WO2020196986A1 - 하이드로겔의 기계적 강도를 이용한 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관신생 관련 사이토카인 조절 방법 - Google Patents

하이드로겔의 기계적 강도를 이용한 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관신생 관련 사이토카인 조절 방법 Download PDF

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stem cell
mechanical strength
cytokines
derived extracellular
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차재민
정선영
김태희
방오영
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인천대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a method for regulating angiogenesis-related cytokines of stem cell-derived extracellular vesicles using the mechanical strength of a hydrogel, and specifically, the step of encapsulating stem cells inside a three-dimensional polymer cell scaffold with controlled mechanical strength. It relates to a method for regulating angiogenesis-related cytokines of stem cell-derived extracellular vesicles, including stem cells encapsulated and cultured in a three-dimensional polymer cell scaffold with controlled mechanical strength, and extracellular vesicles derived from the stem cells.
  • hPSCs Human pluripotent stem cells
  • hESCs human embryonic stem cells
  • hiPSCs induced pluripotent stem cells
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • the phenotype of MSCs as non-hematopoietic stem cells is characterized by the expression of surface markers such as CD73, CD90 and CD105 and a deficiency of CD14, CD34 and CD45.
  • MSC was initially thought to be present in the bone marrow, but follow-up studies have shown that MSC is isolated from various adult tissues such as adipose tissue, heart, Wharton's jelly, dental pulp, peripheral blood, umbilical cord blood, menstrual blood, and chorion. It turns out that it can be.
  • the maintenance of stem cell niche and tissue homeostasis is achieved by MSCs present in these various tissues.
  • Extracellular endoplasmic reticulum refers to all types of vesicles surrounded by a lipid membrane that cells release when biological signals are obtained from other cells or when chemical stimulation such as oxidative or hypoxia is received.
  • the size of the extracellular vesicles ranges from about 40 nm to several mm.
  • the combination of biomolecules specific to each cell type in the extracellular endoplasmic reticulum is surrounded by a double lipid membrane structure.
  • Extracellular vesicles are involved in the transmission of signals between cells, organs and even living organisms and are detected in bodily fluids such as blood, urine, cerebrospinal fluid, breast milk and saliva. Extracellular vesicles are subdivided into exosomes (30-100nm in diameter), microvesicles (100-1000nm), and apoptotic bodies (50-5000nm). Extracellular vesicles can also be distinguished by biogenesis.
  • Exosomes are derived from the multivesicular body (MVB), whereas microvesicles (MV) come out of the plasma membrane of cells and are released directly into the extracellular space. Exosomes can be quantified by protein markers such as CD9, CD63, CD81, Alix or TSG101, but specific markers of microvesicles have not yet been identified. Size analysis and morphological observation are also possible.
  • extracellular vesicles can influence receptor cell function through the delivery of a variety of unique constructs of biomolecules. This variety of cellular signaling allows the target cell to be protected or to receive other messages, even if the target cell is at a remote location from the origin of the vesicle. Interestingly, only 8% of RNA in vesicles was found to originate in parental cells, and 270 unique gene transcripts were found in exosomes. Extracellular endoplasmic reticulum proteins can also be carriers of information. Extracellular vesicles extracted from MSCs have been demonstrated to participate in many cellular interactions through numerous studies.
  • MSCs known to possess immunomodulatory and regenerative potential, are considered potential therapeutic extracellular vesicle producers because they release large amounts of extracellular vesicles.
  • Extracellular vesicles extracted from MSCs can be identified by specific markers such as CD44, CD73, and CD90. Taken together, it can be presumed that MSCs produce extracellular vesicles with different composition of genetic material and protein to regulate the behavior of adjacent cells to induce regeneration of functions.
  • Bioprocess is a technology that can transform laboratory-scale research into successful clinical therapy or commercialization. For a wide range of clinical applications, additional challenges such as cost, automation, standardization and production of high-quality cells with adequate cell counts must be addressed. Mass production and quality control should be considered fundamentally. Recently, researchers have shown that culturing cells in bioreactors increases the rate of production of extracellular vesicles. However, there is still a limit to the use of extracellular vesicles extracted from stem cells because there is no biological process method for increasing the production and clinical efficacy of extracellular vesicles. For example, previous studies have reported that monolayer culture conditions that allow only two-dimensional cell-to-cell contact interfere with communication between cells, extracellular matrix (ECM), and other adjacent cells.
  • ECM extracellular matrix
  • the present invention aims to tailor the therapeutic compound of EV through 3D bioprocessing of MSC and its culture matrix.
  • the physical interaction between the MSC and the culture matrix stimulates the MSC to secrete paracrine factors as a combination of prepared cytokines for the target disease.
  • Controlling the physical properties of the culture matrix is achieved by encapsulating the cells in GelMA (Gelatin methacryloyl) hydrogel.
  • the 3D GelMA hydrogel containing a motif can mimic a microenvironment surrounded by an extracellular matrix (ECM).
  • the present invention provides a method for regulating angiogenesis-related cytokines of stem cell-derived extracellular vesicles, including the step of encapsulating the stem cells inside a three-dimensional polymeric cell scaffold with controlled mechanical strength, The method may further include the step of culturing the stem cells encapsulated inside the 3D polymer cell support by shaking culture or bioreactor.
  • the bioreactor refers to a system that artificially reproduces a biochemical reaction process such as decomposition, synthesis, and chemical transformation of substances in the body of an organism, and is also referred to as a bioreactor.
  • the stem cells are meant to encompass all embryonic stem cells, adult stem cells, induced pluripotent step cells (iPS cells), and progenitor cells.
  • the stem cells may be at least one selected from the group consisting of embryonic stem cells, adult stem cells, pluripotent induction stem cells, and progenitor cells.
  • the stem cells may be allogeneic stem cells and/or autologous stem cells.
  • the stem cells may be adult stem cells, such as mesenchymal stem cells, more specifically human mesenchymal stem cells, but are not limited thereto.
  • Extracellular vesicles are endoplasmic reticulums produced by cells and secreted out of cells, and include, but are not limited to, exosomes, microvesicles, and microparticles.
  • the extracellular vesicles may be extracellular vesicles derived from stem cells.
  • the size of the extracellular vesicles may range from about 40 nm to several mm, and the combination of biomolecules specific to each cell type in the extracellular vesicles is surrounded by a double lipid membrane structure.
  • Various types of proteins enzymes, growth factors, receptors and cytokines), membranous lipids, nucleic acids and metabolites are the main contents of the extracellular endoplasmic reticulum.
  • Extracellular vesicles are involved in the transmission of signals between cells, organs and even living organisms and can be detected in body fluids such as blood, urine, cerebrospinal fluid, breast milk and saliva.
  • the three-dimensional polymeric cell scaffold is a physical scaffold made for in vitro culture and implantation of cells, and can induce differentiation and promote cell growth, and is preferably biocompatible and biodegradable.
  • the three-dimensional polymeric cell support according to the present invention is a hydrogel containing methacrylated gelatin (GelMA), has excellent adhesion to stem cells, and is based on natural biopolymers such as gelatin.
  • Angiogenesis-related cytokine control method is characterized in that the stem cells are encapsulated inside a three-dimensional polymeric cell scaffold, and the encapsulation method includes stem cells and stem cells in a methacrylated gelatin (GelMA) solution.
  • GelMA methacrylated gelatin
  • a photoinitiator is mixed and obtained by irradiating UV to the mixed solution, and the methacrylated gelatin is cross-linked by UV irradiation.
  • the mechanical strength of the three-dimensional polymeric cell support can be adjusted by the UV intensity irradiated to the mixed solution, but is not limited thereto, and the higher the degree of methacryloylation of GelMA, that is, the higher the degree of substitution of GelMA when preparing the GelMA hydrogel. Since the crosslinking density may increase and the stiffness of the prepared hydrogel may be increased, the mechanical strength of the cell support may be controlled by such a method.
  • the intensity of the irradiated UV is 1 ⁇ 10mW / cm 2
  • the distance to GelMA (test piece) is 3 ⁇ 10cm, which can be appropriately adjusted according to the type of polymer, preferably 2 ⁇ 5mW / cm 2 , the distance is 5 to 9 cm, most preferably 3.8 mW/cm 2 , and the distance is 7 cm. If the intensity of UV is too strong, it is preferable to maintain the intensity of UV and the distance to GelMA in the above-described range because it can induce DNA damage of stem cells and induce cell aging and apoptosis.
  • the mechanical strength of the cell scaffold is divided into three stages in the range of 3 to 30 kPa, and the cell scaffold having a soft strength is irradiated with UV for 1 to 5 seconds, and the Young's modulus (kPa) of the cell scaffold is 3 ⁇ 10 kPa;
  • the cell scaffold having a medium intensity is irradiated with UV for 6 to 15 seconds, and the Young's modulus is 11 to 18 kPa;
  • Cell scaffolds having a hard strength are irradiated with UV for 16 to 25 seconds, and the Young's modulus is 19 to 30 kPa.
  • the mechanical strength of the cell support is less than 3 kPa, the hydrogel is released during the cell culture process, and if the mechanical strength exceeds 30 kPa, the cells cannot grow.
