CN103920188B - 一种组织工程半月板修复片及其制备方法 - Google Patents
一种组织工程半月板修复片及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种组织工程半月板修复片及其制备方法，本发明制备的组织工程半月板修复片包括脱细胞半月板薄片、种子细胞和生长因子缓释载体，其中，脱细胞半月板薄片两个表面均匀分布微盲孔，种子细胞以及生长因子缓释载体复合在脱细胞半月板薄片两个表面上。脱细胞半月板薄片上分布的微盲孔增大了支架材料的面积，可作为种子细胞和生长因子缓释载体的储蓄池，使其附着牢固，不容易发生脱落；多种生长因子通过缓释载体可以持久释放营养，提高细胞扩增效率，同时维持细胞表型，抑制细胞老化，促进组织工程半月板修复片与自身组织的融合。制备的组织工程半月板修复片具有和天然半月板相似的结构特征，可以用于半月板损伤的修复及诱导半月板纤维软骨组织再生。
Description
技术领域
本发明属于组织工程医用生物材料技术领域，具体涉及一种具有天然结构与功能的组织工程半月板修复片及其制备方法。
背景技术
半月板是两个半月状的纤维软骨，位于胫骨平台内侧和外侧的关节面，具有稳定膝关节、传递并分散膝关节负荷力及促进关节内营养的功能，是保持膝关节结构稳定、发挥运动功能的重要组织。半月板损伤多由扭转外力引起，造成关节疼痛、关节活动受限而导致肌肉萎缩及行走不便等危害，严重影响患者生活。半月板损伤是膝关节最常见的运动损伤之一。
半月板由外向内分别为：外侧10～20%左右为红区，由膝内外侧动脉供应血液，形成半月板周围动脉丛，内侧30%左右区域为白区，无血液供应，中间50～60%左右的区域为过渡的红白区。目前半月板损伤临床上应用的修复手段主要有：缝合，切除以及半月板假体移植。缝合的范围仅限于有血液供应的红区以及部分红白区的简单损伤，缝合后这些区域可自行愈合，但临床上此类病例较少，约占总半月板病例数的20～30%。而由于半月板的结构特点和受力特征，大多数损伤都发生在白区，此类损伤由于无血液供应因而不能自行愈合，需进行半月板切除手术，手术中奉行的原则是尽量保存较多的半月板组织，所以部分切除的情况比较常见，一些比较严重的病例实施次全切，即保留半月板红区最外层的一层边缘，只有极少数情况下才实施半月板全切手术。半月板部分切除或全切手术对症状以及疼痛的缓解作用明显，但是由于半月板功能的重要性，切除手术后长期随访结果表明关节软骨发生退行性改变，严重的甚至引发骨性关节炎。因此，一些行半月板切除手术之后的患者需要接受半月板假体移植手术以保护关节软骨、维持关节稳定，恢复运动功能。
近年来，国内外一些研究者致力于研究一种可以替代半月板行使其功能的假体结构或组织。总结起来其假体类型包括机械假体、人工合成半月板以及同种异体半月板，但由于无法满足半月板的力学要求或长期效果不明确，应用也较少。专利US4502161、US5092894、US20040195727等提供了一种弹性硅胶和聚丙烯腈等人工合成材料的半月板假体及其制备方法；专利US20050234549A1、US20010016797A1、US4880429、US006042610A、20071019229.2等提供了以猪小肠粘膜下层（SIS）、胶原、蚕丝蛋白等天然材料为原料的半月板假体及其制备方法，这些材料的植入可以延缓膝关节软骨的退行性改变以及骨性关节炎的发生，但其结构特点与生物力学特征与正常半月板组织差别较大，其韧性、弹性等仍无法满足膝关节功能的要求。专利US20110060412A1、200780042802.7提供了一种半月板来源的假体制备方法，但长期随访表明其存在退化以及需要二次手术进行移除的风险，临床使用也较少。
