KR20220087890A - 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부 및 그 제조방법 - Google Patents

기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부 및 그 제조방법 Download PDF

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KR20220087890A
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Abstract

본 발명은 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 기저막층을 포함하는 무세포 진피는 그 구조 내에 피부유래 세포의 부착을 용이하게 하는 기저막층이 포함되어 있고 진피층의 구조가 보존되어 있다. 따라서, 추가의 동물유래 세포외기질의 코팅을 필요로 하지 않고, 무영양세포(feeder cell free), 무이종(xeno free) 및 무혈청(serum-free)의 배양 요소에서 피부유래 세포의 적용 및 배양/분화가 가능하며 임상적으로도 안전함을 부여할 수 있다.
또한, 상기 인공 피부 지지체 상에 피부유래 세포를 배양하여 제조한 인공 피부는 피부 결손부에 이식 시 조직이 안전하고 효과적으로 재생될 수 있다.

Description

기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부 및 그 제조방법{Dermal-based artificial skin comprising a basement membrane layer and method for manufacturing the same}
본 발명은 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부 및 그 제조방법에 관한 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 표피 및 진피층의 세포 및 면역반응 유발 인자의 잔류를 최소화한 반면, 기저막층은 보존하여 인공 피부로 적용할 수 있는 기저막층을 포함하는 무세포 진피, 및 상기 무세포 진피에 피부유래 세포를 배양하여 제조된 인공 피부에 관한 것이다.
피부는 인체에서 가장 큰 장기로, 외부 자극 및 감염 위험으로부터 일차적인 방어 역할을 담당한다. 피부는 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하조직(hypodermis)의 3개 층으로 구성되며, 모낭, 털, 땀샘, 피지선 등과 같은 부속 기관이 있어 보호막 기능 외에도 피부 탄력, 체온 조절 등의 다양한 기능을 수행하고 있는 중요한 복합 기관이다.
광범위한 화상, 당뇨병 등으로 인한 피부궤양 또는 피부 손상과 사고, 외상, 노화 등으로 인한 피부 조직의 함몰 등에 대한 미용성형 및 재건성형 분야에서 대체 피부의 필요성이 증가됨에 따라, 피부를 대신할 수 있는 생체 재료 및 인공 피부 개발이 급속도로 진행되어 왔으며, 최근에는 이를 넘어 화장품 개발시의 동물실험 대체시험이나, 신약 개발에서 사용되는 화합물의 독성시험으로 그 적용이 확대되고 있다.
인공 피부는 진피 대용물과 그 위에 존재하는 각질층까지 분화시킨 형태로, 진피와 각질층 사이의 기저막층은 두 층 사이의 물리적인 방어막일뿐만 아니라, 표피세포의 부착을 용이하게 하여 지지대로서 역할을 하고, 표피의 형성을 조절하여 상처치유과정에도 관여한다. 그러므로, 기저막층이 포함된 인공 피부는 피부 재생 및 인공 피부를 이용한 대체 시험에서도 필수적이다.
현재 적용되는 피부 대체재는 공여받은 탈표피화된 진피, 콜라겐, 젤라틴 및 소장점막하조직과 같은 생체 유래 분해성 피복제와 PLGA와 같은 생체친화성 합성 고분자를 직접 적용한 형태이거나, 콜라겐이나 고분자 스폰지에 피부 유래 세포를 배양한 인공 피부를 적용한 형태이다.
콜라겐은 피부 진피층의 대부분을 차지하는 단백질로써, 다양한 형태의 제품으로 시판되고 있지만, 제조 공정상의 어려움으로 가격이 높게 형성되며, 특히, 콜라겐을 인공 피부 지지체로 사용한 경우, 세포와 혼합 후 수축되는 단점과 진피층을 그대로 구현할 수 없다는 단점이 있다.
또한, 피부 유래 세포가 배양된 대체재 혹은 인공 피부 제작시 기저막층 형성 및 세포 부착을 위해 동물 유래 세포외기질을 코팅하거나, 동물 유래 성분(피더세포, 우혈청, 돼지 트립신 등)이 포함된 배양 요소로 세포를 배양하여 외래성 바이러스 및 마이코플라스마 오염 등과 같은 안전성에 문제가 있을 수 있다.
상기 언급한 기존 재료의 한계점을 해결하기 위해, 본 발명에서는 공여받은 피부로부터 각질형성세포의 부착을 용이하게 하는 기저막층과 세포외기질을 포함하는 진피층의 구조는 보존하고, 면역 반응을 일으킬 수 있는 세포 등은 제거한 기저막층을 포함하는 무세포 진피를 제작한다. 또한, 상기 기저막층을 포함하는 무세포 진피에 피부유래 세포를 적용하여 복합 배양함으로써 진피와 표피층이 모두 존재하는 전층 인공 피부를 제공한다.
