CN109486754A - 人脐带间充质干细胞在制备脑瘫药物中的应用及培养方法 - Google Patents

人脐带间充质干细胞在制备脑瘫药物中的应用及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种人脐带间充质干细胞在制备脑瘫药物中的应用及培养方法，通过对人脐带分离得到的华通氏胶体进行培养，得到细胞克隆团，随后对所得细胞克隆团进行胰蛋白酶消化得到P0代细胞，将P0代细胞传代培养至P4代，通过对P4代细胞表面抗原鉴定筛选得到合格的人脐带间充质干细胞。人脐带间充质干细胞组织融合性好，免疫原性弱，其迁徙能力强，在体内外扩增迅速，具有多向分化潜能，能向神经细胞方向分化，所以能够应用于制备作为治疗儿童脑瘫疾病药物中。本发明所述方法简单、安全、创伤小、患者依从性好，并且本发明建立了治疗儿童脑性瘫痪的人脐带间充质干细胞制备及临床应用标准和操作规程，安全有效，具有良好的应用前景。

Description

人脐带间充质干细胞在制备脑瘫药物中的应用及培养方法
技术领域
本发明属于干细胞培养和应用技术领域，具体涉及人脐带间充质干细胞在制 备脑瘫药物中的应用及培养方法。
背景技术
儿童脑性瘫痪(Cerebral Palsy，CP)指从出生前到生后1年内，各种原因 引起的非进行性脑损伤所致的中枢性运动功能障碍及姿势异常，常伴有智力低 下、语言障碍、癫痫、听力低下、视觉异常等，临床尚无任何有效的治疗手段。 该疾病病因较为复杂，其主要病因是早产、产伤、围产期窒息及核黄疸等造成 新生儿脑组织缺血缺氧。
传统的治疗方法以支持治疗为主，临床上通常采用传统的脑瘫治疗方法， 如康复训练、高压氧、神经营养药物、细胞因子、针灸治疗等，这些治疗手段 对于损伤程度相对较轻的神经细胞有一定的效果，但对于年龄大于3岁的儿童 和/或对于损伤较重的神经细胞，则收效甚微，其关键就在于所有的治疗方式中 均没有针对性的对脑病变本身的神经修复和/或干预方案。如何及尽快的使脑瘫 儿童损伤的功能得到恢复成为其日后独立和融入社会的关键因素。因此，开发 新的有效治疗策略尤为迫切。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了人脐带间充质干细胞在 制备脑瘫药物中的应用及培养方法。人脐带间充质干细胞是一种更原始的间充 质干细胞群，是来自中胚层的早期细胞，组织融合性好，免疫原性弱；同时， 其迁徙能力强，在体内外扩增迅速，具有多向分化潜能，能向神经细胞方向分 化。这些优点使其能作为细胞移植的供体对损伤的细胞和组织进行替代、修复 的同时还可以避免组织配型及免疫排斥等问题，具有很好的优势。
本发明所采用的技术方案为：
(1)将人脐带经冲洗后置于脐带保存液中，恒温保存；
(2)从步骤(1)所述人脐带中分离得到华通氏胶体，之后将所述华通氏 胶体剪成组织匀浆块，加入培养基中进行培养，得到细胞克隆团；
(3)将所述细胞克隆团用胰蛋白酶进行消化，得到P0代细胞；
(4)将所述P0代细胞进行传代培养，传至P4代时进行收获并冻存；
(5)对所述P4代细胞进行细胞表面抗原鉴定，筛选得到合格P4代细胞， 即为所述人脐带间充质干细胞。
进一步的，步骤(1)中，所述人脐带取用的是无感染性疾病产妇胎儿娩出 后结扎的人脐带；冲洗人脐带用的是经消毒后的PBS溶液。
进一步的，步骤(1)中，所述人脐带保存液为含900-1100U/mL庆大霉素 的PBS溶液；所述恒温保存温度为2～8℃。
进一步的，步骤(2)中，所述组织匀浆块体积为1-4mm3。
进一步的，步骤(2)中，所述培养基为人脐带间充质干细胞无血清培养基， 培养条件为3％-7％二氧化碳、36-38℃恒温、湿度90％-100％。
进一步的，步骤(3)中，所述细胞克隆团生长到培养瓶瓶壁面积的70％ -90％时进行消化。
进一步的，步骤(3)中，添加胰蛋白酶的原始浓度为0.2％-0.3％，含有细 胞克隆团的培养基与添加胰蛋白酶的体积比为1:(5-7)，消化时间为1-3min。
进一步的，步骤(4)中，所述传代培养采用的培养基为人脐带间充质干细 胞无血清培养基，培养条件为3％-7％二氧化碳、36-38℃恒温、湿度90％-100％。
进一步的，步骤(4)中，对所述P4代细胞的冻存为程序性降温冻存；冻 存温度为零下75-零下85℃。
