CN109589455A - 一种热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物及制备方法 - Google Patents

一种热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医学技术领域，公开了一种热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物及制备方法，取烧伤皮肤进行脱细胞处理，制备变性真皮支架替代物；将干细胞种植到上述支架中制备成具有生物活性的变性脱细胞真皮基质，随后观察创面组织的上皮化、血管化，炎症因子、浸润情况；从烧伤皮肤中提取变性胶原蛋白，再添加壳聚糖，成纤维细胞等原料，运用3D打印技术制作活性真皮替代物；将上述重构的生物活性真皮替代物应用于深度烧伤切削痂创面。本发明可用于自体或异体(充填，补片，创面敷料或复合移植)；应用于大面积烧伤、烫伤创面，抗原性和免疫原性更低，生物相容性好，成本低，目前商品化ADM售价每平米500～700万元。

Description

一种热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物及制备方法
技术领域
本发明属于医学技术领域，尤其涉及一种热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物及制备方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
人造皮肤(亦称人工皮)，早有问世，60年代，国内外曾兴起一股″人工皮热″，其品种繁多，归纳起来，目前全世界已研究应用过的人造皮肤，有以下三类：(1)高分子塑料，合成多肽，人造纤维等合成材料制成的薄膜状，海棉状人造皮肤；(2)再生蛋白和动物组织羊膜，腹膜，胎膜等生物材料制成的人造皮肤；(3)全聚薄膜制成的薄片状人造皮肤。
上述各类人造皮肤，在临床应用中，比如筛状植皮法是将拟植皮的人造皮肤切开许多小口，在一定的张力条件下，固定于创面，即可增加皮片的面积，同时也便于渗出液引流。皮片生长后，这些小孔即自行愈合，遗留的斑状疤痕也可逐渐消退。但是，在植皮的过程中常会出现在植皮时，人造皮肤从切开的小口处被撕裂，从而使植皮失败。而其他的方法都存在不同方面和不同程度的缺点，或因粘附不牢，强度太差；或因抗原性太强，刺激性大；或因通透性能不好，易感染，或因阻碍自生体皮生长，疤痕累累；或因原料来源不易，成本太高；或因工艺繁什，制造困难，又难于贮存等，均先后被淘汰。″人工皮热″逐渐冷却，因此，现在临床单位在治疗烧伤实践中，仍采用一些传统方法，造成了患者疼痛，瘢痕过大，治疗期长等现象。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)应用于医疗领域，大面积烧伤、烫伤等，切痂手术切除的变性皮肤直接扔掉，从别的部位来取，现在医院通用(ADM)天然真皮材料来自于异体或异种(猪)，有一定的免疫原性，且存在潜在的微生物感染可能；在伦理上不易被大众接受且价格昂贵。
(2)现有技术来源于异体或异种皮肤的脱细胞真皮基质ADM缺点来源于异体或异种，存在一定的免疫原性和潜在微生物感染的可能，且价格较高。
解决上述技术问题的难度和意义：
难度：现有技术中，种植细胞比较困难；在老鼠身上没法模拟完整的烧伤模型，只是针对一个深二度的烫伤创面。
解决现有技术存在的问题后，带来的意义为：
本发明的本质是胶原蛋白热降解产物，具有更低抗原性和免疫原性，既可以提取热变性胶原蛋白也可以制成真皮支架材料，可用于自体也可用于异体，且用途广泛(充填，补片，创面敷料或复合移植)；且具有废物利用的意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物及制备方法。其产品可用于自体也可用于异体；免疫原性更低；可实现废物利用。
本发明是这样实现的，一种热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物的制备方法，包括：
对变性脱细胞基质进行重构：对变性脱细胞基质进行重构，与干细胞联合，干细胞种植到支架中；
或采用从烧伤皮肤中提取变性胶原蛋白，再添加壳聚糖，成纤维细胞原料混合，运用3D打印技术制作活性真皮替代物。
进一步，所述热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物的制备方法具体包括：
