CN101550135A

CN101550135A - As-605240的制备方法及在制备治疗炎性疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN101550135A
Application number: CNA2008100459680A
Authority: CN
Inventors: 陈俐娟; 魏于全; 罗有福; 吴晓华
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2008-09-02
Filing date: 2008-09-02
Publication date: 2009-10-07

Abstract

AS－605240的制备方法及在治疗炎性疾病药物的应用，本发明对5－喹喔啉亚甲基－2，4－噻唑烷二酮[AS－605240，结构式见(I)]提供了对国际专利公开的制备方法的改进。选3，4－二氨基甲苯和乙二醛水溶液作原料，相对易得，各步反应试剂碳酸氢钠、N－溴代丁二酰亚胺和四氯化碳等廉价易得，反应条件温和。本发明用AS605240作了大量的刀豆球蛋白A(Concanavalin A)诱导的小鼠实验性心肌炎、急慢性肝炎、急性结肠炎和胰腺炎的疗效观察，均证实了它的良好疗效。而现有噻唑烷二酮药物(TZDs)，如曲格列酮等主要用于治疗糖尿病、心血管疾病等方面。近年有论文证实AS－605240通过抑制磷脂酰肌醇3(PI3K)激酶γ亚型信号途径，从而对小鼠关节和类风湿关节炎有保护作用。为此本发明提出AS－605240在治疗炎性疾病药物的应用为噻唑烷二酮化合物发掘和开拓了新的医疗领域。

Description

AS-605240的制备方法及在制备治疗炎性疾病药物中的应用

(一)技术领域：

本发明涉及一种噻唑烷二酮化合物AS-605240的制备方法及AS-605240在制备治疗炎性疾病药物中的应用。属医用配制品类(A61K)和杂环化合物类(C07D)。

(二)背景技术：

本发明涉及的一种噻唑烷二酮化合物为AS-605240，化学名(Z)-5-喹喔啉-6-亚甲基-2，4-噻唑烷二酮。

具有噻唑烷二酮结构的已上市的药物或通过化学合成且具有确切生理效应的噻唑烷二酮类似物统称为噻唑烷二酮药物(TZDs)，目前已上市的2，4-噻唑烷二酮类(TZDs)药物如曲格列酮、罗格列酮、吡格列酮、环格列酮等主要用于治疗糖尿病。近几年研究发现TZDs在治疗心血管疾病、抑制牛皮癣、抗肿瘤方面也显示出较好的医疗价值。

TZDs用于类风湿性关节炎近年来也受到人们的重视。磷酸肌醇3激酶(PI3Kγ)作为治疗炎症的药物作用靶点已得到证实，瑞士和意大利科学家(naturemedicine，2005，11(9)：936-941)发现AS-605240等TZDS在体内和体外试验中，可选择性地抑制PI3Kγ的酶活性及PI3Kγ介导的信号转导和趋化作用。对类风湿性关节炎的小鼠模型研究表明，AS-605240是良好的PI3Kγ的小分子口服抑制剂，可有效地预防和治疗关节炎及关节损伤。

但目前的公开文献还未见有AS-605240在肝炎、心肌炎、肠炎等炎症疾病方面的应用的报道。

世界专利WO2004007491公开的AS-605240的合成方法如下：

其中，DME为乙二醇二甲醚。该方法的缺点是原料6-喹喔啉羧酸不易得，第一步反应需要用到环境不友好的二氯亚砜(SOCl₂)；第二步反应需要用到昂贵的三叔丁基氢铝锂<LiAlH(t-Bu)₃.>，且反应在很难实现的低温下进行，不易实现较大规模制备。

(三)发明内容：

本发明目的之一是提供AS-605240的一种改进制备方法；本发明目的之二是提供由AS-605240作为活性成分在治疗炎性疾病药物中的应用。

本发明提供的一种噻唑烷二酮化合物AS-605240制备方法，该AS-605240的结构式为如下式(I)：(见图25)

包括步骤(D)将化合物(5)与化合物(6)在β-丙氨酸和冰乙酸(AcOH)存在下，得到目标化合物(I)：

其特征是该方法还包括下列步骤：

A)将3，4-二氨基甲苯化合物(1)与乙二醛化合物(2)在无机碱存在下反应，得到化合物(3)：

B)化合物(3)在光照或引发剂和溴代试剂存在下存在下反应，得到化合物(4)：

C)化合物(4)在无机碱和二甲基亚砜(DMSO)存在下反应，得到化合物(5)：

上述A)中无机碱可选用NaOH，KOH，Na₂CO₃，K₂CO₃，NaHCO₃，KHCO₃等；反应温度为70～120℃或80～110℃，反应时间为0.5～3小时或1～2小时。

