CN111235102A - 一种脐带间充质干细胞原代培养方法 - Google Patents

一种脐带间充质干细胞原代培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种全新的从脐带华通氏胶中分离获得大量脐带间充质干细胞的方法。本发明方法使用Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂，原代细胞培养所用的细胞培养皿预先用20μg/mL弹性蛋白原(tropoelastin,TE)包被处理过。本发明方法能显著提高脐带间充质干细胞原代细胞产量的方法。本发明方法通过分离华通氏胶，经Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂孵育后再贴壁培养于用弹性蛋白原包被处理过的细胞培养皿。与现有的分离方法相比，本发明所提供的改进方法能显著增加原代细胞的产量，在相同培养时间下能获得更多的原代细胞。

Description

一种脐带间充质干细胞原代培养方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，特别涉及间充质干细胞培养。
背景技术
脐带间充质干细胞是可应用于再生医学领域和治疗系统性疾病的“实用型干细胞”。因其取材方便，无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、活力强，便于扩增，没有配型和排异等问题而成为理想的种子细胞来源，适合于临床研究和应用。脐带间充质干细胞的研究虽然起步相对较晚，但进展迅速，是干细胞转化医学研究中最具发展前景的领域之一。利用脐带间充质干细胞的分化特性,预计在临床上可用于治疗各种涉及组织细胞变性、坏死、缺失引起的组织损伤退变类疾病等。
脐带间充质干细胞原代分离培养方法分为酶消化法和组织块贴壁培养法。酶消化法主要使用一种或多种酶对华通氏胶进行消化，其缺点主要包括：酶浓度、酶种类以及消化时间等均会影响最终的细胞纯度；同时操作步骤增加，过程繁琐，也会增加污染的机会。组织块贴壁培养法是通过分离华通氏胶后剪成小块再直接贴壁培养。相对于酶消化法，组织块贴壁培养法具有众多优点：操作简单，缩短样本处理时间；分离方法易于标准化；成本低；细胞纯度高等。但组织块贴壁培养法也存在细胞爬出的时间较长以及原代细胞产量少等缺点。因此，需要对脐带间充质干细胞的原代分离方法进行改进，才能获取到纯度高且数量多的细胞。
发明内容
为了解决上述现有方法的不足，本发明提供了一种全新的脐带间充质干细胞原代培养方法，该方法种能显著提高脐带间充质原代细胞产量。
Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂和弹性蛋白原的新用途，该用途为Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂和弹性蛋白原共同用于脐带间充质干细胞原代培养中，能显著增加原代细胞的产量，在相同培养时间下能获得更多的原代细胞。
根据本发明的一方面提供了脐带间充质干细胞原代培养方法，脐带间充质干细胞原代培养方法中使用的华通氏胶Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂，并且使用的细胞培养皿预先用弹性蛋白原包被处理过。
根据本发明的一方面提供了一种脐带间充质干细胞原代培养方法，脐带间充质干细胞原代培养方法中使用的所述华通氏胶Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂的方法如下：脐带间充质干细胞原代培养方法中华通氏胶放入Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂中孵育4小时。
根据本发明的一方面提供了一种脐带间充质干细胞原代培养方法，使用的细胞培养皿预先用弹性蛋白原包被处理的方法如下：脐带间充质干细胞原代培养方法中细胞培养皿预先用20μg/mL弹性蛋白原包被处理，4℃放置过夜。
根据本发明的一方面提供了一种脐带间充质干细胞原代培养方法，脐带间充质干细胞原代培养方法中华通氏胶接种于包被好的细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞。
根据本发明的一方面提供了一种脐带间充质干细胞原代培养方法，脐带间充质干细胞原代培养方法包含如下步骤：
步骤(1)获取新生儿脐带，取组织保存液进行无菌和支原体检测后，用生理盐水清洗多次直至洗去脐带中残留的血液；
步骤(2)将步骤(1)获得的脐带找出并剔除脐带中的静脉血管和动脉血管，分离华通氏胶并用生理盐水充分洗涤华通氏胶；
步骤(3)将华通氏胶切成长条(2mm宽，5cm长)，把切好的华通氏胶长条放入HeliosUltraGRO间充质干细胞培养补充剂中孵育4小时；
步骤(4)将步骤(3)中孵育过的华通氏胶长条用生理盐水洗3次，剪成小块(长宽均为2mm)；
步骤(5)细胞培养皿预先用20μg/mL弹性蛋白原包被处理，4℃放置过夜，将步骤(4)中的华通氏胶小块接种于包被好的细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞；
步骤(6)组织培养获得原代脐带间充质干细胞。