随着对半月板结构与功能重要性的逐渐认识，越来越多的半月板损伤患者选择尽可能保留较多的半月板组织，专利US5154189、US6306156B1、201010236591.4等提供了一种以缝线或机械装置物理锚定半月板撕裂的方法，但其本身并不促进半月板组织的愈合和再生。专利200580013082.2公开了一种用于无血管半月板修复和再生的支架，该支架为血液和养分从血管组织区流到具有很少或者没有脉管系统的组织区提供通道，促进撕裂部位愈合，但其本身无生物活性，会改变半月板天然的纤维结构，对半月板生物力学作用产生影响。专利200680031664.8、US20090186062提供了一种用于修复半月板撕裂的胶原膜，该胶原膜的主要成分为I、III型胶原，一面为平滑屏蔽面，抑制细胞粘附和从其中通过；一面为纤维面，允许细胞在其上生长，使用时将纤维面贴合在半月板撕裂处固定，通过引导滑膜细胞、间充质细胞、细胞因子等进入损伤位置进行修复。但该发明不含细胞成分，而细胞和营养成分由关节腔向内迁移需要较长时间；同时胶原膜贴附在半月板上下表面，容易受到关节摩擦发生脱落，形成异物。专利US007819918B2提供了一种用于修复半月板组织修复的可植入性生物材料及其制备方法，该材料主要包含SIS以及生物相容性聚合物、细胞、透明质酸、硫酸软骨素等成分，植入体内随着材料逐渐降解，被新生组织取代。但材料的胶原纤维结构及力学特征与天然半月板相差较大，且材料降解会影响损伤修复部位的微环境，不利于组织的重建与再生。
随着近年来组织工程科学与技术的发展，研究人员致力于通过组织工程技术来修复半月板损伤。由于半月板组织的血液供应特点，不易引起免疫反应，种子细胞可以选取透明软骨细胞、纤维软骨细胞以及各种来源的间充质干细胞。专利201210224724.5提供了一种用于修复半月板撕裂的生物材料及其制备方法，该生物材料由脱细胞基质膜、具有细胞因子及纤维软骨细胞复合的双层多孔胶原结构以及表层纤维软骨细胞膜片构成，同样其力学特征不能满足半月板的特殊受力要求。由于半月板受力的复杂性，理想的支架材料应具有良好的生物相容性，与天然半月板相近的力学性能，能够在撕裂部位实现自我稳定，通过关节腔滑液进行营养吸收。有文献报道采用关节软骨细胞复合脱细胞半月板支架材料制备的组织工程半月板可以用于半月板撕裂修复，但脱细胞半月板支架材料结构致密，细胞很难牢固贴附，在手术过程中以及植入体内后容易发生脱落，同时关节滑液营养较少，不能起到促进材料与自身组织融合的作用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种用于修复半月板损伤的组织工程半月板修复片及其制备方法，以脱细胞半月板薄片为支架材料，在其表面制备微盲孔作为种子细胞和生长因子缓释载体的储蓄池，使种子细胞和生长因子缓释载体不容易发生脱落；生长因子缓释载体可以持久释放营养，促进组织工程半月板修复片与自身组织的融合；制备的组织工程半月板修复片可以用于修复半月板损伤及诱导半月板纤维软骨组织再生。
本发明所制备的组织工程半月板修复片，其特征为，包括脱细胞半月板薄片、种子细胞以及生长因子缓释载体，其中，脱细胞半月板薄片两个表面均匀分布微盲孔，种子细胞以及生长因子缓释载体复合在脱细胞半月板薄片两个表面上；所述脱细胞半月板薄片为哺乳动物半月板经过脱细胞处理后，沿脱细胞半月板的弧度纵向削切而得；所述的种子细胞为透明软骨细胞、纤维软骨细胞、以及各种间充质干细胞，包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞；所述的生长因子缓释载体为复合生长因子的微球，其中微球由无细胞毒性的可降解材料制备而成，微球其平均粒径在3～50μm，优选在3～30μm之间；所述微盲孔的直径为10～100μm，微盲孔的孔深为10～80μm，微盲孔的孔间距为10～50μm，其中优选微盲孔的直径为20～60μm，孔深为20～40μm。
本发明所提出的组织工程半月板修复片的制备方法，包括，种子细胞的培养，生长因子缓释载体的制备，脱细胞半月板薄片的制备，采用打孔技术在脱细胞半月板薄片的两个表面制备微盲孔，最后将种子细胞和生长因子缓释载体以离心法接种于脱细胞半月板薄片的两个表面，完成组织工程半月板修复片的制备；具体步骤包括：