上述B)中引发剂可选用过氧苯甲酰或偶氮二异丁腈(AIBN)或二者的混合物；溴代试剂可选用单质溴，N-溴代乙酰胺(NBA)或N-溴代丁二酰亚胺(NBS)；溶剂采用CCl₄；反应时间为0.5～3小时或1～2小时。

上述C)中的无机碱可选用NaOH，KOH，Na₂CO₃，K₂CO₃，NaHCO₃，KHCO₃等；反应温度为80～180℃或90～120℃。

本发明还包括以AS-605240为药物活性成分的药用制剂(是一种组合物)，它含有结构式(I)的化合物，以及药用载体、辅料或稀释剂，也就是各种剂型需要的赋型剂。剂型可采用常用的片剂、胶囊、注射剂、粉针剂等等。

本发明提出了AS-605240在制备治疔和预防心肌炎、肝炎、结肠炎和胰腺炎的上述药用制剂中的应用。AS-605240应用在小鼠上的实验性疗效，见本发明实施例2、3、4、5和6。

本发明有益效果：

i本发明提出的AS-605240的制备方法与世界专利WO2004007491公开的方法比，原料3，4-二氨基甲苯相对易得到，各步反应试剂廉价易得，反应条件温和。ii.本发明对AS-605240发掘了新的用途，开拓了一个新的应用领域。iv.由实施例2、3、4、5、6等提供的AS-605240小鼠试验的疗效观察均证实了含它的药剂在治疗心肌炎、急慢性肝炎、结肠炎和胰腺炎等方面均有较好的疗效。

(四)附图说明：

图1实施例2AS605240对小鼠正常组实验性心肌炎HE染色观察图

图2实施例2AS605240对小鼠对照治疗组实验性心肌炎HE染色观察图；

图3实施例2AS605240对小鼠模型组实验性心肌炎HE染色观察图；

图4实施例2AS605240对小鼠治疗组实验性心肌炎HE染色观察图；

图5实施例2AS605240对小鼠模型组实验性心肌炎的免疫组化观察图；

图6实施例2AS605240对小鼠治疗组实验性心肌炎的免疫组化观察图；

图7实施例3血清转氨酶ALT生化学评价图表；

图8实施例3肝组织H&E染色进行病理切片观察图(A、B、C、D)；

图9实施例3AS605240保护致死剂量ConA诱导的小鼠存活率图表；

图10实施例4肝小叶内胶原蛋白沉着图片(正常组)；

图11实施例4肝小叶内胶原蛋白沉着图片(模型组)；

图12实施例4肝小叶内胶原蛋白沉着图片(治疗组)；

图13实施例5正常组结肠切片图；

图14实施例5模型组结肠切片图；

图15实施例5AS605240治疗组结肠切片图(AS 100mg/kg)；

图16实施例5AS605240治疗组结肠切片图(AS 50mg/kg)；

图17实施例5地塞米松对照治疗组结肠切片图；

图18实施例5急性结肠炎组织学评分(Histoiogic Score)图表；

图19实施例5急性结肠炎的保护生存实验图表；

图20实施例6胰酶变化图表；

图21实施例6淀粉酶变化图表；

图22实施例6正常小鼠组织病理图；

图23实施例6急性胰腺炎模型(蛙皮素腹腔注射)组织病理图；

图24实施例6治疗组(蛙皮素+AS605240)组织病理图

图25AS-605240的结构式(I)

具体实施方式：

实施例1

<5-喹喔啉亚甲基-2，4-噻唑烷二酮(AS-605240)化合物的制备方法>

此方法由如下四个步骤组成：

A)6.1克3，4-二氨基甲苯(1)，14.5克40％乙二醛水溶液(2)和5.3克碳酸钠(Na₂CO₃)在100℃反应2小时；冷至室温以后，用正庚烷萃取三次(30mL×3)；有机层用无水硫酸钠干燥，过滤无水硫酸钠后，减压蒸掉溶剂，得到淡黄色油状产物化合物(3)。

B)0.72克由A)制得的产物化合物(3)，1.78克N-溴代丁二酰亚胺(NBS)和0.1克过氧苯甲酰，在15mL四氯化碳下，回流2小时；趁热过滤，滤液蒸干后，通过快速柱层析分离得到蓬松状白色固体化合物(4)。