进一步的，步骤(5)中，所述细胞表面抗原合格标准为：CD90、CD29、 CD73、CD105表达均大于95％-97％，CD45、CD34、CD79a/CD19、CD14、 HLA-DR表达均小于1％-2％。
进一步的，人脐带间充质干细胞在制备作为治疗儿童脑瘫药物中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明所述治疗儿童脑性瘫痪的人脐带间充质干细胞的培养方法，通过对 人脐带分离得到的华通氏胶体进行培养，得到细胞克隆团，随后对所得细胞克 隆团进行胰蛋白酶消化得到P0代细胞，将P0代细胞传代培养至P4代，通过对 P4代细胞表面抗原鉴定筛选得到合格的人脐带间充质干细胞。其中细胞表面抗 原鉴定筛选标准高于国际细胞治疗协会(ISCT)的标准，保证了输注于人体内 的人脐带间充质干细胞的安全性和有效性。本发明所述方法简单、安全、创伤 小，患者依从性好，单次输入的细胞量较大，并且本发明建立了治疗儿童脑性 瘫痪的人脐带间充质干细胞制备标准操作规程，安全有效，具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例3所述人脐带间充质干细胞治疗儿童脑性瘫痪3、6、 12和24个月后的GMFM-88量表总分百分率变化结果；
图2是本发明实施例3所述人脐带间充质干细胞治疗儿童脑性瘫痪3、6、 12和24个月后的GMFM-88量表“躺及翻身”功能区评分百分率变化结果；
图3是本发明实施例3所述人脐带间充质干细胞治疗儿童脑性瘫痪3、6、 12和24个月后的GMFM-88量表“坐”功能区评分百分率变化结果；
图4是本发明实施例3所述人脐带间充质干细胞治疗儿童脑性瘫痪3、6、 12和24个月后的GMFM-88量表“爬”功能区评分百分率变化结果；
图5是本发明实施例3所述人脐带间充质干细胞治疗儿童脑性瘫痪3、6、 12和24个月后的GMFM-88量表“站”功能区评分百分率变化结果；
图6是本发明实施例3所述人脐带间充质干细胞治疗儿童脑性瘫痪3、6、 12和24个月后的GMFM-88量表“走、跑、跳”功能区评分百分率变化结果；
图7是本发明实施例3所述人脐带间充质干细胞治疗儿童脑性瘫痪3、6、 12和24个月后的CFA量表总分变化结果；
图8是本发明实施例3所述人脐带间充质干细胞治疗儿童脑性瘫痪3、6、 12和24个月后的CFA量表认知能力功能区评分变化结果；
图9是本发明实施例3所述人脐带间充质干细胞治疗儿童脑性瘫痪3、6、 12和24个月后的CFA量表语言能力功能区评分变化结果；
图10是本发明实施例3所述人脐带间充质干细胞治疗儿童脑性瘫痪3、6、 12和24个月后的CFA量表粗大运动功能区评分变化结果；
图11是本发明实施例3所述人脐带间充质干细胞治疗儿童脑性瘫痪3、6、 12和24个月后的CFA量表自理能力功能区评分变化结果；
图12是本发明实施例3所述人脐带间充质干细胞治疗儿童脑性瘫痪3、6、 12和24个月后的CFA量表社会适应能力功能区评分变化结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方 案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而 不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出 创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例提供了人脐带间充质干细胞在制备脑瘫药物中的应用及培养方 法，具体处理方法包括以下步骤：
(1)取用无感染性疾病产妇胎儿娩出后结扎的人脐带，经消毒后的PBS 溶液冲洗后置于含900U/mL庆大霉素的PBS溶液中，2℃恒温保存；
(2)将所述人脐带分离后得到的华通氏胶体剪成1-4mm3组织匀浆块，加 入人脐带间充质干细胞无血清培养基中进行培养，培养条件为3％二氧化碳、 36℃恒温、湿度90％，得到细胞克隆团；
(3)所述细胞克隆团生长到面积占培养瓶瓶壁面积的70％时，用浓度为 0.2％的胰蛋白酶进行消化1min，含有细胞克隆团的培养基与胰蛋白酶的体积比 为1:5，得到P0代细胞；
(4)将所述P0代细胞进行传代培养，采用的培养基为人脐带间充质干细 胞无血清培养基，培养条件为3％二氧化碳、36℃恒温、湿度90％，传至P4代 时进行收获并进行程序性降温冻存，冻存温度为75℃；
