CN110680955B - 一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料及制备方法 - Google Patents

一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110680955B
CN110680955B CN201911037904.0A CN201911037904A CN110680955B CN 110680955 B CN110680955 B CN 110680955B CN 201911037904 A CN201911037904 A CN 201911037904A CN 110680955 B CN110680955 B CN 110680955B
Authority
CN
China
Prior art keywords
aponeurosis
muscle
shaking
mass fraction
placing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911037904.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110680955A (zh
Inventor
林贤丰
王晟毓
王艺芸
范顺武
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Disai Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Zhejiang Disai Biotechnology Co ltd
Affiliated Sir Run Run Shaw Hospital of School of Medicine Zhejiang University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Disai Biotechnology Co ltd, Affiliated Sir Run Run Shaw Hospital of School of Medicine Zhejiang University filed Critical Zhejiang Disai Biotechnology Co ltd
Priority to CN201911037904.0A priority Critical patent/CN110680955B/zh
Publication of CN110680955A publication Critical patent/CN110680955A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110680955B publication Critical patent/CN110680955B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3633—Extracellular matrix [ECM]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3645—Connective tissue
    • A61L27/3662—Ligaments, tendons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/367—Muscle tissue, e.g. sphincter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3691—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by physical conditions of the treatment, e.g. applying a compressive force to the composition, pressure cycles, ultrasonic/sonication or microwave treatment, lyophilisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/10—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of tendons or ligaments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/30—Materials or treatment for tissue regeneration for muscle reconstruction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料及制备方法，脱细胞材料包括胰酶、无菌1‑2M的氯化钠、Triton X‑100、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X‑200、乙醇、的叠氮化钠和液氮。本发明成功制造了一种双相复合材料，互补了腱膜细胞外基质的力学性能和肌肉细胞外基质的再生肌肉的生物学效应，可以更好地促进腱膜和肌肉组织的再生，使缺损再生的新生组织更符合原有腹壁生理结构，相对于不可降解补片，本材料体内可降解，较好地避免了材料长期残留带来的远期不良反应。

