CN110904029B

CN110904029B - 一种单个哺乳动物细胞纳米封装方法及所得封装细胞

Info

Publication number: CN110904029B
Application number: CN201911328017.9A
Authority: CN
Inventors: 杨建民; 石贤爱; 孙继敏; 任亚凤; 郑允权
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: CN110904029A

Abstract

本发明公开了一种单个哺乳动物细胞的纳米封装方法及所得封装细胞，属于生物医学领域。该方法先将哺乳动物细胞制成单细胞悬浮液，随后将其加入带正电荷封装基质的溶液中进行反应；反应完成后，洗涤细胞将其重悬于带负电荷封装基质的溶液中，并加入谷氨酰胺转胺酶进行反应，得到封装层数为2层的封装细胞；循环上述步骤n次，得到封装层数为2n层的封装细胞，并制成封装细胞悬浮液；向该封装细胞悬液中加入谷氨酰胺转胺酶，在20~37℃下交联反应20~120min并保持轻微振荡，离心收集细胞并洗涤后得到表面封装层数为2n层的哺乳动物单细胞。本发明所制得的封装细胞存活率高、封装层紧实、维持时间长，且封装材料均无细胞毒性。

Description

一种单个哺乳动物细胞纳米封装方法及所得封装细胞

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种单个哺乳动物细胞纳米封装方法及所得封装细胞。

背景技术

细胞治疗的目的是替代或修复受损的组织和器官，目前可以通过将细胞悬液经注射器或导管直接注射到组织中或腔内来实现细胞治疗。然而由于在注射过程中产生的高压和剪切应力以及体内的免疫排斥反应，移植细胞的存活率和体内持续循环时间显著降低。

细胞封装技术为解决细胞治疗过程中出现的上述问题提供了一种新途径。封装基质材料的作用与细胞外基质类似，封装层一方面需要具有良好的选择透过性，能保证氧气、小分子营养物质等的自由交换，维持被封装细胞的活性；另一方面能够保护细胞免受物理压力损伤，通过封装层的物理隔离作用减弱免疫排斥反应。

目前哺乳动物的封装方法有微封装和新兴的单细胞纳米封装技术。其中，单细胞纳米封装常用的技术有层层自组装技术（Layer by layer，简称LbL），LbL技术是指通过水溶性的聚电解质与细胞表面功能基团的强相互作用（如化学键等）或弱相互作用（如静电吸引力、氢键、配位键等），使聚电解质自发地逐层交替沉积在细胞表面上，形成结构完整、性能稳定、厚度和组成可控、对各种刺激有实时响应的纳米封装层，而且通过选择特定的聚电解质，可以调控封装层的分子截留量。

静电作用是LbL技术中常见的一种作用力，用所带电荷不同的材料通过正负电荷相互吸引，在细胞膜表面完成多层膜的构建。该操作过程比较简便，并且通过荧光染料或者具有磁性的四氧化三铁粒子等对封装材料进行修饰，就能制备出具有特殊功能的封装层，这对封装细胞的进一步应用有着至关重要的作用。

Wei X等用带正电荷的聚二甲基二烯丙基氯化铵（PDADMAC）和带负电荷的聚苯乙烯磺酸钠（PSS）在静电作用下用LbL技术封装蓝藻，进而保护蓝藻抵抗外界伤害。Kozlovskaya V等用鞣酸（TA）与聚（N-乙烯基吡咯烷酮）（PVPON）通过LbL技术封装胰岛细胞团，封装的胰岛细胞团在体外96小时内仍然能保持其活性和分泌胰岛素的功能。然而，除了使用的聚电解质（PDADMAC、PSS、TA、PVPON等）有细胞毒性外，现有的这些单细胞封装技术中单纯使用LbL技术在细胞外构建的封装层还有结构较松散和维持期比较短暂的缺点，使其不能为封装的细胞提供长期可靠的免疫保护。

