CN110093041A - 一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜及其制备方法 - Google Patents

一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜及其制备方法，具体制备方法为：将蚕丝蛋白溶液加入磷酸缓冲液中，一边恒温搅拌一边滴加甲基丙烯酸酯，滴加完毕后继续恒温搅拌，反应结束后透析，冷冻干燥得到乙酰化改性蚕丝蛋白粉末；将乙酰化改性蚕丝蛋白粉末加入木醋杆菌的发酵培养基中，静置发酵，取出，洗涤，得到负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜；将负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜置于紫外光环境中固化交联，得到产品。本发明制备的乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的生物相容性、力学强度、生物降解度均显著优于现有的产品，可满足组织工程的使用要求，综合性能佳。

Description

一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜及其制 备方法
技术领域
本发明属于水凝胶技术领域，具体涉及一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜及其制备方法。
背景技术
随着人类社会的老龄化及高能、高速创伤的不断增多，软骨组织缺损和软骨组织退行性病变的问题日益突出。近年来，采用组织工程学的方法，将软骨细胞或生长因子种植于具有良好生物相容性的可降解生物支架材料上，进行体外联合培养形成软骨模块，然后植入软骨缺损处来修复软骨损伤的技术为软骨缺损的修复提供了新途径。
水凝胶能够为细胞的增殖与分化提供更接近于天然软骨细胞外基质的微环境，是软骨组织修复的一种理想材料。水凝胶可分为蚕丝蛋白、细菌纤维素、胶原、壳聚糖、明胶等天然材料和聚氧化乙烯、聚丙烯酸-2-羟乙酯、聚乙二醇400双丙烯酸酯等人工材料。天然材料，与人工材料相比，具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性，但是，从临床观察来看，目前构建的组织工程软骨，存在着机械强度不足，大块软骨“空心”，修复组织基质钙化，远期疗效不佳等问题，难以获得理想的临床效果。因此，制备多孔结构与力学强度俱佳的骨组织支架材料成为当前研究的热点。
蚕丝蛋白是一种从蚕丝中提取的天然高分子蛋白，由18种α-氨基酸组成，具有生物相容性、可降解性、无毒性和低免疫原性等特点，但蚕丝蛋白水凝胶的力学性能较差，易脆，使其在实际应用中受到很大限制。中国专利CN109054047A公开的一种丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶及其制备方法和应用，将丝素缺失型蚕茧，剪碎，用去离子水清洗后去除水分，溶解，离心，透析，冻干得到丝胶蛋白粉末，然后将丝胶蛋白粉末完全溶解于pH7-10的磷酸缓冲液中，加入甲基丙烯酸酐，常温下搅拌反应，透析，冻干，再溶于去离子水中制成甲基丙烯酸酐修饰的丝胶溶液，然后将氧化石墨烯分散液与甲基丙烯酸修饰的丝胶蛋白溶液、光引发剂Irgacure 2959溶液混合均匀，通过紫外光照射得到丝胶蛋白/氧化石墨烯复合水凝胶。中国专利CN108822308A公开的一种蚕丝微米纤维增强仿生水凝胶及其制备方法，将光交联剂与甲基丙烯酸酐改性明胶加热混合溶解，加入蚕丝微米纤维，并混合均匀，然后将混合物及时吸入至模具，置于紫外光下光交联，制备得到蚕丝微米纤维增强仿生水凝胶。由上述现有技术可知，通过将丝胶蛋白或者明胶蛋白乙酰化改性处理以提高水凝胶材料的理化性能，可改善现有水凝胶生物相容性欠佳、力学强度低、生物降解难以满足组织工程要求等问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜及其制备方法，本发明将乙酰化改性蚕丝蛋白加入细菌纤维素发酵液中静置发酵和紫外光固化得到机械性能、生物性能和降解性俱佳的复合水凝胶膜。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜，所述乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜包括乙酰化改性蚕丝蛋白和细菌纤维素，所述乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜是乙酰化改性蚕丝蛋白加入细菌纤维素发酵液中静置发酵和紫外光固化得到，所述乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜含有分别由细菌纤维素和乙酰化改性蚕丝蛋白形成的交联双网络孔隙结构。