(1)取烧伤皮肤进行脱细胞处理，制备变性真皮支架替代物；
(2)将干细胞种植到上述支架中制备成具有生物活性的变性脱细胞真皮基质，随后于7天、14天、21天、28天观察创面组织的上皮化、血管化，炎症因子、浸润情况；
(3)从烧伤皮肤中提取变性胶原蛋白，再添加壳聚糖，成纤维细胞原料一起，运用3D打印技术制作活性真皮替代物；将上述重构的生物活性真皮替代物应用于深度烧伤切削痂创面。
进一步，对脱细胞基质进行重构前，需进行：
取Balb/c小鼠，水合氯醛腹腔麻醉后脱去背部毛发，将背部皮肤浸入54℃水中25s，造成背部20％TBSA皮肤深Ⅱ度烫伤创面。24h后，颈椎脱臼法处死小鼠，无菌操作下取背部烫伤皮肤，置于PBS中待用。
取烧伤皮肤进行脱细胞处理；
取出PBS中的烫伤皮肤，于0.1％的苯扎溴铵溶液中浸泡30min，后浸入0.25％的中性蛋白酶中，4℃环境下消化5h，去除表皮；随后在恒温震荡仪中进行脱细胞处理，利用0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶溶液持续震荡洗脱24h，PBS震荡24h；每6h换液一次；
种植：取5-6代干细胞以重力离心法(重力加速度为每分钟300g)进行5个循环，一个循环1分钟，孵箱中培养2个小时获得生物活性变性脱细胞真皮基质；干细胞浓度为5*105/cm2。
深度烧伤模型制备中将干细胞种植到支架中制备成具有生物活性的变性脱细胞真皮基质，随后于7天、14天、21天、28天观察，创面的上皮化、血管化，炎症因子、浸润情况。本发明废物利用；之前的切痂皮肤直接扔掉；来于自体，用于自体免疫性更低；用于大面积烧伤、烫伤，成本更低，ADM一般在500～700万元每平。
从烧伤皮肤中提取变性胶原蛋白，再添加壳聚糖，成纤维细胞等原料一起，运用3D打印技术制作活性真皮替代物；将重构活性真皮替代物应用于切痂手术后的深度烧伤创面，随后于7天、14天、21天、28天观察，创面的上皮化、血管化，炎症因子、浸润情况。
本发明另一目的在于提供一种热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物的制备方法制备的热变性真皮支架替代物。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
废物利用，避免烧伤皮肤切痂后直接扔掉。胶原蛋白热降解产物抗原性和免疫性更低；可用于自体或异体(充填，补片，创面敷料或复合移植)；应用于大面积烧伤、烫伤，成本更低，ADM一般在500～700万元每平。
本发明的真皮替代物在伦理上更容易被接受。
附图说明
图1是本发明实施例提供的ADM与烧伤变性脱细胞真皮基质(DADM)大体观察图。
图中：(1a)、制备的ADM呈乳白色，柔韧性和延展性良好；(1b)、DADM呈乳黄色，有一定的柔韧性和延展性，较ADM柔软；
图2是本发明实施例提供的图1中ADM与烧伤变性脱细胞真皮基质(DADM)两者的组织学比较HE图x40。
图中：(a)、ADM胶原纤维呈疏松、卷曲状，可见细胞除去后留下的空隙；(b)、DADM胶原增粗、部分断裂，但仍保留连续性，胶原排列紊乱、疏松，嗜伊红性增强图。
图3是本发明实施例提供的烧伤变性脱细胞真皮基质(DADM)扫描电镜图。
图中，DADM支架中胶原纤维的形状、方向和结构特征扫描电镜图，支架中散在大小不等孔状结构，与内部相通，无细胞残留，胶原纤维不均匀增粗，保持三维多孔网状结构。
图4是本发明实施例提供的ADM与DADM的体外降解速率图。
图中：在各个时间点，DADM的降解率都高于ADM，经统计分析，12h后，两组差异具有显著差异，故认为DADM比ADM降解速率快，可能提示热损伤后胶原抗降解性能降低。
图5是本发明实施例提供的ADM与DADM308种细胞因子蛋白芯片分布图。
图中：与ADM比较，DADM中IL-9、MMP-9水平有所升高，IL-10、核心蛋白聚糖等多种细胞因子下降，故并未发现DADM含有较高的细胞因子水平。
图6是本发明实施例提供的ADM与DADM体内埋植实验比较(第一列为ADM，第二列为DADM)；
DADM诱导成纤维细胞浸润作用强于ADM，新生胶原产生早于ADM，其炎症反应及新生血管形成作用弱于ADM。
图7是本发明实施例提供的ADM与DADM体内埋植后剩余面积图。
图中：埋植1周后，ADM和DADM的面积均未发生明显减少；4周后ADM和DADM发生明显的降解现象，体积变小；ADM和DADM的剩余面积大小无统计学差异。