Description

一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料及制 备方法
技术领域
本发明属于疝气修复及其再生技术领域，具体涉及一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料及制备方法。
背景技术
腹壁疝是临床常见疾病，其可造成腹腔内容物的异常脱出，形成腹壁肿块，严重时可引起肠嵌顿，坏死。而目前常见的疝修补常采用人工聚乙烯等无生物活性材料，其不可降解，在长期体内植入中可引起慢性疼痛，炎症，感染，疝气复发等风险。作为一种以被动力学支持的惰性材料，人工合成补片通常引起纤维化来加强力学支持，而不能恢复正常的腹壁结构。腹壁由皮肤，皮下脂肪，腹壁肌肉，腱膜，肌筋膜，腹膜组成。腱膜和肌筋膜等腱性组织提供抗张力学支持，而肌肉可调节腹内压。因此，单纯纤维化不能完全恢复正常腹壁功能。而此前有文献报道，肌肉细胞外基质和肌腱细胞外基质可分别促进肌肉和肌腱修复。因此，本发明尝试用新工艺获取肌肉和腱膜细胞外基质复合体，来解决腹壁肌肉和腱膜无法再生的困难。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料及制备方法。
a)为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：对天然组织来源的肌肉腱膜组织进行脱细胞处理。所述的天然组织来源的肌肉腱膜组织来源为哺乳动物腱膜肌肉组织；所述的脱细胞技术包括胰酶、NACL、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠、Triton X-200，叠氮化钠等化学试剂和物理冻融法组成的脱细胞方案，具体包括以下步骤：将初步物理去除腱膜周边脂肪组织；
b)将腱膜肌肉复合体裁剪为5*5cm长宽，5-10mm厚度；
c)将腱膜肌肉复合体放入液氮中10s，再拿出放入蒸馏水中，反复3次。
d)将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为0.3％的叠氮化钠蒸馏水溶液中，以200转/秒的速度震荡1-2天；
e)将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为75％的乙醇中，100转/秒的速度震荡1-2天；
f)重复步骤d；
g)将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为1-2％的十二烷基硫酸钠中，以150转/秒的速度震荡1天；
h)将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为2-4％的Triton X-100中，以150转/秒的速度震荡1天；
i)重复g,h步骤2-4次；
j)将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为0.5％-1.5％的胰酶溶液中，37℃静置12-48小时；
k)将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡12小时；
l)将腱膜肌肉复合体放置于无菌1-2M的氯化钠中，以200转/秒的速度震荡1天；
m)将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为2-10％的脱氧胆酸钠中，以120转/秒的速度震荡1-3天；
n)将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为1-8％的Triton X-200溶液中，以150转/秒的速度震荡1天；
o)将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡7天，每12小时换液；
p)得到脱细胞双相腱膜肌肉。
本发明的有益效果：
本发明获取的腱膜肌肉复合体是一种良好的适合于腹壁疝修复的材料复合体。腹壁疝修复首先需要材料有足够的力学，以防止材料植入后由于骤变的腹内压而撕裂。传统的肌肉细胞外基质力学性能较差，虽然可以促进肌肉纤维的修复，但不足以承受较大的腹内压。作为一种复合材料，腱膜肌肉复合体材料较好模拟再现了体内肌肉作为收缩单位，腱膜作为力学传导分散单位的互补优点。腱膜细胞外基质力学性能相比同类可降解生物活性材料如肌肉细胞外基质和小肠粘膜下层更加强韧，可以有效桥接大范围肌肉缺损，从而减少早期疝气再发的风险。其次，理想的疝气修复需要材料在降解后能重构出有层次的肌肉腱膜新生组织。研究证实，腱膜组织细胞外基质纤维相对于其他组织来源的细胞外基质排列更加整齐，更适合于腱性组织细胞再生。而肌肉细胞外基质相对腱膜细胞外基质则力学刚度更低，利于肌肉干细胞的增殖，分化和肌管再生。在体内修复实验中，本研究证实了腱膜肌肉复合体材料可以诱导出腱纤维样取向性排列的粗大胶原纤维以及纤维下方岛状分布的新生细小肌肉丛。
相比现有疝气补片，本发明显著的进步在于：
1)以哺乳动物的肌肉腱膜组织作为材料获取来源，来源较为广泛。
2)成功制造了一种双相复合材料，互补了腱膜细胞外基质的力学性能和肌肉细胞外基质的再生肌肉的生物学效应。
3)相对于现有补片的促进纤维化增强腹部强度，本材料可以更好地促进腱膜和肌肉组织的再生，使缺损再生的新生组织更符合原有腹壁生理结构。
4)相对于不可降解补片，本材料体内可降解，较好地避免了材料长期残留带来的远期不良反应。
附图说明
图1天然组织来源的腱膜肌肉复合体大体图。
图2天然组织来源的腱膜肌肉复合体的HE染色(A,B),DAPI(C,D),myhc(E,F)染色，证明本材料细胞已被去除。Masson三色(G，H)和阿尔新蓝(I,J)，胶原含量(L)和GAG含量(M)证明多数活性物质被保留。
图3细胞外基质的扫描电镜观察，证明细胞外基质保留完好(A-D)。拉力测试(E-H)证明材料的力学性能较为优异。
图4腱膜肌肉复合体材料复细胞化，说明材料的细胞相容性良好(A-F)。Qrt-PCR结果表明肌肉和腱膜细胞外基质的生物学性质不同，可以促进细胞向腱细胞和肌细胞双相分化，说明材料有良好的生物学效应(G-J)。
图5腱膜肌肉复合体材料的体内再生修复测试，证明材料可以恢复良好的腱膜肌肉结构(A-C)。而单纯单相材料和人工材料则不能恢复这样的结构(D-O)。
图6腱膜肌肉复合体材料相对于目前广泛使用的人工补片，具有防黏连(A-D)，促进组织结构再生(E-J)，促进腹壁力学恢复的作用(K,L)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的一种天然组织来源的腱膜肌肉复合体材料及其制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1天然组织来源的猪小腿三头肌腱膜肌肉复合体细胞外基质的制备
1、用剪刀去除猪小腿三头肌腱膜附近的脂肪，并裁成5cm*5cm*5mm大小；如图1所示，
