CN103446623A - 一种组织工程表皮模型的构建方法 - Google Patents

一种组织工程表皮模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种组织工程表皮模型的构建方法。本发明按照下述步骤进行：A.选用热塑性无纺布，通过热压方法将其制备成圆盘状支架；B.以桑蚕丝为原料，通过脱胶、溶解、透析和浓缩制备丝素蛋白溶液；C.用制备的丝素蛋白溶液对圆盘状无纺布支架进行浸润，丝素溶液浓度为2~10%，然后进行真空干燥和无水乙醇后处理；D.接种人表皮细胞株Hacat，Hacat细胞的接种密度为104~105/ml，气液面培养，待增殖形成片层结构即构建成组织工程表皮模型。本发明解决现有组织工程表皮模型在细胞培养过程中支架易发生收缩的缺点，通过将无纺布热压，使无纺布边缘熔融粘结，避免了构建的组织工程皮肤模型在检测中的侧面渗漏问题。

Description

一种组织工程表皮模型的构建方法
技术领域
本发明属于生物医学工程中的组织工程领域，更具体的说，是涉及一种组织工程表皮模型的构建方法。
背景技术
国内外替代动物做皮肤刺激实验的方法为采用组织工程皮肤模型，当前欧盟推荐的皮肤刺激性替代实验模型是美国出产的EpiDermTM和法国生产的EpiSkin模型。模型大多采用胶原凝胶作为组织工程皮肤的支架，其不足主要表现在将细胞接种到凝胶表面后，细胞/胶原凝胶复合物在培养过程中易收缩，细胞密度发生较大变化，所构建的组织工程表皮面积也发生变化，这些不足导致了应用此类组织工程表皮作检测时存在较大的误差。此外，表皮细胞生长形成皮肤样结构后，模型部分收缩，使其边缘和测试容器间产生缝隙，当进行化学品测试时，化学品溶液易发生侧面渗漏，也使实验产生较大误差。所以本发明通过支架材料的改进解决上述两个问题：支架收缩和化学品溶液侧面渗漏问题。
丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，含量占蚕丝的70%～80%，由乙氨酸、丙氨酸、丝氨酸等18种氨基酸所组成。丝素蛋白具有良好的生物相容性，对机体无毒性，无致敏和刺激作用，又可部分生物降解，其降解产物本身不仅对组织无毒副作用，还对皮肤等有营养与修复的作用；具有良好的柔韧性和抗拉伸强度、透气透湿性、缓释性等，而且经过不同处理可以得到不同的形态，如纤维、溶液、粉、膜、凝胶和海绵网状等。丝素蛋白因其优良的性能在组织工程上的应用越来越受到人们的关注。
丝素蛋白生物相容性良好，很多实验研究表明丝素蛋白可以用来培养多种细胞，如成纤维细胞、上皮细胞、软骨细胞、表皮细胞、角质细胞、成骨细胞等，尤其是哺乳动物细胞。众多实验证明丝素在体外支持干细胞的粘附、增殖和分化，体内促进组织的修复。因此，丝素蛋白有望在组织工程诸多器官的体外构建中用做细胞支架材料，如组织工程化皮肤、软骨、肌腱、血管等。Min 等采用静电纺技术制成的丝素纳米纤维多孔支架，平均孔径为80 nm，在此材料上培养人体角质细胞 (Human keratinocytes) 和成纤维细胞(Fibroblasts) 效果良好。电镜照片显示，培养3 d后角质细胞在丝素纳米纤维材料表面黏附生长，并沿孔扩散到内层，且细胞之间以及细胞与周围纤维之间作用良好；7天后，细胞沿纤维方向生长并形成三维网络状细胞层结构。丝素蛋白对表皮细胞生长具有促进作用，由丝素蛋白制成的丝素膜是一种良好的创面覆盖物。吕国忠等观察到成纤维细胞能够在丝素蛋白纳米纤维中不断伸展、黏附、扩增，并分泌细胞外基质，14 天后成纤维细胞与支架及细胞所分泌的基质融为一体，整个支架表面均被成纤维细胞及基质成分所覆盖，形成活性支架。
以上充分说明了丝素蛋白具有良好的细胞相容性，但单纯的丝素蛋白存在一定的缺陷，例如纯丝素材料在含水量极低时容易破碎，在低湿环境应用时强度不够，结晶区偏少也会导致丝素材料在溶液中的溶失率较高等；采用静电纺制备纳米丝素膜，环境要求苛刻、耗时长，如果用于规模化生产还存在一定困难，以上所述使丝素在某些应用中受到限制，因此通过复合材料性能互补的原理有望制备综合性能良好的组织工程皮肤支架。
发明内容
为了解决现有皮肤模型在培养过程中易发生收缩和边缘易发生检测液渗漏等缺点，本发明提供一种组织工程表皮模型的构建方法。
本发明一种组织工程表皮模型的构建方法， 按照下述步骤进行：
A.选用热塑性无纺布，通过热压方法将其制备成圆盘状支架；
B.以桑蚕丝为原料，通过脱胶、溶解、透析和浓缩制备丝素蛋白溶液；
C.用制备的丝素蛋白溶液对圆盘状无纺布支架进行浸润，丝素溶液浓度为2~10%，然后进行真空干燥和无水乙醇后处理；
D.接种人表皮细胞株Hacat，Hacat细胞的接种密度为104~105/ml，气液面培养，待增殖形成片层结构即构建成组织工程表皮模型。
选用的无纺布的原料为聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺中的一种或几种。将无纺布热压成圆盘状支架的温度为130～200℃，圆盘直径为5mm～30mm，圆盘边缘高度为0.5mm～3mm。
丝素脱胶采用以下任一方法进行：浸泡于Na2CO3的水溶液中，温度为60-100℃；或浸泡于中性皂的水溶液中，温度为90-100℃；或浸泡于去离子水中在温度为110-130℃，压力为0.05-0.18MPa条件下脱胶。