本发明还提供所述一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)将桑蚕丝用0.05％Na2CO3溶液以1：50的浴比在100℃下煮沸30-45min，用去离子水洗净，重复三次，放在室温通风处晾干，得到丝素，然后将丝素以1∶10的浴比分批加入三元溶剂中，置于76±2℃的水浴锅内恒温搅拌，直至完全溶解，得到丝素-氯化钙溶液，将丝素-氯化钙溶液倒入洁净的透析袋(透析袋的截留分子量为3.5kD)中，两头封口，先用流动的自来水透析2d，再用去离子水透析八次，每次1h，之后以10000r/min离心20min，取上清液，得到蚕丝蛋白溶液，以60Co(10Gy)辐射灭菌后，放进冰箱备用；
(2)将步骤(1)制备的蚕丝蛋白溶液加入1.2-2.5％(o.w.f)磷酸缓冲液中，一边恒温搅拌一边滴加甲基丙烯酸酯，滴加完毕后继续恒温搅拌，反应结束后透析(透析袋的截留分子量为3.5kD)，并在-60～-80℃的冰箱内冷冻12-18h左右，然后转移到-40℃的冷冻干燥机里冻干24-48h左右，得到呈白色海绵状的乙酰化改性蚕丝蛋白，粉碎后得乙酰化改性蚕丝蛋白粉末；
(3)将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，其中液态种子培养基配方为：50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，pH6.8；斜面培养基配方50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，18g/L琼脂，pH6.8；发酵培养基配方为80g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、2.0g/L无水硫酸镁、1.0g/L柠檬酸、10g/L磷酸氢二钠、30g/L磷酸氢二钾，pH6.8，木醋杆菌经过斜面划线后置于25-30℃培养箱中，恒温活化培养7d，将活化的木醋杆菌接入种子培养基中，25-30℃条件下150r/min振荡培养72h，将木醋杆菌种子培养液以体积分数7％的接种量接入发酵培养基中，加入步骤(2)制备的辐射灭菌后的乙酰化改性蚕丝蛋白粉末，在恒温培养箱静置发酵培养，过滤收集纤维素，用水反复冲洗除去培养基，再用40g/L NaOH溶液于85℃水浴3h以去除菌体，其间每隔1h用蒸馏水反复冲洗数次，再滴加数滴0.1％乙酸溶液浸泡5min左右，蒸馏水冲洗，得到负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜；
(4)将步骤(3)制备的负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜置于紫外光环境中固化交联，得到乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(1)中，三元溶液为摩尔比为1:2:8的氯化钙、乙醇和水的混合溶液。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(1)中，蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的分子量为3.5-10kD，蚕丝蛋白的浓度为1-5％。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(2)中，恒温搅拌的温度为60-70℃，时间为2-6h，滴加的速率为0.5-1mL/min。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(3)中，静置发酵的温度25-30℃，时间7-10d。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(3)中，负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜中乙酰化改性的蚕丝蛋白和细菌纤维素的质量比为1-3:1-3，负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜的厚度为0.2-0.4cm。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(4)中，固化交联的紫外线波长为365nm，照射时间为30-60s。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(4)中，乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的孔隙率为80-90％，孔隙尺寸为0.1-10μm。
作为上述技术方案的优选，所述乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜用于培养第3代软骨细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明制备的乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜包括乙酰化改性蚕丝蛋白和细菌纤维素，本发明将蚕丝蛋白经甲基丙烯酸酯活性基团修饰，将甲基丙烯酸酯活性基团与蚕丝蛋白表面的氨基发生酰胺化反应，将蚕丝蛋白大分子表面接枝甲基丙烯酸酯盐侧基，使蚕丝蛋白具有可反应的碳碳双键，然后将乙酰化改性的蚕丝蛋白加入到细菌纤维素的发酵液中，通过静态发酵，将蚕丝蛋白大分子均匀地分散在细菌纤维素中，蚕丝蛋白大分子与细菌纤维素之间形成初步的物理交缠，之后借助细菌纤维素的桥梁的作用，乙酰化改性的蚕丝蛋白大分子在紫外光下交联固化时，蚕丝蛋白大分子之间有利于形成β折叠等规整结构，提高了复合水凝胶膜的内部结合力，继而提高复合水凝胶膜的机械性能。
