TWI566789B - 魚皮衍生組織修復材料及其製造方法 - Google Patents

魚皮衍生組織修復材料及其製造方法 Download PDF

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徐云廷
林育琦
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黃冠豪
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Description

魚皮衍生組織修復材料及其製造方法
本發明是關於組織修復材料，特別是關於一種魚皮衍生組織修復材料及其製造方法，其提供一魚皮衍生組織修復材料，且此魚皮衍生組織修復材料適用於作為貼片、敷料、載體、支架、植入物、或藥劑來修復各種組織。
組織工程係與生物以及藥物之生物材料息息相關，其能夠使進行移植手術之病人增強血管造影、組織整合，以及組織重建；生物材料為人造且具生物相容性的組織修復材料，應用於重建人造器官、修復或修補，甚至取代人體組織。
膠原蛋白是組織修復材料的重要組成，其具有使組織生長、傷口癒合等功能。此外，由於以膠原蛋白為組織修復材料的應用領域規模不斷地擴大，因此，開發更具有醫療價值及更多樣性的具有膠原蛋白的組織修復材料，以應用於各種用途，是現今研發者的主要研究之一。
目前的組織修復材料多半是源自於自體、捐贈者或動物。然而，在某些疾病的治療上，無法取得自體的組織修復材料，或無法取得足夠的自體組織修復材料。再者，源自捐贈者的組織修復材料具有捐贈者的 供應、制備程序複雜、成本相對高、免疫排斥的風險等問題。源自動物的組織修復材料仍具有制備程序複雜、成本相對高、免疫排斥的風險、人畜共生疾病等問題。
在一實施例中，一種魚皮衍生組織修復材料，其包括衍生自魚皮且光學清晰的片狀主體。此光學清晰的片狀主體為去細胞的，且其包括含膠原蛋白基質及於膠原蛋白基質中的水。
在一些實施例中，此光學清晰的片狀主體可具有大於或等於70%的透光度、大於或等於5MPa的極限應力、以及大於或等於40g的可縫性。
在一些實施例中，此膠原蛋白基質可為具有膠原蛋白纖維的層狀結構，並且各膠原蛋白纖維可沿著光學清晰的片狀主體的表面延伸。在另一些實施例中，此膠原蛋白基質可為具有膠原蛋白纖維的層狀結構，並且一部分的膠原蛋白纖維是沿著從光學清晰的片狀主體的一表面到另一表面的方向延伸。
在一些實施例中，此光學清晰的片狀主體可衍生自完全無魚鱗及魚肉的魚皮。
在一些實施例中，此光學清晰的片狀主體可衍生自魚皮且無磨碎過。
在一些實施例中，此光學清晰的片狀主體可由一製造方法製成，且此製造方法包括：去除魚皮上的魚鱗、油脂、細胞、色素及口袋結構以獲得一純化後魚皮、以酸液處理純化後魚皮以獲得未崩解的一塑型態 片狀主體、進行塑型態片狀主體的塑型以獲得具有特定形狀的塑型後片狀主體、以及進行一穩定化程序以穩定塑型後片狀主體。
在一實施例中，一種魚皮衍生組織修復材料的製造方法，其包括：取得無魚肉的魚皮、去除魚皮上的魚鱗、油脂、細胞、色素及口袋結構以獲得一純化後魚皮、以及以酸液處理純化後魚皮以獲得未崩解的塑型態片狀主體。
在一些實施例中，魚皮衍生組織修復材料的製造方法可更包括：水洗塑型後片狀主體。在一些實施例中，組織修復材料的製造方法可更包括：在水洗步驟之前或之後，乾燥塑型後片狀主體。在一些實施例中，組織修復材料的製造方法可更包括：在乾燥步驟之後，使塑型後片狀主體回水。
在一些實施例中，魚皮衍生組織修復材料的製造方法可更包括：進行塑型態片狀主體的塑型以獲得具有特定形狀的塑型後片狀主體。在一些實施例中，塑型步驟可包括裁切塑型態片狀主體以獲得塑型後片狀主體，且此塑型後片狀主體的表面為塑型態片狀主體的截面。在另一些實施例中，塑型步驟可包括裁切塑型態片狀主體以獲得塑型後片狀主體，且此塑型後片狀主體的表面為塑型態片狀主體的表面。
在一些實施例中，魚皮衍生組織修復材料的製造方法可更包括：從塑型態片狀主體萃取出膠原蛋白溶液。
在一些實施例中，魚皮衍生組織修復材料的製造方法可更包括：凍乾塑型態片狀主體。
在一些實施例中，魚皮衍生組織修復材料的製造方法可更包 括：去除塑型態片狀主體的外側層、以及以酸液處理外側層去除後的塑型態片狀主體。
在一實施例中，一種魚皮衍生組織修復材料是由前述任一製造方法所製造。
綜上，根據本發明實施例之魚皮衍生組織修復材料及其製造方法適用於提供組織修復材料，且此組織修復材料適用於作為貼片、敷料、載體、支架、植入物、或藥劑來修復各種組織。此組織修復材料具有膠原蛋白以促進損傷組織的修復並具有預期之組織修復應用所需的特定特徵。再者，依照目前各研究顯示，此組織修復材料無殘留人魚共生疾病(病毒所引發的)的致病因子。
S10‧‧‧取得無魚肉的魚皮
S20‧‧‧純化程序
S30‧‧‧塑型程序
S40‧‧‧穩定化程序
S50‧‧‧裁切程序
S210‧‧‧去除魚皮上的魚鱗
S230‧‧‧去除魚皮上的油脂和細胞
S250‧‧‧去除魚皮上的色素和口袋結構
S310‧‧‧以酸液處理純化後魚皮以獲得未崩解的塑型態片狀主體