因此，将单个活细胞封装在生物相容性高、结构稳定和紧密的纳米尺度封装层内仍然是细胞封装领域尚未解决的重要难题。

发明内容

本发明的目的之一在于针对有的层层自组装技术存在所构建的封装层较松散和封装基质材料较高的细胞毒性的问题，提供一种单个哺乳动物细胞纳米封装方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种单个哺乳动物细胞纳米封装方法，包括以下步骤：

（1）将带正电荷封装基质溶于生理盐水或PBS溶液中制备质量浓度为0.5~1.5mg/mL的带正电荷封装基质溶液；将带负电荷封装基质溶于生理盐水或PBS溶液中制备质量浓度为0.5~1.5mg/mL的带负电荷装基质溶液。其中带正电荷封装基质和带负电荷封装基质均选用蛋白类或多肽类物质；

（2）将哺乳动物细胞的单细胞悬液加入到步骤（1）制得的带正电荷封装基质溶液中，4~10℃下反应5~10 min并保持轻微振荡，之后离心收集细胞并洗涤，然后再将洗涤后的细胞重悬于步骤（1）制得的带负电荷封装基质溶液中得到细胞重悬液，并向细胞重悬液中加入谷氨酰胺转胺酶，使其终浓度为0.01~0.2U/mL，4~10℃下反应5 ~ 10 min并保持轻微振荡，之后离心收集细胞并洗涤，得到封装层数为2层的封装细胞；

（3）循环上述步骤（2）n次，n＞1，得到封装层数为2n层的封装细胞，并制成封装层数为2n层的封装细胞悬液；

（4）向封装层数为2n的封装细胞悬液中加入谷氨酰胺转胺酶，使其终浓度为（0.01~0.2）× n U/mL，20~37℃下交联反应20~120min并保持轻微振荡，之后离心收集细胞并洗涤，得到表面封装层数为2n层的哺乳动物单细胞。

上述步骤（1）中所述正电荷封装基质和带负电荷封装基质均选用蛋白类或多肽类物质；选自明胶、胶原蛋白、纤连蛋白中的任一种。明胶、胶原蛋白和纤连蛋白均具有良好生物相容性和降解性，并且，完全没有细胞毒性。

进一步的，所述带正电荷封装基质采用由购买的来自牛皮的B型明胶先在水溶性碳化二亚胺（EDC）的催化作用下经乙二胺改性后，再经透析膜纯化后得到的明胶，其带正电荷更强，且纯度也更高；其具体制备方法为：称取1.0 g B型明胶溶于50 mL的0.1M PBS缓冲液中，随后加入4 mL乙二胺（EDA）和1.0 g的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），搅拌均匀后，用5 M的HCL将溶液pH调至5.0，随后将混合溶液置于37℃水浴锅中缓慢搅拌反应18 h，反应完成后，将溶液装入预处理过的透析袋（截留分子量：8000 ~ 14000Da）中，在37℃水浴锅中温和搅拌，每12 h更换一次去离子水，透析3 ~ 4天后，对上述明胶溶液进行冻干处理，即得带正电荷的明胶。

进一步的，所述带负电荷封装基质采用由购买的来自牛皮的B型明胶经透析膜纯化后得到的明胶，其纯度更高；其具体纯化步骤是：称取2.5 g B型明胶溶于50 mL的0.1 MPBS缓冲液。随后将溶液装入预处理过的透析袋（截留分子量：8000 ~ 14000 Da）中，在37℃水浴锅中温和搅拌，每12 h更换一次去离子水，透析3 ~ 4天后，对上述明胶溶液进行冻干处理，即得带负电荷的明胶。

