CN111378149B - 一种用于3d打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统及其制备方法，属于生物材料技术领域。制备过程包括预凝胶态胶原的制备、胶原纤维的制备、活化肝素的制备等。其中，预凝胶态胶原能够在4度保持稳定数月，并具有二次凝胶性能，简化了传统胶原凝胶的制备过程。胶原纤维‑肝素是生长因子的载体，使加入凝胶体系中的生长因子缓慢释放。此凝胶系统可以灵活方便的缓释多种生长因子和添加各种细胞，由于预凝胶状态的胶原具有良好的成型性能，并在37℃条件下迅速凝胶，因此凝胶系统除了三维培养的功能外，还可以进一步的应用于原位注射和生物3D打印中。

Description

一种用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统及其制 备方法

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种用于3D打印和原位注射的因子缓释中性凝胶系统及其制备方法。

背景技术

胶原是一种生物相容性良好的生物材料，广泛应用于组织工程和再生医学领域，现已经有一系列产品如胶原修复膜、胶原骨支架等在临床上取得了应用许可。在实验研究中，鼠尾胶原得到了广泛的应用，未变性的胶原溶解于酸性溶液中，中和后在一定盐浓度下在37℃可形成凝胶。但传统的胶原凝胶存在以下不足：1，浓度低，广泛应用的鼠尾胶原的浓度一般为3mg/mL，当提高其浓度后，则难以中和均匀。此类胶原黏度低，不适用3D打印和原位注射。2，凝胶快，3mg/mL鼠尾胶原在中性条件下，即使在4℃下，会在20分钟内完全凝胶，当浓度提高，凝胶速度会加快，不仅每次使用需要现配，且限制了操作时间。目前，将生长因子固定于冻干态胶原的方法已经趋于成熟，如京尼平、碳二亚胺发等。但是，在含细胞的水凝胶中固定生长因子的情况比较复杂，首先，上述的固定方法会破坏活性细胞，故不可取。其次，胶原凝胶方式为其三股螺旋结构逐级组装，传统的固定方法会影响三螺旋结构使胶原失去凝胶性能。近年来，研究者发现细胞和因子在组织再生修复中起到重要的作用，传统的干态胶原，已经不能满足细胞治疗的要求，因此，亟需研发一种适用于临床上的可负载细胞和生长因子的材料体系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于3D打印和原位注射的因子缓释中性凝胶系统及其制备方法，其为可打印、可原位注射的半凝胶态胶原，且该胶原可以携带细胞和缓释生长因子。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)胶原溶液的制备：以提取的牛跟腱胶原为原材料，将牛跟腱胶原加入0.1-0.5mol/L的乙酸溶液中，制备3-10mg/mL的牛跟腱胶原溶液；

(2)胶原纤维制备：

在牛跟腱胶原溶液中加入0.1mol/L的PBS溶液和1mol/L氢氧化钠溶液，以酚红为指示剂，将溶液中和至红色，得中性溶液；然后将所得溶液倾倒至5-20倍体积的0.001-0.05mol/L浓度PBS溶液中，于20-37℃水浴条件下磁力搅拌1-4小时，搅拌速度为200-5000转/分钟；所得物料经离心分离后，得到胶原纤维；

(3)肝素活化处理：

将肝素溶解于0.05mol/L的吗啉乙磺酸中，得到浓度为1-10mg/mL的肝素的吗啉乙磺酸溶液，再加入NHS和EDC后，使溶液中NHS浓度为0.01-0.1mmol/L，EDC浓度为0.02-0.2mmol/L；所得混合物料在4℃条件下反应12h后，反应产物经丙酮沉淀，冻干，即得到活化肝素；

(4)胶原纤维与肝素的共价接枝：

将步骤(2)制备的胶原纤维分散于0.01mol/L的PBS或50mmol/L(pH 8.2)碳酸氢钠溶液中，再加入活化肝素，活化肝素的加入量为胶原纤维重量的0.01-0.3倍；所得混合物料中胶原纤维含量为1-5wt.％；将所得混合物料在4℃条件下反应12小时后，经0.01mol/L的PBS透析和冻干后，此时肝素共价接枝于胶原纤维表面(肝素上的羧基和胶原纤维表面上的氨基发生共价反应，从而将肝素共价接枝于胶原纤维表面)，得到表面修饰肝素的胶原纤维；

