CN114767715A - 一种双功能杂多酸类促排剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物促排技术领域,具体涉及一种双功能杂多酸类促排剂,用于核素促排和ROS清除,所述双功能杂多酸类促排剂包括磷钨杂多酸盐。本发明采用了新的磷钨杂多酸盐分子促排剂,有着优异的生物相容性、生物毒性温和且对铀酰具有良好的促排效果和离子选择性,与ZnNa3‑DTPA相比,可显著提高肾脏和骨骼中铀的促排率;去除铀的同时还可以有效地降低由放射性核素引起的生物体内ROS水平升高,成功拓展出一类崭新且高效的放射性核素促排剂,对核能的安全高效发展和核安全应急具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明属于生物促排技术领域,具体涉及一种双功能杂多酸类促排剂。
背景技术
核事故和核泄漏有可能造成核(乏)燃料中关键锕系元素铀等的环境污染,并可能导致人员进一步的体内污染。进入人体24小时后,大约三分之一的铀以六价铀酰离子(UO2 2 +)的形式积累在肾脏和骨骼中,与蛋白质或骨骼中的羟磷灰石钙(HAP)形成稳定复合物难以从体内排出。此外,铀的内暴露会刺激细胞产生高水平的超氧自由基(·O2 -)、H2O2和羟基自由基(·OH),从而诱导细胞的氧化应激以及酶的失活和膜功能障碍。因此,铀的体内污染会导致DNA损伤、急慢性肾损伤和骨肉瘤等。锕系元素促排剂和ROS(自由基)清除剂可以从目标组织中去除锕系元素并降低细胞中的ROS水平,解决铀内污染并减轻氧化应激引起的损伤。在过去的几十年中,研究人员致力于寻找高效率和低毒性的锕系元素促排剂,现有的促排剂分为以下几种:
羧酸类配体:二乙基三胺五乙酸(DTPA)作为锕系元素钚、镅等锕系元素的促排剂已获批用于临床,但其对铀几乎没有促排效果,口服效果也差,而且副作用较大,离子选择性较差;
碳酸氢钠:在有效剂量范围内,会破坏生物体内的酸碱平衡,诱发碱中毒;
磷酸类配体:生物毒性大,且临床研究很少;
铁载体类配体:邻苯二酚(CAM)和对苯二酚酰胺(TAM)在低摩尔比条件下口服和延迟给药能力有限,且肾毒性明显,严重时会造成长期肾脏损害;羟基吡啶酮类配体可高效去除肾脏中的铀,但骨骼铀促排率不佳,体内代谢快,生物利用度低。
综上,现有促排剂毒性大、选择性差、肾脏和骨骼促排能力有限,且小分子药物还存在细胞膜透性差、代谢快、药物多次摄入等局限性。此外,以上促排剂重点关注促排率的提升,忽略了核素内照射引起氧化应激导致细胞内ROS水平升高,进而产生细胞凋亡和组织损伤的情况。目前,关于双功能核素促排剂的研究十分有限且效果有待提升。因此,急需探索新型低毒高效的双功能核素促排剂保障国家公共卫生安全。
发明内容
本发明旨在解决上述问题,提供了一种双功能杂多酸类促排剂,所采用的多金属氧酸盐具有优异的生物相容性、生物毒性温和且对铀酰具有良好的促排效果和离子选择性。
按照本发明的技术方案,所述双功能杂多酸类促排剂,用于核素促排和ROS清除,所述核素选自镧系元素、锕系元素和重金属元素中的一种或多种,所述双功能杂多酸类促排剂包括磷钨杂多酸盐。
目前认为螯合治疗是去除体内核素(锕系元素)的最佳有效治疗方法,该疗法以配位化学为基础选取离子络合剂,在体内选择性地与重金属离子形成稳定的络合物,然后通过尿液加速排出血液和组织中的金属毒物。同时,多金属氧酸盐(POMs)材料具有多方面的优势:(1)六个暴露的活性氧位点满足了铀酰的配位模式;(2)水溶性好;(3)生物活性和生物相容性高。因此在体内对放射性离子表现出了极强的络合能力和极高的选择性。
进一步的,所述锕系元素选自U、Th、Np、Pu或Am。
进一步的,所述磷钨杂多酸盐为PW9杂多酸盐。
进一步的,所述PW9杂多酸盐为α-PW9杂多酸盐。
具体的,所述α-PW9杂多酸盐的化学式为Na9[α-PW9O34]·7H2O。
进一步的,所述磷钨杂多酸盐的制备方法,包括以下步骤,
S1:将钨酸盐溶解在水中,加入磷酸;
S2:加入冰醋酸,得到白色沉淀物即为所述多金属氧酸盐。
进一步的,所述钨酸盐为钨酸钠和/或钨酸钾,优选为钨酸钠二水合物。
