KR101885487B1 - 어피 유도조직 복구재료 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 파스, 드레싱제, 임플란트, 캐리어, 스텐트 또는 약제로 만들어 다양한 조직을 복구하는데 적용되는 어피 유도조직 복구재료 및 그 제조방법을 개시한다. 조직 복구재료는 콜라겐을 포함하여 손상된 조직의 복구를 촉진하며, 예상한 조직 복구 응용에 필요되는 특정한 특징을 가지고 있다. 또한, 이 조직 복구재료는 사람과 동물에 잔류하여 인수공통질환(바이러스에 인한 질환)을 일으키는 유발인자가 없다.

Description

어피 유도조직 복구재료 및 그 제조방법{TISSUE REPAIR MATERIAL DERIVED FROM FISH SKIN AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}
본 발명은 조직 복구재료에 관한 것으로, 특히 파스, 드레싱제, 캐리어, 스텐트, 임플란트 또는 약제로 만들어 다양한 조직을 복구하는데 적용되는 어피 유도조직 복구재료 및 그 제조방법에 관한 것이다.
조직공정은 생물 및 약물의 생물재료와 밀접하게 관련되어 이식 수술을 받은 환자의 혈관 조영, 조직 유합, 조직 재구축을 강화하고, 생물재료는 생체 적합성을 가진 인공 조직 복구재료로서, 인공 장기의 재구축, 복구 또는 수선에 응용되고 심지어 인체조직을 대체한다.
콜라겐은 조직 복구재료의 중요한 구성으로서, 조직을 생장시키고 상처를 유합시키는 등 기능을 구비한다. 또한, 콜라겐을 조직 복구재료로 하는 응용 분야가 확대되고 있으므로, 다양한 용도에 응용되도록 더욱 큰 의료적 가치 및 다양성이 있는 콜라겐을 구비하는 조직 복구재료를 개발하는 것이 현재 기술자들이 주로 검토해야 하는 과제 중의 하나이다.
현재의 조직 복구재료는 대부분 자체, 기증자 또는 동물로부터 유래한 것이다. 그러나, 일부 질병의 치료에 있어서 자체의 조직 복구재료를 획득할 수 없거나 또는 충분한 자체 조직 복구재료를 획득할 수 없다. 또한, 기증자로부터의 조직 복구재료는 기증자의 공급, 복잡한 공정, 상대적으로 높은 원가, 면역 거부의 위험 등 문제가 있다. 동물로부터의 조직 복구재료도 복잡한 공정, 상대적으로 높은 원가, 면역 거부의 위험, 인수공통질환 등 문제가 있다. 공개특허공보 제10-2012-0134096호(2012.12.11.). 일본 공개특허공보 특개2006-028138호(2006.2.2.).
일 실시예에서, 어피 유도조직 복구재료는 어피로부터 유도된 광학적으로 투명한 시트상 주체를 포함한다. 상기 광학적으로 투명한 시트상 주체는 세포가 제거된 것으로, 콜라겐 기질 및 콜라겐 기질 중의 물을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 광학적으로 투명한 시트상 주체는 70%보다 크거나 같은 투광도, 5MPa보다 크거나 같은 한계응력, 40g보다 크거나 같은 가봉성을 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 콜라겐 기질은 콜라겐 섬유를 구비하는 층상 구조일 수 있고, 각 콜라겐 섬유는 광학적으로 투명한 시트상 주체의 표면을 따라 연장될 수 있다. 다른 실시예에서 상기 콜라겐 기질은 콜라겐 섬유를 구비하는 층상 구조일 수 있고, 일부 콜라겐 섬유는 광학적으로 투명한 시트상 주체의 한 표면으로부터 다른 하나의 표면으로 향하는 방향을 따라 연장된다.
일부 실시예에서, 상기 광학적으로 투명한 시트상 주체는 어린 및 어육이 완전히 없는 어피로부터 유도될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 광학적으로 투명한 시트상 주체는 어피로부터 유도될 수 있고 연삭한 적이 없다.
일부 실시예에서, 상기 광학적으로 투명한 시트상 주체는 어피의 어린, 유지, 세포, 색소 및 포켓구조를 제거하여 정제 어피를 획득하는 단계; 산성액으로 정제 어피를 처리하여 붕괴되지 않은 소성상태의 시트상 주체를 획득하는 단계; 소성상태의 시트상 주체를 소성하여 특정한 형상을 가진 소성 시트상 주체를 획득하는 단계; 및 안정화 공정을 진행하여 소성 시트상 주체를 안정화시키는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조될 수 있다.
일 실시예에서, 어피 유도조직 복구재료의 제조방법은 어육이 없는 어피를 취득하는 단계; 어피의 어린, 유지, 세포, 색소 및 포켓구조를 제거하여 정제 어피를 획득하는 단계; 및 산성액으로 정제 어피를 처리하여 붕괴되지 않은 소성상태의 시트상 주체를 획득하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 어피 유도조직 복구재료의 제조방법은, 소성 시트상 주체를 물세척하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 조직 복구재료의 제조방법은 물세척 단계 전에 또는 후에 소성 시트상 주체를 건조시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 조직 복구재료의 제조방법은 건조 단계 후에 소성 시트상 주체를 물에 담구어 소성 시트상 주체의 수분 함량을 회복시키는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 어피 유도조직 복구재료의 제조방법은 소성상태의 시트상 주체를 소성하여 특정한 형상을 가진 소성 시트상 주체를 획득하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 소성 단계는 소성상태의 시트상 주체를 절단하여 소성 시트상 주체를 획득하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 소성 시트상 주체의 표면은 소성상태의 시트상 주체의 단면이다. 다른 실시예에서, 소성 단계는 소성상태의 시트상 주체를 절단하여 소성 시트상 주체를 획득하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 소성 시트상 주체의 표면은 소성상태의 시트상 주체의 표면이다.
일부 실시예에서, 어피 유도조직 복구재료의 제조방법은 소성상태의 시트상 주체로부터 콜라겐 용액을 추출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 어피 유도조직 복구재료의 제조방법은 소성상태의 시트상 주체를 동결 건조시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 어피 유도조직 복구재료의 제조방법은 소성상태의 시트상 주체의 외측층을 제거하는 단계 및 산성액으로 외측층이 제거된 소성상태의 시트상 주체를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 어피 유도조직 복구재료는 전술한 어느 한 제조방법에 의해 제조된다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 어피 유도조직 복구재료 및 그 제조방법은 파스, 드레싱제, 캐리어, 스텐트, 임플란트 또는 약제로 만들어 다양한 조직을 복구하는데 적용되는 조직 복구재료를 제공한다. 상기 조직 복구재료는 콜라겐을 포함하여 손상된 조직의 복구를 촉진하며, 예상한 조직 복구 응용에 필요되는 특정한 특징을 가지고 있다. 또한, 현재의 연구에 따르면 상기 조직 복구재료는 사람과 어류에 잔류하여 인어공통질환(바이러스에 인한 질환)을 일으키는 유발인자가 없다.
도 1은 일 실시예에 따른 어피 유도조직 복구재료의 제조방법의 흐름도이다.
도 2는 일 실시예의 단계(S20)의 흐름도이다.
도 3은 일 실시예의 단계(S30)의 흐름도이다.
도 4는 다른 실시예에 따른 어피 유도조직 복구재료의 제조방법의 흐름도이다.
도 5는 제1 실시예의 단계(S40)의 흐름도이다.
도 6은 제2 실시예의 단계(S40)의 흐름도이다.
도 7은 제3 실시예의 단계(S40)의 흐름도이다.