图8是本发明实施例提供的激光微孔化DADM体内埋植实验(×100)图；图中，激光微孔化DADM较DADM可以明显提高其在体内的血管化。
图9是本发明实施例提供的种植BM-MSCs的DADM HE染色和免疫荧光染色图，图中：接种的BM-MSCs在DADM中均匀分布，已用箭头指出，形成类真皮结构。A图×200，B图×400，红色为III胶原抗体标记的胶原蛋白，蓝色为DAPI标记的细胞核。
图10是本发明实施例提供的DADM中种植的BM-MSCs持续增殖图；
图中：A图:DADM支架接种BM-MSCs后1d、3d和5d的共聚焦显微镜三维成像。
B图:通过定量图A的荧光强度，对DADM中的BM-MSC的增殖进行1d、3d和5d的相对定量分析。
C图:通过CCK-8测量接种在DADM中的BM-MSC的增殖，(n＝3)。
图中：共聚焦显微镜图像显示细胞逐渐渗透到DADM支架内部，随培养时间的延长，支架同一水平截面的细胞数量增加，对其荧光定量显示，荧光强度逐渐增强；为进一步检测细胞的增殖状态，通过CCK-8测量的增殖数据表明DADM中的BM-MSCs成功存活并持续增殖。
图11是本发明实施例提供的DADM和DADM/MSC支架的皮下埋植实验(×200)。
图中：A图:皮下埋植3d、7d、14d和21d后DADM(左)和DADM/MSC(右)的大体图。
B图:DADM和DADM/MSC支架的HE染色比较图。DADM/MSC组比DADM组表现出更明显的血管浸润14d。
C图:DADM和DADM/MSC支架Masson染色比较图。DADM/MSC组支架降解现象较DADM组更为明显(21d)。箭头指向血管；圆圈表示DADM降解区域。
图12是本发明实施例提供的DADM/MSC支架对创面愈合作用的影响(×100)图；
图中：A图:术后7d、14d和21d的小鼠皮肤创面大体外观观察图(去除敷料后)。
B图:创面组织HE染色组织学观察，结果表明DADM/MSC促进创面愈合，可促进皮肤的完全再生。
C图:3组中特定时间创面的相对残余创面面积(术后7d、14d和21d)。
D图:3组创面组织区域再生皮肤附件的平均数目，结果显示DADM/MSC支架促进皮肤附属件的再生，(n＝3)。W代表创面区域，*p<0.05，**p<0.01。
图13是本发明实施例提供的DADM/MSC支架对创面组织中血管再生的影响图。
图中：A图：(×200)创面组织中血管内皮细胞表达。支架移植后7d 3组创面组织利用CD31进行的免疫荧光实验观察，结果显示，移植DADM/MSC支架的创面组织有更多的CD31+细胞表达。
B图：(×100)术后14dα-SMA标记组织中肌动蛋白的表达，评估血管再生。
C图和D图：根据术后14d创面组织的α-SMA染色结果，对3组创面组织的血管密度和血管直径进行量化分析。细胞核用DAPI染色。*p<0.05，**p<0.01。
图14是本发明实施例提供的热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物的制备方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
应用于医疗领域，大面积烧伤、烫伤等，切痂后的烧伤皮肤直接扔掉，随后进行自体或异体植皮手术，现在医院通用的(ADM)天然真皮材料来自于异体，有一定免疫原性，且存在潜在的微生物感染可能；在伦理不易被大众接受且价格昂贵。
本发明提供的热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物及制备方法，包括：(1)取烧伤皮肤进行脱细胞处理，制备变性真皮支架替代物；(2)将干细胞种植到上述支架中制备成具有生物活性的变性脱细胞真皮基质，随后于7天、14天、21天、28天观察创面组织的上皮化、血管化，炎症因子、浸润情况；(3)从烧伤皮肤中提取变性胶原蛋白，再添加壳聚糖，成纤维细胞等原料，运用3D打印技术制作活性真皮替代物；将上述重构的生物活性真皮替代物应用于深度烧伤切削痂创面。本发明属废物利用，避免深度烧伤皮肤切削痂后直接扔掉；胶原蛋白热降解产物，抗原性和免疫源性更低，生物相容性好，可用于自体或异体(充填，补片，创面敷料或复合移植)；应用于大面积烧伤、烫伤创面，成本更低，目前商品化ADM售价每平米500～700万元。
图14，本发明实施例提供的热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物的制备方法，包括：
S101:深度烧伤模型制备；
S102:取烧伤皮肤进行脱细胞处理；