步骤一、种子细胞的培养：选用的种子细胞包括透明软骨细胞、纤维软骨细胞、以及可以分化为纤维软骨细胞的间充质干细胞，包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞；上述种子细胞的培养方法以及使用的细胞培养基可以参考相关文献；
步骤二、生长因子缓释载体的制备：采用无细胞毒性的可降解材料制备平均粒径在3～50μm，优选在3～30μm之间的微球，包括明胶微球、胶原微球、壳聚糖微球，制备方法可以参照文献（陈宇，刘兆丽，吴庆辉等.微米级壳聚糖微球的制备.大连工业大学学报，2012年第03期；詹国平，郝丽.艾叶挥发油明胶微球的制备及其性能表征.中南大学学报，2011，42(8)：2239～2244.），干燥后，钴60灭菌备用；将微球充分浸润在富含生长因子的溶液中，4℃放置24小时后，1200～1500转/分钟离心10～15分钟，收集微球，冻干，完成生长因子缓释载体的制备；所述富含生长因子的溶液组成为，以步骤一使用的细胞培养基为溶剂，含有非必需氨基酸100mL/L、L-谷氨酰胺100～5000μg/mL、维生素C（Vc）750～1500μg/mL、转化生长因子-β1（TGF-β1）50ng～200ng/mL、碱性成纤维生长因子（bFGF）10～500ng/mL，血小板源性生长因子（PDGF-bb）10～100ng/mL、胰岛素样生长因子（IGF-1）10～500ng/mL；
本步骤制备的生长因子缓释载体与步骤一中使用的种子细胞粒径大小相近，容易混合均匀，可以一次性接种于脱细胞半月板薄片上，操作方便。将丰富的生长因子与微球联合使用，能够延长生长因子局部释放和作用时间，促进新生组织与自身组织的融合；本发明添加的多种生长因子可以为组织工程半月板修复片植入体内后提供营养，能够刺激细胞生长，提高细胞扩增效率，同时维持细胞表型，抑制细胞老化，能够更好的促进细胞在支架材料中的复层化及增殖分化与迁移，从而促进组织的愈合与再生。
步骤三、脱细胞半月板薄片的制备：将哺乳动物半月板按照文献方法进行脱细胞处理后，沿脱细胞半月板的弧度纵向削切，得到长度为3～10mm，宽度为2～5mm，厚度为0.3～1.5mm的脱细胞半月板薄片（参见图1）；
经过脱细胞处理后的半月板既有良好的生物相容性，又具备天然半月板的结构特点，是理想的支架材料。根据半月板损伤部位和大小，本步骤从脱细胞半月板的相近区域纵向削切，得到的脱细胞半月板薄片结构均一、力学性能一致，有利于支架材料在修复部分实现自我稳定，通过后续步骤在脱细胞半月板薄片的两个表面（所述脱细胞半月板薄片的两个表面是指制备的组织工程半月板修复片嵌入半月板损伤部位后与自体半月板组织相接触的两个面，下同。）复合种子细胞和生长因子缓释载体，嵌入半月板损伤部位后，脱细胞半月板薄片的两个表面直接与自体半月板组织相接触，能够促进与自身组织的融合。
步骤四、脱细胞半月板薄片表面打盲孔：在脱细胞半月板薄片的两个表面，采用打孔技术制备微盲孔，完成后对脱细胞半月板薄片灭菌；所述微盲孔直径为10～100μm，微盲孔的孔深为10～80μm，微盲孔的孔间距为10～50μm，其中优选微盲孔直径为20～60μm，微盲孔的孔深为20～40μm；
生长因子缓释载体无法结合在支架材料表面，而脱细胞半月板结构致密，种子细胞难以迁移进入支架材料内部，因此种子细胞和生长因子缓释载体在脱细胞半月板表面复合不紧密，在手术过程中或植入体内后容易发生脱落，通过在脱细胞半月板薄片两个表面制备微盲孔，增加了支架材料的表面积，可以作为装载种子细胞和生长因子缓释载体颗粒的储藏池，也使得种子细胞与生长因子缓释载体可以更稳定的分布在支架材料表面。
