JP2009112224A - 三次元疾患皮膚再構築物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】エピモルフィンをコードする核酸が発現可能に導入されている遺伝子導入表皮基底細胞を、支持体上で三次元に培養して得られる三次元疾患皮膚再構築物及び表皮基底細胞に、エピモルフィンをコードする核酸を発現可能に導入し、得られた遺伝子導入表皮基底細胞を、支持体上で三次元に培養する三次元疾患皮膚再構築物の製造方法。
【選択図】 なし
Description
(1) エピモルフィンをコードする核酸が発現可能に導入されている遺伝子導入表皮基底細胞を、支持体上で三次元に培養して得られる三次元疾患皮膚再構築物、
(2) 前記核酸が、アミノ末端側にシグナルペプチドが付加されたエピモルフィンをコードする核酸である前記(1)記載の三次元疾患皮膚再構築物、
(3) 前記遺伝子導入表皮基底細胞が、ヒト表皮基底細胞から得られる遺伝子導入細胞であり、前記支持体が、ヒト線維芽細胞がコラーゲンゲル内に包埋された細胞包埋コラーゲンゲルである前記(1)又は(2)に記載の三次元疾患皮膚再構築物、並びに
(4) 表皮基底細胞に、エピモルフィンをコードする核酸を発現可能に導入して得られた遺伝子導入表皮基底細胞を、支持体上で三次元に培養することを特徴とする三次元疾患皮膚再構築物の製造方法
に関する。
to open gap 11、Cost to extend gap 1、expect value 10、wordsize 11の条件(デフォルト値)下、アライメントし、算出される値として、少なくとも80%以上、好ましくは90%以上の配列相同性を有する塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが、表皮基底細胞中において、エピモルフィンとしての機能を示すポリペプチドである核酸、又は(c)前記GenBankアクセッション番号:D14582(配列番号:1)又は前記GenBankアクセッション番号:D10475の塩基配列に完全に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件(例えば、6×SSC(1×SSCの組成:0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0)と0.5重量% SDSと5×デンハルト溶液と100μg/ml 変性サケ精子DNAと50体積% ホルムアミドとを含む溶液中、少なくとも50℃の温度条件で10時間インキュベーションし、つぎに、2×SSCのイオン強度条件下で、少なくとも42℃の温度条件下での洗浄を行なう条件)又はよりストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、エピモルフィンとしての機能を発現するポリペプチドである核酸などであってもよい。
(A)前記支持体上に、当該遺伝子導入表皮基底細胞を播種する工程、
(B)前記工程(A)で得られた播種後の支持体を、一定期間、前記表皮基底細胞の生育に適した培地に浸漬させて、5体積% CO2下、36℃〜38℃(細胞を良好に生育させる観点から、好ましくは36.5℃〜37.5℃、特に好ましくは37℃)の条件で培養する工程、及び
(C)前記工程(B)で得られた培養物における遺伝子導入表皮基底細胞の表面を、空気と前記培地との接触面まで持ち上げて配置し、一定期間、5体積% CO2下、36℃〜38℃(細胞を良好に生育させる観点から、好ましくは36.5℃〜37.5℃、特に好ましくは37℃)の条件で培養する工程、
を含む方法(Air−lift法)などにより行なわれる。前記遺伝子導入表皮基底細胞の三次元培養により、遺伝子導入表皮基底細胞が重層化され、導入した遺伝子に応じて分化が進行し、本発明の三次元疾患皮膚再構築物が得られる。