(5)预凝胶胶原的制备：取20mL步骤(1)制备的牛跟腱胶原溶液，使用中和剂将其调至红色；所述中和剂为0.1mol/L的PBS、酚红和1mol/L氢氧化钠溶液，或者所述中和剂为10倍浓缩各种培养基和1mol/L氢氧化钠，以溶液呈现红色判定为中性；中和后的溶液在25-37℃水浴条件下处理5-50分钟，然后在4-10℃离心2-5小时，离心力为10000-30000g，可通过离心时间和离心力调节中性胶原浓度；离心后得到的沉淀使用摇晃加搅拌的方式匀质后，即得到具有一定黏度，置于37℃会两次凝胶的可打印、可注射的预凝胶胶原；预凝胶胶原为形成凝胶的成分，置于体内或在37℃条件下，可以得到中性凝胶。

(6)将步骤(5)制备的预凝胶胶原、步骤(4)制备的表面修饰肝素的胶原纤维和一定浓度的生长因子混合，经4℃处理12小时后，再加入一定量的细胞，所得混合物料即为所述用于3D打印和或原位注射的因子缓释中性凝胶系统。其中生长因子的含量为0.1-1000ng/mL。

上述步骤(1)中，所述牛跟腱胶原的提取过程如下：

将牛跟腱溶解于含有胃蛋白酶的乙酸溶液中，搅拌72h后，依次进行盐析和乙酸透析过程，透析袋截留分子量为3000-10000Da，得到所述牛跟腱胶原，该过程均为无菌操作。

所述含有胃蛋白酶的乙酸溶液的制备过程为：将胃蛋白酶加入浓度为0.1-0.5mol/L的乙酸溶液中，混合均匀后即获得胃蛋白酶的乙酸溶液；该胃蛋白酶的乙酸溶液中胃蛋白酶的含量为1-5mg/mL。

上述步骤(1)中，所述盐析过程采用4mol/L的NaCl溶液，所述透析过程采用0.1-0.5mol/L的乙酸。

本发明设计机理如下：

本发明公开的凝胶体系，通过酶法提取了无菌的牛跟腱胶原，经过处理后，能够在低温下稳定保持半凝胶状态，其特点为：浓度可控、黏度可控、升温后凝胶迅速，其实质为纤维化的胶原和未纤维化胶原的混合物。使中性胶原的原位注射和生物3D打印成为可能。本发明同时合成了一种共价接枝肝素的胶原纤维，肝素对多种生长因子有较强的结合能力，通过共价交联在胶原纤维上的肝素，达到缓释生长因子的目的。本发明将胶原预凝胶和胶原纤维-肝素分开制备，胶原凝胶的过程中，胶原分子逐渐形成胶原纤维并相互交错，最终形成了凝胶结构，本发明将带有肝素的胶原纤维加入正在发生纤维化过程的胶原中，该纤维会被稳定包裹于凝胶之中，使最终的凝胶体系具有了缓释生长因子的能力。综上，本发明得到了一种中性、可负载细胞、可缓释因子的凝胶体系，可用于生物3D打印以及原位注射治疗中。

本发明的优点有有益效果如下：

1、本发明所制备的预凝胶态胶原具有一定的成形性能，且在4度能够稳定存在数月，可均匀混合因子和细胞，在37度条件下又能迅速凝胶。这些性质对胶原的生物加工和原位注射都具有重要意义。

2、本发明所述的凝胶系统具有缓释生长因子、负载细胞的能力，带有细胞和因子的修复材料是组织工程修复材料的发展趋势。

3、本发明所制备的共价交联有肝素的胶原纤维，独立于胶原预凝胶制备，并于凝胶前添加。胶原纤维-肝素反应时所需的缓冲液、交联剂已通过透析除去，不会污染凝胶主体。

附图说明

图1为实施例1中MC3T3-e1在高浓度胶原中生长3天。

图2为成纤维细胞在凝胶表面生长状态；其中：(a)在添加胶原纤维的含bFGF的凝胶表面生长状态；(b)在添加肝素-胶原纤维的含bFGF的凝胶表面生长状态。

图3为本发明制备的预凝胶胶原在4℃储存和37℃培养后的状态；其中：(a)4℃储存2个月的预凝胶胶原；(b)放入37℃培养箱20分钟后的胶原凝胶。

图4为肝素修饰的胶原纤维光镜形貌。

图5为凝胶干燥后表面电镜形貌，可见凝胶实质为交错的纳米纤维。

具体实施方式

以下通过实施例详述本发明。

实施例1

1、胶原提取：

牛跟腱破碎脱脂，浸入0.1mol/L的乙酸溶液中，并加入胃蛋白酶(3mg/mL)。4℃搅拌72小时后，4mol/L氯化钠溶液盐析，所得沉淀使用0.1mol/L乙酸透析，透析袋截留分子量为8000Da。使用乙酸溶液调节浓度，得到6mg/mL的牛跟腱胶原，溶剂乙酸浓度为0.1mol/L，以上步骤均为无菌操作。