2、将腱膜肌肉复合体放入液氮中10s，迅速拿出放入蒸馏水中，反复3次。
3、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为0.3％的叠氮化钠蒸馏水溶液中，以200转/秒的速度震荡1天；
4、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为75％乙醇中，100转/秒的速度震荡1天；
5、重复步骤3；
6、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为1％SDS中，以150转/秒的速度震荡1天；
7、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为2％Triton X-100中，以150转/秒的速度震荡1天；
8、重复6,7步骤2次；
9、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为0.5％胰酶溶液中，37℃静置12小时；
10、将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡12小时；
11、将腱膜肌肉复合体放置于无菌1M的氯化钠中，以200转/秒的速度震荡1天；
12、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为2％脱氧胆酸钠中，以120转/秒的速度震荡1天；
13、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为1％Triton X-200溶液中，以150转/秒的速度震荡1天；
14、将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡7天，每12小时换液；
15、得到然组织来源的腱膜肌肉复合体。
如图2所示，将得到天然组织来源的腱膜肌肉复合体的HE染色(A,B),DAPI(C,D),myhc(E,F)染色，证明本材料细胞已被去除。Masson三色(G，H)和阿尔新蓝(I,J)，胶原含量(L)和GAG含量(M)证明多数活性物质被保留。如图3所示，细胞外基质的扫描电镜观察，证明细胞外基质保留完好(A-D)。拉力测试(E-H)证明材料的力学性能较为优异。
实施例2天然组织来源的猪小腿三头肌腱膜肌肉复合体细胞外基质的制备
1、用剪刀去除猪小腿三头肌腱膜附近的脂肪，并裁成5cm*5cm*10mm大小；
2、将腱膜肌肉复合体放入液氮中10s，迅速拿出放入蒸馏水中，反复3次。
3、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为0.3％的叠氮化钠蒸馏水溶液中，以200转/秒的速度震荡1天；
4、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为75％乙醇中，100转/秒的速度震荡1天；
5、重复步骤3；
6、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为1％SDS中，以150转/秒的速度震荡1天；
7、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为2％Triton X-100中，以150转/秒的速度震荡1天；
8、重复6,7步骤2次；
9、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为1％胰酶溶液中，37℃静置12小时；
10、将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡12小时；
11、将腱膜肌肉复合体放置于无菌1M的氯化钠中，以200转/秒的速度震荡1天；
12、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为4％脱氧胆酸钠中，以120转/秒的速度震荡1天；
13、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为3％Triton X-200溶液中，以150转/秒的速度震荡1天；
14、将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡7天，每12小时换液；
实施例3天然组织来源的猪小腿三头肌腱膜肌肉复合体细胞外基质的制备
1、用剪刀去除猪小腿三头肌腱膜附近的脂肪，并裁成5cm*5cm*15mm大小；
2、将腱膜肌肉复合体放入液氮中10s，迅速拿出放入蒸馏水中，反复3次。
3、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为0.3％的叠氮化钠蒸馏水溶液中，以200转/秒的速度震荡1天；
4、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为75％乙醇中，100转/秒的速度震荡1天；
5、重复步骤3；
6、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为1％SDS中，以150转/秒的速度震荡1天；
7、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为2％Triton X-100中，以150转/秒的速度震荡1天；
8、重复6,7步骤2次；
9、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为1.5％胰酶溶液中，37℃静置12小时；
10、将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡12小时；
11、将腱膜肌肉复合体放置于无菌1M的氯化钠中，以200转/秒的速度震荡1天；
12、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为10％脱氧胆酸钠中，以120转/秒的速度震荡1天；
13、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为8％Triton X-200溶液中，以150转/秒的速度震荡1天；
14、将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡7天，每12小时换液；
实施例4天然组织来源的牛小腿三头肌腱膜肌肉复合体细胞外基质的制备
1、用剪刀去除牛小腿三头肌腱膜附近的脂肪，并裁成5cm*5cm*5mm大小；
2、将腱膜肌肉复合体放入液氮中10s，迅速拿出放入蒸馏水中，反复3次。
3、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为0.3％的叠氮化钠蒸馏水溶液中，以200转/秒的速度震荡1天；