  • Suitable commercial UV photoinitiators are Irgacure TM 184, Irgacure TM 500, Irgacure TM 907, Irgacure TM 369, Irgacure TM 1700, Irgacure TM 651, Irgacure TM 819, Irgacure TM 1000, Irgacure TM 1300, Irgacure TM 1300 available from CIBA SPECIALTY CHEMICALS.
  • the expression of any one or more of the angiogenesis-related cytokines EGF, THPO, PDGF-BB, VEGF-D, ENA-78 or MMP-9 is expressed in the 2D control group. It increases compared to that, which is a characteristic that appears in all groups (soft, neutral and rigid) regardless of mechanical strength.
  • the expression of any one or more cytokines of I-309 or IL-10 is reduced compared to other groups (neutral, rigid and 2D control).
  • GRO, PLGF, IFN ⁇ , RANTES, IGF-1, TGF ⁇ 1, TIMP-1 or VEGF-D of any one or more of the cytokine expression is increased compared to other groups.
  • any one or more of the cytokine expression is increased compared to other groups (soft, rigid and 2D control), among IL-6, ANG or IL-8
  • the expression of any one or more cytokines is decreased compared to the other groups.
  • PLGF extracellular endoplasmic reticulum
  • IL-1 ⁇ IL-1 ⁇
  • PECAM-1 PECAM-1
  • PLG PLG
  • IL-2 TIE-2
  • Endostatin IL-4
  • the expression of any one or more cytokines of TNF-a is decreased compared to other groups (soft, neutral and 2D control), and the expression of any one or more of Leptin, MCP-1 or VEGF is increased compared to the other groups.
  • stem cells encapsulated and cultured inside a three-dimensional polymer cell support having a controlled mechanical strength and an extracellular vesicle derived from the stem cells.
  • the encapsulation may be achieved by mixing stem cells and a photoinitiator in a methacrylated gelatin (GelMA) solution, and irradiating UV to the mixed solution, and the mechanical strength is controlled by the UV irradiation time.
  • the cultured stem cells can be separated by decomposing the GelMA with collagenase, and the stem cells are characterized by an increase in cytokines related to angiogenesis in the extracellular endoplasmic reticulum.
  • the method of separating the extracellular endoplasmic reticulum from stem cells can be performed by all known conventional methods, such as centrifugation, filtering, column (size exclusion column), exoquick, etc., but is limited thereto. It is not.
  • the inventors used tangential flow filtration (TFF) to separate extracellular vesicles.
  • a pharmaceutical composition for inducing or promoting angiogenesis comprising the stem cells or extracellular vesicles derived from the stem cells as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inducing or promoting angiogenesis, comprising the stem cells or extracellular vesicles derived from the stem cells as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be usefully applied in the prevention or treatment of diseases requiring angiogenesis, for example, ischemic diseases such as myocardial infarction, stroke, hypoxic ischemic brain injury, and arteriosclerotic diseases of the lower extremities.
  • ischemic diseases such as myocardial infarction, stroke, hypoxic ischemic brain injury, and arteriosclerotic diseases of the lower extremities.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes stem cells or extracellular vesicles derived from the stem cells as an active ingredient, and includes a pharmaceutically acceptable carrier, that is, a carrier commonly used in the field of cell therapy.
  • a pharmaceutically acceptable carrier that is, a carrier commonly used in the field of cell therapy.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in the form of intra-tissue-transplant injections, intravenous injections, lyophilized preparations for injection, and the like for cell transplantation according to a conventional pharmaceutical method, and particularly preferably for cell transplantation. It can be formulated in the form of an intra-tissue-transplantable injection.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may include a sterile aqueous solution (eg, physiological saline, etc.), a non-aqueous solvent, and the like.
  • suitable stabilizers, adjuvants eg, Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, etc.
  • isotonic agents preservatives, and the
  • the method for regulating angiogenesis-related cytokines of stem cell-derived extracellular vesicles using the mechanical strength of the hydrogel of the present invention is a simple and safe method of controlling the mechanical strength of the hydrogel without chemical factors or cell transfection, as a target treatment factor. It has shown the possibility of producing composed extracellular vesicles.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the encapsulation process of the present invention.
  • the output of ultraviolet rays is 3.8 mW/cm 2 and the curing time is 3 seconds, 10 seconds and 20 seconds for ductility, neutrality and rigidity, respectively.
  • Figure 2 shows the results of measuring the mechanical properties of GelMA by AFM; (a) Young's modulus values from the force-distance curves of (a) GelMA samples and (b, c) the force-distance curves of GelMA.
  • 3 is a FIB Quanta 3D image of a soft, neutral and rigid GelMA hydrogel.
  • Fig. 5 is an Immunocytochemistry image of two-dimensional culture (2D) control MSCs; (a) DAPI-free negative control, (b) DAPI-treated negative control, (c) two-dimensional culture (2D) control MSCs immunostained with CD105, a positive MSC marker.
  • FIG. 6 is an optical microscope image of an encapsulated MSC; (a) soft, (b) neutral, (c) rigid GelMA hydrogel.
  • Figure 7 is a photograph showing the Live and Dead results of encapsulated MSC; (a) soft, (b) neutral, (c) rigid GelMA hydrogel.
  • phalloidin staining image of encapsulated MSCs after 5 days of culture (a) soft, (b) neutral, (c) rigid GelMA hydrogel, phalloidin (green), DAPI (blue).
  • FIG. 9 is a diagram comparing the results of gene expression profile analysis of encapsulated MSC and two-dimensional culture (2D) MSC; (A) qPCR array, (b) scatter plot, (c) graph of the gene expression profile of encapsulated MSCs.
  • 10 is a graph showing the DNA quantitative analysis results of encapsulated MSCs.
  • 11 is a TEM image of an isolated extracellular vesicle.
  • FIG. 12 is a graph showing the size distribution of extracellular vesicles; (a, b) Size distribution graph of extracellular vesicles derived from GelMA encapsulated MSCs, (c) average size.
  • FIG. 13 is a photograph showing the results of Western blot of isolated extracellular vesicles.
  • VEGF is a positive control
  • PBS is a negative control.
  • Untreated bare slide glass was cut to 24 x 24 mm using a diamond cutter and immersed in 10% NaOH solution overnight at room temperature. The glass was washed twice with distilled water and 70% ethanol and then dried. The completely dried glass was treated with 3-trimethoxysilyl propyl methacrylate (TMS-PMA) solution overnight at 80°C. TMS-PMA coated glass was spin coated with PEG solution.
  • TMS-PMA 3-trimethoxysilyl propyl methacrylate
  • Working PEG solution is phosphate buffered saline (PBS), poly (ethylene glycol) 1000 dimethacrylate (Poly (ethylene glycol) 1000 dimethacrylate, PEG), photoinitiator (2-hydroxy-1-(4-( hydroxyethoxy)phenyl)-2-methyl-1-propanone) in a ratio of 10:1:0.1, respectively.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Poly (ethylene glycol) 1000 dimethacrylate, PEG Poly (ethylene glycol) 1000 dimethacrylate, PEG
  • photoinitiator (2-hydroxy-1-(4-( hydroxyethoxy)phenyl)-2-methyl-1-propanone) in a ratio of 10:1:0.1, respectively.
  • the PEG-coated glass was UV induced crosslinked for 60 seconds at a power of 3.8 mW/cm 2 (Omnicure® S2000, Excelitas Technologies Corp., Massachusetts, USA). The cured glass was washed again with PBS
  • a gelma hydrogel solution containing 10% GelMA (Gelatin methacryloyl) and 0.05% photoinitiator in PBS were newly prepared and used immediately.
  • a polydimethylsiloxane (PDMS) spacer having a height of 300 ⁇ m was also manufactured for the encapsulation process.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • hMSCs Human mesenchymal stem cells (hMSCs, PT2501, Lonza, Basel, Switzerland) were cultured in an incubator at 37°C in a humid atmosphere containing 5% CO 2 .
  • low-glucose DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • antibiotic-antibacterial agent was used for the expansion of MSC.
  • the medium was changed every 3-4 days.
  • Encapsulated MSCs were cultured with Low-glucose DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) containing 10% FBS and 1% antibiotic-antibacterial agent.
  • hMSC For the encapsulation of hMSC, cells were dissociated with TrypLE Express (Gibco) and the number of cells was counted with a hemocytometer. Trypsinized cells were suspended in a GelMA solution and encapsulation medium at a concentration of 1.5 x 10 5 cells/total volume of 75 ⁇ l at a ratio of 5:1, resulting in a final GelMA concentration of 8.3%. . 75 [mu]l of a GelMA solution containing suspended hMSC was poured into TMS-PMA and PEG-coated slide glass.
  • MSCs were encapsulated in cross-linked GelMA with otherwise controlled mechanical stiffnesses; That is, Soft (3 seconds at 3.8 mW/cm 2 ), Medium (10 seconds at 3.8 mW/cm 2 ), and Hard (20 seconds at 3.8 mW/cm 2 ).