도 8은 제4 실시예의 단계(S40)의 흐름도이다.
도 9는 제5 실시예의 단계(S40)의 흐름도이다.
도 10은 제6 실시예의 단계(S40)의 흐름도이다.
도 11은 제7 실시예의 단계(S40)의 흐름도이다.
도 12는 제8 실시예의 단계(S40)의 흐름도이다.
도 13은 또 다른 실시예에 따른 어피 유도조직 복구재료의 제조방법의 흐름도이다.
도 14는 일 실시예의 원시 어피의 표면 사진이다.
도 15~17은 일 실시예의 원시 어피의 주사형 전자현미경(SEM)에 의한 현미경 사진이다.
도 18은 일 실시예에 따른 제2 정제 어피의 SEM에 의한 현미경 사진이다.
도 19은 일 실시예에 따른 제1 소성상태의 시트상 주체의 사진이다.
도 20은 일 실시예에 따른 제1 소성상태의 시트상 주체의 SEM에 의한 현미경 사진이다.
도 21은 일 실시예에 따른 제1 소성상태의 시트상 주체의 염색 슬라이스의 현미경 사진이다.
도 22는 일 실시예에 따른 제1 안정상태의 시트상 주체의 사진이다.
도 23~24는 일 실시예에 따른 제1 안정상태의 시트상 주체의 SEM에 의한 현미경 사진이다.
도 25는 일 실시예의 제4 안정상태의 시트상 주체의 SEM에 의한 현미경 사진이다.
도 26은 일 실시예의 제5 안정상태의 시트상 주체의 SEM에 의한 현미경 사진이다.
도 27은 일 실시예에 따른 제6 안정상태의 시트상 주체의 SEM에 의한 현미경 사진이다.
도 28은 일 실시예에 따른 제7 안정상태의 시트상 주체의 SEM에 의한 현미경 사진이다.
후술하는 “제1”, “제2”, “제3” 등 번호의 용어는 소자를 구분하기 위한 것일 뿐, 소자를 배열하거나 차이성을 한정하기 위한 것이 아니며 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것도 아니다.
일 실시예에서, 어피 유도조직 복구재료는 어피로부터 유도된 시트상 주체를 포함한다. 상기 시트상 주체는 세포가 제거된 것으로, 콜라겐 기질 및 콜라겐 기질 중의 물을 포함한다. 상기 어피로부터 유도된 시트상 주체는 각종 조직의 복구에 충분히 적용되는 가봉성을 가지고 있다. 그 중, 어피 유도조직 복구재료는 파스, 드레싱제, 캐리어, 스텐트, 임플란트 또는 약제로 만들어 다양한 조직을 복구하는데 적용되는 바, 예를 들어 안부 조직, 구강 조직, 피부, 골조직 등이 있다. 일부 실시예에서, 상처의 관찰 및/또는 안부 조직의 복구에 적용되도록 상기 시트상 주체는 광학적으로 투명한 시트상 주체일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 시트상 주체는 파스, 드레싱제, 캐리어, 스텐트 또는 임플란트로서의 충분한 한계응력을 더 구비할 수 있다.
일부 실시예에서, 광학적으로 투명한 시트상 주체는 70%보다 크거나 같은 투광도, 5MPa보다 크거나 같은 한계응력, 40g보다 크거나 같은 가봉성을 가지고 있다.
일부 실시예에서, 콜라겐 기질은 복수개의 콜라겐 섬유를 포함하는 층상 구조일 수 있다. 일부 실시예에서, 각 콜라겐 섬유는 시트상 주체의 표면을 따라 연장될 수 있다. 다른 실시예에서, 복수개의 콜라겐 섬유의 일부는 시트상 주체의 한 표면으로부터 다른 하나의 표면을 향하는 방향을 따라 연장되고, 나머지는 서로 다른 방향으로 연장된다(예를 들어, 시트상 주체의 표면을 따라 연장됨).
도 1을 참조하면, 일 실시예에서 어피 유도조직 복구재료의 제조방법은 주로 어육이 없는 어피를 취득한(단계(S10)) 후의 정제 공정(단계(S20)) 및 소성 공정(단계(S30))을 구비한다.
단계(S10)의 일부 실시예에서, 어피는 어린이 있으나 어육이 없는 원시 어피일 수 있다. 일부 실시예에서, 생산 및 판매 이력 등 관련 증명문서를 제공할 수 있는 어장에서 물고기를 획득하고, 획득한 물고기의 어피와 어육을 분리시켜 어린이 있으나 어육이 없는 원시 어피를 얻는다. 일부 실시예에서, 어피를 제공하는 물고기는 농어, 도미, 바리과(예를 들어 우럭 등), 틸라피아 등과 같은 색소가 어피 표층에만 있는 어류일 수 있다.
도 2를 참조하면, 정제 공정(단계(S20))은 어피의 어린을 제거하는 단계(S210); 어피의 유지와 세포를 제거하는 단계(S230); 및 어피의 색소와 포켓구조를 제거하는 단계(S250)를 포함한다. 상기 정제 공정(단계(S20))이 완료되면, 정제 어피를 얻을 수 있다.
단계(S210)의 일 실시예에서, 적어도 하나의 방식(이하, 제1방식이라고 함)에 의해 원시 어피의 어린을 완전히 제거하여 어린이 제거된 어피를 얻은 후 깨끗한 물로 어린이 제거된 어피를 세척하여 어린이 제거된 어피의 불순물, 예를 들어 조직액, 핏물 또는 이들의 조합을 제거할 수 있다. 일부 실시예에서, 제1방식은 물리적 방식, 화학적 방식 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어(이에 한정되지 않음), 물리적 방식은 손으로 원시 어피의 어린을 제거할 수 있고, 칼로 원시 어피의 어린을 긁어낼 수 있으며, 액체 절단력으로 원시 어피의 어린을 제거할 수 있고, 고압 기체(액체)로 원시 어피의 어린을 제거할 수 있으며 또는 원시 어피를 25℃~60℃의 온수에 침지시켜 어린을 제거할 수 있다. 화학적 방식의 일 실시예에서, 예를 들어(이에 한정되지 않음) 원시 어피를 산성액에 침지하여 어린을 제거한다. 일부 실시예에서, 산성액은 유기산 또는 무기산일 수 있다. 그 중, 산성액은 호박산, 포름산, 초산, 시트르산, 피루브산, 푸마르산, 염산(HCl), 질산(HNO3) 또는 황산(H2SO4)일 수 있다. 화학적 방식의 다른 실시예에서, 예를 들어(이에 한정되지 않음) 원시 어피를 알칼리성액에 침지함으로써 어린을 제거한다. 그 중, 알칼리성액은 수산화나트륨(NaOH) 또는 수산화칼륨(KOH)일 수 있다. 화학적 방식의 또 다른 실시예에서, 예를 들어(이에 한정되지 않음) 원시 어피를 과산화 수소수(H2O2)에 침지함으로써 어린을 제거한다.