根据本发明的一方面提供了一种脐带间充质干细胞原代培养方法，脐带间充质干细胞原代培养方法中使用的培养基为MEMα完全培养基，所述MEMα完全培养基制备方法为：MEMα基础培养基(体积百分比为95％)，Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂(体积百分比为5％)，配置完成后再添加肝素使其浓度达到2IU/mL。
根据本发明的一方面提供了一种脐带间充质干细胞原代培养方法，脐带间充质干细胞原代培养方法中原代细胞计数采用血球计数板计数法、原代细胞染色采用结晶紫染色液染色。
Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂和弹性蛋白原共同用于脐带间充质干细胞原代培养中，能显著增加原代细胞的产量，在相同培养时间下能获得更多的原代细胞。
本发明还提供了Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂和弹性蛋白原的新用途，所述用途为Helios UltraGRO细胞培养补充剂和弹性蛋白原共同用于上述一种脐带间充质干细胞原代培养方法中，能显著增加原代细胞的产量，在相同培养时间下能获得更多的原代细胞。
附图说明
图1、为本发明其中一个实施例中，图1A分别为常规组，弹性蛋白原组，HeliosUltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞克隆染色结果，结果显示实验组的原代细胞克隆数量显著多于其它各组；图1B分别为常规组，弹性蛋白原组，Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和HeliosUltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞数的统计结果，结果显示实验组的原代细胞数量相对于常规组，弹性蛋白原组和HeliosUltraGRO间充质干细胞培养补充剂组分别提高了65.1％，50.2％和35.7％。
图2、为本发明其中一个实施例中，图2A分别为常规组，弹性蛋白原组，HeliosUltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞克隆染色结果，结果显示实验组的原代细胞克隆数量显著多于其它各组；图2B分别为常规组，弹性蛋白原组，Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和HeliosUltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞数的统计结果，结果显示实验组的原代细胞数量相对于常规组，弹性蛋白原组和HeliosUltraGRO间充质干细胞培养补充剂组分别提高了62.3％，49.6％和37.2％。
图3、为本发明其中一个实施例中，图3A分别为常规组，弹性蛋白原组，HeliosUltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞克隆染色结果，结果显示实验组的原代细胞克隆数量显著多于其它各组；图3B分别为常规组，弹性蛋白原组，Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和HeliosUltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞数的统计结果,结果显示实验组的原代细胞数量相对于常规组，弹性蛋白原组和HeliosUltraGRO间充质干细胞培养补充剂组分别提高了58.6％，43.2％和28.7％。
图4、为本发明其中一个实施例中，图4A分别为常规组，弹性蛋白原组，HeliosUltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞克隆染色结果，结果显示实验组的原代细胞克隆数量显著多于其它各组；图4B分别为常规组，弹性蛋白原组，Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和HeliosUltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞数的统计结果,结果显示实验组的原代细胞数量相对于常规组，弹性蛋白原组和HeliosUltraGRO间充质干细胞培养补充剂组分别提高了56.5％，41.9％和25.4％。
图5、为本发明其中一个实施例中，图5A分别为常规组，弹性蛋白原组，HeliosUltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞克隆染色结果，结果显示实验组的原代细胞克隆数量显著多于其它各组；图5B分别为常规组，弹性蛋白原组，Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和HeliosUltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞数的统计结果,结果显示实验组的原代细胞数量相对于常规组，弹性蛋白原组和HeliosUltraGRO间充质干细胞培养补充剂组分别提高了59.8％，43.3％和24.8％。