丝素溶解的方法采用下述任一方法：溶解于CaCl2、乙醇、水的三元溶液中，CaCl2、乙醇、水的摩尔比为1:2:8，温度为50-100℃，溶解时间为2-5h；或溶解于CaCl2的水溶液中，CaCl2的质量百分比浓度为30-50%，溶解温度90-100℃，溶解时间5-20min；溶解于9.3mol/L的LiBr溶液中，溶解温度50-70℃，溶解时间30-60min。
丝素浓缩采用以下任一方法进行：透析袋透析法；或加热挥发法；或中空纤维超滤法。
本发明解决现有组织工程表皮模型在细胞培养过程中支架易发生收缩的缺点，本发明将无纺布热压成圆盘状支架，再用丝素溶液进行修饰，将无纺布尺寸稳定性和丝素良好生物相容性很好地结合起来；通过将无纺布热压，使无纺布边缘熔融粘结，避免了构建的组织工程皮肤模型在检测中的侧面渗漏问题。将人表皮细胞株Hcat在支架上进行气液面培养，结果表明细胞在支架上能很好的粘附、增殖，形成片层结构，构建的组织工程化表皮模型是一种理想的模型，可用于化学品检测以及皮肤光老化研究等方面。
本发明提出采用丝素蛋白修饰无纺布作为组织工程皮肤的支架材料：无纺布的孔径可根据需要定制，材料便于剪裁；有较好的力学性能，能确保与细胞复合培养过程中细胞/支架复合物不发生变形；丝素对无纺布的修饰易于实现，既保证了整体支架材料的力学强度，又充分利用了丝素蛋白的良好细胞相容性的特点。
附图说明
图1是圆盘状无纺布热压示意图，
图2是没接种细胞的空白支架的电镜图，
图3是接种人表皮细胞株Hacat的支架的电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细描述。
本发明中无纺布的原料是聚酯、聚丙烯、聚乙烯、聚酰胺中的一种或几种。
本发明中无纺布圆盘支架的热压成型温度为130～200℃，图1是圆盘状无纺布热压示意图。
本发明中丝素蛋白是以桑蚕丝为原料，经过脱胶、溶解、透析、浓缩制备而成，脱胶的方法为通过将桑蚕丝浸入Na2CO3水溶液中进行，Na2CO3水溶液的浓度为0.1-1%之间，温度为60-100℃，溶解在乙醇、水、CaCl2的三元溶液中，溶解温度为50-100℃，溶解时间为2-5h，透析在流水冲洗下在透析袋中进行，浓缩采用在PEG水溶液中进行。
本发明用于修饰无纺布的丝素溶液浓度为2~10%。
本发明人表皮细胞株Hacat的接种密度为104~105/ml。
将Hacat细胞在所述的支架上进行培养，结果表明所构建的组织工程化表皮在培养过程中不发生收缩、检测液在边缘不发生渗漏，是一种理想的组织工程化表皮模型。
实施例一
聚丙烯熔喷无纺布，140℃热压成圆盘状。
市售桑蚕丝，浸入60℃Na2CO3水溶液中进行脱胶，Na2CO3水溶液的浓度为0.2%，每次30min，共3次，水洗后70℃干燥。溶解于60℃的CaCl2、乙醇、水的三元溶液中（摩尔比1:2:8），溶解时间为2h，装入透析袋，在流水冲洗下透析。得到浓度为3%的丝素蛋白溶液。将圆盘状无纺布浸泡在丝素溶液中，取出后真空干燥，无水乙醇后处理，以104/ml接种Hacat细胞，气液面培养，构建组织工程表皮模型。图2是没接种细胞的空白支架的电镜图，图3是接种人表皮细胞株Hacat的支架的电镜图，结果表明细胞在支架上能很好的粘附、增殖，形成片层结构，构建的组织工程化表皮模型是一种理想的模型，可用于化学品检测以及皮肤光老化研究等方面。
实施例二
聚乙烯、聚丙烯双组份熔喷无纺布，130℃热压成圆盘状。
市售桑蚕丝，浸入90-100℃的中性皂水溶液中进行脱胶，水洗后70℃干燥。溶解于95℃的CaCl2水溶液中，溶解时间为10min，装入透析袋，在流水冲洗下透析。得到浓度为6%的丝素蛋白溶液。将圆盘状无纺布浸泡在丝素溶液中，取出后真空干燥，无水乙醇后处理，以104/ml接种Hacat细胞，气液面培养，构建组织工程表皮模型。
实施例三
聚酰胺纺粘无纺布，200℃热压成圆盘状。
市售桑蚕丝，浸入去离子水中高温高压进行脱胶，水洗后70℃干燥。溶解于70℃的CaCl2、乙醇、水的三元溶液中（摩尔比1:2:8），溶解时间为4h，装入透析袋，在流水冲洗下透析。得到浓度为9%的丝素蛋白溶液。将圆盘状无纺布浸泡在丝素溶液中，取出后真空干燥，无水乙醇后处理，以105/ml接种Hacat细胞，气液面培养，构建组织工程表皮模型。
实施例四
聚酯、聚丙烯复合无纺布，140℃热压成圆盘状。
市售桑蚕丝，浸入90℃Na2CO3水溶液中进行脱胶，每次30min，共3次，水洗后70℃干燥。溶解于60℃的LiBr溶液中，溶解时间为4h，加热挥发法浓缩。得到浓度为6%的丝素蛋白溶液。将圆盘状无纺布浸泡在丝素溶液中，取出后真空干燥，无水乙醇后处理，以105/ml接种Hacat细胞，气液面培养，构建组织工程表皮模型。
实施例五
聚酯、聚丙烯复合无纺布，140℃热压成圆盘状。
市售桑蚕丝，浸入100℃Na2CO3水溶液中进行脱胶，每次30min，共3次，水洗后70℃干燥。溶解于70℃的乙醇、水、CaCl2的三元溶液中，溶解时间为5h，中空纤维超滤法浓缩。得到浓度为9%的丝素蛋白溶液。将圆盘状无纺布浸泡在丝素溶液中，取出后真空干燥，无水乙醇后处理，以105/ml接种Hacat细胞，气液面培养，构建组织工程表皮模型。
尽管结合附图对本发明进行了上述描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明的宗旨下做出的许多变形，均属于本发明的保护之列。