S330‧‧‧進行塑型態片狀主體的塑型以獲得具有特定形狀的塑型後片狀主體
S410‧‧‧表面圖案化步驟
S430‧‧‧乾燥塑型後片狀主體
S450‧‧‧直接水洗塑型後片狀主體
S452‧‧‧水洗塑型後片狀主體
S470‧‧‧乾燥塑型後片狀主體
S472‧‧‧再乾燥塑型後片狀主體
S490‧‧‧將塑型後片狀主體泡水以使塑型後片狀主體回水
[圖1]為一實施例之魚皮衍生組織修復材料的製造方法的流程圖。
[圖2]為一實施例之步驟S20的流程圖。
[圖3]為一實施例之步驟S30的流程圖。
[圖4]為另一實施例之魚皮衍生組織修復材料的製造方法的流程圖。
[圖5]為第一實施例之步驟S40的流程圖。
[圖6]為第二實施例之步驟S40的流程圖。
[圖7]為第三實施例之步驟S40的流程圖。
[圖8]為第四實施例之步驟S40的流程圖。
[圖9]為第五實施例之步驟S40的流程圖。
[圖10]為第六實施例之步驟S40的流程圖。
[圖11]為第七實施例之步驟S40的流程圖。
[圖12]為第八實施例之步驟S40的流程圖。
[圖13]為又一實施例之魚皮衍生組織修復材料的製造方法的流程圖。
[圖14]為一實施例之原始魚皮的表面的照片。
[圖15-17]為一實施例之原始魚皮的掃描式電子顯微鏡(SEM)的顯微照片。
[圖18]為一實施例之第二純化後魚皮的SEM的顯微照片。
[圖19]為一實施例之第一塑型態片狀主體的照片。
[圖20]為一實施例之第一塑型態片狀主體的SEM的顯微照片。
[圖21]為一實施例之第一塑型態片狀主體的染色切片的顯微照片。
[圖22]為一實施例之第一穩定態片狀主體的照片。
[圖23-24]為一實施例之第一穩定態片狀主體的SEM的顯微照片。
[圖25]為一實施例之第四穩定態片狀主體的SEM的顯微照片。
[圖26]為一實施例之第五穩定態片狀主體的SEM的顯微照片。
[圖27]為一實施例之第六穩定態片狀主體的SEM的顯微照片。
[圖28]為一實施例之第七穩定態片狀主體的SEM的顯微照片。
以下述及之「第一」、「第二」、「第三」...等序號用語，其係用以區別所指之元件，而非用以排序或限定所指元件之差異性，且亦非用以限制本發明之範圍。
在一實施例中，魚皮衍生組織修復材料包括衍生自魚皮的片狀主體。此片狀主體為去細胞的，且其包括膠原蛋白基質及於膠原蛋白基 質中的水。此衍生自魚皮的片狀主體具有足以適用於各種組織修復應用的可縫性。其中，魚皮衍生組織修復材料適用於作為貼片、敷料、載體、支架、植入物、或藥劑來修復各種組織，例如：眼科組織、口內組織、皮膚、骨組織等。在一些實施例中，此片狀主體可為光學清晰的片狀主體，以便於觀察傷口及/或適用於修復眼科組織。在一些實施例中，此片狀主體可更具有足以作為貼片、敷料、載體、支架或植入物的極限應力。
在一些實施例中，光學清晰的片狀主體可具有大於或等於70%的透光度、大於或等於5MPa的極限應力、以及大於或等於40g的可縫性。
在一些實施例中，膠原蛋白基質可為層狀結構，並且此層狀結構包括複數膠原蛋白纖維。在一些實施例中，各膠原蛋白纖維可沿著片狀主體的表面延伸。在另一些實施例中，複數膠原蛋白纖維可有一部分的膠原蛋白纖維是沿著從片狀主體的一表面到另一表面的方向延伸，而另一部分則以不同方向延伸(如，沿著片狀主體的表面延伸)。
參照圖1，在一實施例中，魚皮衍生組織修復材料的製造方法主要具有執行在取得無魚肉之一魚皮(步驟S10)之後的一純化程序(步驟S20)及一塑型程序(步驟S30)。
在步驟S10的一些實施例中，魚皮可為具有魚鱗但無魚肉的一原始魚皮。在一些實施例中，可從能提供產銷履歷等相關證明文件之魚場取得一魚，再將取得的魚皮肉分離，以得到帶有魚鱗但無魚肉的原始魚皮。在一些實施例中，提供魚皮的魚的魚種可為諸如鱸魚、鯛魚、鮨科魚(如，石斑魚等)、吳郭魚...等色素僅存在於魚皮表層之魚種。
參照圖2，純化程序(步驟S20)包括去除魚皮上的魚鱗(步 驟S210)、去除魚皮上的油脂和細胞(步驟S230)、以及去除魚皮上的色素和口袋結構(步驟S250)。此純化程序(步驟S20)執行完成即得到一純化後魚皮。
在步驟S210的一實施例中，可透過至少一種方式(以下稱第一方式)完全去除原始魚皮上的魚鱗以得到一去魚鱗魚皮，然後以乾淨的水清洗去魚鱗魚皮以去除去魚鱗魚皮上的雜質，例如：組織液、血水或其組合。在一些實施例中，第一方式可是物理方式、化學方式或其組合。舉例來說(但不限於此)，在物理方式上，可用手將原始魚皮上的魚鱗剝除、可用刨刀刮除原始魚皮上的魚鱗、可用液體剪切力將原始魚皮上的魚鱗去除、可用高壓氣(液)體將原始魚皮上的魚鱗去除、或將原始魚皮浸泡在25℃~60℃的溫水中以去除魚鱗。在化學方式的一實施例中，舉例來說(但不限於此)，原始魚皮透過浸泡酸液以去除魚鱗。在一些實施例中，酸液可為有機酸或無機酸。其中，酸液可為琥珀酸、甲酸、醋酸、檸檬酸、丙酮酸、胡索酸、鹽酸(HCl)、硝酸(HNO3)、或硫酸(H2SO4)。在化學方式的另一實施例中，舉例來說(但不限於此)，原始魚皮是透過浸泡鹼液，以去除魚鱗。其中，鹼液可為氫氧化鈉(NaOH)或氫氧化鉀(KOH)。在化學方式的又一實施例中，舉例來說(但不限於此)，原始魚皮透過浸泡雙氧水(H2O2)，以去除魚鱗。
