CN113842504A - 一种用于骨再生的多功能电纺支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于骨再生的多功能电纺支架的制备方法。属于组织工程与再生医学领域，具体步骤：1、制备溶血磷脂酸纳米颗粒和去铁胺纳米颗粒；2、制得医用高分子混合溶液且分成两等分；3、通过溶血磷脂酸纳米颗粒、氧化锌纳米颗粒及一份医用高分子混合溶液制备同轴电纺的壳层溶液；4、通过去铁胺纳米颗粒及另一份医用高分子混合溶液制备同轴电纺的核层溶液；5、制备具有核壳结构的电纺支架；6、真空干燥至祛除溶剂，最终制得产品。本发明制备的用于骨再生的多功能电纺支架在壳层具有溶血磷脂酸纳米颗粒和氧化锌纳米颗粒，在核层具有去铁胺纳米颗粒，电纺支架同时具有抗菌，促成骨和促血管再生等功能，可应对复杂微环境下骨组织的修复。

Description

一种用于骨再生的多功能电纺支架的制备方法
技术领域
本发明属于组织工程与再生医学技术领域，涉及一种用于骨再生的多功能电纺支架的制备方法，其制备的支架材料同时具有抗菌、促成骨和血管再生的功能。
背景技术
现有技术中，种植牙作为一种恢复功能及实现美学修复的有效途径越来越受到关注，临床需求旺盛，2011年时我国年种植牙颗数仅为12万颗左右，2011-2017年复合增长率达到56％，是全球增长最快的种植牙市场之一；种植牙技术成功的关键是在种植位置具有足够的骨量和能够增殖的软组织,但是由于创伤、牙周疾病感染以及肿瘤切除等各种原因导致植入部位健康骨量不足,限制了种植牙的适用范围,因此骨缺损的修复成为一项临床挑战；为了能够成功的植入种植牙,临床上尝试了很多技术来修复牙槽骨缺损,包括植骨,牵张成骨和引导骨组织再生等；前者由于供体短缺、手术创伤大、存在相关并发症以及费用昂贵等原因，在临床上的应用受到相当程度的限制；近年来，材料技术的变革促进骨组织工程的快速发展，各种促进骨再生的植入支架应运而生；引导骨组织再生(guided boneregeneration，GBR)技术作为临床最常用最有效的骨增量术之一，在口腔种植修复骨缺损的治疗中被大量应用；GBR是指将引导骨组织再生膜(guided bone regenerationmembrane，GBRM)置于骨缺损区，利用膜的生物学性能引导成骨性细胞优先占领缺损区域，并同时阻止非成骨性细胞进入缺损区，从而达到促进骨再生、修复的目的。
GBR概念与技术的出现一方面解决牙槽突骨量不足的问题，扩大口腔种植的适应证；另一方面保证牙种植体的理想种植位置和方向，最大限度地满足种植美学的要求；引导骨再生膜作为种植牙领域的高附加值生物材料，市场规模随种植牙行业保持高速增长，由于关于生物再生材料的发展，因此其要求不断提高，故如何改善屏障膜，提高其空间维持能力，提高其诱导骨再生能力及抗感染能力，减少膜暴露率、软组织感染、膜移位，调节可吸收性薄膜的吸收速度以满足不同个体及不同类型骨缺损再生修复的需要等等，已成为研究的热点。
目前，在去铁胺的成骨应用中，专利《一种载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架及制备方法和应用》，其采用表面修饰淫羊藿苷和去铁胺,可显著提高支架的力学性能,且有利于血管网的形成；专利《一种负载去铁胺的人工骨膜及其制备方法》，其利用化学键将带有氨基的DFO键合到DFO-高分子材料共混人工骨膜表面,达到缓慢持久释放的效果；专利《人工载药同轴再生血管支架及其复合工艺制备方法》，其利用两种工艺复合不同材料制备三层载药血管支架,模拟天然血管的三层结构,缩短了体外培养移植所需的时间和成功率；然后，临床的骨缺损往往伴随感染和炎症情况，如何应对复杂微环境，成为提高骨再生能力的关键；目前，制备促进有抗菌、促成骨和血管再生的同轴电纺支架未见报道。