2、胶原纤维的制备：

将上述胶原溶液8.09mL、10倍浓度PBS1mL、1mol/L氢氧化钠溶液0.81mL和0.1mL的1mg/mL酚红混合，即可得到红色的中性胶原溶液。将溶液加入10倍体积的0.01mol/L的PBS中，37℃磁力搅拌，搅拌速度为1000转/分钟。搅拌2h后，10000转离心，倾去上清液，得到胶原纤维。

3、肝素活化处理：

肝素溶解于0.05mol/L的吗啉乙磺酸溶液中，得到浓度为1mg/mL的肝素的吗啉乙磺酸溶液，加入NHS和EDC，加入后在溶液中的浓度分别为0.04mmol/L和0.08mmol/L。4℃反应12h，丙酮沉淀，冻干，得活化肝素(图5)。

4、胶原纤维与肝素共价连接：

将胶原纤维分散于0.01mol/L的PBS中，加入0.01倍质量的活化肝素，所得混合物料中胶原纤维含量为2.5wt.％。所得混合物料在4℃反应12小时，透析，冻干。此时肝素共价饰于胶原纤维表面的氨基上，得到表面修饰肝素的胶原纤维(图4)。

5、预凝胶胶原的制备：

步骤(1)制备的牛跟腱胶原溶液8.09mL、0.1mol/L PBS1mL、1mol/L氢氧化钠溶液0.81mL、0.1mL的1mg/mL酚红混合，得到中性胶原溶液。放入25℃的水浴中15分钟，以在10℃以10000转/分钟离心5小时，倾去上清，匀质沉淀，可得到具有一定黏度、置于37℃会再次凝胶的可打印、可注射胶原预凝胶。将该胶原预凝胶在4℃储存2个月和放入37℃培养箱20分钟后状态如图3所示。

6、取步骤(5)制备的0.8mL的中性预凝胶胶原，加入0.1g的表面修饰肝素的胶原纤维和100ng的BMP-2生长因子后，4℃下静置12小时。将MC3T3-e1细胞消化离心，10⁶个细胞于100微升培养基中混入静置后的预凝胶胶原溶液中。将上述混合液挤入培养皿中，放入培养箱内20分钟，此时，胶原已经成为凝胶状态，加入培养基，放入培养箱中继续培养3天后，使用死活染色试剂盒观察细胞的成活率，结果如图1。

实施例2

1、胶原提取：

牛跟腱破碎脱脂，浸入0.1mol/L的乙酸溶液中，并加入胃蛋白酶(3mg/mL)。4℃搅拌72小时后，4mol/L氯化钠溶液盐析，所得沉淀使用0.1mol/L乙酸透析，透析袋截留分子量为8000Da。使用0.1mol/L乙酸溶液调节浓度，得到6mg/mL的牛跟腱胶原，以上步骤均为无菌操作。

2、胶原纤维的制备：

将上述胶原溶液8.09mL、10倍浓度PBS1mL、1mol/L氢氧化钠0.81mL和0.1mL的1mg/mL酚红混合，即可得到红色的中性胶原溶液。。将溶液加入10倍体积的0.01mol/L的PBS中，25℃磁力搅拌，搅拌温度速度为2000转/分钟。1h后，10000转离心，倾去上清，得到胶原纤维。

3、肝素活化处理：：

肝素溶解于0.05mol/L的吗啉乙磺酸溶液中，得到浓度为1mg/mL的肝素的吗啉乙磺酸溶液，NHS和EDC，加入后在溶液中的浓度分别为0.08mmol/L和0.16mmol/L。4℃反应12h，丙酮沉淀，冻干。

4、胶原纤维与肝素共价连接：

将胶原纤维分散于0.01mol/L的PBS中，加入0.05倍质量的活化肝素，所得混合物料中胶原纤维含量为2.5wt.％。所得混合物料在4℃反应12小时，透析，冻干。此时肝素共价饰于胶原纤维表面的氨基上，得到表面修饰肝素的胶原纤维。

5、预凝胶胶原的制备：

步骤(1)制备的酸性牛跟腱胶原溶液10mL的酸性胶原溶液，0.1mol/L PBS1mL、1mol/L氢氧化钠溶液0.85mL、0.11mL的1mg/mL酚红混合，得到中性胶原溶液。。放入37℃的水浴中5分钟，10℃时以10000转/分钟离心5小时，倾去上清，匀质沉淀，可得到具有一定黏度，置于37℃会再次凝胶的可打印、可注射胶原预凝胶。