在步驟S230的一實施例中，去魚鱗魚皮上的油脂和細胞能透過同一處理作業或不同處理作業去除。最後，處理後魚皮(即，去油脂和去細胞後的去魚鱗魚皮)進行水洗以去除處理後魚皮上的雜質及/或中和處理後魚皮的pH值。其中，所使用的水可為乾淨的水、去離子水、二 次去離子水(DDW)、生理鹽水、磷酸鹽緩衝溶液(PBS)、或磷酸緩衝溶液(PB)。在一些實施例中，去魚鱗魚皮可以化學藥劑來去除油脂。其中，所使用的化學藥劑可為醇類溶液、鹼液或其任意組合。舉例來說(但不限於此)，醇類溶液可為異丙醇。舉例來說(但不限於此)，鹼液可為NaOH或KOH。在一些實施例中，去魚鱗魚皮可透過至少一種方式(以下稱第二方式)來去除細胞。在一些實施例中，第二方式可為化學方式、酵素處理方式、物理方式、或其任意組合。在化學方式上，是使用化學藥劑來去除去魚鱗魚皮上的細胞。其中，所使用的化學藥劑可為鹽類、鹼液、酸液、氧化劑、螯合劑、或其任意組合。舉例來說(但不限於此)，鹽類可為氯化鈉(NaCl)或氯化鉀(KCl)。舉例來說(但不限於此)，鹼液可為NaOH或KOH。舉例來說(但不限於此)，酸液可為琥珀酸、甲酸、醋酸、檸檬酸、丙酮酸、胡索酸、HCl、HNO3、或H2SO4。舉例來說(但不限於此)，氧化劑可為雙氧水或過硫酸根。舉例來說(但不限於此)，螯合劑可為含過渡金屬元素的試劑，例如：Ca2+、Fe2+、Mn2+...等。在酵素處理方式上，是使用至少一種酵素來去除去魚鱗魚皮上的細胞。其中，所使用的酵素可為蛋白酶、核酸內切酶、或核酸外切酶。舉例來說(但不限於此)，核酸內切酶可為EcoRI、BamHI、HindIII、TaqI、NotI、HinfI、或Sau3A。舉例來說(但不限於此)，核酸外切酶可為核糖核酸酶R、核糖核酸酶II、核糖核酸酶D、RNase BN、核糖核酸酶PH、或核酸外切酶I。在物理方式的一些實施例，能透過冷凍去魚鱗魚皮以去除去魚鱗魚皮上的細胞。在步驟S230的一示範例上，將去魚鱗魚皮浸泡在NaOH與NaCl的混合溶液中12~24小時，並且於浸泡過程中置換混合溶液數次，以得到 處理後魚皮。於浸泡後，處理後魚皮以DDW洗去浸泡之混合溶液，直到魚皮的pH值恢復中性。在一些實施例中，於步驟S230的執行過程中，處理溫度可控制在4℃~20℃。舉例來說(但不限於此)，在步驟S230的執行過程中，所有使用的溶液均具有4℃~20℃的溶液溫度及/或將環境溫度控制在4℃~20℃。
在步驟S250的一實施例中，去魚鱗魚皮(中性)上的色素和口袋結構能透過同一處理作業或不同處理作業去除。在一實施例中，處理後魚皮浸泡在至少一種酸液中，以致使處理後魚皮膨潤(以下稱膨潤魚皮)。然後，膨潤魚皮施以去口袋方式，以去除膨潤魚皮上的口袋結構。其中，舉例來說(但不限於此)，所使用的酸液可為琥珀酸、甲酸、醋酸、檸檬酸、丙酮酸、胡索酸、HCl、HNO3、或H2SO4。於此，依照不同種類的酸液會選用不同的酸液濃度。並且，依照不同的酸液濃度會搭配不同的浸泡時間。舉例來說(但不限於此)，當使用0.01M~0.5M醋酸時，浸泡時間可為0.5小時~18小時；或者，當使用0.3M醋酸時，浸泡時間可為約30分鐘~50分鐘。再者，處理參數(即，酸液濃度和浸泡時間)亦會依照處理後魚皮的尺寸而有所調整。在一示範例中，於實施去口袋方式時，可同時將膨潤魚皮上的色素去除。在另一示範例中，膨潤魚皮能另外施以去色素藥劑來去除膨潤魚皮上的色素。在去口袋方式的一些實施例中，能使用鈍器來以去除膨潤魚皮上的口袋結構。舉例來說(但不限於此)，所使用的鈍器可為手(如，手指)、鐵片、塑膠片、或任何不會損傷魚皮表面的器具。在一些實施例中，所使用的去色素藥劑可為氧化劑(如，雙氧水或次氯酸鈉)或界面活性劑(如，Triton X100)。在一些實施例中， 於實施去口袋方式的過程中，能同時去除掉膨潤魚皮上的紋路、肌肉組織和不必要的殘留組織。
應能明瞭的，流程之步驟順序僅為示意，其是供本技術領域具有通常知識者瞭解本發明之用，而非對本發明之實施範圍加以限制，熟習相關技藝者應可瞭解在合理情況下部分步驟的執行順序可同時進行、先後對調或合併執行。舉例來說，根據各步驟的執行內容，步驟S210、步驟S230和步驟S250中任二個步驟或三個步驟可合併成一個步驟。舉例來說，將魚皮浸泡在酸液中以使魚皮膨潤，然後以鈍器同時去除膨潤魚皮上的魚鱗和口袋結構。
參照圖3，塑型程序(步驟S30)包括以酸液處理純化後魚皮以獲得未崩解且衍生自魚皮的塑型態片狀主體(步驟S310)，以及將塑型態片狀主體塑型成一特定形狀，以獲得具有特定形狀且衍生自魚皮的塑型後片狀主體(步驟S330)。其中，此塑型後片狀主體可為光學清晰的。