1. 한국등록특허 제10-0791502호
본 발명은 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부 및 그의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 표피와 진피층의 세포 및 면역반응 유발 인자의 잔류를 최소화한 반면, 기저막층은 보존하여 인공 피부로 적용할 수 있는 기저막층을 포함하는 무세포 진피 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 동결건조된 기저막층을 포함하는 무세포 진피에 다른 동물 유래 세포외기질의 코팅없이 무영양세포(feeder cell free), 무이종(xeno free) 및 무혈청(serum-free)의 배양 요소에서 피부유래 세포를 적용하여 제조한 인공 피부 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 기저막층을 포함하는 무세포 진피의 진피 방향에 섬유아세포를 파종한 후 배양하는 단계; 및
기저막층을 포함하는 무세포 진피의 기저막층 상에 각질형성세포를 파종한 후 배양 및 분화하는 단계를 포함하는, 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 전술한 인공 피부의 제조 방법에 의해 제조되며,
섬유아세포를 포함하는 기저막층을 포함하는 무세포 진피 지지체; 및
상기 기저막층을 포함하는 무세포 진피의 기저막층 상에 형성되며, 각질형성세포가 배양 및 분화된 표피로 구성되는, 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부를 제공한다.
본 발명에 따른 기저막층을 포함하는 무세포 진피는 그 구조 내에 피부유래 세포의 부착을 용이하게 하는 기저막층이 포함되어 있고 진피층의 구조가 보존되어 있다. 따라서, 추가의 동물유래 세포외기질의 코팅을 필요로 하지 않고, 무영양세포(feeder cell free), 무이종(xeno free) 및 무혈청(serum-free)의 배양 요소에서 피부유래 세포의 적용 및 배양/분화가 가능하며 임상적으로도 안전함을 부여할 수 있다.
또한, 상기 인공 피부 지지체 상에 피부유래 세포를 배양하여 제조한 인공 피부는 피부 결손부에 이식 시 조직이 안전하고 효과적으로 재생될 수 있다.
도 1은 얇은 두께 형태의 기저막층을 포함하는 무세포 진피를 제작하는 공정을 나타낸다.
도 2는 두께가 상이한 기저막층을 포함하는 무세포 진피에 사람 유래 섬유아세포(HDF)를 배양하여 세포 증식을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3(a)는 기저막층을 포함하는 무세포 진피 및 기저막층을 포함하지 않는 무세포 진피에 섬유아세포를 배양하여 세포 증식을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3(b) 및 (c)는 기저막층을 포함하는 무세포 진피(B) 및 기저막층을 포함하지 않는 무세포 진피(C)에 섬유아세포를 배양하여 기간별로 세포 생존을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4(a)는 기저막층을 포함하는 무세포 진피 및 기저막층을 포함하지 않는 무세포 진피에 각질형성세포(HEK)를 배양하여 세포 증식을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 (b)는 기저막층을 포함하는 무세포 진피에 CTS와 콜라겐을 코팅한 후, 각질형성세포를 배양하여 기간별 세포 생존을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 (c)는 기저막층을 포함하는 무세포 진피에 각질형성세포의 수를 다르게 파종하여 배양하고 기간별 세포 생존을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 기저막층을 포함하는 무세포 진피에 사람 피부유래 각질형성세포와 섬유아세포를 함께 배양하고 피부 분화를 진행한 결과를 나타내며, 도 6은 조직학적 분석을 통한 분화 결과를 나타낸다.
본 발명은 A) 기저막층을 포함하는 무세포 진피의 진피 방향에 섬유아세포를 파종한 후 배양하는 단계; 및
B) 기저막층을 포함하는 무세포 진피의 기저막층 상에 각질형성세포를 파종한 후 배양하는 단계를 포함하는, 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 실시예에서는 본 발명에 따른 제조 방법으로 제작된 기저막층을 포함하는 무세포 진피에 동물유래 세포외기질의 코팅 없이 무영양세포(feeder cell free), 무이종(xeno free) 및 무혈청(serum-free) 배양 요소에서 피부유래 세포인 섬유아세포 및/또는 각질형성세포를 파종 및 배양하여, 상기 기저막층을 포함하는 무세포 진피가 피부유래 세포와 적합성과 친화성이 있어 인공 피부로 적합함을 확인하였다.
이하, 본 발명에 따른 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부(이하, 인공 피부라 할 수 있다.)의 제조 방법을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 단계 A) 및 단계 B)의 수행 순서는 제한되지 않으며, 단계 A) 및 단계 B)를 순차적으로 수행하거나, 단계 B) 및 단계 A)를 순차적으로 수행할 수 있으며, 또한, 단계 A) 및 B)를 동시에 수행할 수 있다.
본 발명에서 인공 피부는 기저막층을 포함하는 무세포 진피에 피부유래 세포를 배양 및/또는 분화하여 제조할 수 있다.
본 발명에서 기저막층을 포함하는 무세포 진피는 기저막층을 포함하는 진피를 탈지질화 및 탈세포화하여 제조한 것으로서, 무세포 진피(Acellular Dermal Matrix, ADM)이다.
