CN108703968B

CN108703968B - 左旋千金藤啶碱用于抑制或治疗转移性乳腺癌的用途

Info

Publication number: CN108703968B
Application number: CN201810987173.5A
Authority: CN
Inventors: 周田彦; 卢炜; 杨亮
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2018-08-28
Filing date: 2018-08-28
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2038-08-28
Also published as: CN108703968A

Abstract

本发明涉及抑制或治疗乳腺癌转移的方案,制剂和用途，该方案包括使用有效量的左旋千金藤啶碱或其可药用的盐。本发明的治疗方案能显著抑制乳腺癌转移，降低乳腺癌转移的治疗成本和风险，且无明显毒副作用。

Description

左旋千金藤啶碱用于抑制或治疗转移性乳腺癌的用途

技术领域

本发明涉及左旋千金藤啶碱或其可药用的盐在抑制和治疗转移性乳腺癌中的用途。

背景技术

根据中国国家统计局数据，癌症(Cancer)是中国国民的主要死亡原因，是重大的公共卫生问题。乳腺癌是女性发病率最高的癌症，在2015年占到所有女性癌症新发病例的15％。乳腺癌的远端器官转移对患者存活率有着非常显著的影响，是引起乳腺癌患者死亡的主要原因。

转移性乳腺癌也称为IV期或晚期乳腺癌，根据癌症类型的不同，目前主要的疗法有激素疗法、化学疗法、靶向药物如曲妥珠单抗(赫赛汀)和帕妥珠单抗(Perjeta)、以及手术和放射治疗。但是转移性乳腺癌不能够被治愈，美国癌症协会(ACS)指出，对于患有4期乳腺癌的人，诊断后的5年平均生存率为22％。

左旋千金藤啶碱((-)-Stepholidine，SPD)属于四氢原小檗碱生物碱同类物的先导化合物，是从千金藤属植物中提取出来的。SPD被报道为多巴胺I型受体激动剂，同时也是多巴胺II型受体的拮抗剂，作为非麻醉性镇痛药物用于治疗血管性头痛、偏头痛等，也被报道具有抗精神分裂症、抗帕金森氏病的潜能。在目前已有的研究中，尚无任何证据表明SPD对转移性乳腺癌具有较好的抑制作用。

发明内容

本发明人在研究转移性乳腺癌的治疗过程中发现SPD或其可药用的盐对乳腺癌的肺转移具有良好的抑制效果，且无明显药物毒性。

SPD在肿瘤方面的应用十分有限，特别是在转移性乳腺癌中的应用未见报道。本发明人在研究初期，按照抗癌药研究的经典思路，先开展了体外细胞试验，结果显示SPD对转移性乳腺癌细胞有轻微杀伤作用(见实施例1)，较好地抑制转移性乳腺癌细胞在体外的迁移运动(见实施例2)和侵袭(见实施例3)。在动物体内试验过程中，研究了SPD在鼠源转移性乳腺癌细胞系4T1原位接种的移植瘤动物模型的抗肺转移作用，意外发现SPD对抗乳腺癌肺转移具有显著的抑制效果，且SPD无明显药物毒性(见实施例4)。

因此，本发明的一个目的是提供一种能抑制转移性乳腺癌肺转移且不产生明显毒副作用的治疗药物，包括有效量的左旋千金藤啶碱或其可药用的盐。

所述的可药用的盐是通过常规化学方法从母体化合物合成的，所述母体化合物包含碱性的或酸性的部分。通常，所述盐是比如通过这些化合物的游离酸或碱形式和化学当量的合适的碱或酸在水中或在有机溶剂或在水和有机溶剂的混合物中反应而制备的。通常，非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。酸加成盐的例子包含无机酸加成盐如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐，和有机酸加成盐如醋酸盐、三氟醋酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、安乃近和对甲苯磺酸盐。碱加成盐的例子包含无机盐如钠、钾、钙和铵盐，以及有机的碱金属盐如乙二胺、乙醇胺、N，N-二亚烃基乙醇胺、三乙醇胺和碱性的氨基酸盐。

本发明的另一目的是提供一种抗癌制剂，其包括左旋千金藤啶碱或其可药用的盐。进一步的，本发明提供的抗癌制剂还包括药学上的辅料。其中，所述的抗癌制剂包括片剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、微囊、微球、注射液、脂质体等，所述制剂为缓/控释制剂或不为缓/控释制剂。所述的药学上的辅料包括润滑剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、助溶剂等。