  • the encapsulated MSC was incubated for 5 days under orbital-shaking conditions of 20 rpm. The medium was not changed during the incubation period.
  • the Young's modulus (kPa) of each gelma hydrogel having different stiffness was measured, and the result showed the highest Young's modulus (19 ⁇ 30kPa) in the'stiffness' group, and the lowest Young's modulus (3 ⁇ 30kPa) in the ductile group. 10 kPa) was shown (Fig. 2).
  • the porosity and morphology of GelMA hydrogel were observed by Focused Ion Bean Quanta 3D (FIB Quanta 3D). Pore size and porosity decreased as the strength of the hydrogel increased (FIG. 3).
  • MSCs derived from human bone marrow were cultured with a normal cell expansion medium. MSCs were evaluated for cell surface marker expression using qRT-PCR and Immunocytochemistry.
  • hMSCs were immobilized in 4% (w/v) paraformaldehyde (Biosesang, Seongnam, Korea) for 10 minutes at 4°C. After washing with PBS, the samples were permeabilized for 15 minutes in 0.2% Triton X-100. Samples were rewashed three times with PBS and blocked with 4% Bovine serum albumin (BSA) at 4° C. overnight. After blocking, the encapsulated cells were incubated with Alexa Fluor 488 Phalloidin (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) overnight at 4° C. for imaging the cytoskeleton structure of the cells.
  • BSA Bovine serum albumin
  • 2D control MSCs were incubated overnight at 4°C with primary antibody mouse-anti CD105 (Abcam, Cambridge, England) and secondary antibody AlexaFluor 488 anti-mouse IgG (Abcam) at room temperature for 2 hours. .
  • the sample was washed 3 times with 1% BSA and incubated with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Thermo Fisher Scientific) for 10 minutes at room temperature in the dark. Samples were washed once each with 1% BSA and PBS. Samples were preserved using mountant (ThemoFisher Scientific). The images were visualized with a confocal microscope (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).
  • MSC showed positive expression for CD73 and CD105 and negative for CD34 and CD45 in the qRT-PCR result (FIG. 4).
  • Staining data showed CD105 expression of MSCs in the positive control group, and CD105 expression could not be confirmed in the negative control group (FIG. 5).
  • MSCs were three-dimensionally encapsulated in GelMA hydrogels with different matrix properties achieved by controlling the mechanical stiffness of GelMA. Encapsulated MSCs were cultured using FBS culture medium under orbital-shaking conditions of 20 rpm.
  • the encapsulated MSCs exhibited different morphologies as the substrate stiffness varied. Under soft conditions, MSCs showed'neuron-like' and sometimes'aggregated' morphology, and cytoskeleton extension was observed. In the rigid group, on the contrary, the morphology of MSCs was round and did not aggregate, and the cytoskeleton was not expanded (FIGS. 6 and 8 ). However, MSCs still exhibited different cell behaviors while maintaining MSC stem cell ability (FIG. 9). The encapsulated MSCs showed high viability in live and dead assays (Fig. 7). In addition, the DNA quantification results showed that the encapsulated MSC was growing during the culture period (FIG. 10).
  • gene expression patterns of encapsulated MSCs and 2D control MSCs were analyzed.
  • the gene expression pattern was analyzed by qRT-PCR, and the experimental method is as follows.
  • RNA of the encapsulated MSC was extracted on the 5th day of culture, and Collagenase (Sigma) was used for GelMA hydrogel digestion. Chloroform (Sigma) was added to the TRIzol reagent (ThemoFisher Scientific) treated samples at a ratio of 1:5 (v/v). After centrifuging a sample of chloroform and TRIzol at 4° C. and 15,000 rpm for 15 to 20 minutes, the supernatant was isolated and mixed with isopropanol (Sigma) at a ratio of 1:1. After centrifugation at 4° C.
  • MSCs in the rigid group showed enhanced angiogenesis, chondrogenesis, osteogenesis, neurogenesis, and immunomodulation-related gene expression compared to 2D control MSCs.
  • CSF3, EGF, FUT1, HGF and VWF genes among genes related to angiogenesis Among the genes related to chondrogenesis, ABCB1, BMP4, GDF6, GDF7, HAT1 and ITGAX; Among the genes related to osteogenesis, BGLAP.
  • BMP6, FGF10, HDAC1, HNF1A, RUNX2, SMURF1 and TBX5 Among the genes related to neurogenesis, NES, CSF2 and IL1B;
  • the genes related to immunomodulation it was confirmed that the expression of PTPRC, TGFB3, ICAM1, IFNG, IL10, and TNF genes was increased.
  • genes involved in adipogenesis, tenogenesis, myogenesis, and anti-apoptosis were downregulated.
  • the MSCs as stem cells were highly upregulated and other biological properties were changed. Specifically, it was confirmed that the expression of INS2, LIF, POU5F1, SOX2, TERT, WNT3A and ZFP42 genes among the stemness marker genes was increased.
  • MSCs of the neutral group showed a gene expression pattern similar to that of the rigid group, but MSCs of the soft group tended to show a gene expression pattern different from that of the rigid group.
  • Chondrogenesis, immunomodulation, neurogenesis, tenogenesis, osteogenesis, myogenesis-related genes, and MSC-specific markers are down in the soft group of MSCs. Although regulated, genes related to angiogenesis, adipogenesis, and anti-apoptosis did not show significant changes.
  • genes related to chondrogenesis BMP4, KAT2B and COL1A1; Among the genes related to osteogenesis, ANXA5, PTK2, SMURF1 and SMURE2; ITGB1 and PTPRC among the genes related to immunomodulation; Among the genes related to neurogenesis, BDNF and VIM; Among the genes related to tenogenesis, GDF15 and SMAD4; It was confirmed that the expression of ACTA2 and JAG1 genes among genes related to myogenesis was decreased.
  • EVs collected from the encapsulated MSCs on the 5th day of culture were imaged with a transmission electron microscope (TEM), and their morphology was visualized.
  • TEM transmission electron microscope
  • EV was separated in the following way;
  • the encapsulated hMSCs conditioned medium was collected on the 5th day of culture and filtered through a 0.22 ⁇ m membrane syringe filter to remove dead cells.
  • the collected medium was centrifuged at 100,000 g and 4° C. for 1 hour, and the supernatant was removed.
  • PBS was added and centrifuged again at 100,000g and 4°C for 1 hour. The supernatant was removed and the EV was collected as a pellet.
  • the collected EVs showed a round bi-lipid membrane structure (Fig. 11).
  • the size distribution of EVs was analyzed by a nanoparticle tracking analysis (NTA, Malvern Panalyitcal, Malvern, United Kingdom) system.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • the EV of the MSC encapsulated with Gelmar had a higher proportion of the large EV compared to the 2D control group (FIG. 12).
  • Western blot was performed to show that the collected EVs were not apoptotic bodies. EVs did not show apoptosis expression (FIG. 13).
  • the angiogenic efficacy of encapsulated MSC-derived EVs was confirmed by cytokine array and tube formation assay.
  • the separated EV lysate was applied to a cytokines array (human angiogenesis cytokine array, Abcam) according to the manufacturer's instructions.
  • the cytokines that confirmed the expression pattern through this cytokines array are shown in [Table 3].
  • MSC-derived EVs showed higher angiogenesis-related cytokine expression than 2D control MSC-derived EVs (FIG. 14 ).
  • angiogenic factors such as GRO, PLGF, IFN ⁇ , RANTES, IGF-1, TGF ⁇ 1, TIMP-1 and VEGF-D were highly expressed compared to other groups, The expression of I-309 and IL-10 was highly reduced.
  • EVs derived from MSC encapsulated in medium condition are I-TAC, MCP-3, MCP-4, IL-10, MMP-1, ANGPT1, MMP-9, ANGPT2, PECAM-1, PLG, IL- 2, Endostatin, IL-4, and TNF ⁇ showed high expression, and IL-6, ANG, and IL-8 showed a rather decreased expression compared to other groups.
  • EVs derived from MSCs encapsulated in rigid conditions showed similar expression levels to EVs derived from MSCs encapsulated in soft and neutral conditions in most antibodies.
  • Leptin, MCP-1, and VEGF showed higher expression than other groups under rigid conditions, and PLGF, IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , PECAM-1, PLG, IL-2, TIE-2, Endostatin, and IL- 4 and TNF-a were reduced in expression compared to the 2D control.
  • EGF EGF
  • THPO EGF-BB
  • VEGF-D ENA-78
  • MMP-9 MMP-9
  • the tube formation assay was performed as follows; Before the experiment, ⁇ -Slide Angiogenesis 15 wells (Ibidi, Martinsried, Germany) were coated with Matrigel (BD Bioscience, California, USA) for 30 minutes at 37°C. Human Umbilical Vascular Endothelial Cell (HUVEC) was trypsinized, and the cell suspension was applied to the upper well. EVs isolated from encapsulated (soft, neutral and rigid) and 2D control MSCs were added to each well to make a final 50 ⁇ l volume. Thereafter, ⁇ -Alide Angiogenesis was covered with a provided lid and incubated for 4 hours at 37°C and 5% CO 2 , and then the tube formation was imaged with an optical microscope and analyzed with the Image J program. VEGF was treated as a positive control and PBS as a negative control.