具体实施方式
下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种脐带间充质干细胞原代培养方法。
(1)获取新生儿脐带，取组织保存液进行无菌和支原体检测后，用生理盐水清洗多次直至洗去脐带中残留的血液；
(2)用手术剪将脐带剪成长度为5cm的节段，用镊子撕开脐带，找出并剔除脐带中的静脉血管和动脉血管，分离华通氏胶并用生理盐水充分洗涤华通氏胶；
(3)用无菌手术刀将华通氏胶切成长条(2mm宽，5cm长)，把切好的华通氏胶长条放入Helios UltraGRO细胞培养补充剂中孵育4小时；
(4)孵育好的华通氏胶长条用生理盐水洗3次，剪成长和宽均为2mm的小块；
(5)细胞培养皿预先用20μg/mL弹性蛋白原(tropoelastin,TE)包被处理，4℃放置过夜，将剪好的华通氏胶小块接种于包被好的细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞；
(6)在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图1)。
对照组脐带间充质干细胞原代培养方法：常规组织贴壁培养法(常规组)、单独使用弹性蛋白原的织贴壁培养法(弹性蛋白原组)、单独使用Helios UltraGRO细胞培养补充剂的织贴壁培养法(补充剂组)。
(1)获取新生儿脐带，取组织保存液进行无菌和支原体检测后，用生理盐水清洗多次直至洗去脐带中残留的血液；
(2)用手术剪将脐带剪成长度为5cm的节段，用镊子撕开脐带，找出并剔除脐带中的静脉血管和动脉血管，分离华通氏胶并用生理盐水充分洗涤华通氏胶；
(3)常规组：用无菌剪刀将洗涤后的华通氏胶剪成长和宽均为2mm的小块，将剪好的华通氏胶小块接种于细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞，在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图1)；
(4)弹性蛋白原组：细胞培养皿预先用20μg/mL弹性蛋白原(tropoelastin,TE)包被处理，4℃放置过夜。用无菌剪刀将洗涤后的华通氏胶剪成长和宽均为2mm的小块，将剪好的华通氏胶小块接种于细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞，在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图1)；
(5)补充剂组：用无菌手术刀将华通氏胶切成长条(2mm宽，5cm长)，把切好的华通氏胶长条放入Helios UltraGRO细胞培养补充剂中孵育4小时后将孵育好的华通氏胶长条用生理盐水洗3次，剪成长和宽均为2mm的小块，将剪好的华通氏胶小块接种于细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞，在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图1)。
如图1中，图1A分别为常规组，弹性蛋白原组，Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞克隆染色结果，结果显示实验组的原代细胞克隆数量显著多于其它各组；图1B分别为常规组，弹性蛋白原组，Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞数的统计结果，结果显示实验组的原代细胞数量相对于常规组，弹性蛋白原组和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组分别提高了65.1％，50.2％和35.7％。
实施例2
一种脐带间充质干细胞原代培养方法。
(1)获取新生儿脐带，取组织保存液进行无菌和支原体检测后，用生理盐水清洗多次直至洗去脐带中残留的血液；
(2)用手术剪将脐带剪成长度为5cm的节段，用镊子撕开脐带，找出并剔除脐带中的静脉血管和动脉血管，分离华通氏胶并用生理盐水充分洗涤华通氏胶；
(3)用无菌手术刀将华通氏胶切成长条(2mm宽，5cm长)，把切好的华通氏胶长条放入Helios UltraGRO细胞培养补充剂中孵育4小时；
(4)孵育好的华通氏胶长条用生理盐水洗3次，剪成长和宽均为2mm的小块；
(5)细胞培养皿预先用20μg/mL弹性蛋白原(tropoelastin,TE)包被处理，4℃放置过夜，将剪好的华通氏胶小块接种于包被好的细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞；
(6)在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图2)。
对照组脐带间充质干细胞原代培养方法：常规组织贴壁培养法(常规组)、单独使用弹性蛋白原的织贴壁培养法(弹性蛋白原组)、单独使用Helios UltraGRO细胞培养补充剂的织贴壁培养法(补充剂组)。
(1)获取新生儿脐带，取组织保存液进行无菌和支原体检测后，用生理盐水清洗多次直至洗去脐带中残留的血液；