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供了一种集合抗菌、促成骨和血管再生功能，同时具有同轴结构的三维仿生支架材料的制备方法；即用于骨再生的多功能电纺支架的制备方法；该方法通过使用备溶血磷脂酸纳米颗粒、去铁胺纳米颗粒和氧化锌纳米颗粒，实现了局域释放系统；其中的纳米颗粒不但能够保证药物的生物活性，同时结合同轴电纺丝，保持药物的持久有效的释放，最终能够满足复杂条件下的骨组织修复功能。
技术方案：本发明所述的一种用于骨再生的多功能电纺支架的制备方法，具体操作步骤如下：
(1)、分别制备溶血磷脂酸纳米颗粒和去铁胺纳米颗粒，搁置待用；
具体的是，可以选择采用去溶剂法制备白蛋白包裹的溶血磷脂酸纳米颗粒，去铁胺纳米颗粒采用两步法制备脂质纳米粒、有机溶剂挥发法制备脂质体等；
(2)、根据浓度要求，选择将不同量的可降解医用高分子溶解于有机溶剂中，制得作为支架的基质材料的医用高分子混合溶液，后将制得的医用高分子混合溶液平均分成两等分，搁置待用；
(3)、将制备的溶血磷脂酸纳米颗粒和预先准备的氧化锌纳米颗粒加入至其中一份制得的医用高分子混合溶液中，进行搅拌后从而制成同轴电纺丝的壳层溶液；为了确保材料的功能，所述溶血磷脂酸纳米颗粒和氧化锌纳米颗粒的质量占比分别为2％-6％和1％-3.5％；
(4)、将制备的去铁胺纳米颗粒加入至剩余一份制得的医用高分子混合溶液中，进行搅拌后从而制成同轴电纺丝的核层溶液；为了保证去铁胺的缓慢释放和有效作用，所述去铁胺纳米颗粒的质量占比分别为0.2％-3％；
(5)、对制成的壳层溶液和核层溶液采用同轴高压静电纺丝仪制备具有核壳结构的电纺支架；即采用同轴高压静电纺丝仪制备具有核壳结构的电纺支架，其中，壳层携载血磷脂酸纳米颗粒和氧化锌纳米颗粒，核层携载去铁胺纳米颗粒；
(6)、将制备的具有核壳结构的电纺支架进行真空干燥，直至祛除完其中(电纺支架样品)的残留溶剂，最终制得产品(电纺支架纯品)，即所述的用于骨再生的多功能电纺支架。
进一步的，在步骤(1)中，为了保证持久释放，所述制备的溶血磷脂酸纳米颗粒和去铁胺纳米颗粒的粒径范围均在120-500nm之间；且优先选择PDI小于0.2的颗粒；
其中采用去溶剂法制备白蛋白包裹的溶血磷脂酸纳米颗粒；其粒径在120-380nm，PDI为0.08-0.30；
去铁胺纳米颗粒采用两步法制备脂质纳米粒或有机溶剂挥发法制备脂质体；其粒径在180-350nm，PDI为0.12-0.25。
进一步的，在步骤(2)中，所述可降解医用高分子可以选择人工合成或者天然的，优选选择聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、丝素蛋白中任意一种或二种组合；
所述的有机溶剂优选选择毒性低，易挥发的溶剂，如六氟异丙醇和三氟乙醇等；其溶质的质量比是1％-5％。
进一步的，在步骤(5)中，所述的静电纺丝条件为:壳层溶液流速为1-5ml/h；核层溶液流速为1-2.5ml/h。
进一步的，在步骤(6)中，所述真空干燥的温度是27-40℃。
进一步的，进一步的，所述制备的三维结构材料(用于骨再生的多功能电纺支架)具有多孔互通，孔径大等特点。