상기 기저막층을 포함하는 무세포 진피는 일반적인 무세포 진피와 동일한 분야에 적용될 수 있으며, 본 발명에서는 피부 대체재인 인공 피부에 적용될 수 있다. 구체적으로, 기저막층을 포함하는 무세포 진피는 인공 피부에서 진피의 역할을 수행하며, 피부유래 세포의 배양 및/또는 분화를 위한 지지체의 역할을 수행할 수 있다.
이러한 기저막층을 포함하는 무세포 진피는 a) 피부 조직에서 표피를 제거하여, 100 내지 300 um 두께의 기저막층을 포함하는 진피를 제조하는 단계;
b) 상기 기저막층을 포함하는 진피에서 지질 성분을 제거하는 단계; 및
c) 상기 지질 성분이 제거된 기저막층을 포함하는 진피에서 세포를 제거하는 단계를 통해 제조할 수 있다.
본 발명에서 피부 조직은 동종 또는 이종의 피부 조직일 수 있다. 상기 동종은 인간을 의미하며, 이종은 인간 이외의 동물, 즉, 돼지, 소, 말 등의 포유류를 의미할 수 있다.
즉, 본 발명에서는 동종 또는 이종 유래의 피부 조직을 사용하여 본 발명의 제조 방법에 따라 기저막층 포함 무세포 진피를 제조할 수 있다.
본 발명에서 단계 a)는 피부 조직에서 표피를 제거하여, 100 내지 300 um 두께의 기저막층을 포함하는 진피를 제조하는 단계이다.
일 구체예에서, 상기 단계는 표피층을 포함하는 피부를 더마톰(dermatome)을 이용하여 원하는 두께로 절제할 수 있으며, 특히, 300 um 이하로 얇게 절제할 수 있다. 또한, 표피층을 포함하는 피부를 얇게 얻은 상태에서 표피층만을 제거함으로써 더 얇은 진피를 용이하게 확보할 수 있다.
일 구체예에서, 기저막층을 포함하는 진피의 두께는 100 내지 300 um일 수 있다. 상기 두께 범위에서 기저막층 포함 인공 피부 지지체의 세포 적합성 등이 우수하다. 두께가 300 um를 초과하면 세포 적합성이 저하될 우려가 있으며, 너무 얇으면 인공 피부로의 사용에 부적합하므로, 상기 범위로 두께를 조절하는 것이 중요하다.
본 발명에서는 진피가 기저막층을 포함하므로, 피부유래 세포의 부착율을 높일 수 있으며, 이를 통해 인공 피부를 용이하게 제작할 수 있다.
본 발명에서 단계 b)는 단계 a)에서 제조된 기저막층을 포함하는 진피에서 지질 성분을 제거하는 단계로, 기저막층을 포함하는 진피를 탈지방화할 수 있다. 상기 탈지방화(delipidation)는 기저막층을 포함하는 진피로부터 지질 성분을 제거하는 것을 의미한다.
일 구체예에서, 탈지방화는 탈지질 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 탈지질 용액은 극성 용매, 비극성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 포함할 수 있다. 상기 극성 용매로는 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용액을 사용할 수 있으며, 알코올로는 메탄올, 에탄올 또는 이소프로필 알코올을 사용할 수 있다. 또한, 비극성 용매로는 헥산, 헵탄, 옥탄, 또는 이들의 혼합 용액을 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 탈지질 용액으로 이소프로필 알코올(IPA) 및 헥산(Hexane)의 혼합 용액을 사용할 수 있다. 이때, 이소프로필 알코올 및 헥산의 혼합 비율은 20:80 내지 80:20일 수 있다.
상기 탈지질 용액의 처리 시간은 1 내지 8 시간일 수 있다.
본 발명에서 단계 c)는 단계 b)에 의해 지질 성분이 제거된 기저막층을 포함하는 진피에서 세포를 제거하는 단계로, 기저막층을 포함하는 진피를 탈세포화할 수 있다. 탈세포화(decellularization)는 기저막층을 포함하는 진피로부터 세포외기질을 제외한 다른 세포 성분, 예를 들면 핵, 세포막, 헥산 등을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명에서는 탈지방화 및 탈지질화를 거친 기저막층을 포함하는 진피를 기저막층을 포함하는 무세포 진피로 표현할 수 있다.
일 구체예에서, 탈세포화는 탈세포 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 탈세포 용액으로 염기성 용액을 사용할 수 있으며, 구체적으로, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 탈세포 용액으로 수산화나트륨(NaOH)을 사용할 수 있다. 종래에는 계면활성제 또는 효소를 사용하여 탈세포화를 수행하였다. 그러나, 효소를 사용하는 경우 진피층 자체에 손상을 줄 수 있고, 효소가 잔류하여 체내에 이식되는 경우 환자의 본래 조직에 손상을 줄 수 있으며 심각한 경우엔 면역반응을 일으키는 문제가 있었다. 또한, 계면활성제를 사용하는 경우 상기 계면활성제의 잔류를 최소화시키기 위해 세척 작업이 필요하며, 계면활성제의 잔류는 체내에서 세포 및 조직 독성을 나타내는 원인이 될 수 있었다. 따라서, 본 발명에서는 탈세포화시 탈세포 용액을 사용하여 전술한 문제점을 해결할 수 있으며, 또한, 세포 독성이 없다는 장점을 가진다.