(5)对所述P4代细胞表面抗原鉴定，合格标准为CD90、CD29、CD73、 CD105表达均大于95％，CD45、CD34、CD79a/CD19、CD14、HLA-DR表达 均小于1％，筛选得到合格P4代细胞；
(6)输注前将P4代细胞进行35℃水浴复苏，抽样留取细胞培养上清液用 作放行检验，包括对细菌、真菌、支原体和内毒素的测定，筛选得到检验合格 的P4代细胞；
(7)用浓度为0.2％的胰蛋白酶对所述检验合格的P4代细胞进行消化1min， 常温下450rpm离心4min，经消毒后的PBS溶液洗涤3次，加入生理盐水进行 稀释，人脐带间充质干细胞中残留细胞培养液小于0.3％，得到处理后的人脐带 间充质干细胞；
(8)对脑瘫患儿进行静脉滴注，每次输注细胞数量为2*107个，输注总量 为2*108个干细胞。
实施例2
本实施例提供了人脐带间充质干细胞在制备脑瘫药物中的应用及培养方 法，具体处理方法包括以下步骤：
(1)取用无感染性疾病产妇胎儿娩出后结扎的人脐带，经消毒后的PBS 溶液冲洗后置于含1100U/mL庆大霉素的PBS溶液中，8℃恒温保存；
(2)将所述人脐带分离后得到的华通氏胶体剪成4mm3组织匀浆块，加入 人脐带间充质干细胞无血清培养基中进行培养，培养条件为7％二氧化碳、38℃ 恒温、湿度100％，得到细胞克隆团；
(3)所述细胞克隆团生长到面积占培养瓶瓶壁面积的90％时用浓度为 0.3％的胰蛋白酶进行消化3min，含有细胞克隆团的培养基与胰蛋白酶的体积比 为1:7，得到P0代细胞；
(4)将所述P0代细胞进行传代培养，采用的培养基为人脐带间充质干细 胞无血清培养基，培养条件为7％二氧化碳、38℃恒温、湿度100％，传至P4代时进行收获并进行程序性降温冻存，冻存温度为85℃；
(5)对所述P4代细胞进行细胞表面抗原鉴定，合格标准为CD90、CD29、 CD73、CD105表达均大于97％，CD45、CD34、CD79a/CD19、CD14、HLA-DR 表达均小于2％，筛选得到合格P4代细胞；
(6)输注前将P4代细胞进行45℃水浴复苏，抽样留取细胞培养上清液用 作放行检验，包括对细菌、真菌、支原体和内毒素的测定，筛选得到检验合格 的P4代细胞；
(7)用浓度为0.3％的胰蛋白酶对所述检验合格的P4代细胞进行消化3min， 常温下550rpm离心6min，经消毒后的PBS溶液洗涤5次，加入生理盐水进行 稀释，人脐带间充质干细胞中残留细胞培养液小于0.5％，得到处理后的所述人 脐带间充质干细胞；
(8)对脑瘫患儿进行静脉输注，每次输注细胞数量为5*107个，输注总量 为3*108个干细胞。
实施例3
本实施例提供了人脐带间充质干细胞在制备脑瘫药物中的应用及培养方 法，具体处理方法包括以下步骤：
(1)取用无感染性疾病产妇胎儿娩出后结扎的人脐带，经消毒后的PBS 溶液冲洗后置于含1000U/mL庆大霉素的PBS溶液中，6℃恒温保存；
(2)将所述人脐带分离后得到的华通氏胶体剪成2mm3组织匀浆块，加入 人脐带间充质干细胞无血清培养基中进行培养，培养条件为5％二氧化碳、37℃ 恒温、湿度95％，得到细胞克隆团；
(3)所述细胞克隆团生长到面积占培养瓶瓶壁面积的80％时用浓度为 0.25％的胰蛋白酶进行消化2min，含有细胞克隆团的培养基与胰蛋白酶的体积 比为1:6，得到P0代细胞；
(4)将所述P0代细胞进行传代培养，采用的培养基为人脐带间充质干细 胞无血清培养基，培养条件为5％二氧化碳、37℃恒温、湿度95％，传至P4代 时进行收获并进行程序性降温冻存，冻存温度为80℃；
(5)对所述P4代细胞进行细胞表面抗原鉴定，合格标准为CD90、CD29、 CD73、CD105表达均大于96％，CD45、CD34、CD79a/CD19、CD14、HLA-DR 表达均小于1.5％，筛选得到合格P4代细胞；
(6)输注前将P4代细胞进行40℃水浴复苏，抽样留取细胞培养上清液用 作放行检验，包括对细菌、真菌、支原体和内毒素的测定，筛选得到检验合格 的P4代细胞；
(7)用浓度为0.25％的胰蛋白酶对所述检验合格的P4代细胞进行消化 2min，常温下500rpm离心5min，经消毒后的PBS溶液洗涤4次，加入生理盐 水进行稀释，人脐带间充质干细胞中残留细胞培养液小于0.4％，得到处理后的 所述人脐带间充质干细胞；
(8)对脑瘫患儿进行静脉滴注，每次输注细胞数量为3*107个，输注总量 为2.5*108个干细胞。