进一步的，所述制备采用同轴高压静电纺丝仪制备具有核壳结构的电纺支架，其核层可以材料去铁胺溶液，无需加入医用高分子混合溶液。
进一步的，所述的产品((用于骨再生的多功能电纺支架)必须能够有效去除溶剂。
进一步的，所述制备的用于骨再生的功能电纺支架在壳层具有溶血磷脂酸纳米颗粒和氧化锌纳米颗粒，在核层具有去铁胺纳米颗粒，电纺支架同时具有抗菌，促成骨和促血管再生等功能；该材料能够整合结构、三类活性物的性能，发挥局域缓释系统的功能。
有益效果：本发明与现有技术相比，本发明的材料设计是根据目前临床骨组织再生的主要问题，即感染和炎症往往会伴随骨组织的损伤或者破坏；通过纳米技术和三维结构材料制备技术实现三种活性物质在同轴支架的有效携载，最终能够在支架材料作用过程中，发挥三种活性物质的作用，最终实现功能有抗菌、促成骨和血管再生的协同作用；电纺支架和同轴电纺技术具有稳定性好，易规模化制备等特点，搭建相关的设备成本可控，特别在制备的设备和环境要求较低，过程简单；本发明所述的用于骨再生的多功能电纺支架本身是高附加值的产品，在组织工程与再生医学领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是本发明的制备流程图；
图2是本发明实施例中制备样品和不添加纳米颗粒样品细菌粘附对照图；
图3是本发明实施例中制备样品和不添加纳米颗粒样品碱性磷酸酶评价图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明做出进一步说明。
本发明所述的一种用于骨再生的多功能电纺支架的制备方法(本发明实施例公开了具有抗菌、促成骨和促进血管生成的三维多功能组织工程支架的制备方法)，其具体操作步骤如下：
(1)、分别制备溶血磷脂酸纳米颗粒和去铁胺纳米颗粒，搁置待用；
具体的是，所述制备溶血磷脂酸纳米颗粒和去铁胺纳米颗粒的制备方法是：可以选择采用去溶剂法制备白蛋白包裹的溶血磷脂酸纳米颗粒；
去铁胺纳米颗粒采用两步法制备脂质纳米粒或有机溶剂挥发法制备脂质体等纳米颗粒；
为了保证持久释放，所述制备的溶血磷脂酸纳米颗粒和纳米颗粒的粒径范围均在120-380nm之间；且优先选择PDI小于0.2的颗粒；
其中，采用去溶剂法制备白蛋白包裹的溶血磷脂酸纳米颗粒，为了保证其持久释放，其粒径范围在120-380nm，PDI为0.08-0.30；
去铁胺纳米颗粒采用两步法制备脂质纳米粒或有机溶剂挥发法制备脂质体；其粒径在180-350nm，PDI为0.12-0.25；
制备的纳米颗粒均采用冷却干燥法去除其中的水分，从而获得粉末状的颗粒；
(2)、根据浓度要求，选择将不同量的可降解医用高分子(称取聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、丝素蛋白中任意一种或二种组合；可以选择人工合成或者天然的)溶解于有机溶剂中，其溶质的质量比控制在1％-5％之间，通过磁力搅拌至完全溶解，从而制得作为支架的基质材料的医用高分子混合溶液，后将制得的医用高分子混合溶液平均分成两等分，搁置待用；
其中，所述的有机溶剂优选选择毒性低，易挥发的溶剂，如六氟异丙醇和三氟乙醇等；
(3)、将制备的溶血磷脂酸纳米颗粒和预先准备(通过购买)的氧化锌纳米颗粒加入至其中一份制得的医用高分子混合溶液中，进行搅拌后从而制成同轴电纺丝的壳层溶液；为了确保材料的功能，所述溶血磷脂酸纳米颗粒和氧化锌纳米颗粒的质量占比分别为2％-6％和1％-3.5％；磁力搅拌至混合均匀；