(2)本发明制备的乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜保留了蚕丝蛋白和细菌纤维素原有的优良特性，生物相容性和可降解性好，制备的复合水凝胶膜中乙酰化改性蚕丝蛋白与细菌纤维素相互作用情况较好，具有理想的交联双网络结构空间结构，孔隙结构多样性，且孔隙率和孔径大小适合有利于细胞黏附、增殖、分化及分泌细胞外基质，力学性能好，承重性好，实用性佳。
(3)本发明的制备方法简单，原料简单，成本低，不需要使用昂贵的光引发剂、纳米材料或者复杂的设备，只需要借助传统的细菌纤维素制备工艺就可以制备而成，制备工艺可控性强，可操作性强，有利于大面积制作，适合工业生产。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1是乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的形成机理示意图；
图2是对比例1制备的静置发酵的纯细菌纤维素膜的电镜图；
图3是实施例6制备的乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的电镜图；
图4是实施例6制备的乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的EDS元素分布图。
其中，1、细菌纤维素分子链 2、蚕丝蛋白分子链 3、甲基丙烯酸盐侧基。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1：
(1)将桑蚕丝用0.05％Na2CO3溶液以1：50的浴比在100℃下煮沸30min，用去离子水洗净，重复三次，放在室温通风处晾干，得到丝素，然后将丝素以1∶10的浴比分批加入摩尔比为1:2：8的氯化钙、乙醇和水构成的三元溶剂中，置于76℃的水浴锅内恒温搅拌，直至完全溶解，得到丝素-氯化钙溶液，将丝素-氯化钙溶液倒入洁净的透析袋(透析袋的截留分子量为3.5kD)中，两头封口，先用流动的自来水透析2d，再用去离子水透析八次，每次1h，之后以10000r/min离心20min，取上清液，得到蚕丝蛋白溶液，以60Co(10Gy)辐射灭菌后，放进冰箱备用，其中蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的分子量为3.5-10kD，蚕丝蛋白的浓度为1％。
(2)将蚕丝蛋白溶液加入1.2％(o.w.f)磷酸缓冲液中，一边在60℃下以500r/min的速率恒温搅拌一边以0.5mL/min的速率滴加甲基丙烯酸酯，滴加完毕后继续在60℃下以500r/min的速率恒温搅拌2h，反应结束后透析(透析袋的截留分子量为3.5kD)，并在-60℃的冰箱内冷冻12h左右，然后转移到-40℃的冷冻干燥机里冻干24h左右，得到呈白色海绵状的乙酰化改性蚕丝蛋白，粉碎后得乙酰化改性蚕丝蛋白粉末。
(3)将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，其中液态种子培养基配方为：50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，pH6.8；斜面培养基配方50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，18g/L琼脂，pH6.8；发酵培养基配方为80g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、2.0g/L无水硫酸镁、1.0g/L柠檬酸、10g/L磷酸氢二钠、30g/L磷酸氢二钾，pH6.8，木醋杆菌经过斜面划线后置于25℃培养箱中，恒温活化培养7d，将活化的木醋杆菌接入种子培养基中，25℃条件下150r/min振荡培养72h，将木醋杆菌种子培养液以体积分数7％的接种量接入发酵培养基中，加入辐射灭菌后的乙酰化改性蚕丝蛋白粉末，在25℃的恒温培养箱静置发酵培养7d，过滤收集纤维素，用水反复冲洗除去培养基，再用40g/L NaOH溶液于85℃水浴3h以去除菌体，其间每隔1h用蒸馏水反复冲洗数次，再滴加数滴0.1％乙酸溶液浸泡5min左右，蒸馏水冲洗，得到厚度为0.2cm的负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜，其中负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜中乙酰化改性的蚕丝蛋白和细菌纤维素的质量比为1:1。
(4)将负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜置于波长为365nm的紫外光环境中固化交联30s，得到乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜。
实施例2：