6、取步骤(5)制备的0.8mL的中性预凝胶胶原，加入0.1g的表面修饰肝素的胶原纤维和100ng的bfgf生长因子，4℃下静置12小时。另设对照组，将表面修饰肝素的胶原纤维替换为未修饰的胶原纤维，其他配比和实验组完全相同。将上述混合物500微升加入24孔板中，放入培养箱中，20分钟后，形成表面光滑的胶原凝胶。将成纤维细胞消化离心，每孔加入500个细胞，加入培养基后，置入培养箱中，帖壁后换液，以后每天2次换液，5d后，使用钙黄绿素对凝胶表面的细胞染色，对比两组细胞的生长情况。结果见图2。

Claims (9)

1.一种可用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

(1)胶原溶液的制备：以提取的牛跟腱胶原为原材料，将牛跟腱胶原加入0.1-0.5mol/L的乙酸溶液中，制备3-10mg/mL的牛跟腱胶原溶液；

(2)胶原纤维制备：

在牛跟腱胶原溶液中加入0.1mol/L的PBS溶液和1mol/L氢氧化钠溶液，以酚红为指示剂，将溶液中和至红色，得中性溶液；然后将所得溶液倾倒至PBS溶液中，于20-37℃水浴条件下磁力搅拌1-4小时，所得物料经离心分离后，得到胶原纤维；

(3)肝素活化处理：

将肝素溶解于吗啉乙磺酸溶液中，得到肝素含量为1-10mg/mL的肝素的吗啉乙磺酸溶液，再加入NHS和EDC；所得混合物料在4℃条件下反应12h后，反应产物经丙酮沉淀，冻干，即得到活化肝素；

(4)胶原纤维与肝素的共价接枝：

将步骤(2)制备的胶原纤维分散于0.01mol/L的PBS或50mmol/L碳酸氢钠溶液中，再加入活化肝素，活化肝素的加入量为胶原纤维重量的0.01-0.3倍，所得混合物料中胶原纤维含量为1-5wt.％；将所得混合物料在4℃条件下反应12小时后，经0.01mol/L的PBS透析和冻干后，此时肝素共价接枝于胶原纤维表面，得到表面修饰肝素的胶原纤维；

(5)预凝胶胶原的制备：取步骤(1)制备的牛跟腱胶原溶液，使用中和剂将其调至红色；中和后的溶液在25-37℃水浴条件下处理5-50分钟，然后在4-10℃离心2-5小时，离心后得到的沉淀使用摇晃加搅拌的方式匀质后，即得到具有一定黏度、置于37℃会再次凝胶的可打印、可注射的预凝胶胶原；

(6)将步骤(5)制备的预凝胶胶原、步骤(4)制备的表面修饰肝素的胶原纤维和生长因子混合，经4℃处理12小时后，再加入一定量的细胞，所得混合物料即为所述可用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统。

2.根据权利要求1所述的可用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述牛跟腱胶原的提取过程如下：

将牛跟腱溶解于含有胃蛋白酶的乙酸溶液中，搅拌72h后，依次进行盐析和乙酸透析过程，透析袋截留分子量为3000-10000Da，得到所述牛跟腱胶原，该过程均为无菌操作。

3.根据权利要求2所述的可用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统的制备方法，其特征在于：所述含有胃蛋白酶的乙酸溶液的制备过程为：将胃蛋白酶加入浓度为0.1-0.5mol/L的乙酸溶液中，混合均匀后即获得胃蛋白酶的乙酸溶液；该胃蛋白酶的乙酸溶液中胃蛋白酶的含量为1-5mg/mL。

4.根据权利要求2所述的可用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述盐析过程采用4mol/L的NaCl溶液，所述透析过程采用0.1-0.5mol/L的乙酸。

5.根据权利要求1所述的可用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所得中性溶液倾倒至PBS溶液中时，所用PBS溶液的浓度为0.001-0.05mol/L，所用PBS溶液的体积为中性溶液体积的5-20倍；所述磁力搅拌的速度为200-5000转/分钟，温度为20-37℃。

6.根据权利要求1所述的可用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述吗啉乙磺酸的浓度为0.05mol/L；在肝素的吗啉乙磺酸溶液中加入NHS和EDC后，溶液中NHS浓度为0.01-0.1mmol/L，EDC浓度为0.02-0.2mmol/L。

7.根据权利要求1所述的可用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，所述中和剂为0.1mol/L的PBS、酚红和1mol/L氢氧化钠溶液，或者所述中和剂为10倍浓缩的各种培养基和1mol/L氢氧化钠，以溶液呈现红色判定为中性。

8.根据权利要求1所述的可用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，离心处理时离心力为10000-30000g，温度为4-10℃，可通过离心时间和离心力以及温度调节中性胶原浓度；所得到的预凝胶胶原为形成凝胶的成分，在37℃条件下，可以得到中性凝胶。

9.一种利用权利要求1所述方法制备的可用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统。

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