CN106492286A - 一种蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶及其制备方法和应用，将经缩水甘油三甲基氯化铵表面改性的细菌纤维素水凝胶、骨形态发生蛋白‑2和蚕丝蛋白作为原料，经电凝胶技术将蚕丝蛋白在表面改性的细菌纤维素水凝胶的表面和内部网络孔隙结构中形成网络孔隙结构，继而构成双网络孔隙结构，骨形态发生蛋白‑2附着于双网络孔隙结构中，形成蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶。该制备方法，简单高效，绿色环保，复合水凝胶材料的机械强度高、孔隙率高，孔隙内部连通性好，生物相容性好，适合作为软骨修复支架，应用于软骨修复组织工程领域。

Description

一种蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纺织材料技术领域，具体涉及一种蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
随着人类社会的老龄化及高能、高速创伤的不断增多，软骨组织缺损和软骨组织退行性病变的问题日益突出。近年来，采用组织工程学的基本原理和方法，将细胞或生长因子种植于可生物降解、组织相容性好的生物材料，形成复合物并植入软骨缺损处，来修复、保持和改善组织功能。然而以往构建的组织工程软骨，存在着机械强度不足，大块软骨“空心”，修复组织基质钙化，远期疗效不佳等问题，难以获得理想的临床效果。因此，如何提高组织工程软骨的质量，成为当前研究的热点。
软骨组织工程支架作为软骨细胞外基质的替代物，是软骨组织工程的基础，合适的细胞支架可为种子细胞和生长因子提供适宜的微环境，完成组织或器官的再生过程，其材料、外形和孔结构对实现其作用和功能具有非常重要的意义，制备工艺的不同对支架的性能可产生明显影响。
目前，天然生物材料如胶原蛋白、丝蛋白、弹力蛋白、细菌纤维素等，由于来源广泛、绿色环保，生物相容性好，能促进细胞与材料的黏附并能维持软骨细胞的分化状态，软骨细胞的生长、代谢好，能产生较多基质并形成软骨阳，从而成为软骨组织工程的研究热点。但是，丝素水凝胶的力学性能较差，易脆，且其对细胞缺乏识别和诱导作用，细菌纤维素垂直于纤维层方向压缩模量较低，细菌纤维素中的水分在受力时容易挤出，溶胀性能不易恢复，而且细菌纤维素过于致密的结构及光滑的表面也会影响细胞在其上的粘附、增殖。因此目前有研究报道将蚕丝蛋白与细菌纤维素作为原料，将两者的功能性相结合制备性能优异的生物工程支架。中国专利CN 105031736A公开的用于人工小口径血管制备的复合材料及其制备方法，将羧基化细菌纤维素和蚕丝蛋白作为原料，经N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺作为交联剂，交联复合形成复合材料，再真空冻干形成。该复合材料是利用改性细菌纤维素表面的羧基与蚕丝蛋白结合，再通过交联剂的作用将细菌纤维素与蚕丝蛋白复合形成复合材料，材料中含有化学交联剂，化学交联剂的存在势必会影响细菌纤维素和蚕丝蛋白复合材料的生物相容性能，对生物材料的安全性能造成隐患，影响材料的绿色环保安全性能。因此制备一种绿色环保高效高强度的生物工程支架显得尤为重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶及其制备方法和应用，将水凝胶技术与电凝胶技术相结合，采用表面改性的细菌纤维素膜与蚕丝蛋白作为主要原料，并且负载骨形态发生蛋白-2，制备得到蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶，该蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶具有双网络孔隙结构，机械强度高，孔隙率高，孔隙内部连通性好，生物相容性好，适合作为软骨修复支架。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶，其特征在于，所述蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶包括表面改性的细菌纤维素、蚕丝蛋白和骨形态发生蛋白-2，所述蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶含有双网络孔隙结构，所述双网状孔隙结构包括表面改性的细菌纤维素形成的网络孔隙结构和蚕丝蛋白形成的网络孔隙结构，所述蚕丝蛋白形成的网络孔隙结构是通过电凝胶技术在表面改性的细菌纤维素网络孔隙结构的表面和内部形成网络孔隙结构。
作为上述技术方案的优选，所述骨形态发生蛋白-2附着于双网络孔隙结构，所述表面改性的细菌纤维素为缩水甘油三甲基氯化铵表面改性的细菌纤维素。
本发明还提供一种蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，经高温灭菌，活化，接种，恒温培养形成凝胶状细菌纤维素膜，将凝胶状细菌纤维素膜浸入碱液溶液中，在80℃下加热处理2h，取出，浸入去离子溶液中，得到透明凝胶状细菌纤维素膜，将透明凝胶状细菌纤维素膜高温灭菌后，加入氢氧化钠溶液，再加入缩水甘油三甲基氯化铵，在70℃下加热反应5h，中和pH值至中性，用蒸馏水充分水洗得到表面改性的细菌纤维素水凝胶；