在步驟S310的一些實施例中，純化後魚皮浸泡在至少一種酸液中，以致使純化後魚皮膨潤但未崩解(即，衍生自魚皮的塑型態片狀主體)。然後，將此塑型態片狀主體以各種器具或模具塑形成特定形狀以形成塑型後片狀主體(即，具有特定形狀的塑型態片狀主體)。其中，舉例來說(但不限於此)，所使用的酸液可為琥珀酸、甲酸、醋酸、檸檬酸、丙酮酸、胡索酸、HCl、HNO3或H2SO4。於此，依照不同種類的酸液會選用不同的酸液濃度。並且，依照不同的酸液濃度會搭配不同的浸泡時間。再者，處理參數(即，酸液濃度和浸泡時間)亦會依照處理後魚皮的 尺寸而有所調整。在一些實施例中，塑型後片狀主體的特定形狀可為二維片狀、表面平整的袋狀、弧狀、管狀、直線或非直線條狀(如，單一條或多條串接成)、球狀(如，粉末或細粒)、塊狀、針狀、實心多邊形、或中空多邊形。
在一些實施例中，於執行塑型步驟(步驟S330)的過程中，塑型態片狀主體可裁切成一特定尺寸。在一示範例中，於裁切之後，塑型後片狀主體的表面是源自塑型態片狀主體的表面(即，塑型態片狀主體的表面的一小區塊)。在另一示範例中，於裁切之後，塑型後片狀主體的表面是源自塑型態片狀主體的截面(即，塑型後片狀主體的上表面及/或下表面為塑型態片狀主體的截面，而塑型後片狀主體的側邊為塑型態片狀主體的表面的一小區塊)。
在一些實施例中，於執行塑型步驟(步驟S330)的過程中，並未將塑型態片狀主體磨碎。
在另一實施例中，參照圖4，於執行塑型程序(步驟S30)之後，可執行一穩定化程序(步驟S40)。
在一實施例中，穩定化程序(步驟S40)可包括穩定塑型後片狀主體以獲得穩定態之光學清晰的片狀主體。
在穩定步驟的第一實施例中，參照圖5，於執行塑型程序(步驟S30)之後，可直接水洗塑型態片狀主體，直至片狀主體的pH值為中性(步驟S450)。換言之，於塑型程序(步驟S30)與水洗步驟(步驟S450)之間無任何乾燥步驟。
在穩定步驟的第二實施例中，參照圖6，於執行塑型程序(步 驟S30)之後，可直接水洗塑型態片狀主體，直至片狀主體的pH值為中性(步驟S450)，以獲得衍生自魚皮的中性片狀主體。於水洗步驟之後，乾燥中性片狀主體(步驟S470)，然後再浸泡在水中以使片狀主體回水(步驟S490)。
在穩定步驟的第三實施例中，參照圖7，於執行塑型程序(步驟S30)之後，可先乾燥塑型後片狀主體(步驟S430)，然後進行水洗直至片狀主體的pH值恢復中性(步驟S452)，以獲得衍生自魚皮的中性片狀主體。
在穩定步驟的第四實施例中，參照圖8，於執行塑型程序(步驟S30)之後，可先乾燥塑型後片狀主體(步驟S430)，然後進行水洗直至片狀主體的pH值恢復中性(步驟S452)，以獲得衍生自魚皮的中性片狀主體。於水洗步驟之後，再乾燥中性片狀主體(步驟S472)，然後將中性片狀主體浸泡在水中以使片狀主體回水(步驟S490)。
在穩定化程序(步驟S40)中，所使用的水可為乾淨的水、去離子水、DDW、生理鹽水、PBS或PB。在穩定化程序(步驟S40)中，所使用的乾燥方式可以是溫和的乾燥方式，例如：風乾或低溫乾燥。
在另一實施例中，參照圖9~12，於穩定化程序(步驟S40)中，在執行穩定步驟之前，可先執行一表面圖案化步驟(步驟S410)。
在表面圖案化步驟(步驟S410)的一實施例中，可將塑型後片狀主體放入具有特定圖案的模具中，以致使塑型後片狀主體的表面具有對應於特定圖案的紋路(以下稱表面紋路)。塑型後片狀主體的表面紋路和模具內表面的特定圖案是匹配的。舉例來說(但不限於此)，表面紋 路可為凸紋、凹紋或其組合。換句話說，模具內表面的特定圖案可相對為凹槽圖案、凸起圖案或器組合。
在一些實施例中，表面圖案化步驟(步驟S410)可合併至塑型步驟(步驟S330)。即，表面紋路可於塑型步驟(步驟S330)中形成，而於穩定化程序(步驟S40)中則無表面圖案化步驟(步驟S410)。
在一些實施例中，塑型程序(步驟S30)和穩定化程序(步驟S40)可交替執行一次或反覆執行數次(未顯示)。
在又一實施例中，參照圖13，於穩定化程序(步驟S40)之後，可執行一裁切程序(步驟S50)。於裁切程序(步驟S50)中，可依產品需求將穩定態之光學清晰的片狀主體裁切成特定尺寸。
在一些實施例中，在純化程序(步驟S20)和塑型程序(步驟S30)之間、或在塑型程序(步驟S30)和穩定化程序(步驟S40)之間可執行一交聯程序。再者，此交聯程序亦可是與塑型程序(步驟S30)同時執行、或是與穩定化程序(步驟S40)同時同時執行。於執行交聯程序的過程中，純化後魚皮或光學清晰的片狀主體以至少一種交聯方式進行處理，以進一步增強機械特性。在一些實施例中，交聯方式可為物理交聯方式或化學交聯方式。舉例來說(但不限於此)，物理交聯方式可為照射紫外光(UV)、照射γ射線(γ-ray)或加熱。舉例來說(但不限於此)，化學交聯方式可使用戊二醛(glutaraldehyde；GA)、丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether；BDDE)、天然交聯劑(genipin)、或EDC/NHS(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide/N-hydroxysuccinimide)等交聯劑。