4、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为75％乙醇中，100转/秒的速度震荡1天；
5、重复步骤3；
6、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为1％SDS中，以150转/秒的速度震荡1天；
7、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为2％Triton X-100中，以150转/秒的速度震荡1天；
8、重复6,7步骤3次；
9、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为1％胰酶溶液中，37℃静置24小时；
10、将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡12小时；
11、将腱膜肌肉复合体放置于无菌1M的氯化钠中，以200转/秒的速度震荡1天；
12、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为3％脱氧胆酸钠中，以120转/秒的速度震荡2天；
13、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为1％Triton X-200溶液中，以150转/秒的速度震荡1天；
14、将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡7天，每12小时换液；
实施例5天然组织来源的牛小腿三头肌腱膜肌肉复合体细胞外基质的制备1、用剪刀去除牛小腿三头肌腱膜附近的脂肪，并裁成5cm*5cm*10mm大小；
2、将腱膜肌肉复合体放入液氮中10s，迅速拿出放入蒸馏水中，反复3次。
3、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为0.3％的叠氮化钠蒸馏水溶液中，以200转/秒的速度震荡1.5天；
4、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为75％乙醇中，100转/秒的速度震荡1天；
5、重复步骤3；
6、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为2％SDS中，以150转/秒的速度震荡1天；
7、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为2％Triton X-100中，以150转/秒的速度震荡1天；
8、重复6,7步骤3次；
9、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为1％胰酶溶液中，37℃静置24小时；
10、将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡12小时；
11、将腱膜肌肉复合体放置于无菌1.5M的氯化钠中，以200转/秒的速度震荡1天；
12、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为6％脱氧胆酸钠中，以120转/秒的速度震荡2天；
13、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为1％Triton X-200溶液中，以150转/秒的速度震荡1天；
14、将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡7天，每12小时换液；
实施例6天然组织来源的猪腹壁腱膜肌肉复合体细胞外基质的制备的制备
1、用剪刀去除猪腹壁腱膜肌肉附近的脂肪，并裁成5cm*5cm*5mm大小；
2、将腱膜肌肉复合体放入液氮中10s，迅速拿出放入蒸馏水中，反复3次。
3、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为0.3％的叠氮化钠蒸馏水溶液中，以200转/秒的速度震荡2天；
4、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为75％乙醇中，100转/秒的速度震荡2天；
5、重复步骤3；
6、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为1.5％SDS中，以150转/秒的速度震荡1天；
7、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为3％Triton X-100中，以150转/秒的速度震荡1天；
8、重复6,7步骤4次；
9、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为1.5％胰酶溶液中，37℃静置48小时；
10、将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡12小时；
11、将腱膜肌肉复合体放置于无菌2M的氯化钠中，以200转/秒的速度震荡1天；
12、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为4％脱氧胆酸钠中，以120转/秒的速度震荡3天；
13、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为2％Triton X-200溶液中，以150转/秒的速度震荡1天；
14、将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡7天，每12小时换液；
实施例7天然组织来源的猪腹壁腱膜肌肉复合体细胞外基质的制备的制备
1、用剪刀去除猪腹壁腱膜肌肉附近的脂肪，并裁成5cm*5cm*10mm大小；
2、将腱膜肌肉复合体放入液氮中10s，迅速拿出放入蒸馏水中，反复3次。
3、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为0.3％的叠氮化钠蒸馏水溶液中，以200转/秒的速度震荡2天；
4、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为75％乙醇中，100转/秒的速度震荡2天；
5、重复步骤3；
6、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为2％SDS中，以150转/秒的速度震荡1天；
7、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为4％Triton X-100中，以150转/秒的速度震荡1天；
8、重复6,7步骤4次；
9、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为1.5％胰酶溶液中，37℃静置48小时；