일 구체예에서, 탈세포 용액의 농도는 0.05 내지 0.5 M일 수 있다. 상기 농도 범위에서 세포의 제거가 용이하다.
또한, 일 구체예에서, 탈세포화 단계는 30 분 내지 10 시간 동안 수행될 수 있다. 상기 시간 범위에서 세포의 제거가 용이하다.
또한, 본 발명에서는 기저막층 포함 무세포 진피를 동결 건조하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 상기 동결건조를 통해 기저막층을 포함하는 무세포 진피의 수분을 제거하며, 이를 통해 상기 무세포 진피에의 세포 부착율을 향상시킬 수 있다.
일 구체예에서 동결건조는 영하 60 내지 90℃에서 2 내지 4일 동안 수행할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 기저막층을 포함하는 무세포 진피를 멸균하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
일 구체예에서, 멸균은 방사선 혹은 전자선을 조사하여 수행할 수 있으며, 조사 범위는 10 내지 30 kGy일 수 있다.
전술한 제조 방법에 의해 기저막층을 포함하는 무세포 진피가 제조되며, 상기 기저막층을 포함하는 무세포 진피는 기저막층 및 진피로 구성될 수 있다. 상기 기저막층을 포함하는 무세포 진피는 면역반응 유발 인자의 잔류를 최소화한 반면, 기저막층이 보존되어 있으므로 인공 피부로 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명은 전술한 제조 방법에 의해 제조된 기저막층을 포함하는 무세포 진피를 사용하여 인공 피부를 제조한다.
세포가 포함된 대체재 혹은 인공 피부 모델의 제작시, 전통적으로 동물유래 성분이 포함된 배양 요소로 세포를 배양하거나 동물유래 세포외기질을 코팅하여 제작하며, 동물유래 성분의 부재 시 세포 부착 및 분화가 일어나지 않는다(Lamb R, Ambler CA (2013) Keratinocytes Propagated in Serum-Free, Feeder-Free Culture Conditions Fail to Form Stratified Epidermis in a Reconstituted Skin Model. PLoS ONE 8(1): e52494. doi:10.1371/journal.pone.0052494). 그러나, 이러한 동물유래 성분을 사용할 경우 동물유래 바이러스나 마이코플라스마 등과 같은 오염을 일으킬 수 있어 안전성에 문제가 될 수 있다.
피부의 기저막층은 콜라겐, 라미닌, 프로테오글리칸, 피브로넥틴 등과 같은 성분으로 구성되어 상피세포를 그 아래 조직에 강하게 부착시키는 역할을 한다.
따라서, 본 발명에서는 기저막층을 포함하는 무세포 진피를 사용하므로, 그 구조 내에 피부유래 세포의 부착을 용이하게 하는 기저막층이 포함되어 있고, 또한 진피의 구조가 보존되어 있으므로, 추가의 동물유래 세포외기질의 코팅을 필요로 하지 않는다. 이를 통해, 기저막층을 포함하는 무세포 진피 상에서 피부유래 세포의 배양 및 분화가 가능하며 임상적으로도 안전함을 부여할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 기저막층을 포함하는 무세포 진피는 100 내지 300 um의 얇은 두께를 가진다. 따라서, 피부유래 세포의 부착 및 배양 효율을 더욱 향상시킬 수 있으며, 피부 결손부에 이식시 조직이 안전하고 효과적으로 재생될 수 있다.
본 발명에서 단계 A) 및 단계 B)는 동물 유래 세포외기질의 코팅 없이 기저막층을 포함하는 무세포 진피 상에 피부유래 세포가 파종될 수 있다.
또한, 본 발명에서 단계 A) 및 단계 B)는 무영양세포(feeder cell free), 무이종(xeno free) 및 무혈청(serum-free) 배양 요소(환경)에서 수행될 수 있다. 상기 무영양세포(feeder cell free), 무이종(xeno free) 및 무혈청(serum-free) 배양 요소는 피더 세포, 우혈청, 돼지 트립신 등의 동물유래 성분을 포함하지 않는 배지에서 배양 및/또는 분화가 수행되는 것을 의미한다. 이를 통해 외래 동물성 유래 물질의 오염 문제를 해소하여 안전성 있는 인공 피부를 제조할 수 있다.
본 발명에서 단계 A)는 기저막층을 포함하는 무세포 진피의 진피 방향에 섬유아세포를 파종한 후 배양하는 단계이다.
본 발명에서 기저막층을 포함하는 무세포 진피의 진피 방향은 기저막층이 형성되지 않는 진피 방향의 면을 의미하며, 진피층이라고 표현할 수 있다.