图1显示hUC-MSC(人脐带间充质干细胞)输注组与对照组在治疗后3、 6、12、24个月相比，GMFM-88评分得到更显著的提高并达到统计学意义， 表明人脐带间充质干细胞输注联合基本康复疗法可使患儿的粗大运动功能比单 纯康复疗法能得到更明显改善。
图2-图6为GMFM-88的5个功能区评分情况，可以看到hUC-MSC输注 组治疗后3个月各功能区功能显示出明显改善，在治疗后24个月与对照组水平 相比均得到不同程度的提高，其中D区-站和E区-走、跑和跳基线分值较低， 经过移植治疗后提升幅度较大。
图7显示hUC-MSC输注组与对照组在治疗后3、6、12、24个月相比，CFA 总评分得到更显著的提高并达到统计学意义，表明人脐带间充质干细胞输注联 合基本康复疗法可使患儿的综合功能比单纯康复疗法能得到更明显改善。
图8-图12显示hUC-MSC输注组在移植治疗后3个月各功能区功能显示出 改善效果，治疗后24个月与对照组水平相比均得到不同程度的提高，其中认知 功能、自理动作及社会适应能力提升幅度较大。
实验例
1、病例入选标准：
(1)临床诊断符合脑性瘫痪诊断标准；
(2)患儿年龄3-12周岁以内；
(3)接受治疗前的15天内没有癫痫的大发作，24小时内没有癫痫发作；
(4)能够配合检查和治疗过程，患者能完成能力评估和评分；
(5)法定监护人和/或患者签署知情同意书。
2、病例排除标准：
(1)有严重过敏反应史或对2种及2种以上的食物、药物过敏；
(2)合并以下任一情况：免疫系统疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病或 有严重的心肝肾等器官功能障碍者；
(3)肿瘤患者；
(4)存在严重的感染性疾患未被控制者或进行操作部位存在局部感染；
(5)凝血功能障碍性疾病患者；
(6)血清病原学检测阳性者，包括艾滋病病毒、梅毒抗体、肝炎标志物5 项、TORCH5项；
(7)先天性心脏病患者；
(8)任何其他研究者认为不适合参加该研究的情况。
3、实验方案：选取脑性瘫痪儿童68例，脱落3例，其余65例完成所有随 访评估，其中男童51例，女童14例，平均年龄(7.6±0.7)岁，入选患儿随机 分为hUC-MSC输注组和对照组：hUC-MSC输注组33例，对照组32例，组间 人口学资料并无统计学差异。hUC-MSC输注组给予人脐带间充质干细胞悬液 治疗及现代康复疗法治疗，对照组给予生理盐水安慰剂及现代康复疗法治疗。
(1)hUC-MSC输注组：经静脉滴注，每次滴注含有5.0×107个人脐带间 充质干细胞悬液50mL，15min内完成，每七天滴注一次，28天为一疗程，疗 程之间间隔3个月，连续进行2个疗程的治疗；
(2)对照组：经静脉滴注，每次滴注50mL生理盐水，15min内完成，每 七天滴注一次，28天为一疗程，疗程之间间隔3个月，连续进行2个疗程的治 疗；
(3)现代康复疗法：由专业的脑瘫康复训练师应用现代康复治疗(Bobath 疗法+引导式教育治疗法)为基础治疗。每日2次，每次1小时，连续3个月为 一个疗程，连续2个疗程。Bobath疗法即神经发育学治疗法，主要采用抑制异 常姿势、促进正常姿势的方法治疗脑瘫，疗效得到国际公认，由康复训练师按 照标准操作流程完成。引导式教育疗法即Peto法，是一种国际公认的治疗儿童 脑瘫的有效方法，由康复训练师按照标准操作流程完成。
4、疗效评价与总结：
(1)疗效评价指标：分为对患儿的肢体运动功能评价和对脑瘫患儿综合功 能评价，对患儿的肢体运动功能评价使用粗大运动功能测量量表(GMFM)， 对脑瘫患儿综合功能评价使用残疾儿童综合功能评定评分量表(CFA)；
GMFM：粗大运动功能测量量表，是一种常用于评估脑瘫儿童粗大运动功 能变化的临床测量方法，是目前脑瘫患儿粗大运动评估中使用最广泛的量表， 分A-E共5个功能区，共88项评估内容。
CFA：残疾儿童综合功能评定评分，分为五个功能分区，分别对患儿的认 知功能、运动功能、语言功能、自理动作以及社会适应能力进行评定，每个功 能分区含10项评估内容；
(2)以上疗效量表评估由2名康复医师完成以避免主观因素对疗效量表评 估的干扰；
(3)疗效评价结果：hUC-MSC输注组与对照组在治疗后3、6、12、24 个月相比，GMFM-88评分和CFA评分得到显著的提高并达到统计学意义(分 别如图1和图3所示)，表明人脐带间充质干细胞输注联合基本康复疗法可使 患儿的粗大运动功能和综合功能比单纯康复疗法能得到更明显改善，其中D区 -站、E区-走、跑、跳、认知功能、自理动作和社会适应能力提升幅度较大(见 图2和图4)。也证实了人脐带间充质干细胞移植联合现代康复疗法治疗儿童 脑瘫是安全的，并且对粗大运动功能以及综合功能的改善程度显著优于单纯的 现代康复疗法的疗效。