  • VEC Human Umbilical Vascular Endothelial Cell
  • the tube formation efficacy test result showed a pattern similar to that of the cytokine array result, and the encapsulated MSC-derived EV showed a higher effect than the 2D control MSC-derived EV in the angiogenesis of HUVECs in vitro (FIG. 15 ).
  • EVs isolated from MSCs encapsulated with rigid hydrogels were treated, more loops were formed than those treated with VEGF, a positive control, and EVs of soft and neutral hydrogels were compared to EVs of 2D control. It was confirmed that a large number of loops were formed.

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Abstract

본 발명은 하이드로겔의 기계적 강도를 이용한 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관신생 관련 사이토카인 조절 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 기계적 강도가 조절된 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 줄기세포를 캡슐화하는 단계를 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법, 기계적 강도가 조절된 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 캡슐화되어 배양된 줄기세포 및 상기 줄기세포로부터 유래된 세포외 소포체에 관한 것으로, 본 발명은 화학적 인자 또는 세포 형질감염 없이 하이드로겔의 기계적 강도 조절이라는 간편하고 안전한 방법을 통하여, 표적 치료 인자로 구성된 세포외 소포체의 생산 가능성을 보여주었다.

Description

하이드로겔의 기계적 강도를 이용한 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관신생 관련 사이토카인 조절 방법
본 발명은 하이드로겔의 기계적 강도를 이용한 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관신생 관련 사이토카인 조절 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 기계적 강도가 조절된 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 줄기세포를 캡슐화하는 단계를 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법, 기계적 강도가 조절된 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 캡슐화되어 배양된 줄기세포 및 상기 줄기세포로부터 유래된 세포외 소포체에 관한 것이다.
줄기세포는 자가 재생 및 다 계통 분화 능력이 있는 세포로 정의된다. 인간 배아 줄기세포(human embryonic stem cell, hESC)와 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, hiPSCs)를 포함하는 인간 다능성 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSCs)는 세 가지 모든 배엽층(germ layer)의 유도체로 분화할 수 있는 자가 재생 및 다능성의 가능성을 가지고 있다고 보고되었다. 이러한 이유로 많은 연구자들은 PSC 또는 PSC-유래 세포를 사용하여 다양한 질병을 치료하는 방법에 중점을 두었다.
중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell, MSC)는 지방, 연골 및 뼈와 같은 간엽 계통으로 분화할 수 있는 자가-재생성, 다능성 성체 줄기세포이다. 비-조혈 줄기세포로서 MSC의 표현형은 CD73, CD90 및 CD105와 같은 표면 마커의 발현 및 CD14, CD34 및 CD45의 결핍으로 특징지어진다. MSC는 초기에 골수에 존재한다고 여겨졌지만, 후속 연구에 의하면 MSC는 지방 조직, 심장, 와튼 젤리(Wharton's jelly), 치수(dental pulp), 말초 혈액, 제대혈, 생리혈, 융모막과 같은 다양한 성인 조직으로부터 분리될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 줄기세포 니치(niche) 및 조직 항상성의 유지는 이러한 다양한 조직에 존재하는 MSC에 의해 이루어진다.
최근 세포외 소포체(extracellular vesicle, EV)는 줄기세포-기반 요법의 대체제로 무 세포 치료 전략의 후보가 되었다. 세포외 소포체(EV)는 다른 세포에서 생물학적 신호를 얻거나 산화성 또는 저산소증과 같은 화학적 자극을 받았을 때 세포가 방출하는 지질막으로 둘러싸인 모든 종류의 소낭(vesicle)를 가리킨다. 세포외 소포체의 크기는 약 40nm에서 수 mm이다. 세포외 소포체에서 각 세포 유형에 특유한 생체 분자의 조합은 이중 지질 막 구조로 둘러싸여 있다. 다양한 유형의 단백질(효소, 성장 인자, 수용체 및 사이토카인), 멤브레인형 지질, 핵산 및 대사 산물이 세포외 소포체의 주요 내용물이다. 세포외 소포체는 세포, 장기 및 심지어 생물 사이의 신호 전달에 관여하며 혈액, 소변, 뇌척수액, 모유 및 타액과 같은 체액에서 검출된다. 세포외 소포체는 엑소좀(직경 30-100nm), 미세소포(100-1000nm), 그리고 세포사멸체(50-5000nm) 크기로 세분화된다. 세포외 소포체는 또한 biogenesis에 의해 구별할 수 있다. 엑소좀은 다소포체(multivesicular body, MVB)에서 유래한 반면 미세소포(microvesicle, MV)는 세포의 원형질막에서 나와 직접 세포 외 공간으로 방출된다. 엑소좀은 CD9, CD63, CD81, Alix 또는 TSG101과 같은 단백질 마커에 의해 정량화될 수 있지만 미세소포의 특정 마커는 아직 확인되지 않았다. 크기 분석과 형태학 관찰도 가능하다.
세포외 소포체는 생체 분자의 다양하고 독특한 구성의 전달을 통해 수용체 세포 기능에 영향을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다. 이 다양한 세포 신호 전달을 통해 대상 세포가 소포 기원으로부터 원격 위치에 있더라도 표적 세포를 보호하거나 다른 메시지를 받을 수 있다. 흥미롭게도, 소포(vesicle)의 RNA 8%만이 부모 세포에서 기원한 것으로 밝혀졌으며, 270개의 독특한 유전자 전사물이 엑소좀에서 발견되었다. 세포외 소포체의 단백질은 또한 정보 전달자가 될 수 있다. MSC에서 추출한 세포외 소포체는 수많은 연구를 통해 많은 세포 상호 작용에 참여하는 것으로 입증되었다. 면역 조절 및 재생 잠재력을 보유한 것으로 알려진 MSC는 다량의 세포외 소포체를 방출하기 때문에 잠재적인 치료용 세포외 소포체 생산자로 간주된다. MSC에서 추출한 세포외 소포체는 CD44, CD73, CD90과 같은 특정 마커로 식별할 수 있다. 종합해보면, MSC는 유전 물질과 단백질의 조성이 다른 세포외 소포체를 생산하여 인접한 세포의 행동을 조절하여 기능의 재생을 유도한다고 추측할 수 있다.
Bioprocess는 실험실 규모의 연구를 성공적인 임상 요법 또는 상업화로 전환할 수 있는 기술이다. 광범위한 임상 적용을 위해서는 비용, 자동화, 표준화 및 적절한 세포 수를 가진 고품질 세포 생산과 같은 추가적인 문제를 해결해야 한다. 대량 생산 및 품질 관리는 기본적으로 고려되어야 한다. 최근 연구자들은 생물 반응기에서 세포 배양이 세포외 소포체의 생산 속도를 증가시킨다는 것을 보여주었다. 그러나 세포외 소포체의 생산 및 임상 효능을 증가시키기 위한 생물 공정 방법이 없기 때문에 줄기세포에서 추출한 세포외 소포체를 사용하는 데에는 여전히 한계가 있다. 예를 들어, 이전의 연구에서는 2차원 세포 간 접촉만 허용하는 단층 배양 조건이 세포, 세포 외 기질(ECM) 및 기타 인접 세포 간의 커뮤니케이션을 방해한다고 보고했다. 따라서 MSC가 치료 화합물을 방출하는 본래의 능력을 재현하기에는 충분하지 않다. 본 발명자의 이전 연구는 3D 스페로이드에서 MSC를 배양하여 이러한 한계를 극복하고 MSC 유래 미세소포(MV)의 증폭된 생산과 효능을 보였다. 이러한 이전 연구를 토대로, 세포외 소포체 연구를 성공적인 임상 결과로 전환하기 위해서는 보다 효과적인 생물 공정 기술이 필요하다.
본 발명은 MSC의 3D 바이오 프로세싱 및 그의 배양 매트릭스를 통해 EV의 치료 화합물을 맞춤형 제작하는 것을 목표로 한다.　MSC와 배양 매트릭스 간의 물리적 상호 작용은 MSC가 표적 질병에 대한 준비된 사이토카인의 조합으로 측분비인자(paracrine factor)를 분비하도록 자극한다. 배양 매트릭스의 물리적 특성을 조절하는 것은 세포를 겔마(GelMA, Gelatin methacryloyl) 하이드로겔로 캡슐화함으로써 달성된다. 세포 개질(cell remodeling)에 관여하는 아르기닌-글리신-아스파르트산(arginine-glycine-aspartic acid, RGD) 서열, 세포 부착점(cellular attachment point) 및 매트릭스 메탈로프로티나제(matrix metalloproteinase, MMP) 반응성 펩티드 모티프를 함유하고 있는, 상기 3D GelMA 하이드로겔은 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)에 둘러싸인 미세 환경을 모방할 수 있다. 이는 세포의 증식과 세포 골격 확장을 허용하여 다른 세포 모폴로지를 나타낸다. 본 발명은 화학적 인자 또는 세포 형질감염 없이 표적 치료 인자로 구성된 EV의 생산 가능성을 보여 주었기 이러한 접근법은 더 큰 규모의 플랫폼에 적용될 수 있으며, MSC에서 추출한 EV를 임상 시험에 적용할 수 있게 해준다.