단계(S230)의 일 실시예에서, 어린이 제거된 어피의 유지와 세포는 동일한 처리 작업 또는 서로 다른 처리 작업에 의해 제거될 수 있다. 마지막으로, 처리 후의 어피(즉, 유지와 세포가 제거되고 어린이 제거된 어피)를 세척하여 처리 후 어피의 불순물의 제거 및/또는 처리 후의 어피의 pH값의 중화를 구현한다. 그 중, 사용하는 물은 깨끗한 물, 탈이온수, 2차 탈이온수(DDW), 생리식염수, 인산염 완충용액(PBS) 또는 인산 완충용액(PB)일 수 있다. 일부 실시예에서, 어린이 제거된 어피는 화학 약제로 유지를 제거할 수 있다. 그 중, 사용하는 화학 약제는 알코올류 용액, 알칼리성액 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 예를 들어(이에 한정되지 않음), 알코올류 용액은 이소프로판올일 수 있다. 예를 들어(이에 한정되지 않음), 알칼리성액은 NaOH 또는 KOH일 수 있다. 일부 실시예에서, 어린이 제거된 어피는 적어도 하나의 방식(이하, 제2방식이라고 함)에 의해 세포를 제거할 수 있다. 일부 실시예에서, 제2방식은 화학적 방식, 효소처리방식, 물리적 방식 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 화학적 방식은 화학 약제를 사용하여 어린이 제거된 어피의 세포를 제거한다. 그 중, 사용하는 화학 약제는 염류, 알칼리성액, 산성액, 산화제, 킬레이트제 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 예를 들어(이에 한정되지 않음), 염류는 염화나트륨(NaCl) 또는 염화칼륨(KCl)일 수 있다. 예를 들어(이에 한정되지 않음), 알칼리성액은 NaOH 또는 KOH일 수 있다. 예를 들어(이에 한정되지 않음), 산성액은 호박산, 포름산, 초산, 시트르산, 피루브산, 푸마르산, HCl, HNO3 또는 H2SO4일 수 있다. 예를 들어(이에 한정되지 않음), 산화제는 과산화 수소수 또는 과황산염일 수 있다. 예를 들어(이에 한정되지 않음), 킬레이트제는 천이 금속 원소를 함유하는 시약일 수 있는데, 예를 들어 Ca2+, Fe2+, Mn2+ 등이 있다. 효소 처리 방식은 적어도 하나의 효소를 사용하여 어린이 제거된 어피의 세포를 제거한다. 그 중, 사용하는 효소는 프로테아제, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제일 수 있다. 예를 들어(이에 한정되지 않음), 엔도뉴클레아제는 EcoRI, BamHI, HindIII, TaqI, NotI, HinfI 또는 Sau3A일 수 있다. 예를 들어(이에 한정되지 않음), 엑소뉴클레아제는 리보뉴클레아제 R, 리보뉴클레아제 II, 리보뉴클레아제 D, RNase BN, 리보뉴클레아제 PH 또는 엑소뉴클레아제 I일 수 있다. 물리적 방식의 일부 실시예에서, 어린이 제거된 어피를 냉동함으로써 어린이 제거된 어피의 세포를 제거할 수 있다. 단계(S230)의 일예에서, 어린이 제거된 어피를 NaOH와 NaCl의 혼합 용액에 12~24시간 침지하고 침지 과정에서 혼합 용액을 여러번 치환함으로써 처리 후의 어피를 획득한다. 침지한 후, 처리후의 어피에 대해 어피의 pH값이 중성으로 회복될 때까지 DDW를 이용하여 침지된 혼합 용액을 씻어낸다. 일부 실시예에서, 단계(S230)의 수행 과정에서 처리온도는 4℃~20℃로 제어할 수 있다. 예를 들어(이에 한정되지 않음), 단계(S230)의 수행 과정에서 사용한 모든 용액은 모두 4℃~20℃의 온도를 가지고 있고 및/또는 환경 온도를 4℃~20℃로 제어한다.
단계(S250)의 일부 실시예에서, 어린이 제거된 어피(중성)의 색소와 포켓구조는 동일한 처리 작업 또는 서로 다른 처리작업에 의해 제거될 수 있다. 일 실시예에서, 처리후의 어피를 적어도 하나의 산성액에 침지시켜 팽윤시킨다(이하, “팽윤 어피”라고 함). 이 후, 포켓 제거 방식으로 팽윤 어피의 포켓구조를 제거한다. 그 중, 예를 들어(이에 한정되지 않음) 사용하는 산성액은 호박산, 포름산, 초산, 시트르산, 피루브산, 푸마르산, HCl, HNO3 또는 H2SO4일 수 있다. 여기서, 서로 다른 종류의 산성액에 따라 서로 다른 산성액 농도를 선택한다. 그리고, 서로 다른 산성액 농도에 따라 서로 다른 침지시간을 사용한다. 예를 들어(이에 한정되지 않음), 0.01M~0.5M 초산을 사용할 경우 침지시간은 0.5시간~18시간일 수 있고, 또는 0.3M 초산을 사용할 경우 침지시간은 30분~50분일 수 있다. 또한, 처리 파라미터(즉, 산성액 농도 및 침지시간)도 처리후의 어피의 사이즈에 따라 조정될 수 있다. 일예에서, 포켓 제거 방식을 실시할 때, 팽윤 어피의 색소를 동시에 제거할 수 있다. 다른 예에서, 별도로 색소 약제를 사용하여 팽윤 어피의 색소를 제거할 수 있다. 포켓 제거 방식의 일부 실시예에서, 둔기로 팽윤 어피의 포켓 구조를 제거할 수 있다. 예를 들어(이에 한정되지 않음), 사용하는 둔기는 손(예를 들어 손가락), 철편, 플라스틱편 또는 어피 표면을 손상하지 않는 임의의 도구일 수 있다. 일부 실시예에서, 사용하는 색소 제거제는 산화제(예를 들어, 과산화 수소수 또는 차아염소산나트륨) 또는 계면활성제(예를 들어, Triton X100)일 수 있다. 일부 실시예에서, 포켓을 제거하는 과정에서, 팽윤 어피의 무늬, 근육조직과 불필요한 잔류조직을 동시에 제거할 수 있다.
이해해야 할 것은, 공정의 단계 순서는 예에 불과하고 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들이 본 발명을 이해할 수 있도록 한 것일 뿐, 본 발명의 실시범위를 한정하기 위한 것이 아니며, 관련 기술을 숙지하는 자는 합리적인 경우에 일부 단계의 수행 순서를 동시에 진행하거나 앞, 뒤 순서를 바뀌어 진행하거나 또는 함께 수행할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 각 단계의 수행 내용에 따라 단계(S210), 단계(S230)와 단계(S250) 중의 임의의 2개의 단계 또는 3개의 단계는 하나의 단계로 합칠 수 있다. 예를 들어, 어피를 산성액에 침지하여 어피를 팽윤시킨 후 둔기로 팽윤 어피의 어린 및 포켓구조를 동시에 제거한다.
도 3을 참조하면, 소성 공정(단계(S30))은 산성액으로 정제 어피를 처리하여 어피로부터 유도된 붕괴되지 않은 소성상태의 시트상 주체를 획득하는 단계(S310) 및 소성상태의 시트상 주체를 특정한 형상으로 소성하여 어피로부터 유도된 특정한 형상을 가진 소성 시트상 주체를 획득하는 단계(S330)를 포함한다. 그 중, 상기 소성 시트상 주체는 광학적으로 투명한 것일 수 있다.