10、将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡12小时；
11、将腱膜肌肉复合体放置于无菌2M的氯化钠中，以200转/秒的速度震荡1天；
12、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为10％脱氧胆酸钠中，以120转/秒的速度震荡3天；
13、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为6％Triton X-200溶液中，以150转/秒的速度震荡1天；
14、将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡7天，每12小时换液；
实施例8天然组织来源的腱膜肌肉复合体细胞外基质体外支持细胞生长
1、脱细胞步骤同上述实施例1中步骤1-14；
2、将步骤12所得的腱膜肌肉复合体浸入pH7.0的0.1M PBS中，150转/分钟转速震荡12小时；
3、将腱膜肌肉复合体浸入10％的胎牛血清高糖溶液中，于37℃静置24小时。
4、吸干腱膜肌肉复合体可浸出的液体，以50000/cm2的密度滴加骨髓来源间充质干细胞，于37摄氏度静置贴附1小时后，加入10％的胎牛血清高糖溶液。
5、细胞于37摄氏度培养3天，即可获得复细胞化的腱膜肌肉复合体。
如图4所示，腱膜肌肉复合体材料复细胞化，说明材料的细胞相容性良好(A-F)。Qrt-PCR结果表明肌肉和腱膜细胞外基质的生物学性质不同，可以促进细胞向腱细胞和肌细胞双相分化，说明材料有良好的生物学效应(G-J)。
实施例9天然组织来源的腱膜肌肉复合体细胞外基质再生腹壁
1、脱细胞步骤同上述实施例1中步骤1-14；
2、将步骤12所得的腱膜肌肉复合体浸入pH7.0的0.1M PBS中，150转/分钟转速震荡12小时；
3、将腱膜肌肉复合体浸入10％的胎牛血清高糖溶液中，于37℃静置24小时。
4、将腱膜肌肉复合体浸入pH7.0的0.1M PBS中，150转/分钟转速震荡36小时，每12小时换一次液。
5、在兔子腹壁上于无菌环境下剪去4cm*4cm大小的腹壁组织，用3-0可吸收缝线将上述获得的腱膜肌肉复合体缝合至缺口，然后缝合皮肤。如图5所示，腱膜肌肉复合体材料的体内再生修复测试，证明材料可以恢复良好的腱膜肌肉结构(A-C)。而单纯单相材料和人工材料则不能恢复这样的结构(D-O)；如图6所示，腱膜肌肉复合体材料相对于目前广泛使用的人工补片，具有防黏连(A-D)，促进组织结构再生(E-J)，促进腹壁力学恢复的作用(K,L)。
由上述实施例可知，本发明提供的天然组织来源的腱膜肌肉复合体制备方法，该材料可以有效复合细胞，得到复细胞化的腱膜肌肉复合体材料。且该材料在体内实验中，有效再生了兔子腹壁腱膜和肌肉组织，因而该材料是一种很有潜力的腹壁疝气修复材料。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的制备方法，其特征在于：
使用的脱细胞材料包括质量分数为0.5%-1.5%的胰酶、无菌1-2M的氯化钠、质量分数为2-4% 的Triton X-100、质量分数为1-2%的十二烷基硫酸钠、质量分数为2-10%的脱氧胆酸钠、质量分数为1-8% 的Triton X-200、质量分数为75%乙醇、质量分数为0.3%的叠氮化钠和液氮；
具体包括以下步骤：
a、将初步物理去除腱膜周边脂肪组织；
b、将腱膜肌肉复合体裁剪为5*5cm长宽，5-10mm厚度；
c、将腱膜肌肉复合体放入液氮中10s，再拿出放入蒸馏水中，反复3次；
d、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为0.3%的叠氮化钠蒸馏水溶液中，以200转/秒的速度震荡1-2天；
e、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为75%的乙醇中，100转/秒的速度震荡1-2天；
f、重复步骤d；
g、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为1-2%的十二烷基硫酸钠中，以150转/秒的速度震荡1天；
h、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为2-4% 的Triton X-100中，以150转/秒的速度震荡1天;
i、重复g,h步骤2-4次；
j、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为0.5%-1.5%的胰酶溶液中，37℃静置12-48小时；
k、将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡12小时；
l、将腱膜肌肉复合体放置于无菌1-2M的氯化钠中，以200转/秒的速度震荡1天；
m、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为2-10%的脱氧胆酸钠中，以120转/秒的速度震荡1-3天；
n、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为1-8% 的Triton X-200溶液中，以150转/秒的速度震荡1天；
o、将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡7天，每12小时换液；
p、得到脱细胞双相腱膜肌肉。
CN201911037904.0A 2019-10-29 2019-10-29 一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料及制备方法 Active CN110680955B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911037904.0A CN110680955B (zh) 2019-10-29 2019-10-29 一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料及制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911037904.0A CN110680955B (zh) 2019-10-29 2019-10-29 一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料及制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110680955A CN110680955A (zh) 2020-01-14
CN110680955B true CN110680955B (zh) 2021-12-14