상기한 기술적 과제를 달성하고자, 본 발명은 기계적 강도가 조절된 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 줄기세포를 캡슐화하는 단계를 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법을 제공하며, 상기 방법은 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 캡슐화된 줄기세포를 진탕 배양 또는 바이오리액터로 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 바이오리액터(bioreactor)는 생물의 체내에서 이루어지는 물질의 분해, 합성, 화학적인 변환 등의 생화학적 반응 과정을 인공적으로 재현하는 시스템을 지칭하며, 생물반응장치라고도 한다.
상기 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 성체줄기세포(adult stem cells), 유도만능줄기세포(induced pluripotent step cells; iPS cells), 및 전발생세포(progenitor cells)를 모두 포괄하는 의미로 사용될 수 있으며, 예컨대, 줄기세포는 배아줄기세포, 성체 줄기세포, 만능유도줄기세포, 및 전발생세포들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 줄기세포는 동종 유래의 줄기세포 및/또는 자가 유래의 줄기세포일 수 있다. 바람직하게 상기 줄기세포는 성체줄기세포, 예컨대, 중간엽줄기세포, 보다 구체적으로 인간 중간엽줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
세포외소포체란 세포에서 생성되어 세포 밖으로 분비되는 소포체로써, 엑소좀(exosome), 마이크로베지클(microvesicle), 마이크로파티클(microparticle) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포외 소포체는 줄기세포로부터 유래한 세포외 소포체일 수 있다.
세포외 소포체의 크기는 약 40nm에서 수 mm일 수 있고, 세포외 소포체에서 각 세포 유형에 특유한 생체 분자의 조합은 이중 지질막 구조로 둘러싸여 있다. 다양한 유형의 단백질(enzymes, growth factors, receptor 및 cytokine), 멤브레인형 지질, 핵산 및 대사 산물이 세포외 소포체의 주요 내용물이다. 세포외 소포체는 세포, 장기 및 심지어 생물 사이의 신호 전달에 관여하며 혈액, 소변, 뇌척수액, 모유 및 타액과 같은 체액에서 검출될 수 있다.
3차원 고분자 세포 지지체는 세포의 체외 배양 및 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체로 세포성장을 유도분화하고 촉진시킬 수 있으며, 생체적합성이며 생분해성인 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 3차원 고분자 세포 지지체는 메타크릴레이트화된 젤라틴(methacrylated gelatin, GelMA)를 포함하는 하이드로겔로서, 줄기세포의 부착능이 우수하며, 젤라틴과 같은 천연생체고분자를 기반으로 한다.
본 발명에 따른 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법은 줄기세포를 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 캡슐화하는 것을 특징으로 하며, 상기 캡슐화 방법은 메타크릴레이트화된 젤라틴(methacrylated gelatin, GelMA) 용액에 줄기세포 및 광개시제를 혼합하고, 상기 혼합 용액에 UV를 조사하여 이루어지고, 상기 메타크릴레이트화된 젤라틴은 UV 조사에 의하여 상호 교차결합(cross-linking)된다.
상기 3차원 고분자 세포 지지체의 기계적 강도는 상기 혼합 용액에 조사되는 UV 강도에 의하여 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 GelMA 수화젤을 제조할 때 GelMA의 methacryloylation 정도, 즉 GelMA의 치환도가 높을수록 가교 밀도가 증가하고 제조된 수화젤의 강성(stiffness)이 증가할 수 있어 이와 같은 방법에 의하여 세포 지지체의 기계적 강도를 조절할 수도 있다.
상기 조사되는 UV의 강도는 1 ~ 10mW/cm2, GelMA(시편)와의 거리는 3 ~ 10cm이며, 이는 고분자의 종류에 따라서 적절하게 조절될 수 있으며, 바람직하게는 2 ~ 5mW/cm2이고, 거리는 5 ~ 9cm이며 가장 바람직하게는 3.8mW/cm2, 거리는 7cm이다. UV의 강도가 너무 강하면 줄기세포의 DNA 손상을 유발하여 세포노화와 세포사멸을 유도할 수 있기 때문에, UV의 강도와 GelMA와의 거리를 상기 기재된 범위로 유지하는 것이 바람직하다.
상기 세포 지지체의 기계적 강도는 3 ~ 30kPa 범위에서 3단계로 구분되는데 연성(soft)의 강도를 갖는 세포 지지체는 1 ~ 5초 동안 UV를 조사하며 이때 세포 지지체의 영률(Young's modulus, kPa)은 3 ~ 10kPa이고; 중성(medium)의 강도를 갖는 세포 지지체는 6 ~ 15초 동안 UV를 조사하며 이때 영률은 11 ~ 18kPa이고; 강성(hard)의 강도를 갖는 세포 지지체는 16 ~ 25초 동안 UV를 조사하며 이때 영률은 19 ~ 30kPa이다.
상기 세포 지지체의 기계적 강도가 3kPa 미만이면 세포 배양 과정에서 하이드로젤이 풀어지게 되고, 기계적 강도가 30kPa를 초과하는 경우에는 세포가 자라지(growth) 못하게 된다.
적절한 상업적 UV 광개시제는 CIBA SPECIALTY CHEMICALS사로부터 입수 가능한 Irgacure TM 184, Irgacure TM 500, Irgacure TM 907, Irgacure TM 369, Irgacure TM 1700, Irgacure TM 651, Irgacure TM 819, Irgacure TM 1000, Irgacure TM 1300, Irgacure TM 1870, Irgacure TM 2959, Darocur TM 1173, Darocur TM 2959, Darocur TM 4265 및 Darocur TM ITX, BASF AG사로부터 입수 가능한 Lucerin TM TPO, LAMBERTI사로부터 입수 가능한 Esacure TM KT046, Esacure TM KIP150, Esacure TM KT37 및 Esacure TM EDB, SPECTRA GROUP Ltd.사로부터 입수 가능한 H-Nu TM 470 및 H-Nu TM 470X를 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 2-hydroxy-1-(4-(hydroxyethoxy)phenyl)-2-methyl-1-propanone(Irgacure TM 2959)을 사용하였다.
상기 방법으로 줄기세포를 캡슐화한 이후, 이를 진탕 배양하면 혈관신생 관련 사이토카인인 EGF, THPO, PDGF-BB, VEGF-D, ENA-78 또는 MMP-9 중 어느 하나 이상의 사이토카인 발현을 2D 대조군에 비하여 증가시키며, 이는 기계적 강도에 상관없이 모든 그룹(연성, 중성 및 강성)에서 나타나는 특징이다.
연성 그룹(3 ~ 10kPa)에서 배양된 줄기세포의 세포외 소포체(EV)의 경우 I-309 또는 IL-10 중 어느 하나 이상의 사이토카인 발현이 다른 그룹(중성, 강성 및 2D 대조군)에 비하여 감소되며, GRO, PLGF, IFNγ, RANTES, IGF-1, TGFβ1, TIMP-1 또는 VEGF-D 중 어느 하나 이상의 사이토카인 발현이 다른 그룹에 비하여 증가된다.
중성 그룹(11 ~ 18kPa)에서 배양된 줄기세포의 세포외 소포체(EV)의 경우 I-TAC, MCP-3, MCP-4, IL-10, MMP-1, ANGPT1, MMP-9, ANGPT2, PECAM-1, PLG, IL-2, Endostatin, IL-4, 또는 TNFα 중 어느 하나 이상의 사이토카인 발현이 다른 그룹(연성, 강성 및 2D 대조군)에 비하여 증가되며, IL-6, ANG 또는 IL-8 중 어느 하나 이상의 사이토카인 발현이 다른 그룹에 비하여 감소된다.
강성 그룹(19 ~ 30kPa)에서 배양된 줄기세포의 세포외 소포체(EV)의 경우 PLGF, IL-1α, IL-1β, PECAM-1, PLG, IL-2, TIE-2, Endostatin, IL-4 또는 TNF-a 중 어느 하나 이상의 사이토카인 발현이 다른 그룹(연성, 중성 및 2D 대조군)에 비하여 감소하며, Leptin, MCP-1 또는 VEGF 중 어느 하나 이상의 사이토카인 발현이 다른 그룹에 비하여 증가한다.
본 발명의 다른 실시 예에서, 기계적 강도가 조절된 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 캡슐화되어 배양된 줄기세포 및 상기 줄기세포로부터 유래된 세포외 소포체가 제공된다. 상기 캡슐화는 메타크릴레이트화된 젤라틴(methacrylated gelatin, GelMA) 용액에 줄기세포 및 광개시제를 혼합하고, 상기 혼합 용액에 UV를 조사하여 이루어질 수 있으며, 기계적 강도는 UV 조사 시간에 의하여 조절된다. 또한 상기 배양된 줄기세포는 collagenase로 상기 GelMA를 분해하여 분리할 수 있으며, 상기 줄기세포는 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인이 증가된 것을 특징으로 한다.