步骤五、种子细胞和生长因子缓释载体与脱细胞半月板薄片的复合：用离心法接种种子细胞及生长因子缓释载体；将步骤四制备的脱细胞半月板薄片其中一个表面朝下平放入平底离心管；取第1～6代种子细胞，计数；将步骤二制备的生长因子缓释载体先用步骤一使用的细胞培养基浸润，计数后再与种子细胞以2:1～1:4的数量比例混合，按照总量2×103～2×105个/mL的浓度制成悬液，转移至平底离心管中，浸没脱细胞半月板薄片，使其朝上的一个表面在液面以下0.5～3cm，以900转/分钟离心10分钟，吸出上清后，将脱细胞半月板薄片平移至37℃、5%CO2条件下放置5～10分钟以蒸干其表面多余水分，然后在已接种细胞和生长因子缓释载体的脱细胞半月板薄片表面均匀滴加pH为中性的胶原溶液，在37℃、5%CO2条件下内静置10～30分钟，使胶原溶液浸润到微盲孔中并固化，完成脱细胞半月板薄片一个表面的接种；采用同样方法将种子细胞与生长因子缓释载体接种于脱细胞半月板薄片的另一个表面，完成组织工程半月板修复片的制备。
采用离心法接种细胞和生长因子缓释载体，可以将种子细胞和生长因子缓释载体一次性复合在脱细胞半月板薄片的两个表面，接种时间短，接种率高，尤其在微盲孔内部接种数量多，贴附牢固，并通过胶原溶液凝固进一步固定种子细胞和生长因子缓释载体贴附在脱细胞半月板薄片的表面，尤其是微盲孔内部，避免在手术操作过程中损失有效成分。
与现有技术及产品相比，本发明的特点是：
1）制备的组织工程半月板修复片具有和天然半月板相似的平行或交错排列的胶原纤维束结构，可以传递并分散膝关节的负荷力，在与半月板损伤部位相接触的组织工程半月板修复片两个表面分布有种子细胞和生长因子缓释载体，植入体内后，种子细胞可以分泌细胞外基质与自体组织融合，生长因子缓释载体可以延长生长因子在体内的作用时间，从而诱导纤维软骨结构的再生，实现与自体组织的整合与修复；
2）在脱细胞半月板薄片的两个表面均匀分布与种子细胞和生长因子缓释载体颗粒大小相近的微盲孔，增大了支架材料的表面积，可以作为种子细胞和生长因子缓释载体的储蓄池，使得种子细胞和生长因子缓释载体与脱细胞半月板薄片的复合更加紧密，使组织工程半月板修复片在移植手术过程中以及植入体内后，与手术器械或自体组织发生的接触摩擦也不易引起细胞层的脱落。5周动物实验取材组织学结果显示，采用本发明制备的组织工程半月板修复片，可以在损伤部位与半月板自体组织互相长入，实现较好的整合和修复（附图3A及3B）；但是未作微盲孔处理的组织工程半月板仅有部分区域实现了损伤部位的修复（附图4）；仅对半月板损伤处进行缝合的空白对照组的半月板损伤未发生愈合（附图3C）；
3）种子细胞与缓释载体选用离心法一次性接种于脱细胞半月板薄片表面，接种时间短，接种率高，尤其在微盲孔内部接种数量多，贴附牢固，并通过滴加的胶原溶液凝固进一步固定种子细胞和生长因子缓释载体贴附在支架材料的表面，尤其是微盲孔内部，避免在手术操作过程中损失有效成分；
4）本发明添加的多种生长因子可以为组织工程半月板修复片植入体内后提供营养，能够刺激细胞生长，提高细胞扩增效率，同时维持细胞表型，抑制细胞老化，能够更好的促进细胞在支架材料中的复层化及增殖分化与迁移，从而促进组织的愈合与再生；
5）以微球复合生长因子作为缓释载体，既保证了种子细胞和生长因子的局部释放又延长了其作用时间。实验证明其因子释放时间可以延长到30天，并明显提高了组织工程半月板修复片植入后的组织再生能力，利于半月板组织的重建，对于修复半月板损伤具有临床应用价值。通过动物实验发现，用本发明制备的组织工程半月板修复片修复半月板损伤，1周时损伤部位已经开始愈合，部分区域已有细胞相互迁入，而利用未复合生长因子缓释载体的半月板修复材料进行的动物实验，组织学结果显示材料与自体半月板组织仍相互脱离，界限明显，二者尚未开始整合。
附图说明
图1为脱细胞半月板薄片的制备过程示意图，其中A为沿脱细胞半月板弧度纵向削切脱细胞半月板薄片位置的示意图；B为削切得到的脱细胞半月板薄片示意图。