(1)将桑蚕丝用0.05％Na2CO3溶液以1：50的浴比在100℃下煮沸45min，用去离子水洗净，重复三次，放在室温通风处晾干，得到丝素，然后将丝素以1∶10的浴比分批加入摩尔比为1:2:8的氯化钙、乙醇和水构成的三元溶剂中，置于74℃的水浴锅内恒温搅拌，直至完全溶解，得到丝素-氯化钙溶液，将丝素-氯化钙溶液倒入洁净的透析袋(透析袋的截留分子量为3.5kD)中，两头封口，先用流动的自来水透析2d，再用去离子水透析八次，每次1h，之后以10000r/min离心20min，取上清液，得到蚕丝蛋白溶液，以60Co(10Gy)辐射灭菌后，放进冰箱备用，其中蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的分子量为3.5-10kD，蚕丝蛋白的浓度为5％。
(2)将蚕丝蛋白溶液加入2.5％(o.w.f)磷酸缓冲液中，一边在70℃下以1000r/min的速率恒温搅拌一边以1mL/min的速率滴加甲基丙烯酸酯，滴加完毕后继续在70℃下以1000r/min的速率恒温搅拌6h，反应结束后透析(透析袋的截留分子量为3.5kD)，并在-80℃的冰箱内冷冻18h左右，然后转移到-40℃的冷冻干燥机里冻干48h左右，得到呈白色海绵状的乙酰化改性蚕丝蛋白，粉碎后得乙酰化改性蚕丝蛋白粉末。
(3)将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，其中液态种子培养基配方为：50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，pH6.8；斜面培养基配方50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，18g/L琼脂，pH6.8；发酵培养基配方为80g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、2.0g/L无水硫酸镁、1.0g/L柠檬酸、10g/L磷酸氢二钠、30g/L磷酸氢二钾，pH6.8。木醋杆菌经过斜面划线后置于30℃培养箱中，恒温活化培养7d。将活化的木醋杆菌接入种子培养基中，30℃条件下150r/min振荡培养72h。将木醋杆菌种子培养液以体积分数7％的接种量接入发酵培养基中，加入辐射灭菌后的乙酰化改性蚕丝蛋白粉末，在30℃的恒温培养箱静置发酵培养10d，过滤收集纤维素，用水反复冲洗除去培养基，再用40g/L NaOH溶液于85℃水浴3h以去除菌体，其间每隔1h用蒸馏水反复冲洗数次，再滴加数滴0.1％乙酸溶液浸泡5min左右，蒸馏水冲洗，得到厚度为0.4cm的负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜，其中负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜中乙酰化改性的蚕丝蛋白和细菌纤维素的质量比为1:3。
(4)将负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜置于波长为365nm的紫外光环境中固化交联60s，得到乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜。
实施例3：
(1)将桑蚕丝用0.05％Na2CO3溶液以1：50的浴比在100℃下煮沸35min，用去离子水洗净，重复三次，放在室温通风处晾干，得到丝素，然后将丝素以1∶10的浴比分批加入摩尔比为1:2:8的氯化钙、乙醇和水构成的三元溶剂中，置于78℃的水浴锅内恒温搅拌，直至完全溶解，得到丝素-氯化钙溶液，将丝素-氯化钙溶液倒入洁净的透析袋(透析袋的截留分子量为3.5kD)中，两头封口，先用流动的自来水透析2d，再用去离子水透析八次，每次1h，之后以10000r/min离心20min，取上清液，得到蚕丝蛋白溶液，以60Co(10Gy)辐射灭菌后，放进冰箱备用，其中蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的分子量为3.5-10kD，蚕丝蛋白的浓度为2.5％。
(2)将蚕丝蛋白溶液加入1.8％(o.w.f)磷酸缓冲液中，一边在65℃下以800r/min的速率恒温搅拌一边以0.6mL/min的速率滴加甲基丙烯酸酯，滴加完毕后继续在65℃下以800r/min的速率恒温搅拌4h，反应结束后透析(透析袋的截留分子量为3.5kD)，并在-70℃的冰箱内冷冻16h左右，然后转移到-40℃的冷冻干燥机里冻干36h左右，得到呈白色海绵状的乙酰化改性蚕丝蛋白，粉碎后得乙酰化改性蚕丝蛋白粉末。