进一步的,所述磷酸和冰醋酸的加入方式均为搅拌条件下滴加。
进一步的,所述步骤S1中,钨酸盐和磷酸的摩尔比为3-10:1;优选为6:1。
进一步的,所述步骤S1中,加入磷酸后所得混合溶液呈碱性;优选的pH为8.9-9.0,所得产物为PW9杂多酸盐。
进一步的,所述钨酸盐和冰醋酸的摩尔比为9:7-12,优选为9:10。
进一步的,所述步骤S2中,加入冰醋酸后,继续搅拌0.5-3h。
进一步的,所述步骤S2中,加入冰醋酸后,溶液的最终pH为7.5±0.3。
具体的,多金属氧酸盐的制备方法可以如下:在磁力搅拌下将钨酸钠二水合物在水中搅拌直到固体完全溶解,在不停搅拌下逐滴加入磷酸(85%);加完磷酸后,pH为8.9-9.0;在剧烈搅拌下滴加冰醋酸,在添加过程中大量白色沉淀物形成,溶液的最终的pH为7.5±0.3,继续搅拌0.5-3h,收集沉淀并抽滤干燥得到所述多金属氧酸盐。
本发明的第二方面提供了磷钨杂多酸盐在核素促排中的应用,所述核素选自镧系元素、锕系元素和重金属元素中的一种或多种;具体的,可以为磷钨杂多酸盐在制备核素促排剂中的应用。
进一步的,所述磷钨杂多酸盐为PW9杂多酸盐。
进一步的,所述锕系元素为U、Th、Np、Pu或Am;镧系元素为Eu、Ce或Gd;所述重金属元素为Pb或Hg。
本发明的有益效果在于:采用了新的磷钨杂多酸盐分子促排剂,有着优异的生物相容性、生物毒性温和且对铀酰具有良好的促排效果和离子选择性,与ZnNa3-DTPA相比,可显著提高肾脏和骨骼中铀的促排率;去除铀的同时还可以有效地降低由放射性核素引起的生物体内氧化应激升高的ROS,成功拓展出一类崭新且高效的放射性核素促排剂,对核能的安全高效发展和核安全应急具有重要的现实意义。
附图说明
图1为实施例1所得POMs的结构示意图。
图2为实施例1所得POMs的热重分析(左)及红外光谱(右)图。
图3为实施例1所得POMs的生物溶血实验。
图4为检测实施例1中POMs与铀酰的配位模式图。
图5为检测实施例1所得UO2-PW9的红外光谱(左)和粉末X射线衍射(右)图。
图6为POMs在不同pH下的离子选择性。
图7为不同配体的细胞流式图。
图8为不同配体的激光扫描共聚焦成像图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1:多金属氧酸盐(POMs)的制备及表征
在磁力搅拌下将120g(0.36mol)钨酸钠二水合物Na2WO4·2H2O与150mL水在300mL的烧杯中搅拌直到固体完全溶解。磷酸(85%)在不停搅拌下逐滴加入(4.0mL,0.06mol)。加完酸后,溶液的pH为8.9-9.0。在剧烈搅拌下滴加冰醋酸(22.5mL,0.40mol),在添加过程中大量白色沉淀物形成。溶液的最终的pH为7.5±0.3。继续搅拌1h,收集沉淀并抽滤干燥,得到POMs(α-PW9杂多酸盐),产物的产量是90g(85-90%),结构如图1所示,红外光谱和热重分析如图2所示。
生物相容性实验如图3所示,从左向右,依次为去离子水、PBS和六种浓度的POMs,具体数据如表1所示:
表1:不同浓度POMs的溶血率
实施例2:多金属氧酸盐(POMs)的制备
在磁力搅拌下将0.36mol钨酸钾与150mL水在300mL的烧杯中搅拌直到固体完全溶解,磷酸(85%)在不停搅拌下逐滴加入(8.0mL,0.12mol);在剧烈搅拌下滴加冰醋酸(15.75mL,0.28mol),在添加过程中大量白色沉淀物形成,继续搅拌0.5h,收集沉淀并抽滤干燥,得到POMs。
实施例3:多金属氧酸盐(POMs)的制备
在磁力搅拌下将0.36mol钨酸钠二水合物与150mL水在300mL的烧杯中搅拌直到固体完全溶解,磷酸(85%)在不停搅拌下逐滴加入(2.4mL,0.036mol);在剧烈搅拌下滴加冰醋酸(27mL,0.48mol),在添加过程中大量白色沉淀物形成,继续搅拌3h,收集沉淀并用抽滤干燥,得到POMs。
将实施例1所得POMs进行以下检测试验
检测实施例1:多金属氧酸盐配体与铀溶液配位模式和离子选择性
1)多金属氧酸盐与铀酰配位模式