(2)用手术剪将脐带剪成长度为5cm的节段，用镊子撕开脐带，找出并剔除脐带中的静脉血管和动脉血管，分离华通氏胶并用生理盐水充分洗涤华通氏胶；
(3)常规组：用无菌剪刀将洗涤后的华通氏胶剪成长和宽均为2mm的小块，将剪好的华通氏胶小块接种于细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞，在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图2)；
(4)弹性蛋白原组：细胞培养皿预先用20μg/mL弹性蛋白原(tropoelastin,TE)包被处理，4℃放置过夜。用无菌剪刀将洗涤后的华通氏胶剪成长和宽均为2mm的小块，将剪好的华通氏胶小块接种于细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞，在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图2)；
(5)补充剂组：用无菌手术刀将华通氏胶切成长条(2mm宽，5cm长)，把切好的华通氏胶长条放入Helios UltraGRO细胞培养补充剂中孵育4小时后将孵育好的华通氏胶长条用生理盐水洗3次，剪成长和宽均为2mm的小块，将剪好的华通氏胶小块接种于细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞，在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图2)。
如图2中，图2A分别为常规组，弹性蛋白原组，Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞克隆染色结果，结果显示实验组的原代细胞克隆数量显著多于其它各组；图2B分别为常规组，弹性蛋白原组，Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞数的统计结果，结果显示实验组的原代细胞数量相对于常规组，弹性蛋白原组和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组分别提高了62.3％，49.6％和37.2％。
实施例3
一种脐带间充质干细胞原代培养方法。
(1)获取新生儿脐带，取组织保存液进行无菌和支原体检测后，用生理盐水清洗多次直至洗去脐带中残留的血液；
(2)用手术剪将脐带剪成长度为5cm的节段，用镊子撕开脐带，找出并剔除脐带中的静脉血管和动脉血管，分离华通氏胶并用生理盐水充分洗涤华通氏胶；
(3)用无菌手术刀将华通氏胶切成长条(2mm宽，5cm长)，把切好的华通氏胶长条放入Helios UltraGRO细胞培养补充剂中孵育4小时；
(4)孵育好的华通氏胶长条用生理盐水洗3次，剪成长和宽均为2mm的小块；
(5)细胞培养皿预先用20μg/mL弹性蛋白原(tropoelastin,TE)包被处理，4℃放置过夜，将剪好的华通氏胶小块接种于包被好的细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞；
(6)在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图3)。
对照组脐带间充质干细胞原代培养方法：常规组织贴壁培养法(常规组)、单独使用弹性蛋白原的织贴壁培养法(弹性蛋白原组)、单独使用Helios UltraGRO细胞培养补充剂的织贴壁培养法(补充剂组)。
(1)获取新生儿脐带，取组织保存液进行无菌和支原体检测后，用生理盐水清洗多次直至洗去脐带中残留的血液；
(2)用手术剪将脐带剪成长度为5cm的节段，用镊子撕开脐带，找出并剔除脐带中的静脉血管和动脉血管，分离华通氏胶并用生理盐水充分洗涤华通氏胶；
(3)常规组：用无菌剪刀将洗涤后的华通氏胶剪成长和宽均为2mm的小块，将剪好的华通氏胶小块接种于细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞，在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图3)；
(4)弹性蛋白原组：细胞培养皿预先用20μg/mL弹性蛋白原(tropoelastin,TE)包被处理，4℃放置过夜。用无菌剪刀将洗涤后的华通氏胶剪成长和宽均为2mm的小块，将剪好的华通氏胶小块接种于细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞，在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图3)；
(5)补充剂组：用无菌手术刀将华通氏胶切成长条(2mm宽，5cm长)，把切好的华通氏胶长条放入Helios UltraGRO细胞培养补充剂中孵育4小时后将孵育好的华通氏胶长条用生理盐水洗3次，剪成长和宽均为2mm的小块，将剪好的华通氏胶小块接种于细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞，在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图3)。