(2)将脱胶后的蚕丝纤维加入摩尔比为1:2:8的氯化钙-乙醇-水三元溶液中，在80℃下加热搅拌至完全溶解，过滤，透析和浓缩得到蚕丝蛋白溶液，将蚕丝蛋白溶液中加入骨形态发生蛋白-2，混合均匀，形成骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液；
(3)将步骤(1)制备的表面改性的细菌纤维素水凝胶中插入正电极，置于步骤(2)制备的骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液中，将骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液插入负电极，施加电压，经电凝胶技术制备得到蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(1)中，高温灭菌的温度为121℃，时间为20min。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(1)中，氢氧化钠溶液的质量分数为0.5mol/L。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(1)中，透明凝胶状细菌纤维素膜、氢氧化钠溶液和缩水甘油三甲基氯化铵的料液比为1g:20ml:3-5ml。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(2)中，骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的质量分数为90-95％。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(2)中，蚕丝蛋白溶液的质量分数为3-8％。
作为上述技术方案的优选，所述步骤(3)中，电压为15-25V的直流电压，所述正电极和负电极的材料为石墨棒或者铜棒。
作为上述技术方案的优选，所述蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶用于培养软骨细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明制备的蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶的主要原料为蚕丝蛋白、细菌纤维素和骨形态发生蛋白-2，蚕丝蛋白是一种天然高分子蛋白，由18种氨基酸构成，含有结晶区和非结晶区，丝素蛋白可为细胞生长、粘附和分化提供所需的空间及环境，并抑制软骨细胞的去分化。细菌纤维素是由β-D-葡萄糖通过β-1，4-糖苷键结合成的直链，具有高结晶度、高持水性、超细三维纳米纤维结构、高抗张强度、高弹性模量、生物相容性和可降解性等特点。骨形态发生蛋白-2是转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员，可以加速全层关节软骨缺损修复，还可改善修复软骨组织学形态和生化性状。因此本发明制备的蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶具有这三种材料的优点，可以对软骨细胞进行识别和诱导，并促进生长因子等的负载和稳定分散，且具有良好的机械强度、生物相容性和可降解性能。
(2)本发明制备的蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶中的细菌纤维素为表面改性的细菌纤维素，表面改性的细菌纤维素表面含有电荷，有利于蚕丝蛋白和骨形态发生蛋白-2的附着，使蚕丝蛋白和表面改性的细菌纤维素通过离子键以及共价键连接，形成互传、半互传或互传和半互传混合的双网络结构，提高了蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶的机械性能，而且网孔中孔隙的半径为纳米级，可以帮助负载物质的稳定和分散。
(3)本发明制备的蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶采用电凝胶技术进行复合，通过电流的作用，将电源正极附近，也就是在细菌纤维素膜周围的蚕丝蛋白大分子之间发生相互作用，在细菌纤维素膜的内部和表面交联形成蚕丝蛋白微球胶束，蚕丝蛋白微球胶束的数量不断增加形成蚕丝蛋白水凝胶，采用电凝胶方法将蚕丝蛋白与细菌纤维素相结合，形成双网络结构，方法简单，效率高，不会破坏蚕丝蛋白大分子的结构，不影响蚕丝蛋白的生物相容性能，而且不使用化学交联剂，绿色环保。
(4)本发明制备的蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶的制备方法简单，绿色环保高效，不影响蚕丝蛋白和细菌纤维素原有的优良特性，制备的蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶有利于细胞黏附、增殖、分化及分泌细胞外基质，可在人体内通过水解和细胞吞噬等途径自然降解排出，力学性能好，耐压缩，孔隙率、孔径大小和内连经大小适合，生物相容性和可降解性好。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
附图1是蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶的结构示意图；
附图2是蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶的制备方法示意图。