本发明的实现具有以下积极意义：

(1)通过SPD治疗转移性乳腺癌，可显著抑制乳腺癌肺转移，且无明显毒副作用；

(2)本发明所述的药物安全性良好，可在确保良好药效的条件下极大地降低患者的治疗风险。

附图说明

图1为SPD对人转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞存活率的影响结果图(n＝6)。MDA-MB-231细胞分别给予空白对照和不同浓度SPD时细胞存活率的变化曲线(以空白对照组为100％，单因素方差分析，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。

图2为SPD对鼠转移性乳腺癌4T1细胞存活率的影响结果图(n＝6)。4T1细胞分别给予空白对照和不同浓度SPD时细胞存活率的变化曲线(以空白对照组为100％，单因素方差分析，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。

图3为SPD对人转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响结果图(n＝3)。SCH23390(简称SCH)作为多巴胺受体D1亚型(dopamine receptor D1，DRD1)拮抗剂，可逆转SPD抑制乳腺癌细胞迁移的作用。乳腺癌细胞分别给与空白对照和不同浓度SPD(或加入拮抗剂SCH)时划痕愈合的照片和定量图(以空白对照组为100％，单因素方差分析，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。

图4为SPD对鼠转移性乳腺癌4T1细胞迁移能力的影响结果图(n＝3)。SCH23390作为DRD1拮抗剂，可逆转SPD抑制乳腺癌细胞迁移的作用。乳腺癌细胞分别给与空白对照和不同浓度SPD(或加入拮抗剂SCH)时划痕愈合的照片和定量图(以空白对照组为100％，单因素方差分析，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。

图5为SPD对人转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响结果图。SCH23390作为DRD1拮抗剂，可逆转SPD抑制乳腺癌细胞侵袭的作用。乳腺癌细胞分别给与空白对照和不同浓度SPD(或加入拮抗剂SCH)时通过基质胶细胞照片。

图6为SPD对鼠转移性乳腺癌4T1细胞侵袭能力的影响结果图。SCH23390作为DRD1拮抗剂，可逆转SPD抑制乳腺癌细胞侵袭的作用。乳腺癌细胞分别给与空白对照和不同浓度SPD(或加入拮抗剂SCH)时通过基质胶细胞照片。

图7为雌性荷瘤BALB/c小白鼠肿瘤的肺转移情况(SPD高、低剂量，n＝6)。鼠源转移性乳腺癌4T1荷瘤BALB/c小白鼠分别给予空白对照生理盐水、SPD 1mg/kg、SPD 2mg/kg时肺结节照片。

图8为SPD给药时雌性荷瘤BALB/c小白鼠体重的变化(SPD高、低剂量，n＝6)。鼠源转移性乳腺癌4T1荷瘤BALB/c小白鼠分别给予空白对照生理盐水、SPD 1mg/kg、SPD 2mg/kg时体重的变化曲线。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，本发明人提供了下述的实施例，然而，这些实施例仅仅是作为说明性的目的而给出的，并且不解释为对本发明的限制，因为其中许多变化是可能的，而不脱离本发明的主旨和范围。本发明的方法虽然在特定实施方案加以描述，但所属技术领域的技术人员显而易见，可使所述方法的步骤或步骤的顺序发生变化，但不偏离本发明的概念和范畴。更具体来说，显而易见的在化学上和生物学上相关的其他药理过程类似的药物可以取代本文所述的药物，同时达到相同或相似的效果。所述技术领域的技术人员显而易见的对所有这种相似的替换或修饰都应被认为在本发明的范畴和概念内。

实施例1：

SPD对转移性乳腺癌体外细胞存活的影响

本实施例研究了SPD对人转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞和鼠转移性乳腺癌4T1细胞体外存活的影响。

取对数生长期细胞，用0.25％胰酶-0.53mmol/L EDTA溶液消化、计数。将MDA-MB-231细胞按5000个/孔(4T1为3000/孔)接种于96孔细胞培养板。培养24h后，进行给药，SPD给药组的终浓度为0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L，每组设6个平行，继续孵育48h。孵育结束后弃去培养基，每孔加入100μL预先预冷的10％三氯乙酸(TCA，w/v)溶液，4℃固定1h；弃去TCA溶液，自来水冲洗5次，自然晾干；每孔加入100μL 0.4％磺酰罗丹明B(SRB)染料，室温下染色30min；弃去SRB染料，用1％醋酸溶液洗5次，自然晾干；每孔加入200μL 10mmol/L Tris溶液(pH 10.5)，振荡器上振摇20min使与肿瘤细胞碱性氨基酸残基结合的SRB溶解，酶标仪测定540nm波长处吸光度。空白对照组和药物处理组的吸光度表示为OD_control,540和OD_sample,540。其中一块96孔细胞培养板不给药处理，在细胞自接种起培养24h后按上述步骤处理，其平均吸光度设为OD_0h，540。细胞存活率按公式1计算：