图2为本发明制备的组织工程半月板修复片修复兔半月板白区损伤的实验组及未做修复空白对照组的5周取材外观照片；其中A与B分别为修复新鲜损伤与陈旧性损伤的实验组的取材外观照片，箭头所指位置显示半月板损伤部位愈合良好，证明本发明制备的组织工程半月板修复片植入体内具有组织诱导再生能力，促进了半月板的结构重建与功能恢复。C为空白对照组的取材外观照片，空白对照组是指对半月板损伤处仅进行缝合处理，箭头所指位置显示损伤部位的半月板组织互相脱离，未发生整合情况。新鲜损伤是指损伤时间较短尚未在损伤位置发生磨损的损伤；陈旧性损伤是指损伤时间较长，已经在损伤位置发生磨损的损伤，手术时需要对磨损进行清创后再进行组织工程半月板修复片的移植。
图3为图2的组织学照片，其中A与B分别为修复新鲜损伤与陈旧性损伤的实验组的取材组织学切片结果图片，显示组织工程半月板修复片与半月板自体组织整合良好，可以诱导纤维软骨的再生；C为空白对照组的取材组织学切片结果，空白对照组是指对半月板损伤处仅进行缝合处理，显示半月板损伤未发生愈合。说明植入组织工程半月板修复片可以实现半月板损伤部位的再生与修复。
图4为未作微盲孔处理的组织工程半月板修复片用于修复兔半月板白区损伤动物实验5周取材的组织学照片，显示组织工程半月板修复片与半月板自体组织仅有部分愈合，没有实现完全整合。与图3A及3B相比，说明微盲孔增大了脱细胞半月板薄片的表面积，作为细胞和生长因子缓释载体的储蓄池，使得细胞和生长因子缓释载体与支架材料的复合更加紧密，从而能够促进细胞外基质的分泌以及组织间的融合。
具体实施方式
以下结合实例对本发明技术方案作进一步的详细说明。
实例中所采用的兔脱细胞半月板与猪脱细胞半月板来源于第四军医大学动物实验中心提供健康成年兔膝关节半月板与猪膝关节半月板，分离去除其周围的滑膜及结缔组织，置于PBS溶液中带回实验室。
实例1中使用的种子细胞为人骨髓间充质干细胞，采购于北京裕恒丰科技有限公司。
实例2中使用的种子细胞为兔纤维软骨细胞，分离培养方法参照文献：潘险峰,林月秋,汤逊等.兔半月板纤维软骨细胞的培养及生物学特性研究，中国矫形外科杂志，2000年10期。
实例1中的紫外激光打孔仪器为武汉楚天激光股份有限公司PSV-6001型，其紫外波长为355nm。
实例2中委托苏州德龙激光股份有限公司进行打孔的仪器为DeepPioneer皮秒激光精细微加工设备。
实例中使用的5mL平底离心管为江苏海门百得福实验器材公司生产的LXG-5型号。
实施例1、
步骤一、人骨髓间充质干细胞的培养：将购买的第1代人骨髓间充质干细胞复苏后接种于人骨髓间充质干细胞培养基，置于细胞培养箱中培养，3天后第一次换液，以后隔天换液，5天后细胞达到80%以上汇合，再用0.25%的胰酶溶液消化得到第2代人骨髓间充质干细胞，备用；所述的人骨髓间充质干细胞培养基为含有10%胎牛血清（FBS）的α-MEN培养基；
步骤二、生长因子缓释载体的制备：壳聚糖微球的制备方法参考文献：陈宇,刘兆丽,吴庆辉等.微米级壳聚糖微球的制备.大连工业大学学报,2012年第03期，制备的壳聚糖微球粒径在7～16μm之间，平均粒径为10μm，钴60辐照灭菌备用；将壳聚糖微球充分浸润在富含生长因子的溶液中，4℃放置24小时后，1200转/分钟离心15分钟，收集微球，冻干，完成生长因子缓释载体的制备；所述富含生长因子的溶液组成为，以步骤一使用的人骨髓间充质干细胞培养基为溶剂，含有非必需氨基酸100mL/L、L-谷氨酰胺500μg/mL、Vc为750μg/mL、TGF-β1为75ng/mL、bFGF为50ng/mL，PDGF-bb为20ng/mL、IGF-1为40ng/mL；
步骤三、脱细胞半月板薄片的制备：将兔半月板按照文献（周预，刘玉杰，黄靖香，赵斌.兔半月板脱细胞基质的制备，《中国医学科学院学报》，2011年01期。）进行脱细胞处理后，沿脱细胞半月板的弧度纵向削切，得到长度为6mm，宽度为3mm，厚度为0.5mm的脱细胞半月板薄片；