단계(S310)의 일부 실시예에서, 정제 어피를 적어도 하나의 산성액에 침지하여 정제 어피를 팽윤시키지만 붕괴되지 않도록 한다(즉, 어피로부터 유도된 소성상태의 시트상 주체). 이 후, 각종 도구 또는 금형에 의해 상기 소성상태의 시트상 주체를 특정한 형상으로 소성하여 소성 시트상 주체를 형성한다(즉, 특정한 형상을 가진 소성상태의 시트상 주체). 그 중, 예를 들어(이에 한정되지 않음) 사용하는 산성액은 호박산, 포름산, 초산, 시트르산, 피루브산, 푸마르산, HCl, HNO3 또는 H2SO4일 수 있다. 여기서, 서로 다른 종류의 산성액에 따라 서로 다른 산성액 농도를 선택한다. 그리고, 서로 다른 산성액 농도에 따라 서로 다른 침지시간을 사용한다. 또한, 처리 파라미터(즉, 산성액 농도 및 침지시간)도 처리후 어피의 사이즈에 따라 조정될 수 있다. 일부 실시예에서, 소성 시트상 주체의 특정한 형상은 2차원 시트상, 표면이 평탄한 포켓 형상, 호형, 관형, 직선 또는 비직선 띠형상(예를 들어, 단일 띠 또는 복수개의 띠가 열결된 것), 구형(예를 들어, 분말 또는 세립), 블록 형상, 바늘 형상, 중실 다변형 또는 중공 다변형 일 수 있다.
일부 실시예에서, 소성단계(단계(S330))를 수행하는 과정에서, 소성상태의 시트상 주체는 특정한 사이즈로 절단될 수 있다. 일예에서, 절단한 후 소성 시트상 주체의 표면은 소성상태의 시트상 주체의 표면으로부터 유래된 것이다(즉, 소성상태의 시트상 주체 표면의 하나의 작은 블록). 다른 예에서, 절단한 후 소성 시트상 주체의 표면은 소성상태의 시트상 주체의 단면으로부터 유래된 것이다(즉, 소성 시트상 주체의 상면 및/또는 하면이 소성상태의 시트상 주체의 단면이고, 소성 시트상 주체의 측변은 소성상태의 시트상 주체 표면의 하나의 작은 블록임).
일부 실시예에서, 소성단계(단계(S330))를 수행하는 과정에서, 소성상태의 시트상 주체를 연삭하지 않는다.
다른 실시예에서, 도 4를 참조하면 소성 공정(단계(S30))을 수행한 후 안정화 공정(단계(S40))을 수행할 수 있다.
일 실시예에서, 안정화 공정(단계(S40))은 소성 시트상 주체를 안정화시켜 안정상태의 광학적으로 투명한 시트상 주체를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
안정 단계의 제1 실시예에서, 도 5를 참조하면 소성 공정(단계(S30))을 수행한 후 시트상 주체의 pH값이 중성이 될 때까지 소성상태의 시트상 주체를 직접 물로 세척할 수 있다(단계(S450)). 즉, 소성 공정(단계(S30))과 물세척 단계(단계S450) 사이에는 그 어떤 건조 단계도 없다.
안정 단계의 제2 실시예에서, 도 6을 참조하면 소성 공정(단계(S30))을 수행한 후 시트상 주체의 pH값이 중성이 될 때까지 소성상태의 시트상 주체를 직접 물로 세척하여(단계(S450)) 어피로부터 유도된 중성 시트상 주체를 획득할 수 있다. 물세척 단계 후, 중성 시트상 주체를 건조시키고(단계(S470)), 그 다음 물에 침지하여 시트상 주체의 수분 함량을 회복시킨다(단계(S490)). 이때, 소성 시트상 주체를 물에 담구어 소성 시트상 주체의 수분 함량을 회복시키는 것을 '환수(backwater)'라 한다.
안정 단계의 제3 실시예에서, 도 7을 참조하면 소성 공정(단계(S30))을 수행한 후 먼저 소성 시트상 주체(단계S430)를 건조시키고, 그 다음 시트상 주체의 pH값이 중성을 회복할 때까지 물세척하여(단계(S452)) 어피로부터 유도된 중성 시트상 주체를 획득할 수 있다.
안정 단계의 제4 실시예에서, 도 8을 참조하면 소성 공정(단계(S30))을 수행한 후 먼저 소성 시트상 주체(단계S430)를 건조시키고, 그 다음 시트상 주체의 pH값이 중성을 회복할 때까지 물세척하여(단계(S452)) 어피로부터 유도된 중성 시트상 주체를 획득할 수 있다. 물세척 단계 후, 중성 시트상 주체(단계(S472))를 재건조시키고, 그 다음 중성 시트상 주체를 물에 침지하여 시트상 주체의 수분 함량을 회복시킨다(단계(S490)).
안정화 공정(단계(S40))에서, 사용하는 물은 깨끗한 물, 탈이온수, DDW, 생리식염수, PBS 또는 PB일 수 있다. 안정화 공정(단계(S40))에서 사용하는 건조방식은 온화한 건조방식일 수 있는데, 예를 들어 풍건 또는 저온 건조일 수 있다.
다른 실시예에서, 도 9~도 12를 참조하면 안정화 공정(단계(S40))에서 안정 단계를 수행하기 전에 먼저 표면 패턴화 단계(단계S410)를 수행할 수 있다.
표면 패턴화 단계(단계(S410))의 일 실시예에서, 소성 시트상 주체의 표면이 특정한 패턴과 대응되는 무늬(이하, “표면 무늬”라고 함)를 가지도록 소성 시트상 주체를 특정한 패턴을 가진 금형에 넣을 수 있다. 소성 시트상 주체의 표면 무늬와 금형 내면의 특정한 패턴은 매칭되는 것이다. 예를 들어(이에 한정되지 않음), 표면 무늬는 볼록 무늬, 오목 무늬 또는 이들의 조합일 수 있다. 즉, 금형 내면의 특정한 패턴은 상대적으로 홈 패턴, 돌기 패턴 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 실시예에서, 표면 패턴화 단계(단계(S410))는 소성단계(단계(S330))와 합칠 수 있다. 즉, 표면 무늬는 소성단계(단계(S330))에서 형성되고, 안정화 공정(단계(S40))에는 표면 패턴화 단계(단계S410)가 없을 수 있다.
일부 실시예에서, 소성 공정(단계(S30))과 안정화 공정(단계(S40))은 교체적으로 1회 수행하거나 또는 반복적으로 수회 수행할 수 있다(미도시).
또 다른 실시예에서, 도 13을 참조하면 안정화 공정(단계(S40)) 후 절단 공정(단계(S50))을 수행할 수 있다. 절단 공정(단계(S50))에서, 제품의 수요에 따라 안정상태의 광학적으로 투명한 시트상 주체를 특정한 사이즈로 절단할 수 있다.
일부 실시예에서, 정제 공정(단계(S20))과 소성 공정(단계(S30)) 사이 또는 소성 공정(단계(S30))과 안정화 공정(단계(S40)) 사이에는 가교 공정을 수행할 수 있다. 또한, 상기 가교 공정은 소성 공정(단계(S30))과 동시에 수행되거나 또는 안정화 공정(단계(S40))과 동시에 수행될 수 있다. 가교 공정을 수행하는 과정에서, 기계적 특성이 더욱 강화되도록 적어도 하나의 가교 방식으로 정제 어피 또는 광학적으로 투명한 시트상 주체를 처리한다. 일부 실시예에서, 가교방식은 물리적 가교방식 또는 화학적 가교방식일 수 있다. 예를 들어(이에 한정되지 않음), 물리적 가교방식은 자외선 조사(UV), γ선 조사(γ-ray) 또는 가열일 수 있다. 예를 들어(이에 한정되지 않음), 화학적 가교방식은 글루타르알데히드(glutaraldehyde; GA), 부탄디올 디글리시딜 에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether; BDDE), 게니핀(genipin) 또는 EDC/NHS(1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)- carbodiimide/N-hydroxysuccinimide) 등 가교제를 사용할 수 있다.