(1)マウスへの紫外線照射
メス7週齢ヘアレスマウスHR−1(以下、「HR−1マウス」ともいう(清水実験材料株式会社供給)の背部の皮膚を、商品名:GL20SE UVBランプ(280−380nm、発光ピーク:306nm、三共電気株式会社製)による7分間のUVBの単回照射(300mJ/cm2)に曝した。その後、前記HR−1マウスを、さらに5日間飼育した。
前記(1)で得られたHR−1マウスの皮膚組織の凍結切片(10μm四方)を、冷メタノール中10分間浸漬させて、固定し、固定試料を得た。つぎに、前記固定試料を、ブロッキング試薬(3質量% BSAのリン酸緩衝生理的食塩水溶液)とともに、室温で30分間インキュベーションした。その後、得られた試料を、一次抗体として、エピモルフィンに対するアフィニティー精製抗体(1:150)ともに、室温で60分間インキュベーションし、つづいて、Alexa Fluor 488−結合二次抗体(モレキュラー・プローブズ・ヨーロッパ社製)とともに、室温で60分間インキュベーションすることにより、UVBが照射されたHR−1マウスの皮膚組織におけるエピモルフィンの局在を調べた。なお、対照として、UVBが照射されていないHR−1マウスの皮膚組織の凍結切片(10μm四方)を用いて、UVBが照射されたHR−1マウスの場合と同様に、UVBが照射されていないHR−1マウスの皮膚組織におけるエピモルフィンの局在を調べた。また、ヨウ化プロピジウム(シグマ−アルドリッチ社製)を用いて、細胞核を、対比染色した。結果を図1に示す。図1は、試験例1におけるUVB照射HR−1マウス及びUVB非照射HR−1マウスの皮膚組織の免疫化学染色の結果を示す図面代用写真である。図1(a)は、UVB非照射HR−1マウスの皮膚組織の免疫化学染色の結果を示す図面代用写真であり、図1(b)は、UVB照射HR−1マウスの皮膚組織の免疫化学染色の結果を示す図面代用写真である。図中、1は、エピモルフィンの局在位置の一例を示す。また、図中、スケールバーは、100μmを示す。
DMEM/HamF12(シグマ−アルドリッチ社製)に、終濃度:10質量%となるように熱不活性化FCSを添加し、熱不活性化FCS含有DMEM/HamF12培地(以下、DH10)を得た。
線維芽細胞であるPT67細胞を、DH10中、5体積%CO2下、37℃で培養した。
IL−2シグナルペプチド(配列番号:3)をコードする核酸(配列番号:4)を、エピモルフィンをコードするcDNA(配列番号:1)におけるエピモルフィンのN末端に対応する部位に付加し、IL−2シグナルペプチド結合エピモルフィンをコードする核酸を得た。得られた核酸をレトロウイルス発現ベクター(クローンテック社製、商品名:pQCXIN)のEcoRI認識部位に挿入して、細胞表面エピモルフィン用発現プラスミドを調製した。
レトロウイルス発現ベクターpQCXIN(商品名、クローンテック社製)を、遺伝子導入用試薬(インビトロジェン社製、商品名:リポフェクタミン及びインビトロジェン社製、商品名:プラス試薬)を用いてパッケージング細胞PT67に導入した。得られた細胞の培養上清からレトロウイルスを得た。得られたレトロウイルスをHaCaT細胞に感染させ、検出可能な量のトランスジーン産物を持たない細胞(HaCaT−TF−対照細胞)を得た。
(1)線維芽細胞(PT67−TE細胞)におけるエピモルフィンの強制発現
前記製造例2で得られたPT67−TE細胞を、前記DH10中、60−70%コンフルエントになるまで培養した。得られたPT67−TE細胞を、リン酸緩衝生理的食塩水(PBS)で2回洗浄した。その後、得られたPT67−TE細胞に、商品名:GL20SE UVBランプ(三共電気株式会社製、発光ピーク306nm)を用いて、10秒間、10mJ/cm2のUVBを直接照射し、その後、DH10中で5体積% CO2下、37℃で、3日間培養した。