본 발명에서 섬유아세포는 진피의 주된 구성 세포로써, 세포외기질과 성장인자를 분비하여 진피 조직을 더욱 견고하게 할 수 있다.
일 구체예에서, 파종되는 섬유아세포의 수는 cm2 당 1X 104 내지 1 X 106일 수 있다.
일 구체예에서, 섬유아세포의 배양은 성장인자 기반의 배양 배지를 사용하여 수행할 수 있으며, 구체적으로 배양 배지는 무이종(xeno free) 및 무혈청(serum-free) 배지일 수 있다. 배양은 1 내지 21일 동안 수행될 수 있다.
본 발명에서 단계 B)는 기저막층을 포함하는 무세포 진피의 기저막층 상에 각질형성세포를 파종한 후 배양 및 분화하는 단계이다.
상기 피부각질형성세포는 기저막층을 포함하는 무세포 진피에 부착, 배양 및 분화되어 표피의 역할을 수행할 수 있다. 즉, 본 발명에서는 진피와 표피가 모두 존재하는 전층 인공 피부를 제조할 수 있다.
일 구체예에서, 파종되는 각질형성세포의 수는 cm2 당 5 X 104 내지 1 X 106일 수 있다.
일 구체예에서, 각질형성세포의 배양은 당업계에서 일반적으로 사용되는 각질형성세포 배양 배지를 사용하여 수행할 수 있으며, 구체적으로 배양 배지는 성장인자 기반의 무영양세포(feeder cell free), 무이종(xeno free) 및 무혈청(serum-free) 배지일 수 있다. 배양은 1 내지 7일 동안 수행될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 각질형성세포를 배양한 후, 7 내지 21 일 동안 분화시킬 수 있다.
이때, 분화는 당업계에서 일반적으로 사용되는 각질형성세포 분화 배지를 사용하여 수행될 수 있으며, 구체적으로 분화 배지는 무이종(xeno free) 및 무혈청(serum-free) 배지일 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부 제조 방법에 의해 제조된 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부에 관한 것이다.
본 발명에 따른 인공 피부는 섬유아세포를 포함하는 기저막층을 포함하는 무세포 진피; 및
상기 기저막층을 포함하는 무세포 진피의 기저막층 상에 형성되며, 각질형성세포가 배양 및 분화된 표피로 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 인공 피부는 피부 대체재로서 사용될 수 있으며, 구체적으로, 광범위한 화상, 당뇨병 등으로 인한 피부궤양 또는 피부 손상과 사고, 외상, 노화로 인한 피부조직의 함몰 등에 대한 미용성형 및 재건성형 분야에서 피부 대체재로 사용될 수 있다.
하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범주는 하기 실시예에 한정되는 것이 아니며 첨부된 특허청구범위에 기재된 사항에 의해 도출되는 기술적 사항을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형, 수정 또는 응용이 가능하다는 것을 당업자는 이해할 수 있을 것이다.
실시예
실시예 1. 기저막층을 포함하는 인공 피부 제작
(1) 기저막층을 포함하는 무세포 진피 제조
피부 조직(조직은행으로부터 비영리 목적의 환자 치료를 위해 기증받은 시신으로부터 채취)을 준비하였다.
피부 조직을 더마톰을 이용해, 표피 포함 100 내지 300μm를 절제하여 기저막층을 포함하는 진피를 확보하였다. 그 후 멸균 증류수로 수회 세척하였다.
절제된 기저막층을 포함하는 진피에 알코올(IPA) 및 헥산(Hexane)의 혼합용액을 처리하여 지방을 제거하고, 표피와 진피에 존재하는 세포를 제거하기 위하여 수산화나트륨(NaOH)을 처리하였다(기저막층 포함 무세포 진피 제조).
기저막층 포함 무세포 진피에 과산화수소(H2O2)를 사용하여 피부에 있는 시반을 제거하고 바이러스 불활화를 수행하였다. 세척이 완료된 피부조직은 동결건조를 진행하여 수분을 제거하였고, 멸균하였다.
(2) 인공피부 제작
기저막층 포함 진피를 배양용기에 넣고 진피층이 위로 오게 위치시킨 다음, 배양액에 부유시킨 섬유아세포를 진피층 방향에 파종 및 배양하여 상기 섬유아세포가 진피층 내로 고착하고 증식되도록 유도하였다.
1~21 일간 배양 후, 섬유아세포가 자라고 있는 무세포 진피의 기저막층을 위로 하도록 뒤집고 각질형성세포를 기저막층 방향에 파종하여 1~7 일간 배양하였다. 그 후, 14 일간 각질형성세포 분화 배지 및 ALI(Air-liquid interface) 상태로 유지하여 분화를 유도하여 인공 피부를 제조하였다.
비교예 1. 기저막층을 포함하지 않는 인공 피부 제조
(1) 기저막층 포함하지 않는 무세포 진피 제조
실시예 1의 (1)에서 표피와 기저막층을 제거한 아래로 100 내지 300μm를 절제해 기저막층을 포함하지 않는 진피를 제조한 것을 제외하고는, 실시예의 방법으로 기저막층을 포함하지 않는 무세포 진피를 제조하였다.