일부 수식태양에서, 소성 공정(S30)의 단계를 조정하고, 소성 공정(S30) 후의 공정을 삭제할 수 있다. 그 중, 조정 후의 소성 공정은 산성액으로 정제 어피를 처리하여 어피로부터 유도된 소성상태의 시트상 주체를 획득하는 단계 및 소성상태의 시트상 주체로부터 콜라겐 용액을 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 여기서, 콜라겐 용액이 바로 획득한 어피 유도조직 복구재료이다. 일부 예에서, 조정 후의 소성 공정은 소성단계(단계(S330))를 삭제할 수 있다. 기타 예에서, 조정 후의 소성 공정은 소성상태의 시트상 주체를 추출하기 적합한 특정한 사이즈 및/또는 특정 형상으로 절단하도록 소성단계(단계(S330))를 보류할 수 있다.
또한, 조정 후의 소성 공정에서, 산처리 단계와 추출 단계 사이에 중화 단계를 진행하여 소성상태의 시트상 주체의 pH값을 중성으로 회복시킬 수 있다. 예를 들어, 중화 단계는 소성상태의 시트상 주체를 물세척하는 단계를 포함할 수 있다.
기타 수식태양에서, 소성 공정(S30)의 단계를 조정하고, 소성 공정(S30) 후의 공정을 삭제할 수 있다. 여기서, 조정 후의 소성 공정은 산성액으로 정제 어피를 처리하여 어피로부터 유도된 붕괴되지 않은 소성상태의 시트상 주체를 획득하는 단계(단계(S310)) 및 소성상태의 시트상 주체를 동결 건조시켜 콜라겐 스펀지를 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 여기서, 콜라겐 스펀지가 바로 획득한 어피 유도조직 복구재료이다. 일부 예에서, 조정 후의 소성 공정은 소성단계(단계(S330))를 삭제할 수 있다. 기타 예에서, 조정 후의 소성 과정은 소성단계(단계(S330))를 보류하여 산처리 단계(단계(S310))와 동결 건조 단계 사이에서 수행할 수 있다.
또한, 조정 후의 소성 공정은 산처리 단계(단계(S310))(또는 소성단계(단계(S330))와 동결 건조 단계 사이에서 중화 단계를 진행하여 시트상 주체의 pH값을 중성으로 회복시킬 수 있다. 예를 들어, 중화 단계는 시트상 주체를 물세척하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 수식태양에서, 소성 공정(S30)의 단계를 조정할 수 있다. 여기서, 조정 후의 소성 공정은 수회의 산처리 단계(단계(S310))를 진행할 수 있다. 또한, 임의의 2회의 산처리 단계(단계(S310)) 사이에서 소성상태의 시트상 주체의 적어도 하나의 외측층을 제거한다. 마지막으로, 콜라겐 박막인 어피 유도조직 복구재료를 획득할 수 있다. 그 중, 산처리 단계(단계(S310))의 처리 파라미터(예를 들어, 산성액 종류, 산성액 농도, 침지 시간)는 각 회마다 동일하거나 다르거나 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 예에서, 조정 후의 소성 공정은 소성단계(단계(S330))를 삭제할 수 있다. 기타 예에서, 조정 후의 소성 공정은 소성단계(단계(S330))를 보류하여 임의의 산처리 단계(단계(S310)) 후에 수행할 수 있다.
일부 예에서, 소성 공정(S30) 후의 공정을 삭제할 수 있다. 기타 예에서, 조정 후의 소성 공정은 소성 공정(S30) 후의 공정을 보류할 수 있다. 만약 소성 공정(S30) 후의 과정이 삭제되면, 모든 산처리 단계(단계(S310))를 완성한 후 중화 단계를 진행하여 시트상 주체의 pH값을 중성으로 회복시킬 수 있다. 예를 들어, 중화 단계는 시트상 주체를 물세척하는 단계를 포함할 수 있다.
제조 공정1: SEM 샘플 제조
샘플(즉, 관찰하고자 하는 어피 또는 관찰하고자 하는 시트상 주체)을 탈이온수에 30분간 방치한다. 이 후, 탈이온수를 2.5% 글루타르알데히드 용액으로 치환하고, 샘플을 글루타르알데히드 용액에 20분간 침지시킨다. 글루타르알데히드 용액에서의 침지가 끝난 후, 탈이온수로 샘플을 10분간 세척하는데 3회 세척한다. 이어서, 1% 오스뮴산(osmic acid)을 첨가하여 샘플과 2시간 반응시킨다. 이 후, 오스뮴산을 제거하고, 탈이온수로 샘플을 10분간 세척하는데 3회 세척한다. 이어서, 농도 기울기가 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 및 100%인 알콜(alcohol)로 샘플을 탈수시킨다. 이 후, 샘플을 임계점 건조기(EM CPD300, Leica)에 넣어 건조시켜 주사형 전자현미경(SEM)(S-3000 N, Hitachi)으로 SEM 측정/관찰할 수 있는 샘플(이하, SEM 샘플이라고 함)을 획득한다.
제조 공정2: 냉동 슬라이스 및 H&E 염색
샘플(즉, 관찰하고자 하는 시트상 주체)을 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)로 24시간 고정하고, 30% 자당용액(sucrose solution)으로 4℃에서 탈수시킴으로써 수분이 얼음을 형성하여 샘플의 조직을 파손하는 것을 방지한다. 탈수 샘플을 사전에 포매제(O.C.T)를 충분히 충전한 금형에 넣고, 액상 질소를 이용하여 순간 냉동시킨다. O.C.T이 정형된 후, 냉동 슬라이서(CM1900, Leica)로 -25℃에서 절단하여 슬라이스 샘플을 획득한다. 여기서, 슬라이스 샘플의 두께는 10μm이다. 슬라이스 샘플을 hematoxyline 용액에 넣어 염색시키고, 실온에서 1분간 방치한다. 이어서, 탈이온수로 슬라이스 샘플을 10분간 침지 및 세척하고, 다시 eoxin 용액에 넣어 6분간 염색시킨다. 이 후, 탈이온수로 슬라이스 샘플을 8분간 세척한다. 이어서, 슬라이스 샘플을 순서대로 농도 기울기가 75%, 85%, 95% 및 100%인 알콜로 탈수시키고 풍건한 후 밀폐시켜 광학 현미경(DM6000B, Leica)으로 관찰한다.
테스트 공정1: 기계적 테스트
샘플(즉, 테스트하고자 하는 시트상 주체)을 ASTM D638-2003 규범에 따라 아령형으로 절단한 후, 만능시험기(3365, INSTRON)의 지그에 고정시킨다. 기계적 테스트는 만능 시험기에 의해 5mm/min의 속도 및 500N의 힘으로 테스트한다. 여기서, 테스트를 진행하는 각 조의 슬라이스 샘플수는 6보다 크거나 같고, 슬라이스 샘플의 측정된 한계 응력의 평균을 계산한다.
테스트 공정2: 투광도 테스트
샘플(즉, 테스트하고자 하는 시트상 주체)을 DDW에 16시간 침지하여 시트상 주체의 수분 함량을 회복시킨다. 그 중, 샘플과 DDW의 비례는 8매의 샘플을 500ml DDW에 침지시키는 것이다. 샘플을 직경이 0.7cm인 작은 원형편으로 절단한 후 작은 원형편을 미량 오리피스 판 바닥부에 방치하고, 100㎕ DDW를 첨가한다. 미량 오리피스 판의 제어홀에는 100㎕ DDW만 첨가한다. 이 후, 효소 면역 분석 측정기(ELISA meter)(Sunrise, TECAN)에 의해 400nm~700nm 전파장에서 판독하고, 판독된 전파장 흡광값의 평균을 계산한다. 이 후, 아래의 공식에 의해 투광도를 계산한다.