上述步骤（2）中所述哺乳动物细胞的单细胞悬液中哺乳动物细胞的含量为1×10⁵~2×10⁶个/mL。

优选的，上述步骤（3）中n=2~6，即循环步骤（1）2~6次，得到封装层数为4~12层的封装细胞，并制成封装层数为2n的封装细胞悬液。封装层数为4~12层的封装细胞向外扩散的伪足封装在纳米封装层内，同时还能够维持哺乳动物细胞的正常物质交换及其他生命活动，保护哺乳动物细胞免受外界物理压力和化学物质的损害。

本发明的目的之二在于提供根据上述一种单个哺乳动物细胞纳米封装方法制得的哺乳动物封装细胞。

谷氨酰胺转氨酶(TGase)普遍用于食品加工领域，尤其是在肉制品、改性乳制品蛋白质和加工植物蛋白等方面。TGase可以作为蛋白交联剂，提高了肉制品的风味口感和营养价值，增加凝胶的强度，改善奶制品的热稳定性和保水性，同时能降低一些食品的致敏性。研究还发现TGase作为交联剂能制备可食用膜。

本发明中将哺乳动物细胞的单细胞悬液依次加入到带正电荷的封装基质溶液和带负电荷的溶液中，哺乳动物细胞表面的负电荷先与带正电荷封装基质通过正、负电荷之间的静电相互作用在哺乳动物细胞表面包覆形成一层带正电荷封装基质层，再通过带负电荷封装基质层与带正电荷封装基质层之间的静电相互作用在带正电荷封装基质层外包覆形成一层带负电荷封装基质层，从而依次在哺乳动物细胞表面自内向外依次交叉包覆带正电荷封装基质层和带负电荷封装基质层。与此同时，本发明在选用蛋白类或多肽类物质作为带正、负电荷封装基质的基础上，并首次突破常规将TGase作为单个哺乳动物细胞的纳米封装系统的交联剂，TGase能催化蛋白质间的酰基转移，使蛋白质之间发生共价交联，从而在哺乳动物细胞表面构建结构稳定、紧密的纳米封装层。封装后的哺乳动物细胞体积基本不变，而且还具有较高的单细胞封装效率。并且，本发明的封装基质材料不具有细胞毒性，同时，通过对TGase的添加量进行控制，使得哺乳动物细胞在该TGase浓度条件下能够保持89%以上的存活率，即TGase对哺乳动物细胞基本无毒。

本发明的有益效果在于：

本发明选用无细胞毒性的蛋白类或多肽类物质作为带正、负电荷封装基质，并首次突破常规将TGase作为单个哺乳动物细胞的纳米封装系统的交联剂，从而在哺乳动物细胞表面构建结构稳定、紧密的纳米封装层。本发明的封装基质材料不具有细胞毒性，同时，通过对TGase的添加量进行控制，使得哺乳动物细胞在该TGase浓度条件下能够保持89%以上的存活率。本发明的封装细胞存活率高、封装层紧实、维持时间长。

附图说明

图1为未封装的HeLa细胞的扫描电镜图。

图2为实施例1所制得的封装HeLa细胞的扫描电镜图。

图3为实施例2所制得的封装HeLa细胞的扫描电镜图。

图4为实施例3所制得的封装HeLa细胞的扫描电镜图。

图5为实施例4所制得的封装HeLa细胞的扫描电镜图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

一种单个哺乳动物细胞纳米封装方法，包括以下步骤：

（1）将带正电荷封装基质溶于生理盐水或PBS溶液中制备质量浓度为0.5~1.5mg/mL的带正电荷封装基质溶液;将带负电荷封装基质溶于生理盐水或PBS溶液中制备质量浓度为0.5~1.5mg/mL的带负电荷装基质溶液，其中带正电荷封装基质和带负电荷封装基质均选用蛋白类或多肽类；

（2）将哺乳动物细胞的单细胞悬液加入到步骤（1）制得的带正电荷封装基质溶液中，4℃下反应10 min并保持轻微振荡，之后离心收集细胞并洗涤，然后再将洗涤后的细胞重悬于步骤（1）制得的带负电荷封装基质溶液中得到细胞重悬液，并向细胞重悬液中加入谷氨酰胺转胺酶，该细胞重悬液中谷氨酰胺转胺酶的添加量为0.01~0.2U/mL，4℃下反应10 min并保持轻微振荡，之后离心收集细胞并洗涤，得到封装层数为2层的封装细胞；