如图3中，图3A分别为常规组，弹性蛋白原组，Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞克隆染色结果，结果显示实验组的原代细胞克隆数量显著多于其它各组；图3B分别为常规组，弹性蛋白原组，Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞数的统计结果,结果显示实验组的原代细胞数量相对于常规组，弹性蛋白原组和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组分别提高了58.6％，43.2％和28.7％。
实施例4
一种脐带间充质干细胞原代培养方法。
(1)获取新生儿脐带，取组织保存液进行无菌和支原体检测后，用生理盐水清洗多次直至洗去脐带中残留的血液；
(2)用手术剪将脐带剪成长度为5cm的节段，用镊子撕开脐带，找出并剔除脐带中的静脉血管和动脉血管，分离华通氏胶并用生理盐水充分洗涤华通氏胶；
(3)用无菌手术刀将华通氏胶切成长条(2mm宽，5cm长)，把切好的华通氏胶长条放入Helios UltraGRO细胞培养补充剂中孵育4小时；
(4)孵育好的华通氏胶长条用生理盐水洗3次，剪成长和宽均为2mm的小块；
(5)细胞培养皿预先用20μg/mL弹性蛋白原(tropoelastin,TE)包被处理，4℃放置过夜，将剪好的华通氏胶小块接种于包被好的细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞；
(6)在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图4)。
对照组脐带间充质干细胞原代培养方法：常规组织贴壁培养法(常规组)、单独使用弹性蛋白原的织贴壁培养法(弹性蛋白原组)、单独使用Helios UltraGRO细胞培养补充剂的织贴壁培养法(补充剂组)。
(1)获取新生儿脐带，取组织保存液进行无菌和支原体检测后，用生理盐水清洗多次直至洗去脐带中残留的血液；
(2)用手术剪将脐带剪成长度为5cm的节段，用镊子撕开脐带，找出并剔除脐带中的静脉血管和动脉血管，分离华通氏胶并用生理盐水充分洗涤华通氏胶；
(3)常规组：用无菌剪刀将洗涤后的华通氏胶剪成长和宽均为2mm的小块，将剪好的华通氏胶小块接种于细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞，在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图4)；
(4)弹性蛋白原组：细胞培养皿预先用20μg/mL弹性蛋白原(tropoelastin,TE)包被处理，4℃放置过夜。用无菌剪刀将洗涤后的华通氏胶剪成长和宽均为2mm的小块，将剪好的华通氏胶小块接种于细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞，在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图4)；
(5)补充剂组：用无菌手术刀将华通氏胶切成长条(2mm宽，5cm长)，把切好的华通氏胶长条放入Helios UltraGRO细胞培养补充剂中孵育4小时后将孵育好的华通氏胶长条用生理盐水洗3次，剪成长和宽均为2mm的小块，将剪好的华通氏胶小块接种于细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞，在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图4)。
如图4中，图4A分别为常规组，弹性蛋白原组，Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞克隆染色结果，结果显示实验组的原代细胞克隆数量显著多于其它各组；图4B分别为常规组，弹性蛋白原组，Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞数的统计结果,结果显示实验组的原代细胞数量相对于常规组，弹性蛋白原组和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组分别提高了56.5％，41.9％和25.4％。
实施例5
一种脐带间充质干细胞原代培养方法。
(1)获取新生儿脐带，取组织保存液进行无菌和支原体检测后，用生理盐水清洗多次直至洗去脐带中残留的血液；
(2)用手术剪将脐带剪成长度为5cm的节段，用镊子撕开脐带，找出并剔除脐带中的静脉血管和动脉血管，分离华通氏胶并用生理盐水充分洗涤华通氏胶；
(3)用无菌手术刀将华通氏胶切成长条(2mm宽，5cm长)，把切好的华通氏胶长条放入Helios UltraGRO细胞培养补充剂中孵育4小时；
(4)孵育好的华通氏胶长条用生理盐水洗3次，剪成长和宽均为2mm的小块；
(5)细胞培养皿预先用20μg/mL弹性蛋白原(tropoelastin,TE)包被处理，4℃放置过夜，将剪好的华通氏胶小块接种于包被好的细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞；
(6)在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图5)。