A=log(1/T)
T는 투광도를 나타내고, A는 작은 원형편의 판독된 흡광값의 평균을 나타낸다.
테스트 공정3: 두께 테스트
샘플(즉, 테스트하고자 하는 시트상 주체)의 두께는 막두께계에 의해 서로 다른 위치의 복수개의 점을 랜덤으로 측정한 후 평균을 취함으로써 획득한다.
테스트 공정4: 가봉성 테스트
샘플(즉, 테스트하고자 하는 시트상 주체)을 1*1cm 사이즈로 절단하고, 비흡수성 봉합사(STIN-ST4 4.0)로 경계와 0.2cm 떨어진 어피의 상하 위치에 꿰맨다. 이 후, 상부 봉합사를 가봉성 측정대에 고정시키고, 하부 봉합사에 무거운 물체를 걸어 놓는다. 어피가 더이상 견디지 못하고 파열될 때까지 하부 봉합사에 걸어 놓은 물체의 중량을 지속적으로 증가하는데, 이때 하부 봉합사에 걸어 놓은 물체의 중량이 바로 상기 샘플의 가봉성이다.
테스트 공정5: 함수율 테스트
건조한 샘플(즉, 테스트하고자 하는 시트상 주체)을 취하여 무게를 측량하고 원시 무게를 기록한다. 이어서, 무게 변화가 원시 무게의 0.05%보다 작을 때까지 오븐을 이용하여 105±3℃로 샘플을 가열하는데 지속적으로 2회 진행한다. 가열한 후, 다시 샘플의 무게를 측량하고 가열 후의 무게를 기록한다. 이 후, 아래의 공식에 의해 함수율을 계산하는데, 즉 함수율=[(원시 무게-가열후 무게)/원시 무게]×100%이다.
실험1: 원시 어피에 대한 관찰
거시적으로 볼 때, 도 14에 도시된 바와 같이 어린을 구비하는 원시 어피는 백색 불투명한 것이고, 원시 어피는 포켓구조 부분에 대량의 색소를 가지고 있다.
어린을 구비하는 원시 어피는 제조 공정1에 의해 SEM 샘플로 처리된다.
도 15는 원시 어피의 단면을 나타내는데, 그 중 원시 어피의 표면에는 포켓 돌기와 유사한 결체조직이 있고 어린을 피복한다. 도 16 및 도 17은 고배율로 관찰한 원시 어피의 단면을 나타내는데, 그 중 포켓구조를 제외하고 원시 어피는 층상 구조이다.
실험2: 정제 공정
원시 어피(4℃ 보다 낮은 저온에 방치해야 함)를 취득한 후, 원시 어피의 어린을 인공 방식으로 완전히 제거하여 어린이 제거된 어피를 획득하고, 그 다음 깨끗한 물로 어린이 제거된 어피를 세척하여 조직액과 핏물을 씻어내어 어린이 제거된 깨끗한 어피를 획득한다. 어린이 제거된 깨끗한 어피를 0.5M NaOH/0.5M NaCl의 혼합용액으로 12시간 침지하여 어린이 제거된 어피를 팽윤(팽창)시켜 반투명(이하, 처리후의 어피라고 함) 형태를 띄게 한다. 이 후, 등체적의 물을 사용하여 처리후의 어피를 교반 세척하고, 혼합용액이 깨끗이 씻어낼 때까지 물을 한번 또는 여러번 바꾼다(즉, 어피가 흰색이 되고 pH값이 중성이 될 때까지). 다시 처리후의 어피(중성)를 1L/0.3M 초산용액에 60분간 침지시킨다. 초산에 침지한 후, 처리후의 어피 표면의 포켓구조가 약해지고, 이 후 손으로 포켓구조를 완전히 제거하여 정제 어피(이하, 제1 정제 어피라고 함)를 획득한다.
실험3: 정제 공정
원시 어피(4℃ 보다 낮은 저온에 방치해야 함)를 취득한 후, 원시 어피의 어린을 인공 방식으로 완전히 제거하여 어린이 제거된 어피를 획득하고, 그 다음 깨끗한 물로 어린이 제거된 어피를 세척하여 조직액과 핏물을 씻어내어 어린이 제거된 깨끗한 어피를 획득한다. 어린이 제거된 깨끗한 어피를 0.1M NaOH/10M NaCl의 혼합용액으로 12시간 침지하여 어린이 제거된 어피를 팽윤(팽창)시켜 반투명(이하, 처리후의 어피라고 함) 형태를 띄게 한다. 이 후, 등체적의 물을 사용하여 처리후의 어피를 교반 세척하고, 혼합용액이 깨끗이 씻어낼 때까지 물을 한번 또는 여러번 바꾼다(즉, 어피가 흰색이 되고 pH값이 중성이 될 때까지). 다시 처리후의 어피(중성)를 0.1M 초산용액에 30분간 침지시킨다. 초산에 침지한 후, 처리후의 어피 표면의 포켓구조가 약해지고, 이 후 둔기로 포켓구조를 완전히 제거하여 정제 어피(이하, 제2 정제 어피라고 함)를 획득한다.
실험4: 제2 정제 어피에 대한 관찰
제2 정제 어피를 제조 공정1에 의해 SEM샘플로 처리한다.
도 18에 도시된 바와 같이, 제2 정제 어피의 단면은 복수개의 콜라겐 섬유가 형성되어 있는 층상 구조인 콜라겐 기질을 구비한다. 도 18을 참조하면, 콜라겐 섬유는 층상 구조의 복수개의 층으로 흩어져 배열되고, 동일층의 콜라겐 섬유는 동일한 방향으로 배열되며, 서로 인접하지 않은 2층의 콜라겐 섬유는 90도로 중첩된다. 또한, 수평층에 수직되는 종방향 섬유가 있다.
실험5: 소성 공정, 안정화 공정 및 가교 공정
제1 정제 어피를 0.5L/0.3M 초산 용액에 24시간 침지시켜 소성 형태(이하, 제1 소성상태의 시트상 주체라고 함)로 변하게 하므로 그 두께와 형상을 간단하게 제어/조정할 수 있다.
제1 소성상태의 시트상 주체를 평활한 표면의 금형 내에 넣어 소성 시트상 주체를 획득한 후, 소성 시트상 주체와 금형을 함께 흡인후드에 넣어 소성 시트상 주체가 완전히 건조될 때까지 건조시킨다. 건조한 후, 다시 소성 시트상 주체를 1L 물에 침지하여 용액이 씻어낼 때까지 교반 세척한다. 이어서, 소성 시트상 주체를 다시 금형에 넣고 완전히 건조시킨다. 이에 따라, 안정상태의 광학적으로 투명한 시트상 주체(이하, 제1 안정상태의 시트상 주체라고 함)를 획득한다.
일 실험에서, 제1 안정상태의 시트상 주체를 자외선 램프(110V, 8W, 254nm)와 50cm 떨어진 위치에 방치하고, 각 면을 60분간 조사하는데 2회 조사하여 안정상태의 광학적으로 투명한 시트상 주체(이하, 제2 안정상태의 시트상 주체라고 함)를 획득한다.
다른 실험에서, 제1 안정상태의 시트상 주체를 1% BDDE(또는 0.05% GA) 용액에 넣어 12시간 교반 및 침지하고, 다시 탈이온수로 3회 침지 및 세척(매회 10분간)하여 안정상태의 광학적으로 투명한 시트상 주체(이하, 제3 안정상태의 시트상 주체라고 함)를 획득한다.