将POMs(化学式为Na9[α-PW9O34]·7H2O,2.5g,0.1mmol)加入到含有UO2(NO3)2·6H2O(0.5g 0.1mmol)的100mL 0.2M NaCl溶液中连续搅拌,溶液变黄,证明固体分散均匀;随后搅拌溶液约1h,加入氯化钠(29.2g 0.5mmol),过滤去除多余沉淀,得到澄清的黄色溶液;在室温下缓慢蒸发两天后收集了UO2-PW9的晶体。POMs与铀酰的配位模式如图4所示;UO2-PW9的红外光谱如图5(左)所示(对比POMs和UO2(NO3)2·6H2O);UO2-PW9的粉末X射线衍射如图5(右)所示。
2)离子选择性
为了评价POMs对铀的选择性和亲和性,将初始浓度为5ppm的铀酰离子与50ppm的Mg2+、Zn2+、Co2+、Ni2+,Mn2+等金属离子混合,POMs在0.5g/L进行的吸附实验。共存溶液在pH=4和30℃条件下轻轻摇动(60rpm)24h。为了更好地模拟真实环境在HEPES缓冲液中加入0.5g/LPOMs,在2ppm的铀酰离子和32ppm的十六倍金属离子Mg2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Mn2+中加入POMs。结果如图6所示,其中铀酰的去除率为88%以上,其他金属干扰离子的去除率低于20%。在其他金属干扰离子浓度高于铀浓度的10倍以上的情况下,证明POMs材料仍然优先去除铀酰,表现出对铀酰的高选择性。
检测实施例2:POMs材料的毒性
1)短期细胞毒性实验
取对数生长期NRK细胞,用含10%Gibco胎牛血清的1640培养液调整细胞浓度为3×104个/mL,接种于无菌的96孔培养板中,分为空白组和染毒加药组。每组设6个平行孔,每孔100μL,置于37℃5%CO2培养箱中培养24h,待细胞贴壁生长后,弃去培养液,染毒加药组加入12.4μM UO2 2+和不同浓度的配体(15.6、31.3、62.5、125、250、500μg/mL)。加药后置于培养箱中继续培养48h后,实验终止后每孔加入10μL CCK-8,继续孵育1-2h,用酶标仪于570nm波长处测定每孔的光吸收值(OD)。按下式计算细胞的存活率。细胞存活率=(试验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%,结果如表2所示。最后选择一个比较合适的浓度作为下面实验的促排实验。
表2:铀酰和POMs材料的短期细胞综合毒性
2)克隆存活细胞实验
取对数生长期NRK细胞接种于6-well板中,细胞密度为1×105细胞,置于37℃在大气中5%的二氧化碳的条件下孵育24h。然后,染毒加药组加入12.4μM UO2 2+和不同浓度的配体(62.5、125、250、500、1000μg/mL)孵育48h。然后稀释至1×103/mL,取细胞悬液100μL接种于6孔板(每孔细胞数100个)中,加入培养基培养7d。然后,细胞中加入甲醇固定,用含0.5%结晶紫的溶液染色。手动计数大于50个细胞的细胞团,计算克隆率=细胞团数目/接种的细胞数目,结果如表3所示。
表3:铀酰和POMs材料的克隆存活细胞综合毒性
从表中数据可以看出,POMs材料和铀酰的综合毒性略高于ZnNa3-DTPA,基本在同一水平上,这说明该药物毒性与已商用的毒性相似。
检测实施例3:小鼠促排
15只30g左右的昆明雌鼠,随机分为3组,1个对照组和2个给药组,每组5只。在促排实验中,对照组和给药组小鼠分别尾静脉注射硝酸铀酰染毒,染毒剂量为0.50mg 238U/kg,给药方式分为三种:立即给药、延迟给药和预给药。对于立即和延迟给药,尾静脉染毒后立即腹腔注射给药和1h后尾静脉给药;对于预给药,先尾静脉给药,1h后进行尾静脉染毒。
POMs材料的注射剂量为100mg/kg,相应的ZnNa3-DTPA的剂量是100mg/kg,铀染毒对照组腹腔或尾静脉注射同体积生理盐水。将小鼠置于代谢笼中饲养,24h后麻醉处死,取肾和骨骼。将样品中加入浓硝酸/双氧水组成的消解液,置于消解仪上处理,采用ICP-MS测定各个样品中的铀含量,其结果如表4-6所示。
表4:POMs材料对铀酰立即给药的促排效果.