其中，1、蚕丝蛋白形成的网络孔隙结构 2、表面改性的细菌纤维素形成的网络孔隙结构 3、骨形态发生蛋白-2 4、电极 5、蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶 6、骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1：
(1)将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，经在121℃下高温灭菌20min，取种子培养基及活化过的菌种斜面，用接种环挑取两环菌种接入液体培养基中，整个过程无菌操作。将培养基摇匀后，放入温控摇瓶柜中，在30℃温度和160r/min转速下培养24h。将培养完成的种子液接入发酵培养基中,30℃恒温静置培养10天，在培养基和空气的交界面生成凝胶状细菌纤维素膜，将凝胶状细菌纤维素膜取出，用去离子水冲洗后，浸入0.5mol/L的NaOH水溶液中，在80℃温度下处理2h，再浸入去离子水中处理，以除去残存的菌体和培养基，得到厚度为0.5cm的透明凝胶状细菌纤维素膜，121℃灭菌20min后室温保存。
(2)将1g透明凝胶状细菌纤维素与20mL浓度为0.5mol/L的NaOH水溶液混合，并加入3ml的缩水甘油三甲基氯化铵，70℃反应5h，然后用HCl进行中和pH值至中性，再用蒸馏水洗涤，得到表面改性的细菌纤维素水凝胶。
(3)将脱胶后的蚕丝纤维加入摩尔比为1:2:8的氯化钙-乙醇-水三元溶液中，在80℃下加热搅拌至完全溶解，过滤，透析和浓缩得到质量分数为3％的蚕丝蛋白溶液，将蚕丝蛋白溶液中加入骨形态发生蛋白-2，混合均匀，形成骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液，其中，骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的质量分数为90％。
(4)将表面改性的细菌纤维素水凝胶中插入正电极铜棒，置于骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液中，将骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液插入负电极铜棒，施加15V的直流电压，经电凝胶技术制备得到蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶。
(5)将软骨细胞按4×105/瓶接种于培养瓶，加入含10％小牛血清、青霉素100μg/ml和链霉素100μg/ml的Ham’s F12完全培养基，置于5％CO2的氛围和37℃的恒温箱内培养，隔日换液，得到传代3代以内的软骨细胞。用F12培养液制成细胞悬液，将传代3代以内的软骨细胞种植到蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶上，置于5％CO2的氛围和37℃的恒温箱内进行体外共培养，隔日换液。
实施例2：
(1)将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，经在121℃下高温灭菌20min，取种子培养基及活化过的菌种斜面，用接种环挑取两环菌种接入液体培养基中，整个过程无菌操作。将培养基摇匀后，放入温控摇瓶柜中，在30℃温度和160r/min转速下培养24h。将培养完成的种子液接入发酵培养基中,30℃恒温静置培养10天，在培养基和空气的交界面生成凝胶状细菌纤维素膜，将凝胶状细菌纤维素膜取出，用去离子水冲洗后，浸入0.5mol/L的NaOH水溶液中，在80℃温度下处理2h，再浸入去离子水中处理，以除去残存的菌体和培养基，得到厚度为2cm的透明凝胶状细菌纤维素膜，121℃灭菌20min后室温保存。
(2)将1g透明凝胶状细菌纤维素与20mL浓度为0.5mol/L的NaOH水溶液混合，并加入3-5ml的缩水甘油三甲基氯化铵，70℃反应5h，然后用HCl进行中和pH值至中性，再用蒸馏水洗涤，得到表面改性的细菌纤维素水凝胶。
(3)将脱胶后的蚕丝纤维加入摩尔比为1:2:8的氯化钙-乙醇-水三元溶液中，在80℃下加热搅拌至完全溶解，过滤，透析和浓缩得到质量分数为8％的蚕丝蛋白溶液，将蚕丝蛋白溶液中加入骨形态发生蛋白-2，混合均匀，形成骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液，其中，骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的质量分数为95％。
(4)将表面改性的细菌纤维素水凝胶中插入正电极石墨棒，置于骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液中，将骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液插入负电极石墨棒，施加25V的直流电压，经电凝胶技术制备得到蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶。
(5)将软骨细胞按4×105/瓶接种于培养瓶，加入含10％小牛血清、青霉素100μg/ml和链霉素100μg/ml的Ham’s F12完全培养基，置于5％CO2的氛围和37℃的恒温箱内培养，隔日换液，得到传代3代以内的软骨细胞。用F12培养液制成细胞悬液，将传代3代以内的软骨细胞种植到蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶上，置于5％CO2的氛围和37℃的恒温箱内进行体外共培养，隔日换液。