(4)、将制备的去铁胺纳米颗粒加入至剩余一份制得的医用高分子混合溶液中，进行搅拌后从而制成同轴电纺丝的核层溶液；为了保证去铁胺的缓慢释放和有效作用，所述去铁胺纳米颗粒的质量占比分别为0.2％-3％；
(5)、对制成的壳层溶液和核层溶液采用同轴高压静电纺丝仪制备具有核壳结构的电纺支架；即采用同轴高压静电纺丝仪制备具有核壳结构的电纺支架，其中，壳层携载血磷脂酸纳米颗粒和氧化锌纳米颗粒，核层携载去铁胺纳米颗粒；
其中，静电纺丝条件为:壳层溶液流速为1-5ml/h；核层溶液流速为1-2.5ml/h；
(6)、将制备的具有核壳结构的电纺支架进行真空干燥(温度在27-40℃)，直至祛除完其中(电纺支架样品)的残留溶剂，最终制得产品(电纺支架纯品)，即所述的用于骨再生的多功能电纺支架；其特点是其具有抗菌，促成骨和促血管生成的作用。
以下结合具体实施例来对本发明做进一步说明。
实施例一：
纳米颗粒制备：以溶血磷脂酸为活性物质，白蛋白，壳聚糖，无水乙醇为辅料制备溶血磷脂酸纳米颗粒，粒径约为250nm，PDI为0.23；去铁胺为活性物，磷脂，甘油，SPAN80，吐温80为辅料制备去铁胺脂质纳米粒，粒径约为280nm，PDI为0.18；获得的纳米颗粒溶液-80℃冷冻后，进行24h的冷冻干燥；
电纺溶液制备：称取聚己内酯和聚乳酸共聚物分布为0.5g和0.5g；加入到6ml的六氟异丙醇溶剂中，在磁力搅拌器上搅拌均匀，制得聚合物溶液；取4.2ml溶液加入溶血磷脂酸纳米颗粒20mg，加入氧化锌纳米颗粒23mg，磁力搅拌至均匀分布；同时取1.8ml溶液加入去铁胺颗粒8mg，搅拌至均匀；
静电纺丝制备：同轴高压静电纺丝仪制备具有核壳结构的电纺支架，携载溶血磷脂酸纳米颗粒和氧化锌纳米颗粒溶液作为壳层溶液，携载去铁胺纳米颗粒溶液作为核层溶液；静电纺丝条件为:高压为16kv，低压-2.5kv，距离为32cm，壳层溶液流速为3ml/h，核层溶液流速1.8ml/h；
产品干燥：在37℃下真空干燥12h去除残留溶剂，获得样品。
实施例二：
纳米颗粒制备：以溶血磷脂酸为活性物质，白蛋白，壳聚糖，无水乙醇为辅料制备溶血磷脂酸纳米颗粒，粒径约为120nm，PDI为0.18；去铁胺为活性物，磷脂，甘油，SPAN80为辅料制备去铁胺脂质纳米粒，粒径约为336nm，PDI为0.21；获得的纳米颗粒溶液-80℃冷冻后，进行24h的冷冻干燥；
电纺溶液制备：称取丝素蛋白1g；加入到6ml的三氟乙醇和二氯甲烷混合溶剂中，在磁力搅拌器上搅拌均匀，制得聚合物溶液；取4.2ml溶液加入溶血磷脂酸纳米颗粒40mg，加入氧化锌纳米颗粒15mg，磁力搅拌至均匀分布；同时取1.8ml溶液加入去铁胺颗粒4mg，搅拌至均匀；
静电纺丝制备：同轴高压静电纺丝仪制备具有核壳结构的电纺支架，携载溶血磷脂酸纳米颗粒和氧化锌纳米颗粒溶液作为壳层溶液，携载去铁胺纳米颗粒溶液作为核层溶液；静电纺丝条件为:高压为18kv，低压-1.5kv，距离为30cm，壳层溶液流速为1.5ml/h，核层溶液流速1.2ml/h；
产品干燥：在37℃下真空干燥12h去除残留溶剂，获得样品。
实施例三：
纳米颗粒制备：以溶血磷脂酸为活性物质，白蛋白，壳聚糖，无水乙醇为辅料制备溶血磷脂酸纳米颗粒，粒径约为200nm，PDI为0.09；去铁胺为活性物，磷脂，甘油，SPAN80，吐温80为辅料制备去铁胺脂质纳米粒，粒径约为210nm，PDI为0.13；获得的纳米颗粒溶液-80℃冷冻后，进行24h的冷冻干燥；
电纺溶液制备：称取聚己内酯和聚乳酸-羟基乙酸共聚物分布为0.5g和0.5g；加入到6ml的三氟乙醇溶剂中，在磁力搅拌器上搅拌均匀，制得聚合物溶液；取4.2ml溶液加入溶血磷脂酸纳米颗粒38mg，加入氧化锌纳米颗粒8mg，磁力搅拌至均匀分布；同时取1.8ml溶液加入去铁胺颗粒8mg，搅拌至均匀；
