磷脂和/或鞘磷脂。
在本发明的一个优选实施方式中，所述外泌体凝胶的pH值为6.5-7.0。
在本发明的一个优选实施方式中，所述外泌体凝胶在-80℃中保存6个月之后外泌体的活力保持在94%以上。
在本发明的一个优选实施方式中，所述述外泌体凝胶在4℃冰箱中保存7天之后外泌体的活力保持在90%以上；优选在91%以上。
在本发明的另一方面，还涉及上述外泌体凝胶的制备方法，其包括如下步骤：
（1）将醋酸溶解于去离子水中，形成醋酸溶液，然后将壳聚糖溶解于醋酸溶液中形成壳聚糖溶液；
（2）将聚丙烯酸和磷脂加入壳聚糖溶液中，加热至50-60℃，不断搅拌至混合均匀得到凝胶基质溶液；
（3）使用碱性溶液调节凝胶基质溶液的pH至6.5-7.1，将凝胶基质溶液降温至35-40℃，向凝胶基质中加入外泌体，搅拌均匀之后于室温中静置得到外泌体凝胶。
在本发明的一个优选实施方式中，所述碱性溶液是氢氧化钠水溶液。
有益效果
本发明制备的外泌体凝胶具有很高的稳定性，可以用于-80℃（无需液氮）长时间保存外泌体，使得外泌体具有很高的存活率。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1： 制备外泌体凝胶
所述外泌体凝胶由外泌体和凝胶基质组成，每克凝胶基质中含有5.0×1011个外泌体，所述凝胶基质主要由下列组分制成：
聚丙烯酸 3.8g；
壳聚糖 2.2g；
卵磷脂 2.0g；
去离子水 90g；
适量的醋酸和氢氧化钠溶液；
具体的制备步骤如下：
（1）将醋酸溶解于去离子水中，形成0.1mol/L的醋酸溶液，然后将壳聚糖溶解于醋酸溶液中形成壳聚糖溶液；
（2）将聚丙烯酸和卵磷脂加入壳聚糖溶液中，加热至55℃，不断搅拌至混合均匀得到凝胶基质溶液；
（3）使用氢氧化钠溶液调节凝胶基质溶液的pH至6.8，将凝胶基质溶液降温至37℃，每克凝胶基质中含有5.0×1011个外泌体的量向凝胶基质中加入外泌体，搅拌均匀之后于室温中静置0.5小时得到外泌体凝胶。
实施例2： 制备外泌体凝胶
所述外泌体凝胶由外泌体和凝胶基质组成，每克凝胶基质中含有5.0×1011个外泌体，所述凝胶基质主要由下列组分制成：
聚丙烯酸 4.8g；
壳聚糖 2.2g；
鞘磷脂 2.0g；
去离子水 90g；
适量的醋酸和氢氧化钠溶液；
具体的制备步骤如下：
（1）将醋酸溶解于去离子水中，形成0.1mol/L的醋酸溶液，然后将壳聚糖溶解于醋酸溶液中形成壳聚糖溶液；
（2）将聚丙烯酸和鞘磷脂加入壳聚糖溶液中，加热至55℃，不断搅拌至混合均匀得到凝胶基质溶液；
（3）使用氢氧化钠溶液调节凝胶基质溶液的pH至6.8，将凝胶基质溶液降温至37℃，每克凝胶基质中含有5.0×1011个外泌体的量向凝胶基质中加入外泌体，搅拌均匀之后于室温中静置0.5小时得到外泌体凝胶。
比较例1：
与实施例1相同，区别在于采用相同量的琼脂代替壳聚糖来制备外泌体凝胶。
比较例2：
与实施例1相同，区别在于采用相同量的二硬脂酸甘油酯代替卵磷脂来制备外泌体凝胶。
实验例：外泌体凝胶长期保存后外泌体活力的检测
取本发明实施例1-2和比较例1-2的外泌体凝胶，分别置于4℃和-80℃中保存，分别检测4℃保存3天和7天、-80℃中冻存1个月、3个月和6个月后外泌体的存活率。具体方法是将外泌体置于37℃的水浴中，复苏1-2min，用台盼蓝染色法进行细胞计数，计算外泌体存活率，检测结果见表1。
从表中可以看出，本发明提供的外泌体凝胶性质稳定，可以在-80℃中长时间保存外泌体，保存6个月后，细胞存活率均超过94.7％，即使是在4℃的冰箱中，也可以保存超过7天，由此表明本发明提供的外泌体凝胶可以用于长时间保存间充质干细胞。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
Claims (8)
1.一种外泌体凝胶，所述外泌体凝胶由外泌体和凝胶基质组成，每克凝胶基质中含有2.0-9.0×1011个外泌体，其特征在于，所述凝胶基质主要由下列组分制成：
聚丙烯酸 3-6重量份；
壳聚糖 2-5重量份；
磷脂 2-4重量份；
去离子水 90-150重量份。
2.根据权利要求1所述的外泌体凝胶，其特征在于，所述磷脂选自卵磷脂和/或鞘磷脂。
3.根据权利要求1所述的外泌体凝胶，其特征在于，所述外泌体凝胶的pH值为6.5-7.0。
4.根据权利要求1所述的外泌体凝胶，其特征在于，所述外泌体凝胶在-80℃中保存6个月之后外泌体的活力保持在94%以上。
5.根据权利要求1所述的外泌体凝胶，其特征在于，所述外泌体凝胶在4℃冰箱中保存7天之后外泌体的活力保持在90%以上。
6.根据权利要求1所述的外泌体凝胶，其特征在于，所述外泌体凝胶在4℃冰箱中保存7天之后外泌体的活力保持在91%以上。
7.权利要求1-6任意一项所述的外泌体凝胶的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
（1）将醋酸溶解于去离子水中，形成醋酸溶液，然后将壳聚糖溶解于醋酸溶液中形成壳聚糖溶液；
（2）将聚丙烯酸和磷脂加入壳聚糖溶液中，加热至50-60℃，不断搅拌至混合均匀得到凝胶基质溶液；
（3）使用碱性溶液调节凝胶基质溶液的pH至6.5-7.1，将凝胶基质溶液降温至35-40℃，向凝胶基质中加入外泌体，搅拌均匀之后于室温中静置得到外泌体凝胶。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述碱性溶液是氢氧化钠水溶液。
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