对照组脐带间充质干细胞原代培养方法：常规组织贴壁培养法(常规组)、单独使用弹性蛋白原的织贴壁培养法(弹性蛋白原组)、单独使用Helios UltraGRO细胞培养补充剂的织贴壁培养法(补充剂组)。
(1)获取新生儿脐带，取组织保存液进行无菌和支原体检测后，用生理盐水清洗多次直至洗去脐带中残留的血液；
(2)用手术剪将脐带剪成长度为5cm的节段，用镊子撕开脐带，找出并剔除脐带中的静脉血管和动脉血管，分离华通氏胶并用生理盐水充分洗涤华通氏胶；
(3)常规组：用无菌剪刀将洗涤后的华通氏胶剪成长和宽均为2mm的小块，将剪好的华通氏胶小块接种于细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞，在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图5)；
(4)弹性蛋白原组：细胞培养皿预先用20μg/mL弹性蛋白原(tropoelastin,TE)包被处理，4℃放置过夜。用无菌剪刀将洗涤后的华通氏胶剪成长和宽均为2mm的小块，将剪好的华通氏胶小块接种于细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞，在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图5)；
(5)补充剂组：用无菌手术刀将华通氏胶切成长条(2mm宽，5cm长)，把切好的华通氏胶长条放入Helios UltraGRO细胞培养补充剂中孵育4小时后将孵育好的华通氏胶长条用生理盐水洗3次，剪成长和宽均为2mm的小块，将剪好的华通氏胶小块接种于细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞，在组织培养第14天时，去除组织块，进行原代细胞计数、原代细胞染色等操作(图5)。
如图5中，图5A分别为常规组，弹性蛋白原组，Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞克隆染色结果，结果显示实验组的原代细胞克隆数量显著多于其它各组；图5B分别为常规组，弹性蛋白原组，Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组以及实验组(即弹性蛋白原和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂联合使用组)的脐带华通氏胶贴壁培养14天时的原代细胞数的统计结果,结果显示实验组的原代细胞数量相对于常规组，弹性蛋白原组和Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂组分别提高了59.8％，43.3％和24.8％。
上述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。

Claims (7)

1.脐带间充质干细胞原代培养方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞原代培养方法使用Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂，并且原代细胞培养所用的细胞培养皿预先用弹性蛋白原包被处理。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞原代培养方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞原代培养方法中所述的Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂的使用方法如下：所述脐带间充质干细胞原代培养方法中华通氏胶切成长条后放入Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂中孵育4小时。
3.根据权利要求2所述的脐带间充质干细胞原代培养方法，其特征在于，所述使用的细胞培养皿预先用弹性蛋白原包被处理的方法如下：脐带间充质干细胞原代培养方法中细胞培养皿预先用20μg/mL弹性蛋白原包被处理，4℃放置过夜。
4.根据权利要求3所述的脐带间充质干细胞原代培养方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞原代培养方法中华通氏胶切成小块后接种于包被好的细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞。
5.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞原代培养方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞原代培养方法包含如下步骤：
步骤(1)获取新生儿脐带，取组织保存液进行无菌和支原体检测后，用生理盐水清洗多次直至洗去脐带中残留的血液；
步骤(2)将步骤(1)获得的脐带找出并剔除脐带中的静脉血管和动脉血管，分离华通氏胶并用生理盐水充分洗涤华通氏胶；