줄기세포로부터 세포외 소포체를 분리하는 방법은 알려진 통상적인 모든 방법에 의하여 수행될 수 있으며, 예컨대 원심분리, 필터링(Filtering), 컬럼(size exclusion column), exoquick 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명자는 세포외 소포체 분리를 위하여 tangential flow filtration(TFF)를 이용하였다.
또 다른 실시 예에서, 상기 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 유래된 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생의 유도 또는 촉진을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인이 증가된 줄기세포 유래 세포외 소포체는 대조군에 비하여 다양한 혈관신생 사이토카인의 발현이 증가되는 것뿐만 아니라 상기 세포외 소포체를 HUVEC에 처리한 경우 대조군에 비하여 효과적으로 혈관신생을 유도하여 혈관을 형성한다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 상기 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 유래된 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생의 유도 또는 촉진을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 혈관신생을 필요로 하는 질환, 예를 들어 심근경색증, 뇌졸중, 저산소성 허혈성 뇌손상, 하지동맥경화성 질환 등의 허혈성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 유래된 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 즉 세포 치료제(cell therapy) 분야에서 통상적으로 사용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 통상의 제제학적 방법에 따라 세포이식을 위한 조직 내-이식용 주사제, 정맥 주사제, 주사용 동결건조제제 등의 형태로 제제화될 수 있으며, 특히 바람직하게는 세포이식을 위한 조직내-이식용 주사제의 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균된 수용액(예를 들어, 생리 식염수 등), 비수성용제 등을 포함할 수 있다. 또한, 필요에 따라 적절한 안정화제, 아주반트(예를 들어, 프로인트 완전 아주반트, 프로인트 불완전 아주반트 등), 등장화제, 보존제 등을 포함할 수도 있다.
본 발명의 하이드로겔의 기계적 강도를 이용한 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관신생 관련 사이토카인 조절 방법은 화학적 인자 또는 세포 형질감염 없이 하이드로겔의 기계적 강도 조절이라는 간편하고 안전한 방법을 통하여, 표적 치료 인자로 구성된 세포외 소포체의 생산 가능성을 보여주었다.
도 1은 본 발명의 캡슐화 과정을 개략적으로 나타낸 그림이다; (a) 처리되지 않은 슬라이드 글라스를 10% NaOH 용액에 담근 후, TMS-PMA 및 PEG로 코팅하였다. (b) 트립신 처리된 MSC를 1:5(v/v)의 비율로 0.005% PI 용액에서 10% 겔마와 혼합하였다. (c) 제작된 PDMS 스페이서 위에 Cell-GelMA 혼합물을 300㎛의 높이로 놓고 UV를 조사하였다. (d) 자외선의 출력은 3.8 mW/cm2이고, 경화 시간은 연성, 중성 및 강성에 대해 각각 3초, 10초 및 20초이다. (e) 캡슐화된 MSC는 20 rpm의 속도로 궤도 진탕기에서 5일 동안 배양되었다.
도 2는 GelMA의 기계적 성질을 AFM로 측정한 결과를 나타낸다; (a) GelMA 샘플의 힘-거리 곡선과 (b, c) GelMA의 힘-거리 곡선으로부터의 영률값.
도 3은 연성, 중성 및 강성 GelMA 하이드로겔의 FIB Quanta 3D 이미지이다.
도 4는 MSC 마커의 qRT-PCR 분석결과를 나타낸 것으로, 획득된 Ct값은 GAPDH로 정규화되었다.
도 5는 2차원 배양(2D) 대조군 MSCs의 면역세포화학(Immunocytochemistry) 이미지이다; (a) DAPI 처리되지 않은 음성 대조군, (b) DAPI 처리된 음성 대조군, (c) 양성 MSC 마커인 CD105로 면역 염색된 2차원 배양(2D) 대조군 MSCs.
도 6은 캡슐화된 MSC의 광학 현미경 이미지이다;(a) 연성, (b) 중성, (c) 강성 GelMA 하이드로겔.
도 7은 캡슐화된 MSC의 Live and Dead 결과를 보여주는 사진이다;(a) 연성, (b) 중성, (c) 강성 GelMA 하이드로겔.
도 8은 배양 5일 후의 캡슐화된 MSC의 팔로이딘(phalloidin) 염색 이미지이다; (a) 연성, (b) 중성, (c) 강성 GelMA 하이드로겔, 팔로이딘(녹색), DAPI(파랑).
도 9는 캡슐화된 MSC 및 2차원 배양(2D) MSC의 유전자 발현 프로파일 분석결과를 비교한 그림이다; 캡슐화된 MSC의 유전자 발현 프로파일에 대한 (a) qPCR array, (b) 산점도(scatter plot), (c) 그래프.
도 10은 캡슐화된 MSC의 DNA 정량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 분리된 세포외 소포체의 TEM 이미지이다.
도 12는 세포외 소포체의 크기 분포를 나타내는 그래프이다; (a, b) GelMA 캡슐화된 MSC로부터 유래된 세포외 소포체의 크기 분포 그래프, (c) 평균 크기.
도 13은 분리된 세포외 소포체의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 사진이다.
도 14는 분리된 세포외 소포체의 혈관신생 사이토카인 어레이(Angiogenic cytokine array) 분석 결과이다.
도 15는 분리된 세포외 소포체의 시험관 튜브 형성 효능 실험(tube formation efficacy assay) 결과를 나타내는 그림이다; VEGF는 양성 대조군이며, PBS는 음성 대조군임.
이하, 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기위한 것일 뿐 어떠한 의미로든 본 발명의 범위가 이들 예로 한정되는 것은 아니다.
실시예
(1) 캡슐화 준비
무-처리 베어 슬라이드 글래스는 다이아몬드 커터를 사용하여 24 Х 24mm로 절단하고 실온에서 밤새 10% NaOH 용액에 담가 놓았다. 글래스를 증류수 및 70% 에탄올로 2회 세척한 후 건조시켰다. 완전 건조된 글래스는 80℃에서 3-트리메톡시실릴프로필 메타크릴레이트(3-trimethoxysilyl propyl methacrylate, TMS-PMA) 용액으로 밤새 처리하였다. TMS-PMA 코팅 유리를 PEG 용액으로 스핀 코팅하였다. Working PEG 용액은 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline, PBS), 폴리(에틸렌 글리콜) 1000 디메타크릴레이트(Poly(ethylene glycol) 1000 dimethacrylate, PEG), 광개시제(2-hydroxy-1-(4-(hydroxyethoxy)phenyl)-2-methyl-1-propanone)를 각각 10:1:0.1의 비율로 포함한다. PEG-코팅된 유리는 3.8 mW/cm2의 출력에서 60초 동안 UV 유도 가교 결합되었다(Omnicure® S2000, Excelitas Technologies Corp., Massachusetts, USA). 경화된 유리를 PBS로 다시 세척하고 건조시켰다. 캡슐화하기 전에, 10% 겔마(GelMA, Gelatin methacryloyl)를 함유하는 겔마 하이드로겔 용액 및 PBS 중의 0.05%의 광개시제를 새로 제조하고 즉시 사용하였다. 높이가 300㎛인 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 스페이서도 캡슐화 공정을 위해 제작되었다.
(2) MSC의 배양 및 캡슐화
인간중간엽줄기세포(hMSCs, PT2501, Lonza, Basel, Switzerland)를 5% CO2를 함유한 습한 대기에서 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. MSC의 확장(expansion)을 위해 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 항생제-항균제를 포함하는 Low-glucose DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)를 사용하였다. 배지는 3-4일마다 교체되었다. 캡슐화된(Encapsulated) MSCs는 10% FBS와 1% 항생제-항균제를 포함하는 Low-glucose DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)와 함께 배양하였다.
hMSC의 캡슐화를 위해, 세포를 TrypLE Express(Gibco)로 해리시키고 세포 수를 혈구계(hemocytometer)로 계산하였다. 트립신 처리된(Trypsinized) 세포를 1.5 x 105 세포/총 부피 75㎕의 농도로 5:1의 비율로 겔마(GelMA) 용액과 캡슐화 배지에 현탁시켜, 최종 겔마(GelMA) 농도를 8.3%로 만들었다. 현탁된 hMSC를 포함하는 GelMA 용액 75㎕를 TMS-PMA 및 PEG-코팅된 슬라이드 글라스에 부었다. MSC는 달리 조절된 기계적 강도(mechanical stiffnesses)를 갖는 가교 결합된 겔마(GelMA) 내에 캡슐화되었다; 즉, 연성(Soft)(3.8mW/cm2에서 3초), 중성(Medium)(3.8mW/cm2에서 10초), 강성(Hard)(3.8mW/cm2에서 20초). 캡슐화된 MSC는 20rpm의 궤도-진탕 조건하에서 5일 동안 배양되었다. 배지는 배양 기간 동안 변경되지 않았다.