步骤四、脱细胞半月板薄片表面打盲孔：将兔脱细胞半月板薄片水平放置；采用紫外激光打孔技术在其两个表面制备微盲孔，设置紫外激光打孔仪器的工作参数：加载光阑孔径为5mm，扫描间距为4μm，输出功率为3W，频率为25kHz，加工速度为50mm/s，总脉冲个数为25个，加工次数为6次，离焦量为-1.2mm，设置孔间距为10μm；一面制备完成后，对另一表面以同样方法制作微盲孔，完成后对脱细胞半月板薄片环氧乙烷灭菌；脱细胞半月板薄片两个表面的微盲孔直径为35μm，微盲孔的孔深为25μm，微盲孔的孔间距为10μm；
步骤五、人骨髓间充质干细胞和生长因子缓释载体与脱细胞半月板薄片的复合：将步骤四制备的脱细胞半月板薄片其中一个表面朝下平放入5mL平底离心管；取第2代人骨髓间充质干细胞作为种子细胞，计数；将步骤二制备的生长因子缓释载体先用步骤一使用的人骨髓间充质干细胞培养基浸润，计数后再与人骨髓间充质干细胞以1:1的数量比例混合，以总量8×103个/mL的浓度制成1mL悬液，转移至5mL平底离心管中，浸没脱细胞半月板薄片，使其朝上的一个表面在液面以下1cm，以900转/分钟离心10分钟，小心吸出上清后，将脱细胞半月板薄片平移至细胞培养箱内放置5分钟以蒸干表面多余水分，之后在其已接种细胞和生长因子缓释载体的表面滴加1μL的pH为中性、浓度为3mg/mL的胶原溶液，在细胞培养箱内静置10分钟，使胶原溶液可以浸润到微盲孔中并凝固，完成脱细胞半月板薄片一个表面的接种；采用同样方法将人骨髓间充质干细胞与生长因子缓释载体接种于脱细胞半月板薄片另一个表面，完成组织工程半月板修复片的制备。
本实例以兔脱细胞半月板作为支架材料，以人骨髓间充质干细胞作为种子细胞，制备的组织工程半月板修复片厚度较薄，表面分布的微盲孔孔径、孔深及孔间距较小，分布细密，使得人骨髓间充质干细胞和生长因子缓释载体的分布均匀致密，适用于半月板新鲜损伤的修复。将制备得到的组织工程半月板修复片根据损伤大小进行裁剪，再嵌入兔半月板红白区损伤部位，缝合固定。5周后，取材外观照与组织学切片均显示，损伤部位材料与自体组织互相长入，愈合良好（如图2A与图3A），而不加材料修复的空白对照组，5周取材外观照与组织学均显示，半月板组织相互脱离，没有实现修复（如图2C与图3C）。
实施例2、
步骤一、兔纤维软骨细胞的培养：兔纤维软骨细胞的分离培养方法及培养基参照文献：潘险峰,林月秋汤逊等.兔半月板纤维软骨细胞的培养及生物学特性研究.中国矫形外科杂志,2000年10期。传代得到第4代的兔纤维软骨细胞，备用；
步骤二、生长因子缓释载体的制备：在60℃下将10mL预热的0.20g/mL明胶溶液缓慢加入到25mL的预热的含2%span-80的液体石蜡中，保持温度，以1300转/分钟搅拌10分钟后，迅速放入冰浴中,加入14mL异丙醇，2mL的25%甲醛溶液。以1300转/分钟继续搅拌2小时，用丙酮清洗3次，冻干；制备的明胶微球粒径在16～32μm之间，平均粒径为21μm，钴60辐照灭菌备用；将微球充分浸润在富含生长因子的溶液中，4℃放置24小时后，1500转/分钟离心10分钟，收集微球，冻干，完成生长因子缓释载体的制备；所述富含生长因子的溶液组成为，以步骤一使用的兔半月板纤维软骨细胞培养基为溶剂，含有非必需氨基酸100mL/L、L-谷氨酰胺4000μg/mL、Vc为1200μg/mL、TGF-β1为175ng/mL、bFGF为450ng/mL，PDGF-bb为75ng/mL、IGF-1为450ng/mL；
步骤三、脱细胞半月板薄片的制备：将猪半月板按照文献（GMPeretti,TJGill,JWXu,etal.Cell-BasedTherapyforMeniscalRepair:ALargeAnimalStudy.AmJSportsMed,2004,32(1):146-158）进行脱细胞处理，沿脱细胞半月板的弧度纵向削切，得到长度为8mm，宽度为4mm，厚度为1.2mm的脱细胞半月板薄片；
步骤四、脱细胞半月板薄片表面打盲孔：将猪脱细胞半月板薄片置于含有双抗（青霉素和链霉素）的PBS溶液中；委托苏州德龙激光股份有限公司以DeepPioneer皮秒激光精细微加工设备在其表面制作微盲孔，完成后对脱细胞半月板薄片钴60灭菌；脱细胞半月板薄片两个表面的微盲孔直径为75μm，微盲孔的孔深为60μm，微盲孔的孔间距为40μm；