(2) 인공 피부 제조
실시예 1의 (2)와 같이 인공 피부를 제조하였다.
본 발명에서 도 1은 얇은 형태의 기저막층을 포함하는 무세포 진피 및 기저막층을 포함하지 않는 무세포 진피를 제작하는 공정을 나타낸다.
도 1에 나타난 바와 같이, 공여된 피부로부터 표피를 포함하여 100 내지 300 μm를 더마톰으로 절제한 기저막층 포함 진피(실시예 1)와 표피와 기저막층이 제거된 아래로 100 내지 300 μm를 더마톰으로 절제한 기저막층 미포함 진피(비교예 1)를 사용하여, 지방 제거, 탈세포화 및 멸균 등의 공정을 통해 기저막층을 포함하는 무세포 진피 및 기저막층을 포함하지 않는 무세포 진피를 제작하였다.
이하, 도면에서 기저막 포함 진피는 기저막층을 포함하는 무세포 진피를, 기저막 미포함 진피는 기저막층을 포함하지 않는 무세포 진피를 사용한 경우를 나타낸다.
실험예 1. 무세포 진피의 두께에 따른 세포 적합성 분석
기저막층을 포함하는 무세포 진피의 두께에 따른 세포 부착 및 증식을 확인하였다.
세척이 완료된 기저막층을 포함하는 무세포 진피를 wet(hydration)한 상태와 동결건조하여 dry한 상태로 1 mm 이하와 2~3 mm 두께로 준비하였다. 이때, 사용된 기저막층을 포함하는 무세포 진피는 두께를 제외하고는 실시예 1의 (1) 방법으로 제조되었다.
상기 기저막층을 포함하는 무세포 진피 위에 cm2 당 2 X 104의 사람 피부유래 섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF)를 분사하여 배양하였다. 세포 부착 및 생존을 확인하기 위해, 배양 7일에 CCK-8 Kit로 흡광도를 측정하여 세포 증식 정도를 확인하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 두께가 상이한 기저막층을 포함하는 무세포 진피에 피부유래 섬유아세포를 배양하여 세포 증식을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 도 2에 나타난 바와 같이, 1 mm 이하의 두께를 가지며 동결건조한 제형(dry한 상태)에서 세포 부착과 세포 증식이 매우 우수한 것을 확인할 수 있다.
실험예 2. 기저막층의 포함 여부에 따른 사람 피부유래 섬유아세포 적합성 분석
(1) 세포 적합성 분석
실시예 1의 (1) 및 비교예 1의 (1)에서 제조한 기저막층을 포함하는 무세포 진피(기저막층 포함 진피) 및 기저막층을 포함하지 않는 무세포 진피(기저막층 미포함 진피)에 대한 세포 적합성을 확인하였다. 상기 세포 적합성은 진피 상에 사람 피부유래 섬유아세포를 배양하여 확인하였다. 본 발명에 사용된 모든 세포는 동물유래 성분이 제거된 조건에서 유지 및 배양되었다.
구체적으로, 실시예 1에서 제조된 기저막층 포함 진피와 비교예 1에서 제조된 기저막층 미포함 진피를 사용하여 세포외기질 성분(CTS, 콜라겐)을 코팅한 상태와 코팅하지 않은 상태에서 cm2 당 1X105의 사람 피부유래 섬유아세포를 포함한 세포혼탁액을 분사하여 배양하였다. 진피 표면에서의 세포 부착 및 증식을 확인하기 위하여, 배양 1일, 4일, 7일, 14일, 21일 동안 세포 배양기에서 배양하였다.
세포 적합성 분석은 다음과 같이 진행하였다. 1일, 4일, 7일, 14일, 21일차에 CCK-8 kit로 흡광도를 측정하여 세포 증식 정도를 확인하였다.
세포 적합성 분석 결과를 도 3(a)에 나타내었다.
도 3(a)는 기저막층의 유무에 따른 기저막층 포함/미포함 진피에서의 섬유아세포의 증식 정도를 확인한 결과를 나타낸다. 상기 도에서 Non coating은 코팅하지 않은 기저막층 포함/미포함 진피, CTS는 세포외기질 성분인 CTS를 코팅한 기저막층 포함/미포함 진피, Collagen은 세포외기질 성분인 콜라겐을 코팅한 기저막층 포함/미포함 진피에서의 흡광도 측정 결과를 나타낸다.
도 3(a)에 나타난 바와 같이, 배양 기간 동안 모든 군에서 섬유아세포의 증식을 확인할 수 있으며, 기저막층 포함 진피가 기저막층 미포함 진피보다 세포 접합성이 우수한 것을 확인할 수 있다.