在一些修飾態樣中，可調整塑型程序(S30)的步驟，並且移除於塑型程序(S30)之後的程序。其中，調整後的塑型程序可包括以酸液處理純化後魚皮以獲得衍生自魚皮的塑型態片狀主體，以及從塑型態片狀主體萃取出一膠原蛋白溶液。於此，膠原蛋白溶液即為得到的魚皮衍生組織修復材料。在一些示範例中，調整後的塑型程序可移除塑型步驟(步驟S330)。在其他示範例中，調整後的塑型程序仍可保留有塑型步驟(步驟S330)以將塑型態片狀主體裁切成適合進行萃取的特定尺寸及/或特定形狀。
再者，在調整後的塑型程序中，可在酸處理步驟與萃取步驟之間，進行一中和步驟以使塑型態片狀主體的pH值恢復中性。舉例來說，中和步驟可包括水洗塑型態片狀主體。
在其他修飾態樣中，可調整塑型程序(S30)的步驟，並移除於塑型程序(S30)之後的程序。於此，調整後的塑型程序可包括以酸液處理純化後魚皮以獲得未崩解且衍生自魚皮的塑型態片狀主體(步驟S310)，以及凍乾塑型態片狀主體以獲得一膠原蛋白海綿。於此，膠原蛋白海綿即為得到的魚皮衍生組織修復材料。在一些示範例中，調整後的塑型程序可移除塑型步驟(步驟S330)。在其他示範例中，調整後的塑型程序仍可保留有塑型步驟(步驟S330)並在酸處理步驟(步驟S310)與凍乾步驟之間執行。
再者，在調整後的塑型程序中，可在酸處理步驟(步驟S310)(或塑型步驟(步驟S330))與凍乾步驟之間，進行一中和步驟以使片狀主體的pH值恢復中性。舉例來說，中和步驟可包括水洗片狀主體。
在又一些修飾態樣中，可調整塑型程序(S30)的步驟。於此，調整後的塑型程序中可進行數次酸處理步驟(步驟S310)。並且，於任兩次酸處理步驟(步驟S310)之間，去除塑型態片狀主體的至少一外側層。最後，能得到為膠原蛋白薄膜的魚皮衍生組織修復材料。其中，每次酸處理步驟(步驟S310)的處理參數(如，酸液種類、酸液濃度、浸泡時間)可相同、或不同、或其組合。
在一些示範例中，調整後的塑型程序可移除塑型步驟(步驟S330)。在其他示範例中，調整後的塑型程序仍可保留有塑型步驟(步驟S330)並在任意一次酸處理步驟(步驟S310)之後執行。
在一些示範例中，可移除於塑型程序(S30)之後的程序。在其他示範例中，調整後的塑型程序仍可保留有仍可保留塑型程序(S30)之後的程序。若塑型程序(S30)之後的程序被移除，可在完成所有酸處理步驟(步驟S310)之後，進行一中和步驟以使片狀主體的pH值恢復中性。舉例來說，中和步驟可包括水洗片狀主體。
製備程序1：SEM樣本製備
樣本(即，欲觀察的魚皮或欲觀察的片狀主體)置於去離子水中30分鐘。然後，將去離子水置換成2.5%戊二醛溶液，並且將樣本浸泡在戊二醛溶液中20分鐘。於戊二醛溶液浸泡完成之後，以去離子水清洗樣本10分鐘且清洗三次。接著，加入1%鋨酸(osmic acid)以與樣本反應2小時。然後，除去鋨酸，並且以去離子水清洗樣本10分鐘且清洗三次。接者，以梯度濃度(30%、50%、70%、80%、90%、95%、及100%)的酒精(alcohol)使樣本脫水。然後，將樣本放入臨界點乾燥機(EM CPD300, Leica)乾燥，即獲得能以掃描式電子顯微鏡(SEM)(S-3000N,Hitachi)進行SEM量測/觀察的樣品(以下稱SEM樣本)。
製備程序2：冷凍切片及H&E染色
樣本(即，欲觀察的片狀主體)以4%三聚甲醛(paraformaldehyde)固定24小時，再以30%蔗糖溶液(sucrose solution)於4℃下脫水，以預防水份產生冰晶破壞樣本的組織。脫水樣本放入預先加足包埋劑(O.C.T)的模具中，並且利用液態氮瞬間冰凍。待O.C.T定型完成後，以冷凍切片機(CM1900,Leica)於-25℃進行切片，以得到切片樣本。於此，切片樣本的切片厚度為10μm。將切片樣本置入hematoxyline溶液進行染色，並於室溫靜置1分鐘。接著，以去離子水浸泡沖洗切片樣本10分鐘，再置入eoxin溶液染色6分鐘。然後，以去離子水沖洗切片樣本8分鐘。接著，將切片樣本依序以梯度濃度(75%、85%、95%及100%)的酒精進行脫水，風乾後將其封片，並於光學顯微鏡(DM6000B,Leica)下觀察。
測試程序1：機械測試
將樣本(即，欲測試的片狀主體)依照ASTM D638-2003規範切成啞鈴型，然後，固定於萬能試驗機(3365,INSTRON)的夾具上。機械測試以萬能試驗機以速度5mm/min及力量500N進行測試。於此，每組進行測試的切片樣本數為大於或等於6，並計算切片樣本所測得的極限應力的平均。
測試程序2：透光度測試
將樣本(即，欲測試的片狀主體)浸泡在DDW中16小時以 使片狀主體回水。其中，樣本與DDW的比例為8片樣本浸泡於500ml DDW中。將樣本裁切成直徑0.7cm的小圓片，然後將小圓片置於微量多孔盤底部，並加入100μl DDW。而微量多孔盤的控制孔中則只加入100μl DDW。然後，以酵素免疫分析測讀儀(ELISA meter)(Sunrise,TECAN)進行400nm~700nm全波常進行讀盤，並且計算讀取到的全波長吸光值的平均。然後，根據下列公式計算出透光度：A=log(1/T)