步骤五、兔纤维软骨细胞和生长因子缓释载体与脱细胞半月板薄片的复合：将步骤四制备的脱细胞半月板薄片其中一个表面朝下平放入5mL平底离心管；取第4代兔纤维软骨细胞作为种子细胞，计数；将步骤二制备的生长因子缓释载体以步骤一使用的兔纤维软骨细胞培养液浸润，计数后与兔纤维软骨细胞以1:4的数量比例混合，以8×104个/mL的浓度制成3mL悬液，放置于5mL平底离心管中，浸没脱细胞半月板薄片，使其朝上的一个表面在液面以下3cm，以900转/分钟离心10分钟，小心吸出上清后，将脱细胞半月板平移至细胞培养箱内放置10分钟以蒸干表面多余水分，之后在其已接种细胞和生长因子缓释载体的表面滴加3μL浓度为3mg/mL的胶原溶液，在细胞培养箱内静置20分钟，使胶原溶液可以浸润到微盲孔中并凝固，完成脱细胞半月板薄片一个表面的接种；采用同样方法将人骨髓间充质干细胞与生长因子缓释载体接种于脱细胞半月板薄片的另一面，完成组织工程半月板修复片的制备。
本实例以猪脱细胞半月板作为支架材料，以兔纤维软骨细胞作为种子细胞。制备的组织工程半月板修复片厚度较厚，表面分布的微盲孔孔径、孔深及孔间距较大，使得兔纤维软骨细胞和生长因子缓释载体的分布较为集中，植入体内后可以分泌大量细胞外基质，适用于半月板已经发生磨损，在手术时需要进行清创处理的损伤宽度较大的陈旧性损伤的修复。将制备得到的组织工程半月板修复片根据损伤大小进行裁剪，再嵌入兔半月板白区陈旧性损伤部位，缝合固定。5周后，取材外观照与组织学切片均显示，损伤部位材料与自体组织融合情况良好，新生组织具有平行或交错排列的胶原纤维结构，说明本发明制备的组织工程软骨能够诱导纤维软骨再生（如图2B与图3B）。而不加材料修复的空白对照组，5周取材外观照与组织学均显示，半月板组织相互脱离，没有实现修复（如图2C与图3C）。
Claims (8)
1.一种组织工程半月板修复片，其特征为，包括脱细胞半月板薄片、种子细胞和生长因子缓释载体，其中，脱细胞半月板薄片两个表面均匀分布微盲孔，种子细胞以及生长因子缓释载体复合在脱细胞半月板薄片两个表面上；所述脱细胞半月板薄片为哺乳动物半月板经过脱细胞处理后，沿脱细胞半月板的弧度纵向削切而得；所述的种子细胞为透明软骨细胞、纤维软骨细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞；所述的生长因子缓释载体为复合生长因子的微球，其中微球由无细胞毒性的可降解材料制备而成，微球平均粒径在3～50μm；所述微盲孔的直径为10～100μm，微盲孔的孔深为10～80μm，微盲孔的孔间距为10～50μm；所述脱细胞半月板薄片的两个表面是指制备的组织工程半月板修复片嵌入半月板损伤部位后与自体半月板组织相接触的两个面。
2.根据权利要求1所述的组织工程半月板修复片，其特征在于脱细胞半月板薄片的长度为3～10mm，宽度为2～5mm，厚度为0.3～1.5mm。
3.根据权利要求1所述的组织工程半月板修复片，其特征在于生长因子缓释载体中复合的生长因子为非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、维生素C、转化生长因子-β1、碱性成纤维生长因子、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子。
4.制备权利要求1所述的组织工程半月板修复片的方法，其特征在于，包括，种子细胞的培养，生长因子缓释载体的制备，脱细胞半月板薄片的制备，采用打孔技术在脱细胞半月板薄片的两个表面制备微盲孔，最后将种子细胞和生长因子缓释载体以离心法接种于脱细胞半月板薄片的两个表面，完成组织工程半月板修复片的制备；其中，所述种子细胞为透明软骨细胞、纤维软骨细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞；所述生长因子缓释载体为复合生长因子的微球，其中微球是可降解材料制备的无细胞毒性，微球平均粒径在3～50μm；所述微盲孔直径为10～100μm，微盲孔的孔深为10～80μm，微盲孔的孔间距为10～50μm；所述的脱细胞半月板薄片的两个表面是指制备的组织工程半月板修复片嵌入半月板损伤部位后与自体半月板组织相接触的两个面。