实施例3：
(1)将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，经在121℃下高温灭菌20min，取种子培养基及活化过的菌种斜面，用接种环挑取两环菌种接入液体培养基中，整个过程无菌操作。将培养基摇匀后，放入温控摇瓶柜中，在30℃温度和160r/min转速下培养24h。将培养完成的种子液接入发酵培养基中,30℃恒温静置培养10天，在培养基和空气的交界面生成凝胶状细菌纤维素膜，将凝胶状细菌纤维素膜取出，用去离子水冲洗后，浸入0.5mol/L的NaOH水溶液中，在80℃温度下处理2h，再浸入去离子水中处理，以除去残存的菌体和培养基，得到厚度为1cm的透明凝胶状细菌纤维素膜，121℃灭菌20min后室温保存。
(2)将1g透明凝胶状细菌纤维素与20mL浓度为0.5mol/L的NaOH水溶液混合，并加入4ml的缩水甘油三甲基氯化铵，70℃反应5h，然后用HCl进行中和pH值至中性，再用蒸馏水洗涤，得到表面改性的细菌纤维素水凝胶。
(3)将脱胶后的蚕丝纤维加入摩尔比为1:2:8的氯化钙-乙醇-水三元溶液中，在80℃下加热搅拌至完全溶解，过滤，透析和浓缩得到质量分数为5％的蚕丝蛋白溶液，将蚕丝蛋白溶液中加入骨形态发生蛋白-2，混合均匀，形成骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液，其中，骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的质量分数为93％。
(4)将表面改性的细菌纤维素水凝胶中插入正电极石墨棒，置于骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液中，将骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液插入负电极石墨棒，施加20V的直流电压，经电凝胶技术制备得到蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶。
(5)将软骨细胞按4×105/瓶接种于培养瓶，加入含10％小牛血清、青霉素100μg/ml和链霉素100μg/ml的Ham’s F12完全培养基，置于5％CO2的氛围和37℃的恒温箱内培养，隔日换液，得到传代3代以内的软骨细胞。用F12培养液制成细胞悬液，将传代3代以内的软骨细胞种植到蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶上，置于5％CO2的氛围和37℃的恒温箱内进行体外共培养，隔日换液。
实施例4：
(1)将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，经在121℃下高温灭菌20min，取种子培养基及活化过的菌种斜面，用接种环挑取两环菌种接入液体培养基中，整个过程无菌操作。将培养基摇匀后，放入温控摇瓶柜中，在30℃温度和160r/min转速下培养24h。将培养完成的种子液接入发酵培养基中,30℃恒温静置培养10天，在培养基和空气的交界面生成凝胶状细菌纤维素膜，将凝胶状细菌纤维素膜取出，用去离子水冲洗后，浸入0.5mol/L的NaOH水溶液中，在80℃温度下处理2h，再浸入去离子水中处理，以除去残存的菌体和培养基，得到厚度为1.5cm的透明凝胶状细菌纤维素膜，121℃灭菌20min后室温保存。
(2)将1g透明凝胶状细菌纤维素与20mL浓度为0.5mol/L的NaOH水溶液混合，并加入3.5ml的缩水甘油三甲基氯化铵，70℃反应5h，然后用HCl进行中和pH值至中性，再用蒸馏水洗涤，得到表面改性的细菌纤维素水凝胶。
(3)将脱胶后的蚕丝纤维加入摩尔比为1:2:8的氯化钙-乙醇-水三元溶液中，在80℃下加热搅拌至完全溶解，过滤，透析和浓缩得到质量分数为4％的蚕丝蛋白溶液，将蚕丝蛋白溶液中加入骨形态发生蛋白-2，混合均匀，形成骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液，其中，骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的质量分数为93％。
(4)将表面改性的细菌纤维素水凝胶中插入正电极铜棒，置于骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液中，将骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液插入负电极铜棒，施加18V的直流电压，经电凝胶技术制备得到蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶。
(5)将软骨细胞按4×105/瓶接种于培养瓶，加入含10％小牛血清、青霉素100μg/ml和链霉素100μg/ml的Ham’s F12完全培养基，置于5％CO2的氛围和37℃的恒温箱内培养，隔日换液，得到传代3代以内的软骨细胞。用F12培养液制成细胞悬液，将传代3代以内的软骨细胞种植到蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶上，置于5％CO2的氛围和37℃的恒温箱内进行体外共培养，隔日换液。