(3)将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，其中液态种子培养基配方为：50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，pH6.8；斜面培养基配方50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，18g/L琼脂，pH6.8；发酵培养基配方为80g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、2.0g/L无水硫酸镁、1.0g/L柠檬酸、10g/L磷酸氢二钠、30g/L磷酸氢二钾，pH6.8。木醋杆菌经过斜面划线后置于28℃培养箱中，恒温活化培养7d。将活化的木醋杆菌接入种子培养基中，26℃条件下150r/min振荡培养72h。将木醋杆菌种子培养液以体积分数7％的接种量接入发酵培养基中，加入辐射灭菌后的乙酰化改性蚕丝蛋白粉末，在26℃的恒温培养箱静置发酵培养8d，过滤收集纤维素，用水反复冲洗除去培养基，再用40g/L NaOH溶液于85℃水浴3h以去除菌体，其间每隔1h用蒸馏水反复冲洗数次，再滴加数滴0.1％乙酸溶液浸泡5min左右，蒸馏水冲洗，得到厚度为0.3cm的负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜，其中负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜中乙酰化改性的蚕丝蛋白和细菌纤维素的质量比为3:1。
(4)将负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜置于波长为365nm的紫外光环境中固化交联45s，得到乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜。
实施例4：
(1)将桑蚕丝用0.05％Na2CO3溶液以1：50的浴比在100℃下煮沸40min，用去离子水洗净，重复三次，放在室温通风处晾干，得到丝素，然后将丝素以1∶10的浴比分批加入摩尔比为1:2:8的氯化钙、乙醇和水构成的三元溶剂中，置于77℃的水浴锅内恒温搅拌，直至完全溶解，得到丝素-氯化钙溶液，将丝素-氯化钙溶液倒入洁净的透析袋(透析袋的截留分子量为3.5kD)中，两头封口，先用流动的自来水透析2d，再用去离子水透析八次，每次1h，之后以10000r/min离心20min，取上清液，得到蚕丝蛋白溶液，以60Co(10Gy)辐射灭菌后，放进冰箱备用，其中蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的分子量为3.5-10kD，蚕丝蛋白的浓度为4％。
(2)将蚕丝蛋白溶液加入2.5％(o.w.f)磷酸缓冲液中，一边在66℃下以800r/min的速率恒温搅拌一边以0.8mL/min的速率滴加甲基丙烯酸酯，滴加完毕后继续在67℃下以900r/min的速率恒温搅拌5h，反应结束后透析(透析袋的截留分子量为3.5kD)，并在-75℃的冰箱内冷冻15h左右，然后转移到-40℃的冷冻干燥机里冻干32h左右，得到呈白色海绵状的乙酰化改性蚕丝蛋白，粉碎后得乙酰化改性蚕丝蛋白粉末。
(3)将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，其中液态种子培养基配方为：50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，pH6.8；斜面培养基配方50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，18g/L琼脂，pH6.8；发酵培养基配方为80g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、2.0g/L无水硫酸镁、1.0g/L柠檬酸、10g/L磷酸氢二钠、30g/L磷酸氢二钾，pH6.8。木醋杆菌经过斜面划线后置于30℃培养箱中，恒温活化培养7d。将活化的木醋杆菌接入种子培养基中，28℃条件下150r/min振荡培养72h。将木醋杆菌种子培养液以体积分数7％的接种量接入发酵培养基中，加入辐射灭菌后的乙酰化改性蚕丝蛋白粉末，在28℃的恒温培养箱静置发酵培养9d，过滤收集纤维素，用水反复冲洗除去培养基，再用40g/L NaOH溶液于85℃水浴3h以去除菌体，其间每隔1h用蒸馏水反复冲洗数次，再滴加数滴0.1％乙酸溶液浸泡5min左右，蒸馏水冲洗，得到厚度为0.25cm的负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜，其中负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜中乙酰化改性的蚕丝蛋白和细菌纤维素的质量比为2:1。
(4)将负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜置于波长为365nm的紫外光环境中固化交联55s，得到乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜。
实施例5：
(1)将桑蚕丝用0.05％Na2CO3溶液以1：50的浴比在100℃下煮沸30min，用去离子水洗净，重复三次，放在室温通风处晾干，得到丝素，然后将丝素以1∶10的浴比分批加入摩尔比为1:2：8的氯化钙、乙醇和水构成的三元溶剂中，置于78℃的水浴锅内恒温搅拌，直至完全溶解，得到丝素-氯化钙溶液，将丝素-氯化钙溶液倒入洁净的透析袋(透析袋的截留分子量为3.5kD)中，两头封口，先用流动的自来水透析2d，再用去离子水透析八次，每次1h，之后以10000r/min离心20min，取上清液，得到蚕丝蛋白溶液，以60Co(10Gy)辐射灭菌后，放进冰箱备用，其中蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的分子量为3.5-10kD，蚕丝蛋白的浓度为5％。