실험예
(1) 겔마(GelMA) 하이드로겔에 의한 배양 기질(culture matrix)의 물리적 특성 조절
겔마(GelMA) 하이드로겔의 기계적 성질은 하이드로젤용 probehand가 장착된 원자 힘 현미경(AFM, XE-120, Park Systems, Suwon, South Korea)을 사용하여 힘-거리(F/D) 곡선 측정에 의해 조사되었으며, F/D 곡선 측정은 PBS 용액으로 채워진 액체 환경에서 수행되었고 각 샘플의 무작위로 선택된 5개의 포인트에서 기록되고 평균화되었다.
Figure PCTKR2019005186-appb-T000001
상이한 강도(stiffness)를 갖는 각 겔마 하이드로겔의 영률(Young's modulus, kPa)을 측정하였으며, 결과는 '강성' 그룹에서 가장 높은 영률(19 ~ 30kPa)을 나타냈으며 연성 그룹에서 가장 낮은 영률(3 ~ 10kPa)을 나타내었다(도 2). 겔마(GelMA) 하이드로겔의 공극율(Porosity)과 형태(morphology)는 Focused Ion Bean Quanta 3D(FIB Quanta 3D)에 의해 관찰되었다. 기공 크기(Pore size)와 공극율은 하이드로겔의 강도가 증가함에 따라 감소하였다(도 3).
(2) 상이한 기계적 특징에서 MSC의 캡슐화 및 배양
인간 골수 유래 MSC를 정상 세포 확장 배지(expansion medium)와 함께 배양하였다. MSC는 qRT-PCR 및 면역세포화학(Immunocytochemistry)을 사용하여 세포 표면 마커 발현에 대해 평가되었다.
면역세포화학(Immunocytochemistry) 실험은 아래의 과정으로 수행하였다; hMSCs는 4℃에서 10분간 4%(w/v) 파라포름알데히드(Biosesang, 성남, 한국)에 고정시켰다. PBS로 세척한 후, 샘플을 0.2% Triton X-100에서 15분 동안 투과화하였다. 샘플을 PBS로 3회 재세척하고 밤새 4℃에서 4% BSA(Bovine serum albumin)으로 차단시켰다. 차단 후, 캡슐화된 세포를 세포의 세포 골격 구조의 이미징을 위해 4℃에서 밤새 Alexa Fluor 488 Phalloidin(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)과 함께 배양 하였다. MSC의 특성 규명을 위해 2D 대조군 MSC를 4℃에서 밤새 1차 항체 mouse-anti CD105(Abcam, Cambridge, England)와 2차 항체 AlexaFluor 488 anti-mouse IgG(Abcam)와 함께 상온에서 2시간 동안 배양하였다. 샘플을 1% BSA로 3회 세척하고 암실에서 실온에서 10분 동안 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, Thermo Fisher Scientific)과 함께 배양 하였다. 샘플을 1% BSA 및 PBS로 각각 1회 세척하였다. 시료는 mountant(ThemoFisher Scientific)를 사용하여 보존하였다. 공초점 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)으로 이미지를 시각화하였다.
상기 실험 결과 MSC는 qRT-PCR 결과에서 CD73 및 CD105에 대해 양성 발현, CD34 및 CD45에 대해 음성을 나타내었다(도 4). 염색 데이터는 양성 대조군에서 MSCs의 CD105 발현을 나타내었으며 음성 대조군에는 CD105 발현을 확인할 수 없었다(도 5).
MSC는 겔마(GelMA)의 기계적 강성을 조절함으로써 달성된 서로 다른 매트릭스 특성을 갖는 겔마(GelMA) 하이드로겔에 3차원적으로 캡슐화되었다. 캡슐화된 MSC는 20 rpm의 궤도-진탕 조건하에서 FBS 배양 배지를 사용하여 배양되었다.
캡슐화된 MSC는 기질의 강성이 다양함에 따라 다른 형태를 나타내었다. 연성 조건에서 MSCs는 '뉴런-형(neuron-like)'과 때로는 '응집된(aggregated)' 형태를 보여 주었으며, 세포 골격 확장(cytoskeleton extension)이 관찰되었다. 강성 그룹에서는 반대로, MSC의 형태는 둥글고 응집되지 않았으며, 그 세포 골격이 확장되지 않았다(도 6 및 8). 그러나 MSC는 여전히 다른 세포 거동을 보이면서도 MSC 줄기세포능(stemness)을 유지하였다(도 9). 캡슐화된 MSCs는 live and dead assay에서 높은 생존력을 보였다(도 7). 또한, DNA 정량화 결과는 배양 기간 동안 캡슐화된 MSC가 성장(growing)하는 것으로 나타났다(도 10).
(3) 캡슐화 및 2D 대조군 MSC의 유전자 발현 프로파일링
생물학적 특성을 특성화하기 위해, 캡슐화된 MSC 및 2D 대조군 MSC의 유전자 발현 패턴을 분석하였다. 유전자 발현 패턴은 qRT-PCR에 의해 분석하였으며 그 실험방법은 아래와 같다.
캡슐화된 MSC의 총 RNA를 배양 5일째에 추출하고, Collagenase(Sigma)를 GelMA 하이드로겔 분해에 사용하였다. 클로로포름(Sigma)을 1:5(v/v)의 비율로 TRIzol 시약(ThemoFisher Scientific) 처리 샘플에 첨가하였다. 클로로포름과 TRIzol을 혼합한 시료를 4℃, 15,000 rpm으로 15 ~ 20분간 원심 분리한 후, 상등액을 단리하고 1:1의 비율로 이소프로판올(Sigma)과 혼합하였다. 다시 4℃, 15,000 rpm으로 20분간 원심 분리한 후, 상등액을 버리고 펠릿을 70% 에탄올로 세척한 다음 동일한 조건에서 다시 원심 분리하였다. 용액을 제거하고 펠릿을 실온에서 수 분간 완전히 건조시켰다. 펠릿을 적절한 DEPC 처리되지 않은 nuclease-free water(Invitrogen)에 용해시켰다. ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(TOYOBO, Osaka, Japan)를 사용하여 역전사하여 제조사의 지시에 따라 cDNA를 제조하였으며, qRT-PCR 어레이는 지시에 따라 RT2 프로파일러 PCR 어레이(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 수행되었다.
상기 qRT-PCR 결과를 도 9(a)에 그래프로 나타내었다. 상기 실험에서 확인한 발현 유전자는 [표 2]에 도시하였다.
Figure PCTKR2019005186-appb-T000002
강성 그룹의 MSC는 2D 대조군 MSC와 비교하여, 강화된 혈관신생(angiogenesis), 연골형성(chondrogenesis), 골형성(osteogenesis), 신경생성(neurogenesis) 및 면역 조절(immunomodulation) 관련 유전자 발현을 보였다.
구체적으로 강성 그룹에서는 혈관신생(angiogenesis) 관련 유전자 중에서 CSF3, EGF, FUT1, HGF 및 VWF 유전자; 연골형성(chondrogenesis) 관련 유전자 중에서 ABCB1, BMP4, GDF6, GDF7, HAT1 및 ITGAX; 골형성(osteogenesis) 관련 유전자 중에서 BGLAP. BMP6, FGF10, HDAC1, HNF1A, RUNX2, SMURF1 및 TBX5; 신경생성(neurogenesis) 관련 유전자 중에서 NES, CSF2 및 IL1B; 면역 조절(immunomodulation) 관련 유전자 중에서 PTPRC, TGFB3, ICAM1, IFNG, IL10 및 TNF 유전자가 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
대조적으로, 지질생성(adipogenesis), 테노제네시스(tenogenesis), 근발생(myogenesis), 및 항-세포사멸(anti-apoptosis)에 관련된 유전자는 하향 조절되었다.
구체적으로 지질생성(adipogenesis) 관련 유전자 중에서 RHOA; 테노제네시스(tenogenesis) 관련 유전자 중에서 GDF15, SMAD4 및 TGFB1; 근발생(myogenesis) 관련 유전자 중에서 ACTA2 및 JAG1; 항-세포사멸(anti-apoptosis) 관련 유전자인 GTF3A 유전자의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
흥미롭게도 강성 그룹의 MSC는 2D 대조군 MSC와 비교하여, 줄기세포로서의 특성은 고도로 상향 조정되었고 다른 생물학적 특성은 변화를 보였다. 구체적으로 줄기세포능(Stemness) 마커 유전자 중에서 INS2, LIF, POU5F1, SOX2, TERT, WNT3A 및 ZFP42 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
중성 그룹의 MSC는 강성 그룹과 유사한 유전자 발현 패턴을 나타내었으나, 연성 그룹의 MSC는 강성 그룹과는 다른 유전자 발현 패턴을 나타내는 경향이 있었다. 연성 그룹의 MSC에서 연골형성(chondrogenesis), 면역 조절(immunomodulation), 신경생성(neurogenesis), 테노제네시스(tenogenesis), 골형성(osteogenesis), 근발생(myogenesis) 관련 유전자, 및 MSC 특이적 마커는 하향 조절되었으나, 혈관신생(angiogenesis), 지질생성(adipogenesis), 항-세포사멸(anti-apoptosis)에 관련된 유전자는 큰 변화를 나타내지 않았다.