C)1.34克由B)制得的白色固体化合物(4)，2.5克碳酸氢钠和25mL二甲基亚砜，在120℃反应2小时；加入500mL水，用乙酸乙酯萃取水层(200mL×3)，合并乙酸

乙酯层，并用5％碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液分别洗涤(200mL×3)；有机层用无水硫酸钠干燥；过滤后，母液除去溶剂后得到黄色粉末，即为化合物(5)。

D)0.4克6-喹喔啉醛(5)，0.44克2，4-噻唑烷二酮(6)，0.34克β-丙氨酸和25mL冰乙酸，在100℃反应3小时；自然冷至室温，加入少量蒸馏水；有大量红棕色固体析出；过滤，用大量的水和乙酸乙酯洗涤沉淀；固体真空下干燥过夜，得到目标产物(I)。

实施例2

<AS605240对小鼠实验性心肌炎的疗效观察>

1)实验材料及动物：①Balb/小鼠(6-8周龄雄性32只)。②百日咳毒素(成都生物制品研究所)。③完全弗氏佐剂(1mg/L sigma)。④多肽(The myhca peptide 614-629Ac-SLKLMATLFSTYASAD-OH上海吉尔生物公司10mg)。⑤AS605240。⑥灌胃针。

2)实验过程：

<造模>：A.将多肽溶于灭菌磷酸缓冲液(PBS)配制成1mg/mL的溶液，与等体积的完全弗氏佐剂乳化混合(冰上操作，用2个灭菌玻璃注射器反复抽吸1个小时)。

B.将小鼠分为4组(模型组10只，治疗组10只，对照组6只，正常组6只)，

模型组和模型治疗组于双侧腋下及腹股沟多点皮下注射上述乳化液，对照组和对照治疗组于同样部位给予同剂量的PBS与CFA的乳化液，同时所有小鼠腹腔注射400ng百日咳毒素；初次免疫一周后再次免疫(不再注射百日咳毒素)。

<治疗>：A.初次免疫当天给予模型治疗组和对照治疗组AS605240(50mg/kg)灌胃，模型组和对照组给予悬浮剂灌胃，连续治疗3周。B.治疗期间密切观察小鼠饮食，体重和生理状态。

<评价>：

A.于第三周称体重，取眼球血，处死小鼠，取出心脏，观察心脏大小和颜色并取典型标本照相，称取心脏重量(需要微量天平)，将心脏横切，部分保存于液氮，其余保存于福尔马林，制作HE切片，观察图片结果：

①见图1：AS605240对小鼠正常组实验性心肌炎观察图片。由此可看出：心肌细胞排列清楚，无炎症细胞浸润和水肿。②见图2：AS605240对小鼠对照组实验性心肌炎观察图片。由此可看出：心肌细胞排列清楚，有极少量炎症细胞灶性浸润。③见图3：AS605240对小鼠模型组实验性心肌炎观察图片。由此可看出：心肌细胞排列紊乱，有大量炎症细胞浸润，心肌水肿并伴有坏死和纤维化。④见图4：AS605240对小鼠治疗组实验性心肌炎观察图片。由此可看出：心肌细胞排列较正常，炎症细胞少量灶性浸润，心肌轻度水肿，坏死和纤维化极少。

B.免疫组化观察心肌中AKT磷酸化的表达和巨噬细胞，CD4，CD8细胞的浸润，结果：

①见图5：模型组，可见较多巨噬细胞浸润。②见图6：治疗组，有散在少量巨噬细胞。

上述结果表明：AS605240对心肌炎有良好治疗效果。

实施例3

<AS605240治疗Concanavalin(刀豆球蛋白)A诱导的小鼠自身免疫性急性肝炎的疗效观察>

1)实验材料及动物：①健康雌性6～8周龄Balb/C小鼠，清洁级，由四川大学动物实验中心提供。②ConA剂量为15mg/Kg，无菌生理盐水配。③AS605240剂量为50mg/Kg。无菌生理盐水配制。④地塞米松剂量为500ug/Kg。

2)实验方法：实验分5组：正常组，对照组，模型组，治疗组，空载组。正常组：不做任何处理。对照组：腹腔注射地塞米松一小时后，ConA尾静脉给药。模型组：ConA尾静脉给药。治疗组：ConA尾静脉给药半小时后，5mg/kg AS605240灌胃治疗。空载组：ConA尾静脉给药半小时后，vehicle灌胃给药。