T代表透光度，而A代表小圓片的讀取吸光值的平均。
測試程序3：厚度測試
樣本(即，欲測試的片狀主體)的厚度是以膜厚計隨機測定不同位置的多個點，然後取平均而得。
測試程序4：可縫性測試
將樣本(即，欲測試的片狀主體)裁切成1*1cm尺寸，以不可吸收縫線(STIN-ST44.0)穿線於魚皮上下距邊界0.2cm處。然後，將上縫線固定懸掛在可縫性測試臺上，下縫線則懸掛重物。持續增加下縫線懸掛重物的重量直至魚皮無法承受重量破裂，此時下縫線所懸掛重物的重量即為此樣本的可縫性。
測試程序5：含水率測試
取乾燥的樣本(即，欲測試的片狀主體)秤重並記錄原始重量。接著，利用烘箱以105±3℃加熱樣本，直到重量變異小於原始重量的0.05%，並且持續兩次。於加熱之後，再將樣本秤重並記錄加熱後重量。然後，根據下列公式計算出含水率：含水率=[(原始重量-加熱後重量)/原 始重量]×100%。
實驗1：原始魚皮的觀察
巨觀下，帶魚鱗的原始魚皮是白色不透明的，並且原始魚皮在口袋結構的部分有大量的色素，如圖14所示。
帶魚鱗的原始魚皮以製備程序1處理成SEM樣本。
圖15顯示原始魚皮的截面，其中原始魚皮的表面具有類似口袋凸起的結締組織，以包覆魚鱗。圖16及17顯示在高倍率觀察下之原始魚皮的截面，其中除了口袋結構，原始魚皮為一層狀結構。
實驗2：純化程序
於取得原始魚皮(應置於小於4℃的低溫下)之後，將原始魚皮上的魚鱗以人工方式完全去除以得到去魚鱗魚皮，然後以乾淨的水清洗去魚鱗魚皮以去除組織液與血水，以獲得乾淨的去魚鱗魚皮。將乾淨的去魚鱗魚皮以0.5M NaOH/0.5M NaCl的混合溶液浸泡12小時，以致使去魚鱗魚皮膨潤(腫脹)並呈現半透明(以下稱處理後魚皮)。然後，使用等體積的水攪拌清洗處理後魚皮，並換水一次或多次，直至混合溶液洗淨(即，直至魚皮變白色且pH值為中性)。再將處理後魚皮(中性)浸泡在1L/0.3M醋酸溶液60分鐘。於醋酸的浸泡後，處理後魚皮表面上的口袋結構會變的脆弱，然後以手完全去除口袋結構，以獲得純化後魚皮(以下稱第一純化後魚皮)。
實驗3：純化程序
於取得原始魚皮(應置於小於4℃的低溫下)之後，將原始魚皮上的魚鱗以人工方式完全去除以得到去魚鱗魚皮，然後以乾淨的水清 洗去魚鱗魚皮以去除組織液與血水，以獲得乾淨的去魚鱗魚皮。將乾淨的去魚鱗魚皮以0.1M NaOH/10M NaCl的混合溶液浸泡12小時，以致使去魚鱗魚皮膨潤(腫脹)並呈現半透明(以下稱處理後魚皮)。然後，使用等體積的水攪拌清洗處理後魚皮，並換水一次或多次，直至混合溶液洗淨(即，直至魚皮變白色且pH值為中性)。再將處理後魚皮(中性)浸泡在0.1M醋酸溶液30分鐘。於醋酸的浸泡後，處理後魚皮表面上的口袋結構會變的脆弱，然後以鈍器完全去除口袋結構，以獲得純化後魚皮(以下稱第二純化後魚皮)。
實驗4：第二純化後魚皮的觀察
第二純化後魚皮以製備程序1處理成SEM樣本。
第二純化後魚皮的截面具有膠原蛋白基質、此膠原蛋白基質為層狀結構，且此層狀結構形成有複數膠原蛋白纖維，如圖18所示。參照圖18，膠原蛋白纖維鬆散地排列成層狀結構的複數層、在相同層的膠原蛋白纖維是以相同方向排列，並且不相鄰二層的膠原蛋白纖維以90度交疊。並且，存在有垂直於水平層的縱向纖維。
實驗5：塑型程序、穩定化程序及交聯程序
將第一純化後魚皮浸泡在0.5L/0.3M醋酸溶液24小時，以致使第一純化後魚皮變成塑型態(以下稱第一塑型態片狀主體)，因此可簡單地控制/調整其厚度與形狀。
將第一塑型態片狀主體置入平滑表面的模具內以得到塑型後片狀主體，然後將塑型後片狀主體與模具一同置入抽氣櫃中乾燥直至塑型後片狀主體完全乾燥。於乾燥後，再將塑型後片狀主體浸泡在1L水中攪 拌清洗至溶液洗去。接著，將塑型後片狀主體再置入模具中，並且再次進行完全乾燥。於是，即可得到穩定態的光學清晰的片狀主體(以下稱第一穩定態片狀主體)。
在一實驗中，第一穩定態片狀主體置放於距紫外光燈管(110V、8W且254nm)50cm處，每一面照射60分鐘並照射2次，以得到穩定態的光學清晰的片狀主體(以下稱第二穩定態片狀主體)。
在另一實驗中，第一穩定態片狀主體放入1%BDDE(或0.05%GA)溶液中攪拌浸泡12小時，再以去離子水浸泡沖洗3次(每次10分鐘)，以得到穩定態的光學清晰的片狀主體(以下稱第三穩定態片狀主體)。
實驗6：第一塑型態片狀主體的觀察
巨觀下，第一塑型態片狀主體呈透明的水膠狀態，如圖19所示。
第一塑型態片狀主體以製備程序1處理成SEM樣本。圖20顯示在SEM量測下之第一塑型態片狀主體的截面，其中第一塑型態片狀主體的層狀結構為鬆散的。
第一塑型態片狀主體以製備程序2處理成染色切片樣本。從第一塑型態片狀主體的染色切片樣本可觀察到第一塑型態片狀主體無細胞殘留，如圖21所示。
實驗7：第一到第三穩定態片狀主體的觀察
巨觀下，第一穩定態片狀主體是透明且平整的，如圖22所示。
第一穩定態片狀主體以製備程序1處理成SEM樣本。圖23及 24顯示在SEM量測下之第一穩定態片狀主體的截面，其中第一穩定態片狀主體的結構致密，並且第一穩定態片狀主體的表面是平整的。