Claims (6)

1. 一种组织工程表皮模型的构建方法，其特征是，按照下述步骤进行：
选用热塑性无纺布，通过热压方法将其制备成圆盘状支架；
以桑蚕丝为原料，通过脱胶、溶解、透析和浓缩制备丝素蛋白溶液；
用制备的丝素蛋白溶液对圆盘状无纺布支架进行浸润，丝素溶液浓度为2~10%，然后进行真空干燥和无水乙醇后处理；
接种人表皮细胞株Hacat，Hacat细胞的接种密度为104~105/ml，气液面培养，待增殖形成片层结构即构建成组织工程表皮模型。
2.根据权利要求1所述的组织工程表皮模型的构建方法，其特征在于，选用的无纺布的原料为聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的组织工程表皮模型的构建方法，其特征在于，将无纺布热压成圆盘状支架的温度为130～200℃，圆盘直径为5mm～30mm，圆盘边缘高度为0.5mm～3mm。
4. 根据权利要求1所述的组织工程表皮模型的构建方法，其特征在于，丝素脱胶采用以下任一方法进行：浸泡于Na2CO3的水溶液中，温度为60-100℃；或浸泡于中性皂的水溶液中，温度为90-100℃；或浸泡于去离子水中在温度为110-130℃，压力为0.05-0.18MPa条件下脱胶。
5. 根据权利要求1所述的组织工程表皮模型的构建方法，其特征在于，丝素溶解的方法采用下述任一方法：溶解于CaCl2、乙醇、水的三元溶液中，CaCl2、乙醇、水的摩尔比为1:2:8，温度为50-100℃，溶解时间为2-5h；或溶解于CaCl2的水溶液中，CaCl2的质量百分比浓度为30-50%，溶解温度90-100℃，溶解时间5-20min；溶解于9.3mol/L的LiBr溶液中，溶解温度50-70℃，溶解时间30-60min。
6.根据权利要求1所述的组织工程表皮模型的构建方法，其特征在于，丝素浓缩采用以下任一方法进行：透析袋透析法；或加热挥发法；或中空纤维超滤法。
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