步骤(3)将华通氏胶切成长条，把切好的华通氏胶长条放入Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂中孵育4小时；
步骤(4)将步骤(3)中孵育过的华通氏胶长条用生理盐水洗3次，剪成小块(长宽均为2mm)；
步骤(5)细胞培养皿预先用20μg/mL弹性蛋白原包被处理，4℃放置过夜，将步骤(4)中的华通氏胶小块接种于包被好的细胞培养皿中，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞；
步骤(6)组织培养获得原代脐带间充质干细胞。
6.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞原代培养方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞原代培养方法中使用的培养基为MEMα完全培养基，所述MEMα完全培养基制备方法为：MEMα基础培养基(体积百分比为95％)，Helios UltraGRO间充质干细胞培养补充剂(体积百分比为5％)，配置完成后再添加肝素使其浓度达到2IU/mL。
7.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞原代培养方法，其特征在于，所述的脐带间充质干细胞原代培养方法中原代细胞计数采用血球计数板计数法、原代细胞染色采用结晶紫染色液染色。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101163496A (zh) * 2005-02-25 2008-04-16 犹他大学研究基金会 促进内皮细胞的粘附或迁移的弹性蛋白原
CN105524877A (zh) * 2014-09-29 2016-04-27 四川新生命干细胞科技股份有限公司 一种脐带间充质干细胞的分离方法
CN105970300A (zh) * 2016-05-11 2016-09-28 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法
CN107189982A (zh) * 2017-06-12 2017-09-22 北京焕生汇生物技术研究院 一种人脐带间充质干细胞的培养方法
CN109652368A (zh) * 2019-01-31 2019-04-19 和携科技(北京)有限公司 从脐带组织中获取原代间充质干细胞的方法
CN110804585A (zh) * 2019-11-19 2020-02-18 武汉济源高科技有限公司 一种脐带间充质干细胞的分离方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101163496A (zh) * 2005-02-25 2008-04-16 犹他大学研究基金会 促进内皮细胞的粘附或迁移的弹性蛋白原
CN105524877A (zh) * 2014-09-29 2016-04-27 四川新生命干细胞科技股份有限公司 一种脐带间充质干细胞的分离方法
CN105970300A (zh) * 2016-05-11 2016-09-28 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法
CN107189982A (zh) * 2017-06-12 2017-09-22 北京焕生汇生物技术研究院 一种人脐带间充质干细胞的培养方法
CN109652368A (zh) * 2019-01-31 2019-04-19 和携科技(北京)有限公司 从脐带组织中获取原代间充质干细胞的方法
CN110804585A (zh) * 2019-11-19 2020-02-18 武汉济源高科技有限公司 一种脐带间充质干细胞的分离方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTÓNIO M DE SOURE: "Integrated culture platform based on a human platelet lysate supplement for the isolation and scalable manufacturing of umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem/stromal cells", vol. 11, no. 5, pages 1630 - 1640 *
GISELLE C. YEO等: "Soluble matrix protein is a potent modulator of mesenchymal stem cell performance", PNAS, vol. 116, no. 6, pages 2042 - 2051, XP055582602, DOI: 10.1073/pnas.1812951116 *
屈玟;宋磊;赵瑶;胡振波;: "人脐带间充质干细胞不同培养方案的比较与优化", vol. 23, no. 08, pages 1009 - 1013 *

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