前記製造例1で得られたHaCaT−TE細胞を、前記DH10中、60−70%コンフルエントになるまで培養した。得られたHaCaT−TE細胞を、リン酸緩衝生理的食塩水(PBS)で2回洗浄した。その後、得られたHaCaT−TE細胞に、商品名:GL20SE UVBランプ(三共電気株式会社製、発光ピーク306nm)を用いて、10秒間、10mJ/cm2のUVBを直接照射した。その後、UVB照射されたHaCaT−TE細胞を、DH10の入ったチャンバースライド(ヌンク・インコーポレーティッド製)上で、5体積% CO2下、37℃で、1時間培養した。
(1)ケラチノサイトの増殖における細胞外エピモルフィンの影響
製造例3で得られたHaCaT−EPM1細胞を、前記DH10で培養し、経時的に細胞の増殖・代謝活性を調べた。各所定時間に採取した細胞に、細胞計数用キット(商品名:Cell Counting Kit(株式会社同仁科学研究所製))に添付の試薬A(株式会社同仁科学研究所製、商品名:WST−1)と溶液Bとの混合溶液110μlを添加し、3時間インキュベーションし、分光光度計(ワッラック(WALLAC)社製、商品名:ARVOtmSX 1420 MULTILABEL COUNTER)で、450nmにおける吸光度を測定し、代謝挙動を調べた。同様に、製造例3で得られたHaCaT−EPM2細胞、製造例4で得られたHaCaT−TF−対照細胞及びHaCaT細胞それぞれについても、代謝挙動を調べた。結果を図4に示す。図4は、試験例3におけるケラチノサイトの増殖における細胞外エピモルフィンの影響を調べた結果を示すグラフである。図中、黒四角は、HaCaT細胞、白四角は、HaCaT−TF−対照細胞、黒丸は、HaCaT−EPM1細胞、白丸は、HaCaT−EPM2細胞を示す。図中、*は、P<0.05、**は、P<0.01、***は、P<0.001である。
製造例3で得られたHaCaT−EPM1細胞を前記DH10中、5体積% CO2下、37℃で4日間培養した。得られた細胞を、SDSサンプルバッファーに添加して、5分間煮沸し、全細胞ライゼート試料を得た。同様に、製造例3で得られたHaCaT−EPM2細胞、製造例4で得られたHaCaT−TF−対照細胞及びHaCaT細胞それぞれについて、全細胞ライゼート試料を得た。
(1)ケラチノサイトによる不溶性コーニファイドエンベロープの形成におけるエピモルフィンの影響
前記試験例3の結果から、ケラチノサイトにおいては、エピモルフィンシグナルは、コーニファイドエンベロープ前駆体であるインボルクリンの生産が増大した細胞において、初期分化を誘導していることがわかる。そこで、ケラチノサイトの分化を強制的に促進させ、コーニファイドエンベロープの能動的産生及び不溶性物質へのそれらの会合をもたらすカルシウム流入を引き起こすことにより、ケラチノサイトの後期分化(角化プロセス)にみられる不溶性コーニファイドエンベロープの形成におけるエピモルフィンの影響を調べた。
IL−2シグナルペプチド結合エピモルフィンをコードするcDNAと、商品名:Adeno−X Expression System 1(クローンテック社製)とを用いて、IL−2シグナルペプチド結合エピモルフィン発現用の組換えアデノウイルスを構築した。
ヒト胎児肺線維芽細胞のMRC−5細胞を、10質量%熱不活性化FCSを含むα−MEM(ギブコ・ラボラトリー社製)10ml中、5体積%CO2下、37℃で72時間培養した。
HaCaT−EPM1細胞に代えて、製造例3のHaCaT−EPM2細胞を用いて、実施例1と同様に、三次元培養産物を得た。
HaCaT−EPM1細胞に代えて、製造例4のHaCaT−TF−対照細胞を用いて、実施例1と同様に、三次元培養産物を得た。