3)评价指标：血清转氨酶ALT和AST的生化学评价；肝组织H&E染色进行病理切片观察；RT-PCR及ELISA分析炎性细胞因子TNF-α，IL-1β的改变。

4)实验结果：

①AS605240治疗降低肝炎小鼠血清ALT。见图7，在加入ConA+AS605240血清转氨酶ALT约为6560±5362，较模型组和空载组都低，但治疗效果不如地塞米松，后者的ALT水平降至1634±1341。②见图8，为肝组织H&E染色进行病理切片观察(A、B、C、D)；A.正常对照组小鼠肝细胞、肝窦未见异常。B.ConA尾静脉给药后20小时，小鼠可见广泛的肝细胞肿胀，部分肝细胞彻底坏死(箭头所示)，坏死灶及血管周围有炎性细胞浸润(箭头带箭尾)。C.ConA尾静脉给药半小时以后，给予50mg/kgAS605240灌胃治疗，肝脏坏死灶及肝细胞水肿都明显改善。D.腹腔预先注射地塞米松1小时，再尾静脉注射ConA，也能明显减轻ConA诱导的肝脏损伤。③见图9，AS605240保护致死剂量ConA诱导的小鼠存活率，7天后，小鼠存活率为100％。

上述结果表明：AS605240能对急性肝炎有良好的治疗作用。

实施例4

<AS605240治疗Concanavalin(刀豆球蛋白)A诱导的慢性肝炎的疗效观察>

1)实验材料：健康雌性8～10周龄Balb/C小鼠，清洁级，由四川大学动物实验中心提供。ConA剂量为10mg/Kg，无菌生理盐水配制；AS605240剂量为50mg/Kg，无菌生理盐水配制。

2)实验方法：实验分四组：正常组，模型组，治疗组。正常组：不做任何处理。

模型组：每周ConA尾静脉给药，连续给药四次，治疗组：在第三次注射ConA，AS605240每天灌胃治疗，治疗一周。

3)评价指标：肝纤维化的病理学评价：H&E染色，天狼星红染色，α-SMA染色。

4)实验结果：AS605240减轻肝纤维化过程中的胶原蛋白沉着。

A.见图10(正常组)：小鼠肝脏仅在中央静脉，汇管区以及大的血管壁有被

天狼星红染成色红色的区域。B.见图11(模型组)：ConA连续每周注射一次，第4次给药一周以后，可见小鼠肝脏的肝小叶内胶原蛋白呈条索状分布，并分割包绕肝小叶。C.见图12(治疗组)：AS605240治疗一周以后，肝小叶内胶原白沉积减少，没有条索状分布的肝纤维，及肝小叶的包裹。

上述结果表明：AS605240对慢性肝炎有良好的治疗效果。

实施例5

<AS605240治疗自身免疫性急性结肠炎的疗效观察>

1)实验材料：①老鼠：6-8周雄性C57/BL6小鼠，体重18-20g，SPF级，购自四川大学实验动物中心，按国际通用标准正常喂养一周后开始实验。②药品：DSS(分子量36000-50000，ICN Biochem)；AS-605240由本实验室合成，用Vehicle(0.5％羧甲基纤维素/0.25％吐温20)溶解。

2)实验方法：

①分组：共5组：正常组(N)；空载组(V)；AS大(100mg/kg qd)；AS小(50mg/kgqd)；地塞米松1mg/kg qd.

②急性结肠炎的建模和治疗方案：见表1

表1急性结肠炎的治疗方案

③急性结肠炎的保护生存试验：见表2

表2急性结肠炎的生存试验方案

④慢性结肠炎的建模和治疗方案：见表3

表3慢性结肠炎的治疗方案

⑤检测指标

i.疾病活动指数(DAI)a.体重减轻；b.大便质地；c.便血。ii.结肠肉眼观察：结肠长度。iii.病理切片观察和组织学评分。iv.免疫组化和Western blot检测组织磷酸化AKT的量。v.组织细胞因子检测：a.RT-PCR测IL-6，IFN-γ，IL-10，iNOS.b.ELSIA测TNF-α，IL-1β.

⑥实验结果

i.对已建立的急性结肠炎的疗效观察

(1)组织学表现(×40)：小鼠的免疫组化切片观察，见图13～图17，

A.正常结肠(见图13正常组)。B.DSS诱导的结肠炎模型(见图14模型组)：小鼠自由饮用3.5％DSS(分子量：35000-40000)一周后，结肠粘膜破坏，粘膜下层出现大量的炎症细胞的浸润，肌层也有少量的炎症细胞浸润，同时大量的腺体也受到破坏。C，D.AS605240治疗结肠炎。小鼠自由饮用3.5％DSS一周后，分别用100mg/kg(图15)和50mg/kg(图16)的AS605240每天灌胃一次，治疗一周后，结肠粘膜破坏明显减轻，100mg/kg大剂量治疗组几乎没有粘膜下层和肌层炎症细胞的浸润，且被损坏的腺体被修复(图15)。50mg/kg的小剂量组仅见粘膜下层少量的炎症细胞的浸润(图16)，腺体被修复；在用地塞米松治疗后，炎症程度也有一定的减轻(图17)。