实施例5：
(1)将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，经在121℃下高温灭菌20min，取种子培养基及活化过的菌种斜面，用接种环挑取两环菌种接入液体培养基中，整个过程无菌操作。将培养基摇匀后，放入温控摇瓶柜中，在30℃温度和160r/min转速下培养24h。将培养完成的种子液接入发酵培养基中,30℃恒温静置培养10天，在培养基和空气的交界面生成凝胶状细菌纤维素膜，将凝胶状细菌纤维素膜取出，用去离子水冲洗后，浸入0.5mol/L的NaOH水溶液中，在80℃温度下处理2h，再浸入去离子水中处理，以除去残存的菌体和培养基，得到厚度为1.2cm的透明凝胶状细菌纤维素膜，121℃灭菌20min后室温保存。
(2)将1g透明凝胶状细菌纤维素与20mL浓度为0.5mol/L的NaOH水溶液混合，并加入4.5ml的缩水甘油三甲基氯化铵，70℃反应5h，然后用HCl进行中和pH值至中性，再用蒸馏水洗涤，得到表面改性的细菌纤维素水凝胶。
(3)将脱胶后的蚕丝纤维加入摩尔比为1:2:8的氯化钙-乙醇-水三元溶液中，在80℃下加热搅拌至完全溶解，过滤，透析和浓缩得到质量分数为6％的蚕丝蛋白溶液，将蚕丝蛋白溶液中加入骨形态发生蛋白-2，混合均匀，形成骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液，其中，骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的质量分数为94％。
(4)将表面改性的细菌纤维素水凝胶中插入正电极铜棒，置于骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液中，将骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液插入负电极铜棒，施加21V的直流电压，经电凝胶技术制备得到蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶。
(5)将软骨细胞按4×105/瓶接种于培养瓶，加入含10％小牛血清、青霉素100μg/ml和链霉素100μg/ml的Ham’s F12完全培养基，置于5％CO2的氛围和37℃的恒温箱内培养，隔日换液，得到传代3代以内的软骨细胞。用F12培养液制成细胞悬液，将传代3代以内的软骨细胞种植到蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶上，置于5％CO2的氛围和37℃的恒温箱内进行体外共培养，隔日换液。
实施例6：
(1)将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，经在121℃下高温灭菌20min，取种子培养基及活化过的菌种斜面，用接种环挑取两环菌种接入液体培养基中，整个过程无菌操作。将培养基摇匀后，放入温控摇瓶柜中，在30℃温度和160r/min转速下培养24h。将培养完成的种子液接入发酵培养基中,30℃恒温静置培养10天，在培养基和空气的交界面生成凝胶状细菌纤维素膜，将凝胶状细菌纤维素膜取出，用去离子水冲洗后，浸入0.5mol/L的NaOH水溶液中，在80℃温度下处理2h，再浸入去离子水中处理，以除去残存的菌体和培养基，得到厚度为0.8cm的透明凝胶状细菌纤维素膜，121℃灭菌20min后室温保存。
(2)将1g透明凝胶状细菌纤维素与20mL浓度为0.5mol/L的NaOH水溶液混合，并加入4ml的缩水甘油三甲基氯化铵，70℃反应5h，然后用HCl进行中和pH值至中性，再用蒸馏水洗涤，得到表面改性的细菌纤维素水凝胶。
(3)将脱胶后的蚕丝纤维加入摩尔比为1:2:8的氯化钙-乙醇-水三元溶液中，在80℃下加热搅拌至完全溶解，过滤，透析和浓缩得到质量分数为5.5％的蚕丝蛋白溶液，将蚕丝蛋白溶液中加入骨形态发生蛋白-2，混合均匀，形成骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液，其中，骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的质量分数为94％。
(4)将表面改性的细菌纤维素水凝胶中插入正电极石墨棒，置于骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液中，将骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液插入负电极石墨棒，施加20V的直流电压，经电凝胶技术制备得到蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶。
(5)将软骨细胞按4×105/瓶接种于培养瓶，加入含10％小牛血清、青霉素100μg/ml和链霉素100μg/ml的Ham’s F12完全培养基，置于5％CO2的氛围和37℃的恒温箱内培养，隔日换液，得到传代3代以内的软骨细胞。用F12培养液制成细胞悬液，将传代3代以内的软骨细胞种植到蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶上，置于5％CO2的氛围和37℃的恒温箱内进行体外共培养，隔日换液。
经检测，实施例1-6制备的蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶与纯细菌纤维素水凝胶和纯蚕丝蛋白水凝胶的孔隙率、平均孔径、内连径、压缩应力、压缩模量、生物相容性和可降解性的结果如下所示：