结果显示(图1、2)：SPD在MDA-MB-231或4T1细胞中的IC₅₀(抑制50％细胞增殖所需的药物浓度)均大于1000μM，说明SPD对转移性乳腺癌细胞无明显细胞毒作用。

讨论：本实施例研究了SPD对体外转移性乳腺癌细胞的细胞毒作用，结果表明SPD对转移性乳腺癌细胞无明显的直接杀伤作用。这一结果与后文SPD可显著抑制体内转移性乳腺癌肺转移的结果形成明显的对比，说明SPD抑制肿瘤转移的机理不同于传统化疗药物的细胞毒作用。由于在抗肿瘤药物领域的研究中，传统的研究方法是先进行体外细胞毒研究并选择细胞毒作用较强的化合物进行研究，而本实例的结果能够说明相关领域的技术人员在本发明之前难以预料SPD对转移性乳腺癌的肺转移具有显著的抑制作用。

实施实例2：

SPD对转移性乳腺癌体外细胞迁移能力的影响

本实例研究了SPD对人转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞和鼠转移性乳腺癌4T1细胞迁移的抑制作用。

取形态正常、状态良好的MDA-MB-231或4T1转移性乳腺癌细胞，进行消化、离心、重新混悬的操作并计数。根据计数结果，用培养基将细胞悬液稀释至100万个/mL，以每孔2mL的体积加入到6孔细胞培养板中，使每孔细胞为200万个。接种后的6孔板置于细胞培养箱12h使细胞贴壁。使用200μL枪头力度均匀地在铺满细胞的六孔板中间划一条粗细均匀的线，使每孔划线宽度一致，使用PBS 1mL清洗划下来的细胞三次，加入下面配置的含药培养基。

将SPD标准液及DRD1拮抗剂SCH23390分别用无血清培养基稀释，分别得到终浓度为SPD 12.5μM、SPD 25μM、SPD 12.5μM+SCH23390 1μM、SPD 25μM+SCH23390 1μM、SCH233901μM的含药培养基备用。空白对照组的培养基加入等体积的DMSO，并使各组的DMSO浓度均为0.5％。

给药12h之后，吸弃各孔培养基，每孔加入0.5mL PBS漂洗一次，吸弃PBS后每孔加入0.5mL甲醇，室温下固定10min。吸弃甲醇，用自来水冲洗6孔板以洗去多余甲醇，自然晾干。将晾干后的6孔板显微镜下拍照，测量划痕宽度，并进行比较。

结果显示(图3、4)：SPD对MDA-MB-231和4T1细胞在体外的细胞迁移力有一定影响，SPD浓度越高，其抑制肿瘤细胞迁移能力的效果越强。DRD1拮抗剂SCH23390能逆转SPD这种抑制细胞迁移的作用。

讨论：划痕愈合实验主要考察细胞体外的迁移能力，间接反映了肿瘤细胞在体内的迁移能力；通过在培养基中加入不同剂量的药物能够考察细胞在药物作用下迁移能力。本章研究中的划痕愈合实验结果表明，SPD在12.5μM、25μM的浓度下均有较明显的抑制细胞迁移能力，具有剂量依赖性，能够说明SPD具有抑制转移性乳腺癌迁移的作用。DRD1拮抗剂SCH23390能逆转SPD这种抑制细胞迁移的作用，说明SPD是通过激动DRD1发挥作用的。

实施实例3：

SPD对转移性乳腺癌体外细胞侵袭能力的影响

本实例研究了SPD对人转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞和鼠转移性乳腺癌4T1细胞侵袭的抑制作用。

使用无血清培养基将基质胶稀释10倍，取50μL稀释的基质胶缓缓加入0.8μM小孔的transwell小皿中，均匀覆盖住小皿底部，将加入基质胶的小皿置于37℃1h使基质胶凝固。

取形态正常、状态良好的MDA-MB-231或4T1转移性乳腺癌细胞，进行消化、离心、重新混悬的操作并计数。根据计数结果，用无FBS培养基将细胞悬液稀释至30万个/mL，以每孔200μL的体积加入到transwell皿中，并分别加入不同量的SPD及SCH23390标准液，使终浓度为SPD 12.5μM、SPD 25μM、SPD 12.5μM+SCH23390 1μM、SPD 25μM+SCH233901μM、SCH23390 1μM。空白对照组的培养基加入等体积的DMSO，并使各组的DMSO浓度均为0.5％。