（2）循环上述步骤（1）n次，n＞1，得到封装层数为2n层的封装细胞，并制成封装层数为2n层的封装细胞悬液；

（3）最后，向封装层数为2n的封装细胞悬液中加入谷氨酰胺转胺酶，使其终浓度为（0.01~0.2）*n U/mL，20~37℃下交联反应20~120min并保持轻微振荡，之后离心收集细胞并洗涤，得到表面封装层数为2n层的哺乳动物单细胞。

具体实施4个实施例，即实施例1-实施例4，其中实施例1-实施例3均按照上述单个哺乳动物细胞纳米封装方法进行，实施例4未在第（3）步添加TGase进行交联反应。歌实施例的带正电荷封装基质及浓度、带负电荷封装基质及浓度、TGase的添加量、封装层数列举于下表1中，各实施例的交联反应中形成凝胶所需的时间、细胞表面形貌、封装层持续时间列举于下表2中：

表1

表2

从上述表1和表2看出：本发明采用蛋白类或多肽类物质的作为封装材料基质，采用LbL技术结合TGase交联反应的方法，成功地封装了哺乳动物单细胞并且未破坏细胞形状，使封装细胞具有更光滑的表面形貌。未封装及实施例1至实施例4封装HeLa细胞的扫描电镜图如图1~图5所示。本发明基于TGase催化交联构建的单细胞纳米封装系统的封装层最长能持续2天的时间；同等条件下，未添加TGase进行交联得到的封装细胞与添加了TGase进行交联后得到的封装细胞相比，其封装层的持续时间减半。

本发明的上述实施例1-3中所用的带负电荷的明胶由购买的明胶（购自：美国Sigma公司，型号：来自牛皮的B型明胶，凝胶强度 = 225 g Bloom，Mw = 50 kDa）经透析膜纯化而得。其具体纯化步骤是：称取2.5 g B型明胶溶于50 mL的0.1 M PBS缓冲液。随后将溶液装入预处理过的透析袋（截留分子量：8000 ~ 14000 Da）中，在37℃水浴锅中温和搅拌，每12 h更换一次去离子水。透析3 ~ 4天后，对上述明胶溶液进行冻干处理，即得带负电荷的明胶。

本发明的带负电荷的明胶也可以通过将购买的来自牛皮的B型明胶直接溶解制得，但是，相对于纯化后的来自牛皮的B型明胶来说，其纯度稍差，或者也可以通过直接购买纯度更高的B型明胶，并对该高纯度明胶直接溶解制得。

本发明的上述实施例1-3中所用到的带正电荷的明胶由购买的牛皮B型明胶（先在水溶性碳化二亚胺（EDC）的催化作用下经乙二胺改性后，再经透析膜纯化后而得。其具体制备方法为：称取1.0 g B型明胶溶于50 mL的0.1M PBS缓冲液中，随后加入4 mL乙二胺（EDA）和1.0 g的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）。搅拌均匀后，用5 M的HCl将溶液pH调至5.0，随后将混合溶液置于37℃水浴锅中缓慢搅拌反应18 h。反应完成后，将溶液装入预处理过的透析袋（截留分子量：8000 ~ 14000 Da）中，在37℃水浴锅中温和搅拌，每12 h更换一次去离子水，透析3 ~ 4天后，对上述明胶溶液进行冻干处理，即得带正电荷的明胶。

本发明的带正电荷和带负电荷封装基质并不限于选用明胶、胶原蛋白、纤连蛋白中的任一种，其只要是蛋白类或多肽类的物质即可。另外，可通过化学修饰方法调节蛋白类或多肽类物质结构中的氨基和羧基比例以制备带负电荷或正电荷的蛋白类或多肽类的物质，分别作为本发明的带正电荷的封装基质和带负电荷的封装基质。