(2) 세포 부착 및 세포 생존 분석
또한, 실시예 1의 (1)에서 제조된 기저막층 포함 진피와 비교예 1의 (1)에서 제조된 기저막층 미포함 진피에 사람 피부유래 섬유아세포를 배양하고, 배양 1일, 4일, 7일, 14일, 21일 동안 Live/dead cell viability assay(Life Technology, USA)를 이용하여 세포 부착 및 생존 여부를 공초점 현미경(LSM 700, Carl Zeiss, Germany)으로 확인하였다.
세포 부착 및 세포 생존을 도 3(b) 및 (c)에 나타내었다.
도 3(b) 및 (c)는 기저막층 포함 진피(B) 및 기저막층 미포함 진피(C)에 섬유아세포를 배양하여 기간별로 세포 생존(구체적으로, 세포 부착 및 세포 증식)을 확인한 결과를 나타낸다. 7일 이후에는 파종된 면과 반대쪽 면을 모두 관찰하였으며, 초록색은 살아있는 세포를, 빨간색은 사멸한 세포를 나타낸다.
상기 도 3(b)에 나타난 바와 같이, 기저막층 포함 진피 및 기저막층 미포함 진피 모두에서 세포 증식이 활발한 것을 확인할 수 있다. 특히, 기저막층 포함 진피의 경우, 7일 이후부터 세포가 분사된 반대 방향에서도 세포가 증식된 것을 확인할 수 있다.
실험예 3. 기저막층의 포함 여부에 따른 사람 피부유래 각질형성세포 적합성 분석
(1) 세포 적합성 분석
실시예 1의 (1) 및 비교예 1의 (1)에서 제조한 기저막층 포함/미포함 진피에 대한 세포 적합성을 확인하였다. 상기 세포 적합성은 기저막층 포함/미포함 진피 상에 사람 피부유래 각질형성세포(human keratinocytes, HEK)를 배양하여 확인하였다.
구체적으로, 기저막층 포함 진피와 기저막층 미포함 진피을 사용하여 세포외기질 성분(CTS, 콜라겐)을 코팅한 상태와 코팅하지 않은 상태에서 cm2 당 1X105의 각질형성세포를 포함한 세포혼탁액을 분사하여 배양하였다. 진피 표면에서의 세포 부착 및 증식을 확인하기 위하여, 일정 기간 동안 세포 배양기에서 배양하였다.
세포 적합성 분석은 다음과 같이 진행하였다. 1일, 3일, 7일차에 CCK-8 kit로 흡광도를 측정하여 세포 증식 정도를 확인하였다
세포 적합성 분석 결과를 도 4(a)에 나타내었다.
도 4(a)는 기저막층의 유무에 따른 기저막층 포함/미포함 진피에서의 각질형성세포의 증식 정도를 확인한 결과를 나타낸다. 상기 도에서 Non coating은 기저막층 포함/미포함 진피를 코팅하지 않은 상태, CTS는 세포외기질 성분인 CTS를 코팅한 상태, Collagen은 세포외기질 성분인 콜라겐을 코팅한 상태에서의 흡광도 측정 결과를 나타낸다.
도 4(a)에 나타난 바와 같이, 배양 기간 동안 기저막층 포함 진피는 코팅 여부에 관계없이 세포가 증식하였으나, 기저막층 미포함 진피는 시간에 따라 흡광도가 감소하여 세포가 사멸됨을 확인할 수 있다.
(2) 세포 부착 및 세포 생존 분석
또한, 실시예 1에서 제조된 기저막층 포함 진피에 각질형성세포를 배양하고, 배양 1일, 4일, 7일차에 Live/dead cell viability assay(Life Technology, USA)를 이용하여 세포 부착 및 생존 여부를 공초점 현미경(LSM 700, Carl Zeiss, Germany)으로 확인하였다.
본 실험예에서는 기저막층 포함 진피를 코팅하지 않거나 또는 세포외기질(CTS, 콜라겐)로 코팅하여 사용하였다.
세포 부착 및 세포 생존을 도 4(b)에 나타내었다.
도 4(b)는 기저막층을 포함 진피에 각질형성세포를 배양하여 기간별로 세포 생존(구체적으로, 세포 부착 및 세포 증식)을 확인한 결과를 나타낸다. 상기 도 4(b)에서 초록색은 살아있는 세포를, 빨간색은 사멸한 세포를 나타낸다.
도 4(b)에 나타난 바와 같이, 미코팅된 기저막층 포함 진피에 분사된 각질형성세포의 시간에 따른 증식율이 코팅한 인공 피부 지지체 대비 우수한 것을 확인할 수 있다.
(3) 각질형성세포 수에 따른 세포 부착 및 증식의 차이 분석
또한, 각질형성세포 수에 따른 세포 부착 및 증식의 차이를 확인하기 위해, 실시예 1의 (1)에서 제조된 기저막층 포함 진피 위에 cm2 당 1 내지 3 X 105의 각질형성세포를 포함한 세포혼탁액을 분사하여 배양하였다. 배양 1일과 3일차에 Live/dead cell viability assay(Life Technology, USA)를 이용하여 세포 부착 및 생존 여부를 공초점 현미경(LSM 700, Carl Zeiss, Germany)으로 확인하였다.