구체적으로 연골형성(chondrogenesis) 관련 유전자 중에서 BMP4, KAT2B 및 COL1A1; 골형성(osteogenesis) 관련 유전자 중에서 ANXA5, PTK2, SMURF1 및 SMURE2; 면역 조절(immunomodulation) 관련 유전자 중에서 ITGB1 및 PTPRC; 신경생성(neurogenesis) 관련 유전자 중에서 BDNF 및 VIM; 테노제네시스(tenogenesis) 관련 유전자 중에서 GDF15 및 SMAD4; 근발생(myogenesis) 관련 유전자 중에서 ACTA2 및 JAG1 유전자의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
(4) 캡슐화 및 2D 대조군 MSC에 의해 생성된 EV의 특성
배양 5일째에 캡슐화된 MSC로부터 수집된 EVs를 투과 전자 현미경(TEM)으로 이미지화하고, 이들의 형태를 시각화하였다.
EV는 다음과 같은 방법으로 분리하였다; 캡슐화된 hMSCs 조정 배지(conditioned medium)를 배양 5일째에 수집하고, 0.22㎛ 막 주사기 필터를 통해 여과하여 죽은 세포를 제거하였다. 수집된 배지를 100,000g, 4℃에서 1시간 동안 원심분리하고 그 상등액을 제거하였다. 수집된 EVs의 세척을 위해 PBS를 넣고 100,000g, 4℃에서 1시간 동안 다시 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 EV를 펠릿으로 수집하였다. 수집된 EV는 둥근 bi-lipid 막 구조를 보였다(도 11).
EV의 크기 분포는 NTA(nanoparticle tracking analysis, Malvern Panalyitcal, Malvern, United Kingdom) 시스템에 의해 분석되었다. 겔마로 캡슐화된 MSC의 EV는 2D 대조군에 비해 크기가 큰 EV의 비율이 더 높았다(도 12). Western blot은 수집된 EV가 세포사멸체(apoptotic body)가 아님을 보여주기 위해 수행되었다. EVs는 세포사멸체 발현을 나타내지 않았다(도 13).
(5) 캡슐화된 MSC 유래 EV의 혈관 생성 효능(Angiogenic efficacy)
캡슐화된 MSC 유래 EVs의 혈관 생성 효능은 사이토카인 어레이 및 튜브 형성 분석(tube formation assay)에 의해 확인되었다.
분리된 EV의 용해물은 제조사의 지시에 따라서 cytokines array(human angiogenesis cytokine array, Abcam)에 적용하였다. 본 cytokines array를 통하여 발현 패턴을 확인한 사이토카인(cytokine)은 [표 3]에 나타내었다.
Figure PCTKR2019005186-appb-T000003
cytokines array결과를 살펴보면, 일반적으로 캡슐화된 MSC 유래 EV는 2D 대조군 MSC 유래 EV보다 높은 혈관 신생 관련 사이토카인 발현을 나타냈다(도 14).
특히, 연성 조건으로 캡슐화된 MSC에서 유래된 EV의 경우, GRO, PLGF, IFNγ, RANTES, IGF-1, TGFβ1, TIMP-1 및 VEGF-D와 같은 혈관 신생 인자는 다른 그룹에 비해 높게 발현되었으며, I-309 및 IL-10의 발현이 높게 감소하였다.
중성(medium) 조건으로 캡슐화된 MSC에서 유래된 EV는 I-TAC, MCP-3, MCP-4, IL-10, MMP-1, ANGPT1, MMP-9, ANGPT2, PECAM-1, PLG, IL-2, Endostatin, IL-4, 및 TNFα에서 높은 발현이 나타났고, IL-6, ANG 및 IL-8에서는 다른 그룹에 비하여 오히려 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
강성 조건으로 캡슐화된 MSC에서 유래된 EV는 대부분의 항체에서 연성 및 중성 조건에서 캡슐화된 MSC에서 유래된 EV와 유사한 발현 수준을 나타내었다. 특히 강성조건에서는 Leptin, MCP-1 및 VEGF에서 다른 그룹에 비하여 높은 발현을 나타내었으며, PLGF, IL-1α, IL-1β, PECAM-1, PLG, IL-2, TIE-2, Endostatin, IL-4 및 TNF-a는 2D 대조군에 비하여 발현이 감소하였다.
EGF, THPO, PDGF-BB, VEGF-D, ENA-78 및 MMP-9는 연성, 중성 및 강성 모든 그룹에서 2D 대조군에 비하여 발현이 증가하였으며, bFGF는 연성 및 강성 그룹에서 다른 그룹에 비하여 발현이 증가하였으며, G-CSF, I-TAC, uPAR, VEGFR2 및 MCP-4는 중성 및 강성 그룹에서 다른 그룹에 비하여 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
튜브 형성 효능 시험(tube formation assay)은 다음과 같이 수행하였다; 실험 전 μ-Slide Angiogenesis 15 well(Ibidi, Martinsried, Germany)을 37℃에서 30분 동안 마트리겔(BD Bioscience, California, USA)로 코팅하였다. Human Umbilical Vascular Endothelial Cell(HUVEC)을 트립신 처리하고, 세포 현탁액을 상부 웰이 적용하였다. 캡슐화(연성, 중성 및 강성) 및 2D 대조군 MSC로부터 분리된 EV를 각 웰에 첨가하여 최종 50㎕의 부피를 만들었다. 이후 μ-Alide Angiogenesis를 제공된 뚜껑으로 덮고 37℃, 5% CO2에서 4시간 배양한 후 튜브 형성을 광학 현미경으로 영상화하고 Image J 프로그램으로 분석하였다. VEGF는 양성 대조군, PBS는 음성 대조군으로 처리하였다.
튜브 형성 효능 시험 결과는 사이토카인 어레이 결과와 유사한 패턴을 보였으며, 시험관 내 HUVEC의 혈관 생성에서 2D 대조군 MSC-유래 EV보다 캡슐화된 MSC-유래 EV가 더 높은 효과를 나타내었다(도 15). 강성 하이드로겔로 캡슐화된 MSC로부터 분리된 EV를 처리한 경우, 양성 대조군인 VEGF를 처리한 것보다 더 많은 loop를 형성하는 것을 확인할 수 있으며, 연성 및 중성 하이드로겔의 EV는 2D 대조군의 EV에 비하여 많은 수의 loop를 형성하는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (19)

  1. 기계적 강도가 조절된 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 줄기세포를 캡슐화하는 단계를 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 캡슐화된 줄기세포를 진탕 배양 또는 바이오리액터로 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 만능유도줄기세포, 및 전발생세포(progenitor cells)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 3차원 고분자 세포 지지체는 메타크릴레이트화된 젤라틴(methacrylated gelatin, GelMA)를 포함하는 하이드로겔인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 캡슐화는 메타크릴레이트화된 젤라틴(methacrylated gelatin, GelMA) 용액에 줄기세포 및 광개시제를 혼합하고, 상기 혼합 용액에 UV를 조사하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 기계적 강도는 상기 혼합 용액에 조사되는 UV 강도에 의하여 조절되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 EGF, THPO, PDGF-BB, VEGF-D, ENA-78 또는 MMP-9 중 어느 하나 이상의 사이토카인 발현을 2D 대조군에 비하여 증가시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 기계적 강도는 3 ~ 30 kPa 범위에서 조절되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 기계적 강도가 3 ~ 10kPa인 경우, GRO, PLGF, IFNγ, RANTES, IGF-1, TGFβ1, TIMP-1 또는 VEGF-D 중 어느 하나 이상의 사이토카인 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 기계적 강도가 3 ~ 10kPa인 경우, I-309 또는 IL-10 중 어느 하나 이상의 사이토카인 발현이 감소되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 기계적 강도가 11 ~ 18kPa인 경우, I-TAC, MCP-3, MCP-4, IL-10, MMP-1, ANGPT1, MMP-9, ANGPT2, PECAM-1, PLG, IL-2, Endostatin, IL-4, 또는 TNFα 중 어느 하나 이상의 사이토카인 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 기계적 강도가 11 ~ 18kPa인 경우, IL-6, ANG 또는 IL-8 중 어느 하나 이상의 사이토카인 발현이 감소되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 기계적 강도가 19 ~ 30kPa인 경우, Leptin, MCP-1 또는 VEGF 중 어느 하나 이상의 사이토카인 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 기계적 강도가 19 ~ 30kPa인 경우, PLGF, IL-1α, IL-1β, PECAM-1, PLG, IL-2, TIE-2, Endostatin, IL-4 또는 TNF-a 중 어느 하나 이상의 사이토카인 발현이 감소되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인 조절 방법.
  15. 기계적 강도가 조절된 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 캡슐화되어 배양된 줄기세포.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 줄기세포는 세포외 소포체의 혈관 신생 관련 사이토카인이 증가된 것을 특징으로 하는, 줄기세포.
  17. 제15항 또는 제16항 중 어느 한 항에 따른 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 혈관신생의 유도 또는 촉진을 위한 약학적 조성물.
  18. 제15항 또는 제16항 중 어느 한 항에 따른 줄기세포 유래 세포외 소포체.
  19. 제18항에 따른 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생의 유도 또는 촉진을 위한 약학적 조성물.
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