本发明的实施例中哺乳动物细胞选用的是HeLa细胞，HeLa细胞的培养操作步骤为：采用DMEM细胞培养基（含10%胎牛血清、100 mol/mL青霉素、100 μg/mL链霉素），置于5%CO₂、37℃培养箱中培养HeLa细胞，每48 h传代一次。

当然，本发明的单个哺乳动物细胞纳米封装方法不限于应用于HeLa细胞，其适用于所有的哺乳动物细胞。

本发明的实施例中哺乳动物细胞的单细胞悬液中哺乳动物细胞的含量为1×10⁶个/mL。单细胞悬液中哺乳动物细胞的含量在1×10⁵~2×10⁶个/mL均可。

对本发明所制得的封装细胞分别进行了细胞存活率和细胞结团率检测，结果如下：（1）本发明所制得的封装HeLa细胞的存活率均在95~98%区间内，证明了基于TGase催化交联构建的单细胞纳米封装系统对细胞存活率不会产生很大的影响；（2）未封装的HeLa细胞的细胞结团率为11.3 ± 0.9%，实施例1（即本发明所制得的封装层为4层的封装细胞组）的细胞结团率为6.9± 1.3%，实施例2（即本发明所制得的封装层为8层的封装细胞组）的细胞结团率为6.4 ± 1.6%，实施例3（即本发明所制得的封装层为12层的封装HeLa细胞组）的细胞结团率为6.9 ± 1.5%，因此，与未封装HeLa细胞相比，本发明所制得的封装HeLa细胞的细胞结团率极显著性的降低。

通过抗胰蛋白酶攻击、防电解质毒性、抗物理应力的实验检测纳米封装层保护细胞的能力。实验方法如下：

（1）抗胰蛋白酶攻击实验：将未封装和封装后的细胞重悬在含有0.1% （wt/v）的胰蛋白酶-EDTA的PBS溶液中，细胞密度为2 × 10⁵个/mL。随后移取100 μL细胞悬浮液于96孔板中，分别温育0、2、5 h后，加入100 μL细胞培养液终止胰蛋白酶反应，再向每孔加入20 μL的WST-1试剂。在37℃恒温二氧化碳培养箱（含5%的CO₂）中孵育4 h后，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度（OD），计算细胞存活率。以在胰蛋白酶-EDTA溶液温育0 h的细胞存活率作为对照组，每个样品设置五个平行样。

（2）防电解质毒性测试：选取细胞毒性较高、分子量为10000 Da的聚醚酰亚胺（PEI）作为研究对象。将未封装和封装后的细胞以2 × 10⁵个/mL的密度分别重悬在含有PEI浓度为0、10、50、100 μg/mL的PBS溶液中，37℃下温育2 h。随后离心并用PBS清洗细胞，将细胞重悬在细胞培养液中，移取100 μL细胞悬浮液于96孔板中，每孔加入10 μL的WST-1试剂。在37℃恒温二氧化碳培养箱（含5%的CO₂）中孵育4 h后，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度（OD），计算细胞存活率。以PEI浓度为0 μg/mL的细胞存活率作为对照组，每个样品设置五个平行样。

（3）抗物理应力测试：将未封装和封装后的细胞以2 × 10⁵个/mL的密度重悬在PBS中，然后在不同的离心力（150，500g，1500，3500 g）下重复进行离心操作5次，施加物理应力。每次离心5 min，每次离心操作结束后将细胞团吹打混匀。全部离心操作结束后，将细胞重悬在细胞培养液中，移取100 μL细胞悬浮液于96孔板中，每孔加入10 μL的WST-1试剂。在37℃恒温二氧化碳培养箱（含5%的CO₂）中孵育4 h后，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度（OD），计算细胞存活率。以通常用于细胞收集的150 g离心力的细胞存活率作为对照组，每个样品设置五个平行样。实验结果如下：