由上表可见，本发明制备的蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶的孔隙率高，孔隙大小和内连径适中，其力学性能、生物相容性和可降解率好，且蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶的生物相容性优于纯细菌纤维素水凝胶，力学性能优于纯蚕丝蛋白水凝胶，因此，本发明制备的蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶将细菌纤维素和蚕丝蛋白的优点很好的结合，蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶的综合性能和附加值高，更有利于市场的推广和使用。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶，其特征在于，所述蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶包括表面改性的细菌纤维素、蚕丝蛋白和骨形态发生蛋白-2，所述蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶含有双网络孔隙结构，所述双网状孔隙结构包括表面改性的细菌纤维素形成的网络孔隙结构和蚕丝蛋白形成的网络孔隙结构，所述蚕丝蛋白形成的网络孔隙结构是通过电凝胶技术在表面改性的细菌纤维素网络孔隙结构的表面和内部形成网络孔隙结构。
2.根据权利要求1所述的一种蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶，其特征在于：所述骨形态发生蛋白-2附着于双网络孔隙结构，所述表面改性的细菌纤维素为缩水甘油三甲基氯化铵表面改性的细菌纤维素。
3.一种蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将木醋杆菌为菌种，配置液态种子培养基、木醋杆菌斜面培养基和发酵培养基，经高温灭菌，活化，接种，恒温培养形成凝胶状细菌纤维素膜，将凝胶状细菌纤维素膜浸入碱液溶液中，在80℃下加热处理2h，取出，浸入去离子溶液中，得到透明凝胶状细菌纤维素膜，将透明凝胶状细菌纤维素膜高温灭菌后，加入氢氧化钠溶液，再加入缩水甘油三甲基氯化铵，在70℃下加热反应5h，中和pH值至中性，用蒸馏水充分水洗得到表面改性的细菌纤维素水凝胶；
(2)将脱胶后的蚕丝纤维加入摩尔比为1:2:8的氯化钙-乙醇-水三元溶液中，在80℃下加热搅拌至完全溶解，过滤，透析和浓缩得到蚕丝蛋白溶液，将蚕丝蛋白溶液中加入骨形态发生蛋白-2，混合均匀，形成骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液；
(3)将步骤(1)制备的表面改性的细菌纤维素水凝胶中插入正电极，置于步骤(2)制备的骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液中，将骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液插入负电极，施加电压，经电凝胶技术制备得到蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶。
4.根据权利要求3所述的一种蚕丝蛋白细菌纤维素复合水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，高温灭菌的温度为121℃，时间为20min。
5.根据权利要求3所述的一种蚕丝蛋白细菌纤维素复合水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，氢氧化钠溶液的质量分数为0.5mol/L。
6.根据权利要求3所述的一种蚕丝蛋白细菌纤维素复合水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，透明凝胶状细菌纤维素膜、氢氧化钠溶液和缩水甘油三甲基氯化铵的料液比为1g:20ml:3-5ml。
7.根据权利要求3所述的一种蚕丝蛋白细菌纤维素复合水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，骨形态发生蛋白-2/蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的质量分数为90-95％。
8.根据权利要求3所述的一种蚕丝蛋白细菌纤维素复合水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，蚕丝蛋白溶液的质量分数为3-8％。
9.根据权利要求3所述的一种蚕丝蛋白细菌纤维素复合水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，电压为15-25V的直流电压，所述正电极和负电极的材料为石墨棒或者铜棒。
10.根据权利要求1所述的一种蚕丝蛋白细菌纤维素复合水凝胶，其特征在于，所述蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶用于培养软骨细胞。
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