(2)组织学评分(Histoiogic Score)：总的组织学评分＝(炎症程度评分+病变深度评分+隐窝破坏评分)×病变范围评分；变动范围在0～40之间。从图18中可看出，加入了AS 100mg/kg和AS50mg/kg的Histoiogic Score低，说明AS605240对结肠炎有一定治疗效果。B.急性结肠炎的保护生存实验，

从图19可以看出：加入了AS100mg/kg和AS50mg/kg的9天存活率均高于空载组和地塞米松组，但14天存活率低于地塞米松，说明了AS-605240对急性结肠炎有较好的治疗效果。

上述结果表明：AS605240能治急性结肠炎。

实施例6

<AS605240治疗胰腺炎小鼠的疗效观察>

1)实验材料：雄性C57小鼠12只(20-22g)，灌胃针，蛙皮素(cerulein).AS605240

2)实验方法：①随机分为治疗组(5只)，模型组(5只)，正常组(2只)，禁食18h，自由饮水。②.治疗组和模型组腹腔注射7次cerulein(50μg/kg，200μL)，每小时一次，正常组注射生理盐水作为空白对照

③治疗组第二次腹腔注射cerulein后立即灌胃给予AS605240(50mg/kg)

④模型组和正常组给予同样剂量的生理盐水灌胃。⑤最后一次注射ceruleinl小时后，取眼动脉血，送检淀粉酶和胰酶(治疗组和模型组各5只，正常组2只)。⑥处死小鼠，观察腹腔内各器官病理变化，取胰腺放入10％福尔马林中固定，并进一步做HE染色，观察病理改变。

3)检测指标：血清胰酶和淀粉酶，胰腺HE染色

4)实验结果：①胰酶及淀粉酶：见图20，图21，可能由于取血时间和样本数量的原因，治疗组和模型组的差异不明显，但有下降的趋势。②组织病理：见图23正常小鼠无病理改变；见图24胰腺炎模型小鼠胰腺间质充血水肿，炎症细胞浸润明显；见图25，用AS605240治疗，胰腺间质轻度水肿，炎症细胞浸润不明显。

上述结果表明：AS605240能对胰腺炎有缓解作用。

Claims

1.制备结构式(I)的噻唑烷二酮化合物AS-605240的方法，

包括步骤(D)将化合物(5)与化合物(6)在β-丙氨酸和冰乙酸存在下，得到目标化合物(I)：

其特征是该方法还包括下列步骤：

A)将3，4-二氨基甲苯(1)与乙二醛水溶液(2)在无机碱存在下反应，得到化合物(3)：

B)化合物(3)在光照或引发剂和溴代试剂存在下，以卤代烃为溶剂，进行溴代反应，得到化合物(4)：

2.按权利要求1的制备方法，其特征是：A)第一步反应无机碱选用NaOH，KOH，Na₂CO₃，K₂CO₃，NaHCO₃，KHCO₃；反应温度为70～120℃，反应时间为0.5～3小时。

3.按权利要求2的制备方法，其特征是：反应温度为80～110℃；反应时间为1～2小时。

4.按权利要求1所述制备方法，其特征是：B)第二步反应中引发剂选用过氧苯甲酰、偶氮二异丁腈(AIBN)或二者的混合物；溴代试剂选用单质溴、N-溴代乙酰胺(NBA)或N-溴代丁二酰亚胺(NBS)；溶剂为CCl₄；反应时间为0.5～3小时。

5.按权利要求4所述制备方法，其特征是：反应时间为1～2小时。

6.按权利要求1所述制备方法，其特征是：C)第三步反应中的无机碱选用NaOH，KOH，Na₂CO₃，K₂CO₃，NaHCO₃，KHCO₃；反应温度为80～180℃。

7.按权利要求6所述制备方法，其特征是：无机碱选用无机碱(盐)Na₂CO₃，K₂CO₃，NaHCO₃，KHCO₃；反应温度为90～120℃。

8.结构式(I)的化合物在制备预防和治疗心肌炎、肝炎、结肠炎和胰腺炎药物中的应用。

9.一种药用制剂，它含有结构式(I)的化合物，以及药用载体、辅料或稀释剂。