Family

ID=69114515

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911037904.0A Active CN110680955B (zh) 2019-10-29 2019-10-29 一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料及制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110680955B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006227711A1 (en) * 2005-03-16 2006-09-28 Musculoskeletal Transplant Foundation Soft tissue processing
CN105013014A (zh) * 2015-07-31 2015-11-04 武汉蓝普医品有限公司 一种无细胞基质生物材料的制备方法和用途
CN107737373A (zh) * 2017-12-07 2018-02-27 山东隽秀生物科技股份有限公司 一种肌腱修复材料的制备方法
CN108465125A (zh) * 2018-04-04 2018-08-31 浙江大学 天然组织来源的肌腱复合肌肉脱细胞材料的制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3545980A1 (en) * 2010-02-26 2019-10-02 DeCell Technologies Inc. Methods for tissue decellularization
CA2913398C (en) * 2012-07-06 2021-04-20 Lifecell Corporation Decellularized muscle matrix

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006227711A1 (en) * 2005-03-16 2006-09-28 Musculoskeletal Transplant Foundation Soft tissue processing
CN105013014A (zh) * 2015-07-31 2015-11-04 武汉蓝普医品有限公司 一种无细胞基质生物材料的制备方法和用途
CN107737373A (zh) * 2017-12-07 2018-02-27 山东隽秀生物科技股份有限公司 一种肌腱修复材料的制备方法
CN108465125A (zh) * 2018-04-04 2018-08-31 浙江大学 天然组织来源的肌腱复合肌肉脱细胞材料的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Preparation of decellularized biphasic hierarchical myotendinous junction extracellular matrix for muscle regeneration;Chenchen Zhao et al;《Acta Biomaterialia》;20171230;第68卷;第15-28页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110680955A (zh) 2020-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3357519B1 (en) Compositions for soft tissue filling and regeneration
Wu et al. An injectable extracellular matrix derived hydrogel for meniscus repair and regeneration
JP3643381B2 (ja) 軟骨組織再構成のための再吸収可能な細胞外マトリックス
Rizzi et al. Tissue engineering for skeletal muscle regeneration
CN102188748B (zh) 一种新型软骨细胞外基质膜及其制备方法
US20020116063A1 (en) Kit for chondrocyte cell transplantation
Cheema et al. Collagen: applications of a natural polymer in regenerative medicine
CN111068116A (zh) 一种注射用软骨修复温敏凝胶及其制备方法
CN111840642A (zh) 一种软骨脱细胞基质复合支架的制备方法及其应用
EP2809340B1 (en) Biomaterial for articular cartilage maintenance and treatment of arthritis
JP2002525043A5 (zh)
CN110680955B (zh) 一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料及制备方法
WO2024037293A1 (zh) 一种修复周围神经损伤的细胞基质神经移植物及其制备方法
CN109529120A (zh) 一种小肠黏膜下层基质修复凝胶的制备方法
CN100402097C (zh) 琼脂/胶原皮肤创伤修复敷料及其制备方法和应用
Wang et al. Highly resilient and fatigue-resistant poly (4-methyl-ε-caprolactone) porous scaffold fabricated via thiol-yne photo-crosslinking/salt-templating for soft tissue regeneration
US20240148938A1 (en) Method for realizing cartilage regeneration by means of inoculating gel cartilage into frame structure
AU2005202385B2 (en) Kit for chondrocyte cell transplantation
Chandy et al. The development of porous alginate/elastin/PEG composite matrix for cardiovascular engineering
Kumaresan et al. Development of Human Umbilical cord based scaffold for tissue engineering application
JP2001293081A (ja) 軟骨移植用材料及びその製造方法
CN115317672B (zh) 仿生骨软骨一体化修复植入体及其制备方法与应用
CN111939323B (zh) 含有透明质酸连接肽和连接蛋白末端肽的功能性多肽水凝胶及其应用
WO2022156648A1 (zh) 一种耳软骨组织工程复合物及其用途
CN115887766A (zh) 载脱细胞膜片生物支架、制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220908

Address after: 310018 3rd floor, building 4, 265 Chengrui street, Xiasha street, Qiantang New District, Hangzhou City, Zhejiang Province

Patentee after: Zhejiang Disai Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: Jianggan District Qingchun Road Hangzhou city Zhejiang province 310016 No. 3

Patentee before: SIR RUN RUN SHAW HOSOITAL ZHEJIANG University SCHOOL OF MEDICINE

Patentee before: Zhejiang Disai Biotechnology Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right