第一至第三穩定態片狀主體的平均極限應力如下表1所示。
由此可見，第一至第三穩定態片狀主體的平均極限應力可接近或大於正常人類角膜。
實驗8：塑型程序
第二純化後魚皮裁切成直徑16mm的小圓片並且分成40組。40組小圓片以不同反應條件(如下表2)浸泡醋酸。
於醋酸浸泡完成後，第30組及第33組至第40組的第二純化後魚皮已崩解，即，無法維持其形態。
實驗9：塑型程序與穩定化程序
將第二純化後魚皮的魚背、腹及尾巴等膠原蛋白含量少之部位(其無法達到良好的膨潤狀態)切除，以保留第二純化後魚皮的中央部位。中央部位的尺寸為7*24cm。再將中央部位裁切成7*3cm(共8片)。其中，每一片的表面源自中央部位的表面。將每一片浸泡在0.5L/0.1M醋酸溶液6小時，並且冷藏16小時。接著，每一片再分層成複數片狀主體(以下稱第二塑型態片狀主體)。
第二塑型態片狀主體根據前述第一實施例之穩定步驟進行處理，以得到穩定態之光學清晰的片狀主體(以下稱第四穩定態片狀主體)。第二塑型態片狀主體根據前述第二實施例之穩定步驟進行處理，以得到穩定態之光學清晰的片狀主體(以下稱第五穩定態片狀主體)。第二塑型態片狀主體根據前述第三實施例之穩定步驟進行處理，以得到穩定態之光學清晰的片狀主體(以下稱第六穩定態片狀主體)。第二塑型態片狀主體根據前述第四實施例之穩定步驟進行處理，以得到穩定態之光學清晰的片狀主體(以下稱第七穩定態片狀主體)。
實驗10：第四至第七穩定態片狀主體的觀察
圖25顯示在SEM量測下之第四穩定態片狀主體的截面，其中第四穩定態片狀主體雖保有縱向膠原蛋白纖維，但第四穩定態片狀主體的結構是鬆散的且其平均極限應力相對低(膨潤型態)。
圖26顯示在SEM量測下之第五穩定態片狀主體，其中第五穩定態片狀主體仍保有縱向膠原蛋白纖維，並且第五穩定態片狀主體的透光度約為70%。
圖27顯示在SEM量測下之第六穩定態片狀主體，其中雖然第六穩定態片狀主體損失一些縱向膠原蛋白纖維，但第六穩定態片狀主體仍有大部分的縱向膠原蛋白纖維。第六穩定態片狀主體的透光度約為80%-85%。
圖28顯示在SEM量測下之第七穩定態片狀主體，其中雖然第七穩定態片狀主體損失一些縱向膠原蛋白纖維，但其結構是整齊緊密堆疊，且第七穩定態片狀主體仍具有大部分的縱向膠原蛋白纖維。第七穩定態片狀主體的透光度大於90%。第七穩定態片狀主體的平均極限應力是第五穩定態片狀主體的2.5倍。第七穩定態片狀主體的平均極限應力與第六穩定態片狀主體的平均極限應力無顯著差異。
實驗11：不同厚度
在一實驗中，第二塑型態片狀主體以2mm夾製具進行厚度裁切，並且根據前述第四實施例的穩定步驟進行處理，以獲得穩定態之光學清晰的片狀主體(以下稱第八穩定態片狀主體)。
在另一實驗中，第二塑型態片狀主體以5mm夾製具進行厚度裁切，並且根據前述第四實施例的穩定步驟進行處理，以獲得穩定態之光學清晰的片狀主體(以下稱第九穩定態片狀主體)。
第八穩定態片狀主體的厚度約為208±36.8μm、第八穩定態片狀主體的透光度大於或等於90%，並且第八穩定態片狀主體的可縫性大 於或等於40g。
第九穩定態片狀主體的厚度約為500±60.8μm，並且第九穩定態片狀主體的可縫性大於或等於55g。
於此，裁切厚度與最終厚度(於穩定化程序後)的比例約為1：0.1。
實驗12：含水率測試
裁切第二塑型態片狀主體，並且裁切後根據前述第四實施例的穩定步驟進行處理，以獲得穩定態之光學清晰的狀主體(以下稱第十穩定態片狀主體)。
當第十穩定態片狀主體的厚度約為200μm時，其含水率約為90%。
實驗13：毒性測試
毒性測試是根據ISO10993-12而進行。從第七穩定態片狀主體萃取出材料萃取液，然後將材料萃取液加入至培養液中進行細胞培養。具有材料萃取液的培養液的測試值除以無材料萃取液的培養液的測試值，其得到的數值大於92%。毒性測試的結果大於70%即為符合法規規範。
實驗14：塑型程序、穩定化程序及交聯程序
將第二純化後魚皮的魚背、腹及尾巴等膠原蛋白含量少之部位(其無法達到良好的膨潤狀態)切除，以保留第二純化後魚皮的中央部位。中央部位的尺寸為7*24cm。再將中央部位裁切成7*3cm(共8片)。其中，每一片的表面源自中央部位的截面。將每一片浸泡在0.5L/0.1M醋酸溶液6小時，並且冷藏16小時，以得到塑型態片狀主體(以下稱第三塑 型態片狀主體)。
接著，第三塑型態片狀主體根據前述第四實施例之穩定步驟進行處理，以得到穩定態之光學清晰的片狀主體(以下稱第十一穩定態片狀主體)。
實驗15：第十一穩定態片狀主體的觀察
當第十一穩定態片狀主體的厚度約為50μm至60μm時，第十一穩定態片狀主體的透光度大於或等於95%，且第十一穩定態片狀主體的可縫性大於或等於60g。當第十一穩定態片狀主體的厚度約為90μm至170μm時，第十一穩定態片狀主體的透光度大於或等於90%，且第十一穩定態片狀主體的可縫性大於或等於60g。當第十一穩定態片狀主體的厚度約為190μm至250μm時，第十一穩定態片狀主體的透光度大於或等於85%，且第十一穩定態片狀主體的可縫性大於或等於60g。當第十一穩定態片狀主體的厚度約為280μm至320μm時，第十一穩定態片狀主體的透光度大於或等於70%，且第十一穩定態片狀主體的可縫性大於或等於60g。其中，最大可縫性能大於150g。第十一穩定態片狀主體的平均極限應力為第七穩定態片狀主體的2倍。