静电纺丝制备：同轴高压静电纺丝仪制备具有核壳结构的电纺支架，携载溶血磷脂酸纳米颗粒和氧化锌纳米颗粒溶液作为壳层溶液，携载去铁胺纳米颗粒溶液作为核层溶液；静电纺丝条件为:高压为18kv，低压-2.5kv，距离为34cm，壳层溶液流速为4.3ml/h，核层溶液流速2.5ml/h；
产品干燥：在37℃下真空干燥12h去除残留溶剂，获得样品。
实施例四：
纳米颗粒制备：以溶血磷脂酸为活性物质，白蛋白，壳聚糖，无水乙醇为辅料制备溶血磷脂酸纳米颗粒，粒径约为150nm，PDI为0.19；去铁胺为活性物，磷脂，甘油，SPAN80，吐温80为辅料制备去铁胺脂质纳米粒，粒径约为320nm，PDI为0.24；获得的纳米颗粒溶液-80℃冷冻后，进行24h的冷冻干燥；
电纺溶液制备：称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物1.0g；加入到6ml的六氟异丙醇溶剂中，在磁力搅拌器上搅拌均匀，制得聚合物溶液；取4.2ml溶液加入溶血磷脂酸纳米颗粒24mg，加入氧化锌纳米颗粒20mg，磁力搅拌至均匀分布；同时取1.8ml溶液加入去铁胺颗粒6mg，搅拌至均匀；
静电纺丝制备：同轴高压静电纺丝仪制备具有核壳结构的电纺支架，携载溶血磷脂酸纳米颗粒和氧化锌纳米颗粒溶液作为壳层溶液，携载去铁胺纳米颗粒溶液作为核层溶液；静电纺丝条件为:高压为16kv，低压-2.5kv，距离为32cm，壳层溶液流速为3.0ml/h，核层溶液流速1.5ml/h；
产品干燥：在37℃下真空干燥12h去除残留溶剂，获得样品。
实施例五：
纳米颗粒制备：以溶血磷脂酸为活性物质，白蛋白，壳聚糖，无水乙醇为辅料去溶剂法制备溶血磷脂酸纳米颗粒，粒径约为136nm，PDI为0.096；去铁胺为活性物，磷脂，胆固醇，吐温80为辅料溶剂挥发法制备去铁胺脂质体，粒径约为186nm，PDI为0.15；获得的纳米颗粒溶液-80℃冷冻后，进行24h的冷冻干燥；
电纺溶液制备：称取聚己内酯和聚乳酸分别为0.8g和0.2g；加入到6ml的六氟异丙醇溶剂中，在磁力搅拌器上搅拌均匀，制得聚合物溶液；取4.2ml溶液加入溶血磷脂酸纳米颗粒18mg，加入氧化锌纳米颗粒10mg，磁力搅拌至均匀分布；同时取1.8ml溶液加入去铁胺颗粒4mg，搅拌至均匀；
静电纺丝制备：同轴高压静电纺丝仪制备具有核壳结构的电纺支架，携载溶血磷脂酸纳米颗粒和氧化锌纳米颗粒溶液作为壳层溶液，携载去铁胺纳米颗粒溶液作为核层溶液；静电纺丝条件为:高压为15kv，低压-2.0kv，距离为32cm，壳层溶液流速为1.8ml/h，核层溶液流速1.2ml/h；
产品干燥：在37℃下真空干燥48h去除残留溶剂，获得样品。
实施例六：
纳米颗粒制备：以溶血磷脂酸为活性物质，白蛋白，壳聚糖，无水乙醇为辅料去溶剂法制备溶血磷脂酸纳米颗粒，粒径约为150nm，PDI为0.16；去铁胺为活性物，磷脂，胆固醇，吐温80为辅料溶剂挥发法制备去铁胺脂质体，粒径约为330nm，PDI为0.24；获得的纳米颗粒溶液-80℃冷冻后，进行24h的冷冻干燥；
电纺溶液制备：称取聚己内酯和聚乳酸-羟基乙酸共聚物分布为0.5g和0.5g；加入到6ml的三氟乙醇溶剂中，在磁力搅拌器上搅拌均匀，制得聚合物溶液；取4.2ml溶液加入溶血磷脂酸纳米颗粒20mg，加入氧化锌纳米颗粒23mg，磁力搅拌至均匀分布；同时取1.8ml溶液加入去铁胺颗粒8mg，搅拌至均匀；