(2)将蚕丝蛋白溶液加入1.2％(o.w.f)磷酸缓冲液中，一边在70℃下以500r/min的速率恒温搅拌一边以1mL/min的速率滴加甲基丙烯酸酯，滴加完毕后继续在60℃下以1000r/min的速率恒温搅拌2h，反应结束后透析(透析袋的截留分子量为3.5kD)，并在-80℃的冰箱内冷冻12h左右，然后转移到-40℃的冷冻干燥机里冻干48h左右，得到呈白色海绵状的乙酰化改性蚕丝蛋白，粉碎后得乙酰化改性蚕丝蛋白粉末。
(3)将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，其中液态种子培养基配方为：50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，pH6.8；斜面培养基配方50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，18g/L琼脂，pH6.8；发酵培养基配方为80g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、2.0g/L无水硫酸镁、1.0g/L柠檬酸、10g/L磷酸氢二钠、30g/L磷酸氢二钾，pH6.8。木醋杆菌经过斜面划线后置于25℃培养箱中，恒温活化培养7d。将活化的木醋杆菌接入种子培养基中，30℃条件下150r/min振荡培养72h。将木醋杆菌种子培养液以体积分数7％的接种量接入发酵培养基中，加入辐射灭菌后的乙酰化改性蚕丝蛋白粉末，在25℃的恒温培养箱静置发酵培养10d，过滤收集纤维素，用水反复冲洗除去培养基，再用40g/L NaOH溶液于85℃水浴3h以去除菌体，其间每隔1h用蒸馏水反复冲洗数次，再滴加数滴0.1％乙酸溶液浸泡5min左右，蒸馏水冲洗，得到厚度为0.32cm的负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜，其中负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜中乙酰化改性的蚕丝蛋白和细菌纤维素的质量比为1:3。
(4)将负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜置于波长为365nm的紫外光环境中固化交联50s，得到乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜。
实施例6：
(1)将桑蚕丝用0.05％Na2CO3溶液以1：50的浴比在100℃下煮沸35min，用去离子水洗净，重复三次，放在室温通风处晾干，得到丝素，然后将丝素以1∶10的浴比分批加入摩尔比为1:2：8的氯化钙、乙醇和水构成的三元溶剂中，置于74℃的水浴锅内恒温搅拌，直至完全溶解，得到丝素-氯化钙溶液，将丝素-氯化钙溶液倒入洁净的透析袋(透析袋的截留分子量为3.5kD)中，两头封口，先用流动的自来水透析2d，再用去离子水透析八次，每次1h，之后以10000r/min离心20min，取上清液，得到蚕丝蛋白溶液，以60Co(10Gy)辐射灭菌后，放进冰箱备用，其中蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的分子量为3.5-10kD，蚕丝蛋白的浓度为2％。
(2)将蚕丝蛋白溶液加入2％(o.w.f)磷酸缓冲液中，一边在62℃下以750r/min的速率恒温搅拌一边以0.8mL/min的速率滴加甲基丙烯酸酯，滴加完毕后继续在65℃下以600r/min的速率恒温搅拌5h，反应结束后透析(透析袋的截留分子量为3.5kD)，并在-75℃的冰箱内冷冻15h左右，然后转移到-40℃的冷冻干燥机里冻干24h左右，得到呈白色海绵状的乙酰化改性蚕丝蛋白，粉碎后得乙酰化改性蚕丝蛋白粉末。
(3)将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，其中液态种子培养基配方为：50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，pH6.8；斜面培养基配方50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，18g/L琼脂，pH6.8；发酵培养基配方为80g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、2.0g/L无水硫酸镁、1.0g/L柠檬酸、10g/L磷酸氢二钠、30g/L磷酸氢二钾，pH6.8。木醋杆菌经过斜面划线后置于26℃培养箱中，恒温活化培养7d。将活化的木醋杆菌接入种子培养基中，28℃条件下150r/min振荡培养72h。将木醋杆菌种子培养液以体积分数7％的接种量接入发酵培养基中，加入辐射灭菌后的乙酰化改性蚕丝蛋白粉末，在26℃的恒温培养箱静置发酵培养10d，过滤收集纤维素，用水反复冲洗除去培养基，再用40g/L NaOH溶液于85℃水浴3h以去除菌体，其间每隔1h用蒸馏水反复冲洗数次，再滴加数滴0.1％乙酸溶液浸泡5min左右，蒸馏水冲洗，得到厚度为0.4cm的负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜，其中负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜中乙酰化改性的蚕丝蛋白和细菌纤维素的质量比为1:2。