在transwell皿下方加入600μL含20％FBS培养基以诱导细胞迁移。

给药24h之后，吸弃各孔培养基，每孔加入0.5mL PBS漂洗一次，吸弃PBS后用棉签将皿上部未迁移过去的细胞擦干净，每孔加入0.5mL甲醇，室温下固定10min。吸弃甲醇，用0.5％结晶紫溶液染色10min。吸弃结晶紫溶液，用自来水冲洗6孔板以洗去多余染料，自然晾干。将晾干后的transwell皿在显微镜下拍照，并进行比较。

结果显示(图5、6)：SPD对MDA-MB-231和4T1细胞在体外的细胞侵袭力有一定影响，SPD浓度越高，其抑制肿瘤细胞侵袭能力的效果越强。DRD1拮抗剂SCH23390能逆转SPD这种抑制细胞侵袭的作用。

讨论：transwell侵袭实验主要考察细胞体外的侵袭能力，间接反映了肿瘤细胞在体内的侵袭能力尤其基质金属酶MMP的活性；通过在培养基中加入不同剂量的药物能够考察细胞在药物作用下侵袭能力。本章研究中的划痕愈合实验结果表明，SPD在12.5μM、25μM的浓度下均有较明显的抑制细胞侵袭能力，具有剂量依赖性，能够说明SPD具有抑制转移性乳腺癌迁移的作用。DRD1拮抗剂SCH23390能逆转SPD这种抑制细胞侵袭的作用，说明SPD是通过DRD1发挥作用的。

实施例4：

SPD对体内转移性乳腺癌移植瘤模型中肺转移的抑制作用(SPD高、低剂量)

本实施例研究了SPD对鼠转移性乳腺癌细胞接种的BALB/c小白鼠肿瘤肺转移的抑制作用。

取生长状态良好的4T1细胞，消化之后加入少量无FBS的RPMI1640培养基，用弯头玻璃吸管将贴在培养瓶壁上的细胞吹下，转移至15mL离心管，1000rpm离心5min，弃掉上清液，加入少量培养基将细胞重新吹打混匀并计数，按照细胞计数结果将细胞悬液用无FBS的培养基稀释至5×10⁶个/mL。将稀释的细胞悬液按照0.2mL的体积原位注射至BALB/c小白鼠右侧第四对乳房脂肪垫下(约含有1×10⁶个细胞)，观察接种情况。

接种后，肿瘤生长到约100mm³时将小鼠随机分为3组，每6只。每组的给药方案为：(1)空白对照组：每三日尾静脉注射0.1mL生理盐水；(2)SPD低剂量组：每三日尾静脉注射0.1mL含SPD的生理盐水，给药剂量为1mg/kg；(3)SPD高剂量组：每三日尾静脉注射0.1mL含SPD的生理盐水，给药剂量为2mg/kg。

从第0天开始，观察两种动物模型每组动物的生存状态，是否出现明显不良反应，并用天平记录其体重，作为计算每日给药剂量的依据，并量化反映动物的生存状态。给药后第17天，完成测量之后，处死动物，将肿瘤从动物体内取出，称重。处死动物之后，完整地解剖取出其肺脏，用生理盐水清洗干净，浸泡在bouin’s固定液内固定染色，待肺脏染色后观察清晰明显的转移灶。

结果显示(图7、8)：SPD 1mg/kg及SPD 2mg/kg组肺转移结节数量显著小于空白对照组，给药期间BALB/c小白鼠体重无显著变化。以上结果表明SPD在转移性乳腺癌细胞接种的移植瘤中能够展现较好的肺转移抑制作用，且有剂量依赖性，药物安全性良好。

讨论：在4T1细胞接种的转移性乳腺癌移植瘤中，SPD展现出了较好的抗肺转移药效。同时，给药期间体重无明显变化，表明SPD无明显全身毒性。

Claims

1.左旋千金藤啶碱及其药学上可用的盐用于制备抑制或治疗转移性乳腺癌的药物的用途。

2.根据权利要求1中所述的用途，其中所述的左旋千金藤啶碱和其他种类的抑制/治疗肿瘤的药物联合使用，或左旋千金藤啶碱及其药学上可用的盐单独使用。

3.根据权利要求1中所述的用途，其中所述的用途为在用药对象的体内施用，所述的用药对象为动物或人。

4.根据权利要求1中所述的用途，其特征在于，左旋千金藤啶碱及其药学上可用的盐以药物制剂的形式被应用，该药物制剂的形式包括片剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、微囊、微球、脂质体，所述药物制剂为缓/控释制剂或不为缓/控释制剂。