실험6: 제1 소성상태의 시트상 주체에 대한 관찰
거시적으로 볼 때, 도 19에 도시된 바와 같이 제1 소성상태의 시트상 주체는 투명한 접착제 상태를 나타낸다.
제1 소성상태의 시트상 주체를 제조 공정1에 의해 SEM 샘플로 처리한다. 도 20은 SEM 측정 하에서의 제1 소성상태의 시트상 주체의 단면을 나타내고, 그 중 제1 소성상태의 시트상 주체의 층상 구조는 흩어져 있다.
제1 소성상태의 시트상 주체를 제조 공정2에 의해 염색 슬라이스 샘플로 처리한다. 도 21에 도시된 바와 같이, 제1 소성상태의 시트상 주체의 염색 슬라이스 샘플로부터 제1 소성상태의 시트상 주체에 세포의 잔류가 없는 것을 관찰할 수 있다.
실험7: 제1 내지 제3 안정상태의 시트상 주체에 대한 관찰
거시적으로 볼 때, 도 22에 도시된 바와 같이 제1 안정상태의 시트상 주체는 투명하며 평평하다.
제1 안정상태의 시트상 주체를 제조 공정1에 의해 SEM 샘플로 처리한다. 도 23 및 도24는 SEM 측정 하에서의 제1 안정상태의 시트상 주체의 단면을 나타내는데, 그 중 제1 안정상태의 시트상 주체의 구조는 치밀하며 제1 안정상태의 시트상 주체의 표면은 평탄하다.
제1 내지 제3 안정상태의 시트상 주체의 평균 한계응력은 표1에 표시된 바와 같다.
Figure 112017126479988-pat00001
이로부터, 제1 내지 제3 안정상태의 시트상 주체의 평균 한계응력은 정상적인 인류 각막보다 크거나 근사할 수 있다는 것을 알 수 있다.
실험8: 소성 공정
제2 정제 어피를 직경이 16mm인 작은 원형편으로 절단하고 40조로 나눈다. 40조의 작은 원형편은 서로 다른 반응조건(표 2와 같음)으로 초산에 침지된다.
Figure 112017126479988-pat00002
초산에 침지된 후 제30조 및 제33조 내지 제40조의 제2 정제 어피가 붕괴되는데, 즉 그 형태를 유지할 수 없다.
실험9: 소성 공정과 안정화 공정
제2 정제 어피의 등부, 복부 및 꼬리 등 콜라겐 함량이 적은 부위(양호한 팽윤 상태를 이룰 수 없음)를 제거하고, 제2 정제 어피의 중앙부위를 보류한다. 중앙부위의 사이즈는 7*24cm이다. 다시 중앙부위를 7*3cm(총 8개)로 절단한다. 그 중, 각각의 표면은 중앙부위의 표면으로부터 유래된다. 각각을 0.5L/0.1M 초산용액에 6시간 침지하고, 16시간 냉장한다. 이어서, 각각을 복수개의 시트상 주체(이하, 제2 소성상태의 시트상 주체라고 함)로 재분층된다.
제2 소성상태의 시트상 주체를 전술한 제1 실시예의 안정 단계에 의해 처리하여 안정상태의 광학적으로 투명한 시트상 주체(이하, 제4 안정상태의 시트상 주체라고 함)를 획득한다. 제2 소성상태의 시트상 주체를 전술한 제2 실시예의 안정 단계에 의해 처리하여 안정상태의 광학적으로 투명한 시트상 주체(이하, 제5 안정상태의 시트상 주체라고 함)를 획득한다. 제2 소성상태의 시트상 주체를 전술한 제3 실시예의 안정 단계에 의해 처리하여 안정상태의 광학적으로 투명한 시트상 주체(이하, 제6 안정상태의 시트상 주체라고 함)를 획득한다. 제2 소성상태의 시트상 주체를 전술한 제4 실시예의 안정 단계에 의해 처리하여 안정상태의 광학적으로 투명한 시트상 주체(이하, 제7 안정상태의 시트상 주체라고 함)를 획득한다.
실험10: 제4 내지 제7 안정상태의 시트상 주체에 대한 관찰
도 25는 SEM 측정 하에서의 제4 안정상태의 시트상 주체의 단면을 나타내는데, 그 중 제4 안정상태의 시트상 주체는 종방향 콜라겐 섬유를 보유하고 있으나, 제4 안정상태의 시트상 주체의 구조가 흩어져 있고 그 평균 한계응력이 상대적으로 낮다(팽윤 형태).
도 26은 SEM 측정 하에서의 제5 안정상태의 시트상 주체를 나타내는데, 그 중 제5 안정상태의 시트상 주체는 종방향 콜라겐 섬유를 보유하고 있고 제2 안정상태의 시트상 주체의 투광도가 약 70%이다.
도 27은 SEM 측정 하에서의 제6 안정상태의 시트상 주체를 나타내는데, 그 중 제6 안정상태의 시트상 주체는 일부 종방향 콜라겐 섬유를 손실하지만, 제6 안정상태의 시트상 주체는 여전히 대부분의 종방향 콜라겐 섬유을 가지고 있다. 제6 안정상태의 시트상 주체의 투광도는 약 80%~85%이고, 제6 안정상태의 시트상 주체의 평균 한계응력과 제7 안정상태의 시트상 주체는 현저한 차이가 없다.
도 28은 SEM 측정 하에서의 제7 안정상태의 시트상 주체를 나타내고, 그 중 제7 안정상태의 시트상 주체는 일부 종방향 콜라겐 섬유를 손실하지만, 그 구조는 나란하고 치밀하게 겹치며 제7 안정상태의 시트상 주체는 여전히 대부분의 종방향 콜라겐 섬유을 가지고 있다. 제7 안정상태의 시트상 주체의 투광도는 90%보다 크고, 제7 안정상태의 시트상 주체의 평균 한계응력은 제5 안정상태의 시트상 주체의 2.5배이다.
실험11: 서로 다른 두께
일 실험에서, 제2 소성상태의 시트상 주체를 2mm의 지그를 통해 두께 절단을 진행하고, 전술한 제4 실시예의 안정단계에 의해 처리하여 안정상태의 광학적으로 투명한 시트상 주체(이하, 제8 안정상태의 시트상 주체라고 함)를 획득한다.
다른 실험에서, 제2 소성상태의 시트상 주체를 5mm의 지그를 통해 두께 절단을 진행하고, 전술한 제4 실시예의 안정단계에 의해 처리하여 안정상태의 광학적으로 투명한 시트상 주체(이하, 제9 안정상태의 시트상 주체라고 함)를 획득한다.
제8 안정상태의 시트상 주체의 두께는 약 208±36.8μm이고, 제8 안정상태의 시트상 주체의 투광도는 90%보다 크거나 같으며, 제8 안정상태의 시트상 주체의 가봉성은 40g보다 크거나 같다.
제9 안정상태의 시트상 주체의 두께는 약 500±60.8μm이고, 제9 안정상태의 시트상 주체의 가봉성은 55g보다 크거나 같다.
여기서, 절단 두께와 최종 두께(안정화 과정 후)의 비례는 약 1:0.1이다.
실험12: 함수율 테스트
제2 소성상태의 시트상 주체를 절단하고, 절단한 후 전술한 제4 실시예의 안정 단계에 의해 처리하여 안정상태의 광학적으로 투명한 시트상 주체(이하, 제10 안정상태의 시트상 주체라고 함)를 획득한다.
제10 안정상태의 시트상 주체의 두께가 약 200μm일 때, 그 함수률은 약 90%이다.