實驗16：製備膠原蛋白溶液
第二純化後魚皮浸泡在0.01M醋酸溶液中2小時，並且除去雜質，以得到塑型態片狀主體。接著，再以一萃取程序從塑型態片狀主體萃取出膠原蛋白溶液。
實驗17：製備膠原蛋白海綿
第二純化後魚皮浸泡在0.1M醋酸溶液中1小時，然後凍乾， 以得到膠原蛋白海綿。
實驗18：製備膠原蛋白薄膜
第二純化後魚皮浸泡在0.01M醋酸溶液中2小時，然後除去外側層，以得到塑型態片狀主體。接著，再將塑型態片狀主體浸泡在0.1M醋酸溶液中1小時，以得到膠原蛋白薄膜。
綜上，根據本發明實施例之魚皮衍生組織修復材料及其製造方法適用於提供組織修復材料，且此組織修復材料適用於作為貼片、敷料、載體、支架、植入物、或藥劑來修復各種組織。此組織修復材料具有膠原蛋白以促進損傷組織的修復並具有預期之組織修復應用所需的特定特徵。再者，依照目前各研究顯示，此組織修復材料無殘留人魚共生疾病(病毒所引發的)的致病因子。
S10          取得無魚肉的魚皮 S20          純化程序 S30          塑型程序

Claims (20)

  1. 一種魚皮衍生組織修復材料，包括： 一光學清晰的片狀主體，衍生自一魚皮且為去細胞的，該光學清晰的片狀主體包括一膠原蛋白基質以及於該膠原蛋白基質中的水。
  2. 如請求項1所述之魚皮衍生組織修復材料，其中該光學清晰的片狀主體具有大於或等於70%的透光度、大於或等於5MPa的極限應力、以及大於或等於40g的可縫性。
  3. 如請求項1所述之魚皮衍生組織修復材料，其中該膠原蛋白基質為一層狀結構、該層狀結構具有複數膠原蛋白纖維，並且各該膠原蛋白纖維是沿著該光學清晰的片狀主體的一表面延伸。
  4. 如請求項1所述之魚皮衍生組織修復材料，其中該膠原蛋白基質為一層狀結構、該層狀結構具有複數膠原蛋白纖維，並且該複數膠原蛋白纖維中的一部分膠原蛋白纖維是沿著從該光學清晰的片狀主體的一表面到該光學清晰的片狀主體的另一表面的一方向延伸。
  5. 如請求項1所述之魚皮衍生組織修復材料，其中該光學清晰的片狀主體衍生自完全無魚鱗及魚肉的該魚皮。
  6. 如請求項1所述之魚皮衍生組織修復材料，其中該光學清晰的片狀主體衍生自該魚皮且無磨碎過。
  7. 如請求項1所述之魚皮衍生組織修復材料，其中該光學清晰的片狀主體由一製造方法製成，且該製造方法包括：去除該魚皮上的魚鱗、油脂、細胞、色素及口袋結構以獲得一純化後魚皮、以酸液處理該純化後魚皮以獲得未崩解的一塑型態片狀主體、進行該塑型態片狀主體的塑型以獲得具有特定形狀的一塑型後片狀主體、以及進行一穩定化程序以穩定該塑型後片狀主體。
  8. 一種魚皮衍生組織修復材料的製造方法，包括： 取得無魚肉的一魚皮； 去除該魚皮上的魚鱗、油脂、細胞、色素及口袋結構以獲得一純化後魚皮；以及 以酸液處理該純化後魚皮以獲得未崩解的一塑型態片狀主體。
  9. 如請求項8所述之魚皮衍生組織修復材料的製造方法，更包括：進行該塑型態片狀主體的塑型以獲得具有特定形狀的一塑型後片狀主體。
  10. 如請求項9所述之魚皮衍生組織修復材料的製造方法，更包括：水洗該塑型後片狀主體。
  11. 如請求項10所述之魚皮衍生組織修復材料的製造方法，更包括：在該水洗步驟之前，乾燥該塑型後片狀主體。
  12. 如請求項10所述之魚皮衍生組織修復材料的製造方法，更包括：在該水洗步驟之後，乾燥該塑型後片狀主體。
  13. 如請求項12所述之魚皮衍生組織修復材料的製造方法，更包括：在該乾燥步驟之後，使該塑型後片狀主體回水。
  14. 如請求項13所述之魚皮衍生組織修復材料的製造方法，更包括：在該水洗步驟之前，乾燥該塑型後片狀主體。
  15. 如請求項9至14中之任一項所述之魚皮衍生組織修復材料的製造方法，其中該塑型步驟包括裁切該塑型態片狀主體以獲得該塑型後片狀主體，其中該塑型後片狀主體的表面為該塑型態片狀主體的截面。
  16. 如請求項9至14中之任一項所述之魚皮衍生組織修復材料的製造方法，其中該塑型步驟包括裁切該塑型態片狀主體以獲得該塑型後片狀主體，其中該塑型後片狀主體的表面為該塑型態片狀主體的表面。
  17. 如請求項8所述之魚皮衍生組織修復材料的製造方法，更包括：從該塑型態片狀主體萃取出一膠原蛋白溶液。
  18. 如請求項8所述之魚皮衍生組織修復材料的製造方法，更包括：凍乾該塑型態片狀主體。
  19. 如請求項8所述之魚皮衍生組織修復材料的製造方法，更包括：去除該塑型態片狀主體的至少一外側層、以及以酸液處理該至少一外側層去除後的該塑型態片狀主體。
  20. 一種魚皮衍生組織修復材料是由如請求項8至19中之任一項所述之組織修復材料的製造方法所製造。
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