S103:对脱细胞基质进行重构，与干细胞联合，干细胞种植到支架中，或是从烧伤皮肤中提取变性蛋白，再添加壳聚糖、成纤维细胞等原料，运用3D打印技术制作生物活性真皮替代物；
S104:将重构生物活性真皮替代物应用于切削痂手术后的深度烧伤创面，随后于7天、14天、21天、28天观察，创面的上皮化、血管化，炎症因子、浸润情况，(上皮化，皮肤附件再生接近正常皮肤结构；血管化支架中有血管进入；炎症因子与正常脱细胞基质对比炎症反应不明显)。
具体包括：
(1)取烧伤皮肤进行脱细胞处理，制备变性真皮支架替代物；
(2)将干细胞种植到上述支架中制备成具有生物活性的变性脱细胞真皮基质，随后于7天、14天、21天、28天观察创面组织的上皮化、血管化，炎症因子、浸润情况；
(3)从烧伤皮肤中提取变性胶原蛋白，再添加壳聚糖、成纤维细胞原料，运用3D打印技术制作活性真皮替代物；将上述重构的生物活性真皮替代物应用于深度烧伤切削痂创面。
请结合具体实验分析对本发明作进一步描述。
2012-2018年在山东大学第二医院中心实验室进行自体变性脱细胞真皮的分析实验。
图1是本发明实施例提供的ADM与烧伤变性脱细胞真皮基质(DADM)图。
图中：(1a)、制备的ADM呈乳白色，柔韧性和延展性良好；(1b)、DADM呈乳黄色，有一定的柔韧性和延展性，较ADM柔软；
图2是本发明实施例提供的图1中ADM与烧伤变性脱细胞真皮基质(DADM)两者的组织学比较HE x40图。
图中：(a)、ADM胶原纤维呈疏松、卷曲状，可见细胞除去后留下的空隙；(b)、DADM胶原增粗、部分断裂，但仍保留连续性，胶原排列紊乱、疏松，嗜伊红性增强图。制备的ADM呈乳白色，柔韧性和延展性良好；胶原纤维呈疏松、卷曲状，可见细胞除去后留下的空隙。DADM呈乳黄色，有一定的柔韧性和延展性，较ADM柔软；胶原增粗、部分断裂，但仍保留连续性，胶原排列紊乱、疏松，嗜伊红性增强。
图3，烧伤变性脱细胞真皮基质(DADM)扫描电镜图。
图中，DADM支架中胶原纤维的形状、方向和结构特征扫描电镜图，支架中散在大小不等孔状结构，与内部相通，无细胞残留，胶原纤维不均匀增粗，保持三维多孔网状结构。
图4是本发明实施例提供的ADM与DADM的体外降解速率图。图中：在各个时间点，DADM的降解率都高于ADM，经统计分析，12h后，两组差异具有显著差异，故认为DADM比ADM降解速率快，提示热损伤后胶原抗降解性能降低。
图5是本发明实施例提供的ADM与DADM308种细胞因子蛋白芯片分布图。
图中：与ADM比较，DADM中IL-9、MMP-9水平有所升高，IL-10、核心蛋白聚糖等多种细胞因子下降，故并未发现DADM含与较高的细胞因子水平。如下表
图6是本发明实施例提供的ADM与DADM之间的细胞因子差异图；图中：ADM与DADM体内埋植实验比较(第一列为ADM，第第二列为DADM)；
DADM诱导成纤维细胞浸润作用强于ADM，新生胶原产生早于ADM，其炎症反应及新生血管形成作用弱于ADM。
图7是本发明实施例提供的ADM与DADM体内埋植后剩余面积图。
图8是本发明实施例提供的激光微孔化DADM体内埋植实验(×100)图；图中，激光微孔化DADM较DADM可以明显提高其在体内的血管化。
图9是本发明实施例提供的种植BM-MSCs的DADM HE染色和免疫荧光染色图，图中：接种的BM-MSCs在DADM中均匀分布，已用箭头指出，形成类真皮结构。A图×200，B图×400，红色为III胶原抗体标记的胶原蛋白，蓝色为DAPI标记的细胞核。
图10是本发明实施例提供的DADM中种植的BM-MSCs持续增殖图；图中：A图DADM支架接种BM-MSCs后1d、3d和5d的共聚焦显微镜三维成像。B图通过定量图A的荧光强度，对DADM中的BM-MSC的增殖进行1d、3d和5d的相对定量分析。C图通过CCK-8测量接种在DADM中的BM-MSC的增殖，(n＝3)。图中：共聚焦显微镜图像显示细胞逐渐渗透到DADM支架内部，随培养时间的延长，支架同一水平截面的细胞数量增加，对其荧光定量显示，荧光强度逐渐增强；为进一步检测细胞的增殖状态，通过CCK-8测量的增殖数据表明DADM中的BM-MSCs成功存活并持续增殖。
图11是本发明实施例提供的DADM和DADM/MSC支架的皮下埋植实验(×200)。图中：A图皮下埋植3d、7d、14d和21d后DADM(左)和DADM/MSC(右)的大体图。B图DADM和DADM/MSC支架的HE染色比较图。DADM/MSC组比DADM组(表现出更明显的血管浸润14d)。C图DADM和DADM/MSC支架Masson染色比较图。DADM/MSC组支架降解现象较DADM组更为明显(21d)。箭头指向血管；圆圈表示DADM降解区域。