(4)将负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜置于波长为365nm的紫外光环境中固化交联30s，得到乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜。
对比例1：
将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，其中液态种子培养基配方为：50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，pH6.8；斜面培养基配方50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，18g/L琼脂，pH6.8；发酵培养基配方为80g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、2.0g/L无水硫酸镁、1.0g/L柠檬酸、10g/L磷酸氢二钠、30g/L磷酸氢二钾，pH6.8。木醋杆菌经过斜面划线后置于26℃培养箱中，恒温活化培养7d。将活化的木醋杆菌接入种子培养基中，28℃条件下150r/min振荡培养72h。将木醋杆菌种子培养液以体积分数7％的接种量接入发酵培养基中，在26℃的恒温培养箱静置发酵培养10d，过滤收集纤维素，用水反复冲洗除去培养基，再用40g/L NaOH溶液于85℃水浴3h以去除菌体，其间每隔1h用蒸馏水反复冲洗数次，再滴加数滴0.1％乙酸溶液浸泡5min左右，蒸馏水冲洗，得到厚度为0.34cm的细菌纤维素膜。
对比例2：
(1)将桑蚕丝用0.05％Na2CO3溶液以1：50的浴比在100℃下煮沸35min，用去离子水洗净，重复三次，放在室温通风处晾干，得到丝素，然后将丝素以1∶10的浴比分批加入摩尔比为1:2：8的氯化钙、乙醇和水构成的三元溶剂中，置于74℃的水浴锅内恒温搅拌，直至完全溶解，得到丝素-氯化钙溶液，将丝素-氯化钙溶液倒入洁净的透析袋(透析袋的截留分子量为3.5kD)中，两头封口，先用流动的自来水透析2d，再用去离子水透析八次，每次1h，之后以10000r/min离心20min，取上清液，得到蚕丝蛋白溶液，以60Co(10Gy)辐射灭菌后，放进冰箱备用，其中蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的分子量为3.5-10kD，蚕丝蛋白的浓度为2％。
(2)将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，其中液态种子培养基配方为：50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，pH6.8；斜面培养基配方50g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，1.0g/L柠檬酸，1.0g/L磷酸氢二钠，3.0g/L磷酸氢二钾，1.46g/L无水硫酸镁，18g/L琼脂，pH6.8；发酵培养基配方为80g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、2.0g/L无水硫酸镁、1.0g/L柠檬酸、10g/L磷酸氢二钠、30g/L磷酸氢二钾，pH6.8。木醋杆菌经过斜面划线后置于26℃培养箱中，恒温活化培养7d。将活化的木醋杆菌接入种子培养基中，28℃条件下150r/min振荡培养72h。将木醋杆菌种子培养液以体积分数7％的接种量接入发酵培养基中，加入辐射灭菌后的蚕丝蛋白，在26℃的恒温培养箱静置发酵培养10d，过滤收集纤维素，用水反复冲洗除去培养基，再用40g/L NaOH溶液于85℃水浴3h以去除菌体，其间每隔1h用蒸馏水反复冲洗数次，再滴加数滴0.1％乙酸溶液浸泡5min左右，蒸馏水冲洗，得到厚度为0.4cm的负载蚕丝蛋白的细菌纤维素膜，其中负载蚕丝蛋白的细菌纤维素膜中蚕丝蛋白和细菌纤维素的质量比为1:2。
经检测，实施例1-6制备的乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜、对比例1制备的细菌纤维素膜、对比例2制备的负载蚕丝蛋白的细菌纤维素膜的孔隙率、孔隙尺寸和机械性能的结果如下所示：
由上表和附图2的内容可知，纯细菌纤维素膜中细菌纤维素成无规则缠绕结构，孔隙率小，孔隙尺寸分布范围大，孔隙分布均匀性较差，附图3-4可知，通过将乙酰化的蚕丝蛋白加入到细菌纤维素的静置发酵中，蚕丝蛋白均匀地分散在细菌纤维素表面和之间，并通过活性碳碳双键的交联作用，在水凝胶膜中形成纤维状或者片状结构，使水凝胶膜中的孔隙结构更加精细化，并含有纳米级和微米级的孔隙结构，但孔隙分布更窄，而且从实施例6制备的乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜和对比例2制备的负载蚕丝蛋白的细菌纤维素膜的机械性能比较可知，本发明制备的水凝胶膜的内部结合力更高，机械性更强，因此本发明制备的乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的实用性更佳。