表3 在胰蛋白酶-EDTA溶液中孵育不同时间后的HeLa细胞存活率

表4 在不同浓度PEI（聚醚酰亚胺）作用2h下的HeLa细胞存活率

表5 在不同离心力作用下的HeLa细胞存活率

结果表明：本发明的基于TGase催化交联构建的单细胞纳米封装系统能保护细胞防止胰蛋白酶的攻击、抵抗电解质的毒性和抵抗物理应力的作用。纳米封装层能对细胞产生保护作用以及构建物理屏障。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种单个哺乳动物细胞纳米封装方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将带正电荷封装基质溶于生理盐水或PBS溶液中制备质量浓度为0.5~1.5mg/mL的带正电荷封装基质溶液；将带负电荷封装基质溶于生理盐水或PBS溶液中制备质量浓度为0.5~1.5mg/mL的带负电荷封装基质溶液；

（2）将哺乳动物细胞的单细胞悬液加入到步骤（1）制得的带正电荷封装基质溶液中，4~10℃下反应5~10min并保持轻微振荡，之后离心收集细胞并洗涤，然后再将洗涤后的细胞重悬于步骤（1）制得的带负电荷封装基质溶液中得到细胞重悬液，并向细胞重悬液中加入谷氨酰胺转胺酶使其终浓度为0.01~0.2U/mL，4~10℃下反应5~10min并保持轻微振荡，之后离心收集细胞并洗涤，得到封装层数为2层的封装细胞；

（4）向封装层数为2n的封装细胞悬液中加入谷氨酰胺转胺酶，使其终浓度为（0.01~0.2）×n U/mL，20~37℃下交联反应20~120min并保持轻微振荡，之后离心收集细胞并洗涤，得到表面封装层数为2n层的哺乳动物单细胞；

步骤（1）所述带正电荷封装基质采用由购买的来自牛皮的B型明胶先在水溶性碳化二亚胺的催化作用下经乙二胺改性后，再经透析膜纯化后得到带正电荷的明胶；

带正电荷的明胶的具体制备方法为：称取1.0g B型明胶溶于50mL的0.1M PBS缓冲液中，随后加入4mL乙二胺和1.0g的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌均匀后，用5M的HCl将溶液pH调至5.0，随后将混合溶液置于37℃水浴锅中缓慢搅拌反应18h，反应完成后，将溶液装入预处理过的截留分子量8000~14000 Da的透析袋中，在37℃水浴锅中温和搅拌，每12h更换一次去离子水，透析3~4天后，对上述明胶溶液进行冻干处理，即得带正电荷的明胶；

步骤（1）所述带负电荷封装基质采用由购买的来自牛皮的B型明胶经透析膜纯化后得到的带负电荷的明胶；

所述带负电荷的明胶的具体制备方法为：称取2.5g B型明胶溶于50mL的0.1M PBS缓冲液，随后将溶液装入预处理过的截留分子量8000~14000 Da的透析袋中，在37℃水浴锅中温和搅拌，每12h更换一次去离子水，透析3~4天后，对上述明胶溶液进行冻干处理，即得带负电荷的明胶。

2.根据权利要求1所述的一种单个哺乳动物细胞纳米封装方法，其特征在于：步骤（2）所述的哺乳动物细胞的单细胞悬液中哺乳动物细胞的含量为1×10⁵~2×10⁶个/mL。

3.根据权利要求1所述的一种单个哺乳动物细胞纳米封装方法，其特征在于：所述步骤（3）中n=2~6，即循环步骤（2）2~6次，得到封装层数为4~12层的封装细胞，并制成封装层数为2n的封装细胞悬液。

4.根据权利要求1~3中任一项中所述的一种单个哺乳动物细胞纳米封装方法所制得的哺乳动物封装细胞。