静电纺丝制备：同轴高压静电纺丝仪制备具有核壳结构的电纺支架，携载溶血磷脂酸纳米颗粒和氧化锌纳米颗粒溶液作为壳层溶液，携载去铁胺纳米颗粒溶液作为核层溶液；静电纺丝条件为:高压为18kv，低压-2.5kv，距离为30cm，壳层溶液流速为3ml/h，核层溶液流速1.6ml/h；
产品干燥：在30℃下真空干燥24h去除残留溶剂，获得样品。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种用于骨再生的多功能电纺支架的制备方法，其特征在于，具体操作步骤如下：
(1)、分别制备溶血磷脂酸纳米颗粒和去铁胺纳米颗粒，搁置待用；
(2)、将可降解医用高分子溶解于有机溶剂中，制得作为支架的基质材料的医用高分子混合溶液，后将制得的医用高分子混合溶液平均分成两等分，搁置待用；
(3)、将制备的溶血磷脂酸纳米颗粒和预先准备的氧化锌纳米颗粒加入至其中一份制得的医用高分子混合溶液中，进行搅拌后从而制成同轴电纺丝的壳层溶液；
(4)、将制备的去铁胺纳米颗粒加入至剩余一份制得的医用高分子混合溶液中，进行搅拌后从而制成同轴电纺丝的核层溶液；
(5)、对制成的壳层溶液和核层溶液采用同轴高压静电纺丝仪制备具有核壳结构的电纺支架；
(6)、将制备的具有核壳结构的电纺支架进行真空干燥，直至祛除完其中的残留溶剂，最终制得所述的用于骨再生的多功能电纺支架。
2.根据权利要求1所述的一种用于骨再生的多功能电纺支架的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述制备溶血磷脂酸纳米颗粒和去铁胺纳米颗粒的制备方法是：采用去溶剂法制备白蛋白包裹的溶血磷脂酸纳米颗粒；其粒径在120-380nm，PDI为0.08-0.30；
去铁胺纳米颗粒采用两步法制备脂质纳米粒或有机溶剂挥发法制备脂质体；其粒径在180-350nm，PDI为0.12-0.25。
3.根据权利要求1所述的一种用于骨再生的多功能电纺支架的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述可降解医用高分子为聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、丝素蛋白中任意一种或二种组合；
所述的有机溶剂为六氟异丙醇和三氟乙醇中的一种；其质量比是1％-5％。
4.根据权利要求1所述的一种用于骨再生的多功能电纺支架的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述溶血磷脂酸纳米颗粒和氧化锌纳米颗粒的质量占比为2％-6％；1％-3.5％。
5.根据权利要求1所述的一种用于骨再生的多功能电纺支架的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述去铁胺纳米颗粒的质量占比分别为0.2％-3％。
6.根据权利要求1所述的一种用于骨再生的多功能电纺支架的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述采用同轴高压静电纺丝仪的静电纺丝条件为:壳层溶液流速为1-5ml/h；核层溶液流速为1-2.5ml/h。
7.根据权利要求1所述的一种用于骨再生的多功能电纺支架的制备方法，其特征在于，在步骤(6)中，所述真空干燥的温度是27-40℃。
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