将软骨细胞按4×105/瓶接种于培养瓶，加入含10％小牛血清、青霉素100μg/ml和链霉素100μg/ml的Ham’s F12完全培养基，置于5％CO2的氛围和37℃的恒温箱内培养，隔日换液，得到第三代软骨细胞。用F12培养液制成细胞悬液，将第三代软骨细胞种植到实施例1-6制备的乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜、对比例1制备的细菌纤维素膜、对比例2制备的负载蚕丝蛋白的细菌纤维素膜上，置于5％CO2的氛围和37℃的恒温箱内进行体外共培养，隔日换液，测得的细胞增值率和可降解率的结果如下：
由上表可见，本发明制备的乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的孔隙结构、大小和分布更有利于之后骨细胞的附着分化和繁殖。
因此，本发明制备的乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的生物相容性、力学强度、生物降解度均显著优于现有的产品，可满足组织工程的使用要求，综合性能佳。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜，其特征在于：所述乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜包括乙酰化改性蚕丝蛋白和细菌纤维素，所述乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜是乙酰化改性蚕丝蛋白加入细菌纤维素发酵液中静置发酵和紫外光固化得到，所述乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜含有分别由细菌纤维素和乙酰化改性蚕丝蛋白形成的交联双网络孔隙结构。
2.权利要求1所述一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将蚕丝纤维脱胶后，溶于三元溶液中，加热搅拌至完全溶解，离心，透析，得到蚕丝蛋白溶液；
(2)将蚕丝蛋白溶液加入磷酸缓冲液中，一边恒温搅拌一边滴加甲基丙烯酸酯，滴加完毕后继续恒温搅拌，反应结束后透析，冷冻干燥得到乙酰化改性蚕丝蛋白粉末；
(3)将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，将步骤(2)制备的乙酰化改性蚕丝蛋白粉末加入发酵培养基中，搅拌均匀，经高温灭菌，活化，接种，静置发酵，取出，洗涤，得到负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜；
(4)将步骤(3)制备的负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜置于紫外光环境中固化交联，得到乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜。
3.根据权利要求2所述的一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，三元溶液为摩尔比为1:2:8的氯化钙、乙醇和水的混合溶液。
4.根据权利要求2所述的一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的分子量为3.5-10kD，蚕丝蛋白的浓度为1-5％。
5.根据权利要求2所述的一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，恒温搅拌的温度为60-70℃，时间为2-6h，滴加的速率为0.5-1mL/min。
6.根据权利要求2所述的一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，静置发酵的温度25-30℃，时间7-10d。
7.根据权利要求2所述的一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜中乙酰化改性的蚕丝蛋白和细菌纤维素的质量比为1-3:1-3，负载乙酰化改性蚕丝蛋白的细菌纤维素膜的厚度为0.2-0.4cm。
8.根据权利要求2所述的一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，固化交联的紫外线波长为365nm，照射时间为30-60s。
9.根据权利要求2所述的一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜的孔隙率为80-90％，孔隙尺寸为0.1-10μm。
10.根据权利要求1所述的一种乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜，其特征在于：所述乙酰化改性蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶膜用于培养第3代软骨细胞。
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