실험13: 독성 테스트
독성 테스트는 ISO10993-12에 따라 진행한다. 제7 안정상태의 시트상 주체로부터 재료 추출액을 추출한 후 재료 추출액을 배양액에 첨가하여 세포를 배양한다. 재료 추출액이 있는 배양약의 측정값을 재료 추출액이 없는 배양약의 측정값으로 나누어 얻은 수치가 92%보다 크다. 독성 테스트의 결과가 70%보다 크면 법규에 부합한다.
실험14: 소성 공정, 안정화 공정 및 가교 공정
제2 정제 어피의 등부, 복부 및 꼬리 등 콜라겐 함량이 적은 부위(양호한 팽윤 상태를 이룰 수 없음)를 제거하고, 제2 정제 어피의 중앙부위를 보류한다. 중앙부위의 사이즈는 7*24cm이다. 다시 중앙부위를 7*3cm(총 8개)으로 절단한다. 그 중, 각각의 표면은 중앙부위의 표면으로부터 유래된다. 각각을 0.5L/0.1M 초산용액에 6시간 침지하고, 16시간 냉장하여 소성상태의 시트상 주체(이하, 제3 소성상태의 시트상 주체라고 함)를 획득한다.
이어서, 제3 소성상태의 시트상 주체를 전술한 제4 실시예의 안정단계에 의해 처리하여 안정상태의 광학적으로 투명한 시트상 주체(이하, 제11 안정상태의 시트상 주체라고 함)를 획득한다.
실험15: 제1 안정상태의 시트상 주체에 대한 관찰
제11 안정상태의 시트상 주체의 두계가 약 50μm 내지 60μm일 때, 제11 안정상태의 시트상 주체의 투광도는 95%보다 크거나 같으며, 제11 안정상태의 시트상 주체의 가봉성은 60g보다 크거나 같다. 제11 안정상태의 시트상 주체의 두계가 약 90μm 내지 170μm일 때, 제11 안정상태의 시트상 주체의 투광도는 90%보다 크거나 같으며 제11 안정상태의 시트상 주체의 가봉성은 60g보다 크거나 같다. 제11 안정상태의 시트상 주체의 두계가 약 190μm 내지 250μm일 때, 제11 안정상태의 시트상 주체의 투광도는 85%보다 크거나 같으며 제11 안정상태의 시트상 주체의 가봉성은 60g보다 크거나 같다. 제11 안정상태의 시트상 주체의 두계가 약 280μm 내지 320μm일 때, 제11 안정상태의 시트상 주체의 투광도는 70%보다 크거나 같으며 제11 안정상태의 시트상 주체의 가봉성은 60g보다 크거나 같다. 그 중, 최대 가봉성은 150g보다 클 수 있다. 제11 안정상태의 시트상 주체의 평균 한계응력은 제7 안정상태의 시트상 주체의 2배이다.
실험16: 콜라겐 용액의 제조
제2 정제 어피를 0.01M 초산용액에 2시간 침지시켜 불순물을 제거함으로써 소성상태의 시트상 주체를 획득한다. 이어서, 추출 공정에 의해 소성상태의 시트상 주체로부터 콜라겐 용액을 추출한다.
실험17: 콜라겐 스펀지의 제조
제2 정제 어피를 0.1M 초산용액에 1시간 침지시킨 후 동결 건조하여 콜라겐 스펀지를 획득한다.
실험18: 콜라겐 박막의 제조
제2 정제 어피를 0.01M 초산용액에 2시간 침지시킨 후 외측층을 제거하여 소성상태의 시트상 주체를 획득한다. 이어서, 다시 소성상태의 시트상 주체을 0.1M 초산용액에 1시간 침지하여 콜라겐 박막을 획득한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 어피 유도조직 복구재료 및 그 제조방법은 파스, 드레싱제, 캐리어, 스텐트, 임플란트 또는 약제로 만들어 다양한 조직을 복구하는데 적용되는 어피 유도조직 복구재료를 제공한다. 이 조직 복구재료는 콜라겐을 포함하여 손상된 조직의 복구를 촉진하며, 예상한 조직 복구 응용에 필요되는 특정한 특징을 가지고 있다. 또한, 현재의 연구에 의하면, 이 조직 복구재료는 사람과 어류에 잔류하여 인어공통질환(바이러스에 인한 질환)을 일으키는 유발인자가 없다.
S10 : 어육이 없는 어피를 획득한다
S20 : 정제 공정
S30 : 소성 공정
S40 : 안정화 공정
S50 : 절단 공정
S210 : 어피의 어린을 제거한다
S230 : 어피의 유지와 세포를 제거한다
S250 : 어피의 색소와 포켓구조를 제거한다
S310 : 산성액으로 정제 어피를 처리하여 붕괴되지 않은 소성상태의 시트상 주체를 획득한다
S330 : 소성상태의 시트상 주체를 소성하여 특정한 형상을 가진 소성 시트상 주체를 획득한다
S410 : 표면 패턴화 단계
S430 : 소성 시트상 주체를 건조한다
S450 : 소성 시트상 주체를 직접 물세척한다
S452 : 소성 시트상 주체를 물세척한다
S470 : 소성 시트상 주체를 건조한다
S472 : 소성 시트상 주체를 재건조한다
S490 : 소성 시트상 주체를 물에 침지하여 소성 시트상 주체를 환수시킨다

Claims (13)

  1. 어육이 없는 어피를 취득하는 단계;
    상기 어피의 어린, 유지, 세포, 색소 및 포켓구조를 제거하여 정제 어피를 획득하는 단계; 및
    산성액으로 상기 정제 어피를 처리하여 붕괴되지 않은 소성상태의 시트상 주체를 획득하는 단계를 포함하는 어피 유도조직 복구재료의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 소성상태의 시트상 주체를 소성하여 특정한 형상을 가진 소성 시트상 주체를 획득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 어피 유도조직 복구재료의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 소성 시트상 주체를 물세척하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 어피 유도조직 복구재료의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 물세척 단계 전에 상기 소성 시트상 주체를 건조시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 어피 유도조직 복구재료의 제조방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 물세척 단계 후에 상기 소성 시트상 주체를 건조시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 어피 유도조직 복구재료의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 건조 단계 후에 상기 소성 시트상 주체의 수분 함량을 회복시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 어피 유도조직 복구재료의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 물세척 단계 전에 상기 소성 시트상 주체를 건조시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 어피 유도조직 복구재료의 제조방법.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 소성 단계는 상기 소성상태의 시트상 주체를 절단하여 상기 소성 시트상 주체를 획득하는 단계를 포함하고, 상기 소성 시트상 주체의 표면은 상기 소성상태의 시트상 주체의 단면인 것을 특징으로 하는 어피 유도조직 복구재료의 제조방법.
  9. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 소성 단계는 상기 소성상태의 시트상 주체를 절단하여 상기 소성 시트상 주체를 획득하는 단계를 포함하고, 상기 소성 시트상 주체의 표면은 상기 소성상태의 시트상 주체의 표면인 것을 특징으로 하는 어피 유도조직 복구재료의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 소성상태의 시트상 주체로부터 콜라겐 용액을 추출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 어피 유도조직 복구재료의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 소성상태의 시트상 주체를 동결 건조시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 어피 유도조직 복구재료의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 소성상태의 시트상 주체의 적어도 하나의 외측층을 제거하는 단계 및 산성액으로 적어도 하나의 외측층이 제거된 상기 소성상태의 시트상 주체를 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 어피 유도조직 복구재료의 제조방법.
  13. 제1항에 따른 조직 복구재료의 제조방법에 의해 제조된 어피 유도조직 복구재료.
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