각질형성세포 수에 따른 세포 부착 및 증식 결과를 도 4(c)에 나타내었다.
도 4(c)는 기저막층 포함 진피에 각질형성세포의 수를 다르게 파종하여 배양하고 기간별 세포 생존을 확인한 결과를 나타낸다. 이때, 초록색은 살아있는 세포를, 빨간색은 사멸한 세포를 나타낸다.
도 4(c)에 나타난 바와 같이, 기저막층 포함 진피에서 세포 수에 따라 각질형성 세포가 증식됨을 확인할 수 있다.
상기 도 3 및 4를 통해 기저막층 포함 진피가 피부유래 세포와 적합성 및 친화성이 있음을 확인할 수 있다.
실험예 4. 기저막층 포함 진피의 인공 피부로서의 적합성 분석
실시예 1의 (1)에서 제조된 기저막층 포함 진피를 사용하여, 진피 방향에 초록색을 나타내는 DiO를 표지한 섬유아세포를 파종하여 배양하고, 기저막층 위에 빨간색을 나타내는 DiI로 표지한 각질형성세포를 파종한 뒤 배양하고, 배양 1일 후 세포 부착 및 형태를 확인하였다.
세포 부착 및 형태를 확인할 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 각질형성세포 및 섬유아세포 모두 기저막층 포함 진피층에 부착하여 증식한 것을 확인할 수 있다.
또한, 각질형성세포 부분을 ALI(air liquid interface)를 통해 분화 유도하였다.
구체적으로, 기저막층 포함 진피의 진피층 위에 섬유아세포를 배양한 후, 각질형성세포를 기저막층 방향에 파종하여 배양한 다음, 14 일간 각질형성세포 분화 배지 및 ALI(Air-liquid interface) 상태로 유지하여 분화를 유도하였다. 이를 통해 인공 피부를 제조하였다.
도 6은 조직학적 분석을 통한 분화 결과를 나타낸다. 피부 유래 세포들이 파종 후 증식하여 14일간 분화 유도된 인공 피부를 중성화 포르말린으로 고정한 뒤, 동결박절하여 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색으로 표본 전체를 관찰하였다.
도 6을 통해, 기저막층 포함 진피에서 각질형성세포가 분화된 인공 피부를 확인할 수 있다.

Claims (11)

  1. 기저막층을 포함하는 무세포 진피의 진피 방향에 섬유아세포를 파종한 후 배양하는 단계; 및
    기저막층을 포함하는 무세포 진피의 기저막층 상에 각질형성세포를 파종한 후 배양 및 분화하는 단계를 포함하는, 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    기저막층을 포함하는 무세포 진피는 a) 피부 조직에서 표피를 제거하여, 100 내지 300 um 두께의 기저막층을 포함하는 진피를 제조하는 단계;
    b) 상기 기저막층을 포함하는 진피에서 지질 성분을 제거하는 단계; 및
    c) 상기 지질 성분이 제거된 기저막층을 포함하는 진피에서 세포를 제거하는 단계를 통해 제조되는 것인, 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부의 제조 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    피부 조직은 동종 또는 이종의 피부 조직인 것인, 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부의 제조 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    단계 b)는 탈지질 용액을 사용하여 수행하며,
    상기 탈지질 용액은 극성 용매, 비극성 용매, 또는 이들의 혼합 용매를 포함하는 것인, 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부의 제조 방법.
  5. 제 2 항에 있어서,
    단계 c)는 탈세포 용액을 사용하여 수행하며,
    상기 탈세포 용액은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부의 제조 방법.
  6. 제 2 항에 있어서,
    기저막층을 포함하는 무세포 진피를 동결 건조 및 멸균하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부의 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    기저막층을 포함하는 무세포 진피에 동물유래 세포외기질을 코팅하지 않고 섬유아세포 및 각질형성세포를 파종하는 것인, 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부의 제조 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    섬유아세포의 배양, 및 각질형성세포의 배양 및 분화는 각각 무영양세포(feeder cell free), 무이종(xeno free) 및 무혈청(serum-free) 배양 요소에서 수행되는 것인, 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부의 제조 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    파종되는 섬유아세포의 수는 cm2 당 1 X 104 내지 1 X 106이며,
    상기 섬유아세포의 배양은 1 내지 21일 동안 수행되는 것인, 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부의 제조 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    파종되는 각질형성세포의 수는 cm2 당 5 X 104 내지 1 X 106이며,
    각질형성세포의 배양은 1 내지 7일 동안 수행되고, 분화는 7 내지 21 일 동안 수행되는 것인, 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부의 제조 방법.
  11. 제 1 항에 따른 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부의 제조 방법에 의해 제조되며,
    섬유아세포를 포함하는 기저막층을 포함하는 무세포 진피; 및
    상기 기저막층을 포함하는 무세포 진피의 기저막층 상에 형성되며, 각질형성세포가 배양 및 분화된 표피로 구성되는, 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부.
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