表5:POMs材料对铀酰延迟给药的促排效果
表6:POMs材料对铀酰预给药的促排效果
实验结果表明POMs材料对小鼠肾脏中和骨骼中的铀皆有去除效果,且三种给药方式对应不同的应急场景,其中预给药的方式效果最好,并且促排效率远远高于商用ZnNa3-DTPA药物。
检测实施例4:损伤修复
使用ROS探针2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)评估细胞水平上ROS的产生。将NRK-52E细胞以每孔8×104个细胞的密度接种在6孔板中,并在5%CO2的气氛中于37℃孵育24h。然后,对于立即给药组,除去培养基,并将细胞与UO2 2+和螯合剂(UO2 2+,PW9或ZnNa3-DTPA的浓度分别为98.2μg/mL和125μg/mL)一起孵育。对于对照组,将螯合剂替换为新鲜的DMEM-F12。孵育48h后,将细胞用含有DCFH-DA(10μM)的无血清培养基(SMF)培养30分钟,然后将细胞用SMF洗涤3次,完全去除未进入细胞的DCFH-DA。用流式细胞仪(FCM)量化细胞内ROS水平,POMs降低由铀酰引起的细胞体内ROS的效果如图7所示。
将NRK-52E细胞以每孔8×104个细胞的密度接种在共聚焦皿中,并在5%CO2的气氛中于37℃孵育24h。然后,对于立即给药组,除去培养基,并将细胞与UO2 2+和螯合剂(UO2 2+,PW9或ZnNa3-DTPA的浓度分别为98.2μg/mL和125μg/mL)一起孵育。对于对照组,将螯合剂替换为新鲜的DMEM-F12。孵育24h后,将细胞用含有FITC荧光染料(1μL)的无血清培养基(SMF)培养20分钟,然后将细胞用SMF洗涤3次,完全去除多余的FITC染料,之后再加入1mL的Hoechst荧光染料,然后将细胞用SMF洗涤3次,以完全去除多余的Hoechst荧光染料。并通过激光扫描共聚焦显微镜成像以可视化每组的ROS水平,POMs降低由铀酰引起的细胞体内ROS的共聚焦成像效果如图8所示。
综上所述,通过研究多金属氧酸盐材料与铀酰的体外络合竞争和配位模式,结果表明多金属氧酸盐具有对铀酰的选择性络合能力,并且在细胞水平评价了材料的生物相容性和细胞毒性,与临床药物ZnNa3-DTPA毒性相似。除此之外,通过流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜量化和可视化每组的ROS水平,证实多金属氧酸盐可以大大降低由铀酰引起的细胞内氧化应激导致的ROS急剧增加,具有优异的损伤修复能力。在生物个体水平上,材料在体内铀的促排效果上远高于商用的ZnNa3-DTPA,证明多金属氧酸盐促排剂在生物促排和损伤修复中具有良好的应用前景。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种双功能杂多酸类促排剂,其特征在于,用于核素促排和ROS清除,所述核素选自镧系元素、锕系元素和重金属元素中的一种或多种,所述双功能杂多酸类促排剂包括磷钨杂多酸盐。
2.根据权利要求1所述的双功能杂多酸类促排剂,其特征在于:所述锕系元素为U、Th、Np、Pu或Am;镧系元素为Eu、Ce或Gd;所述重金属元素为Pb或Hg。
3.如权利要求1所述的双功能杂多酸类促排剂,其特征在于,所述磷钨杂多酸盐为PW9杂多酸盐。
4.如权利要求3所述的双功能杂多酸类促排剂,其特征在于,所述PW9杂多酸盐为α-PW9杂多酸盐。
5.如权利要求1所述的双功能杂多酸类促排剂,其特征在于,所述磷钨杂多酸盐的制备方法,包括以下步骤,
S1:将钨酸盐溶解在水中,加入磷酸;
S2:加入冰醋酸,得到白色沉淀物即为所述多金属氧酸盐。
6.如权利要求5所述的双功能杂多酸类促排剂,其特征在于,所述钨酸盐为钨酸钠和/或钨酸钾。
7.如权利要求5或6所述的双功能杂多酸类促排剂,其特征在于,所述步骤S1中,钨酸盐和磷酸的摩尔比为3-10:1。
8.如权利要求5所述的双功能杂多酸类促排剂,其特征在于,所述步骤S1中,加入磷酸后所得混合溶液呈碱性。
9.磷钨杂多酸盐在核素促排中的应用,所述核素选自镧系元素、锕系元素和重金属元素中的一种或多种。
10.如权利要求9所述的应用,其特征在于,所述磷钨杂多酸盐为PW9杂多酸盐,所述锕系元素为U、Th、Np、Pu或Am;镧系元素为Eu、Ce或Gd;所述重金属元素为Pb或Hg。
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