5.根据权利要求4中所述的组织工程半月板修复片制备方法，其特征在于，生长因子缓释载体中复合的生长因子为非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、维生素C、转化生长因子-β1、碱性成纤维生长因子、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子。
6.根据权利要求4中所述的组织工程半月板修复片制备方法，其特征在于，脱细胞半月板薄片是将哺乳动物半月板进行脱细胞处理后，沿脱细胞半月板的弧度纵向削切，得到长度为3～10mm，宽度为2～5mm，厚度为0.3～1.5mm的脱细胞半月板薄片。
7.根据权利要求4中所述的组织工程半月板修复片制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
步骤一、种子细胞的培养：选用的种子细胞包括透明软骨细胞、纤维软骨细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞；
步骤二、生长因子缓释载体的制备：采用无细胞毒性的可降解材料制备平均粒径在3～50μm之间的微球，包括明胶微球、胶原微球、壳聚糖微球，干燥后，钴60灭菌备用；将微球充分浸润在富含生长因子的溶液中，4℃放置24小时后，1200～1500转/分钟离心10～15分钟，收集微球，冻干，完成生长因子缓释载体的制备；所述富含生长因子的溶液组成为，以步骤一使用的细胞培养基为溶剂，含有非必需氨基酸100mL/L、L-谷氨酰胺100～5000μg/mL、维生素C750～1500μg/mL、转化生长因子-β150ng～200ng/mL、碱性成纤维生长因子10～500ng/mL，血小板源性生长因子10～100ng/mL、胰岛素样生长因子10～500ng/mL；
步骤三、脱细胞半月板薄片的制备：将哺乳动物半月板进行脱细胞处理后，沿脱细胞半月板的弧度纵向削切，得到长度为3～10mm，宽度为2～5mm，厚度为0.3～1.5mm的脱细胞半月板薄片；
步骤四、脱细胞半月板薄片表面打盲孔：在脱细胞半月板薄片的两个表面，采用打孔技术制备微盲孔，完成后对脱细胞半月板薄片灭菌；所述微盲孔直径为10～100μm，微盲孔的孔深为10～80μm，微盲孔的孔间距为10～50μm；
步骤五、种子细胞和生长因子缓释载体与脱细胞半月板薄片的复合：用离心法接种种子细胞及生长因子缓释载体；将步骤四制备的脱细胞半月板薄片其中一个表面朝下平放入平底离心管；取第1～6代种子细胞，计数；将步骤二制备的生长因子缓释载体先用步骤一使用的细胞培养基浸润，计数后再与种子细胞以2:1～1:4的数量比例混合，按照总量2×103～2×105个/mL的浓度制成悬液，转移至平底离心管中，浸没脱细胞半月板薄片，使其朝上的一个表面在液面以下0.5～3cm，以900转/分钟离心10分钟，吸出上清后，将脱细胞半月板薄片平移至37℃、5％CO2条件下放置5～10分钟以蒸干其表面多余水分，然后在已接种细胞和生长因子缓释载体的脱细胞半月板薄片表面均匀滴加pH为中性的胶原溶液，在37℃、5％CO2条件下内静置10～30分钟，使胶原溶液浸润到微盲孔中并固化，完成脱细胞半月板薄片一个表面的接种；采用同样方法将种子细胞与生长因子缓释载体接种于脱细胞半月板薄片的另一个表面，完成组织工程半月板修复片的制备。
8.根据权利要求1所述的组织工程半月板修复片，在修复半月板损伤及诱导半月板纤维软骨组织再生中的应用。
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