実施例1の三次元培養産物及び比較例1の三次元培養産物それぞれについて、ヘマトキシリン・エオシン染色を行なった。その後、得られた産物を光学顕微鏡及び蛍光顕微鏡により観察した。また、前記三次元培養産物から、凍結切片(10μm四方)を調製し、インボルクリンに対するアフィニティー精製抗体(サンタクルズバイオテクノロジーインコーポレーティッド製)及びサイトケラチン−1に対するアフィニティー精製抗体(コバンス社製)を一次抗体として用いて、試験例1と同様に、実施例1の三次元培養産物及び比較例1の三次元培養産物の免疫組織化学染色を行なった。結果を図9に示す。図9は、実施例1の三次元培養産物及び比較例1の三次元培養産物それぞれのヘマトキシリン・エオシン染色後の産物の光学顕微鏡観察の結果、並びに免疫組織化学染色の結果を示す図面代用写真である。図9aは、比較例1の三次元培養産物のヘマトキシリン・エオシン染色の光学顕微鏡観察の結果を示す図面代用写真、図9bは、比較例1の三次元培養産物におけるインボルクリンの免疫組織化学染色の結果を示す図面代用写真、図9cは、比較例1の三次元培養産物におけるサイトケラチン−1の免疫組織化学染色の結果を示す図面代用写真、図9dは、実施例1の三次元培養産物のヘマトキシリン・エオシン染色の光学顕微鏡観察の結果を示す図面代用写真、図9eは、実施例1の三次元培養産物におけるインボルクリンの免疫組織化学染色の結果を示す図面代用写真、図9fは、実施例1の三次元培養産物におけるサイトケラチン−1の免疫組織化学染色の結果を示す図面代用写真である。図中、3は、インボルクリンに対する染色位置、4は、ヨウ化プロピジウムに対する染色位置の一例、5は、サイトケラチン−1に対する染色位置である。図中、スケールバーは、50μmである。
(1)三次元培養産物における分化マーカーの発現プロファイル
実施例1の三次元培養産物、実施例2の三次元培養産物及び比較例1の三次元培養産物のそれぞれの細胞を、SDSサンプルバッファー(組成:62.5mM Tris−HCl(pH6.8)、10質量%グリセロール、2質量% SDS、5体積% 2−メルカプトエタノール、0.0025質量%ブロモフェノールブルー)に直接溶解させ、ホモジナイザーで30秒処理後、5分間煮沸し、実施例1の三次元培養産物、実施例2の三次元培養産物及び比較例1の三次元培養産物のそれぞれの細胞の全細胞ライゼート試料を得た。
実施例1の三次元培養産物及び比較例1の三次元培養産物それぞれの組織構造について、電子顕微鏡により観察した。結果を図11に示す。図11は、実施例1の三次元培養産物及び比較例1の三次元培養産物の電子顕微鏡による観察の結果を示す図面代用写真である。図11(A)は、比較例1の三次元培養産物の組織構造の電子顕微鏡による観察の結果を示す図面代用写真、図11(B)は、実施例1の三次元培養産物の組織構造の電子顕微鏡による観察の結果を示す図面代用写真である。図中、BLは、基底層又はその相当物、SLは、有棘層又はその相当物、GLは、顆粒層又はその相当物、CLは、角化層又はその相当物を示す。スケールバーは、いずれも1μmである。
Claims (4)
- エピモルフィンをコードする核酸が発現可能に導入されている遺伝子導入表皮基底細胞を、支持体上で三次元に培養して得られる三次元疾患皮膚再構築物。
- 前記核酸が、アミノ末端側にシグナルペプチドが付加されたエピモルフィンをコードする核酸である請求項1記載の三次元疾患皮膚再構築物。
- 前記遺伝子導入表皮基底細胞が、ヒト表皮基底細胞から得られる遺伝子導入細胞であり、前記支持体が、ヒト線維芽細胞がコラーゲンゲル内に包埋された細胞包埋コラーゲンゲルである請求項1又は2に記載の三次元疾患皮膚再構築物。
- 表皮基底細胞に、エピモルフィンをコードする核酸を発現可能に導入して得られた遺伝子導入表皮基底細胞を、支持体上で三次元に培養することを特徴とする三次元疾患皮膚再構築物の製造方法。
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