图12是本发明实施例提供的DADM/MSC支架对创面愈合作用的影响(×100)图；图中：A图术后7d、14d和21d的小鼠皮肤创面大体外观观察图(去除敷料后)。B图创面组织HE染色组织学观察，结果表明DADM/MSC促进创面愈合，具有较完全的皮肤再生。C图3组中特定时间创面的相对残余创面面积(术后7d、14d和21d)。D图3组创面组织区域再生皮肤附件的平均数目，结果显示DADM/MSC支架促进皮肤附属件的再生，(n＝3)。W代表创面区域，*p<0.05，**p<0.01。
图13是本发明实施例提供的DADM/MSC支架对创面组织中血管再生的影响图。图中：A图(×200)创面组织中血管内皮细胞表达。支架移植后7d 3组创面组织利用CD31进行的免疫荧光实验观察，结果显示，移植DADM/MSC支架的创面组织由更多的CD31+细胞表达。B图(×100)术后14dα-SMA标记组织中的血管再生。C和D图根据术后14d创面组织的α-SMA染色结果，对3组创面组织的血管密度和血管直径进行量化分析。细胞核用DAPI染色。*p<0.05，**p<0.01。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物的制备方法，其特征在于，所述热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物的制备方法包括：
对变性脱细胞真皮基质进行重构，与干细胞联合，干细胞种植到支架中；或采用从烧伤皮肤中提取变性胶原蛋白，再添加壳聚糖，成纤维细胞原料混合，运用3D打印技术制作生物活性真皮替代物。
2.如权利要求1所述的热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物的制备方法，其特征在于，所述热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物的制备方法具体包括：
(1)取烧伤皮肤进行脱细胞处理，制备变性真皮支架替代物；
(2)将干细胞种植到上述支架中制备成具有生物活性的变性脱细胞真皮基质，随后于7天、14天、21天、28天分析创面组织的上皮化、血管化、炎症因子、浸润情况；
(3)从烧伤皮肤中提取变性胶原蛋白，再添加壳聚糖，成纤维细胞原料一起，运用3D打印技术制作活性真皮替代物；将上述重构的生物活性真皮替代物应用于深度烧伤切削痂创面。
3.如权利要求1所述的热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物的制备方法，其特征在于，对变性脱细胞真皮基质进行重构前，需进行：
深度烧伤模型制备：取Balb/c小鼠，水合氯醛腹腔麻醉后脱去背部毛发，将背部皮肤浸入54℃水中25s，造成背部20％TBSA皮肤深Ⅱ度烫伤创面。24h后，颈椎脱臼法处死小鼠，无菌操作下取背部烫伤皮肤，置于PBS中待用；
取烧伤皮肤进行脱细胞处理：
取出PBS中的烫伤皮肤，于0.1％的苯扎溴铵溶液中浸泡30min，后浸入0.25％的中性蛋白酶中，4℃环境下消化5h，去除残留表皮；随后在恒温震荡仪中进行脱细胞处理，利用0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶溶液持续震荡洗脱24h，PBS震荡24h；每6h换液一次；
种植：取5-6代干细胞以重力离心法种植到支架中，进行5个循环，一个循环1分钟，重力加速度为每分钟300g。孵箱中培养2个小时获得生物活性变性脱细胞真皮基质；干细胞浓度为5*105/cm2。
4.如权利要求3所述的热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物的制备方法，其特征在于，
深度烧伤模型制备或采用：从烧伤皮肤中提取变性胶原蛋白，再添加壳聚糖，成纤维细胞原料一起，运用3D打印技术制作活性真皮替代物；将重构的生物活性真皮替代物应用于切削痂手术后的深度烧伤创面。
5.一种利用权利要求1所述的热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物的制备方法制备的热变性真皮支架替代物。
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