表1是实施例3所述人脐带间充质干细胞治疗儿童脑性瘫痪研究中细胞输 注组和对照组患儿的人口学资料。
表2是实施例3所述人脐带间充质干细胞治疗儿童脑性瘫痪的研究过程中 发生的不良事件结果。
表1人脐带间充质干细胞输注组和对照组患儿的人口学资料
对表1中数据进行分析，入选患儿随机分为hUC-MSC输注组33例和对照 组32例，组间人口学资料并无统计学差异。
表2研究过程中发生的不良事件结果
从表2可以看出hUC-MSC输注组与对照组之间的不良事件发生率并无统 计学差异，并且不良事件程度较轻，hUC-MSC输注组报告25例不良事件里面 只有2例达到中度，其余23例为轻度；而对照组报告的23例中达到中度的3 例，其余20例均为轻度，组间并无统计学差异；发生率相对较高的有上呼吸道 感染和腹泻，但判断与脐带间充质干细胞无明确相关性，并且所有不良事件并 没有导致患儿退出研究，整个治疗过程中并未发生严重不良事件。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到 变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应 以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将人脐带经冲洗后置于脐带保存液中，恒温保存；
(2)从步骤(1)所述人脐带中分离得到华通氏胶体，之后将所述华通氏胶体剪成组织匀浆块，加入培养基中进行培养，得到细胞克隆团；
(3)将所述细胞克隆团用胰蛋白酶进行消化，得到P0代细胞；
(4)将所述P0代细胞进行传代培养，传至P4代时进行收获并冻存；
(5)对所述P4代细胞进行细胞表面抗原鉴定，筛选得到合格P4代细胞，即为所述人脐带间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述人脐带取用的是无感染性疾病产妇胎儿娩出后结扎的人脐带；冲洗人脐带用的是经消毒后的PBS溶液。
3.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述人脐带保存液为含900-1100U/mL庆大霉素的PBS溶液；所述恒温保存温度为2～8℃。
4.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述组织匀浆块体积为1-4mm3；所述培养基为人脐带间充质干细胞无血清培养基，培养条件为3％-7％二氧化碳、36-38℃恒温、湿度90％-100％。
5.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(3)中，所述细胞克隆团生长到培养瓶瓶壁面积的70％-90％时进行消化。
6.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(3)中，添加胰蛋白酶的原始浓度为0.2％-0.3％，含有细胞克隆团的培养基与添加胰蛋白酶的体积比为1:(5-7)，消化时间为1-3min。
7.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述传代培养采用的培养基为人脐带间充质干细胞无血清培养基，培养条件为3％-7％二氧化碳、36-38℃恒温、湿度90％-100％。
8.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(4)中，对所述P4代细胞的冻存为程序性降温冻存；冻存温度为零下75-零下85℃。
9.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(5)中，所述细胞表面抗原鉴定合格标准为：CD90、CD29、CD73、CD105表达均大于95％-97％，CD45、CD34、CD79a/CD19、CD14、HLA-DR表达均小于1％-2％。
10.根据权利要求1-9任一项所述方法制备得到的人脐带间充质干细胞在制备和治疗儿童脑瘫药物中的应用。
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