CN104327297B - 一种用于人工皮肤的多孔纳米银聚氨酯薄膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于人工皮肤的多孔纳米银聚氨酯薄膜及其制备方法。所述制备方法包括：将纳米银抗菌粉末、易挥发性溶剂按一定比例加入带有搅拌器和温度计的混合器中，超声300W分散15min，再将聚氨酯粒料和致孔剂加入，在室温下搅拌30min，得到悬浮液。将上述悬浮液静置脱泡3～6h或真空度为0.6～0.8MPa脱泡20～50min后再在模具中流延成膜。然后将模具在温度100℃放置60～240min，液体薄膜中的溶剂挥发除去。待其冷却后放去离子水(或加用乙醇)中浸泡约48h，使致孔剂完全溶解。取出薄膜，放入40℃烘箱干燥，得到多孔纳米银聚氨酯薄膜。制得的多孔纳米银聚氨酯薄膜用于制作人工皮肤。该人工皮肤的透水透气性好，力学性能指标接近正常人体皮肤、生物亲和性好。

Description

一种用于人工皮肤的多孔纳米银聚氨酯薄膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及组织工程的生物材料技术领域，具体地，本发明涉及一种用于人工皮肤的多孔纳米银聚氨酯薄膜及其制备方法。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，是保护机体的重要的天然屏障。对于严重的皮肤缺损如大面积烧烫伤病人，可能导致水电解质失衡、休克、感染等一系列的问题，此时急需自体皮肤来覆盖创面。但由于自体皮源有限，因此制备一种机械强度接近真实皮肤，防水透气性能好，同时生物相容性好，价格低廉的人工皮肤则能够挽救更多患者的生命。

医用聚氨酯，具有良好的血液相容性、组织相容性、抗凝血性、无毒、无致畸作用，同时，具有良好的韧性、耐溶剂性、耐水解性，耐磨损，易加工成型，分子设计自由度大。因此目前广泛的运用于制备血液透析膜、人工血管、齿科材料、计划生育用品和医用敷料等医用制品。

纳米银作为一种医用抗菌剂，则有着杀灭微生物、促进伤口愈合、抗炎止痛等作用。通过缓慢释放银离子，纳米银有着长效的抗菌性、无耐药性，因此可以作为一种较好的烧伤创面的抗菌制剂。

人工皮肤在上世纪六十年代是许多国家研究的热点。世界上第一种商品化的人工皮肤Integra是Yannas和Burke等人发明的，是一种胶原类真皮替代品，后由Life Science公司开发生产。它的下层是由牛的I型胶原蛋白与6—硫酸软骨素(GAG)复合交联而成，呈多孔状结构，孔径30-120um；上层由硅橡胶薄膜制成，控制水分蒸发、防止感染，与人的表皮作用相当。移植到人体创面后，多孔的结构可允许毛细血管、成纤维细胞等长入。临床实验也表明使用Integra后，经二次植皮可使瘢痕增生减轻，外形美观，炎症及异物反应轻。但是该人工皮肤在临床使用时也存在缺点：对创面的要求高，需二次植皮才能覆盖创面，抗感染能力较差。同时，其力学强度较差，上层硅橡胶薄膜是致密膜，透气性较差。并且价格昂贵、成本高。

此外，由Organogenesis公司研制生产的人工皮肤Apligraf，从形态构成等各方面都和人类皮肤类似。它是由牛肌腱胶原提取的胶原蛋白交联，内含从新生儿包皮分离培养的成纤维细胞，同时表面种植上皮细胞，即形成类似人皮肤的双层结构。尽管Apligraf应用于皮肤缺损创面后没有明显的炎症反应，且创面愈合良好。但此类生物制品仍面临生产周期长，工艺复杂，价格昂贵等特点，使其应用受限。

制备一种价格低廉，制作工艺相对简单，应用方便，生物相容性好、临床效果好的人工皮肤显得尤为重要，以求快速有效的封闭创面，减少因皮肤缺损引起的感染、水电解质失调、休克等一系列疾病的发生。其中，人工皮肤的屏障功能尤为重要，好的屏障功能使人工皮肤作为暂时的创面覆盖物能起到积极的作用，因此对其抗感染以及力学强度、透水透气等特性要求更高，因此制备一种孔径合适并且可调控的多孔聚氨酯薄膜并复合纳米银是一种可行的方法。

目前制备多孔聚合物材料的方法主要有：相分离法、核径迹法、填料破碎法、拉伸法、致孔剂滤出法和冷冻干燥法等。其中致孔剂滤出法工艺简单而被广泛应用。所用致孔剂可以是固体也可以是液体。

用固体作致孔剂存在以下缺点：固体致孔剂的粒径不易达到纳米级，且粒径越小比表面积越大越容易团聚，不易制备具有小孔径的多孔聚氨酯制品。

用液体作致孔剂时，通过简单的机械式混合也不能使致孔剂均匀分散在基体中，需要在体系中加入乳化剂或表面活性剂，不至于分相。然而大多数情况下加入的第三组分不易除去且有些对生物体具有毒性。

Etienne J.C.M.P.Lommen等人在U.S.Pat.No.4985036中描述了一种双层聚氨酯人工皮肤的制备方法，成功制备了上层厚度为0.01-0.2mm，孔径0.7μm；下层厚度0.05-1mm，大孔孔径50-200μm，微孔孔径0.1-0.25μm的人工皮肤。所制备的人工皮肤应用于创面后，有一定的防止水分蒸发、体液流失和抗感染的作用。但其厚度较薄，难以运用于全层皮肤缺损创面。同时，该聚氨酯人工皮肤凭借其物理屏障的作用发挥抗感染效果，并不具备主动的杀菌和抑菌效果，难以运用于感染创面，并且其制备方法单一。

发明内容

针对上述情况，本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种用于人工皮肤的多孔纳米银聚氨酯薄膜及其制备方法。其特点是将纳米银粉体加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，经超声分散后，再加入聚氨酯粒料及致孔剂，置于带有搅拌器和温度计的混合器中，在室温下机械搅拌，得到悬浮液。采用致孔剂滤出法成膜，制得孔径在微米尺寸范围内调节的多孔纳米银聚氨酯薄膜。该方法制备的人工皮肤经动物实验证实可以运用于全层皮肤缺损创面，同时具有较强的抗感染能力，可以运用于感染创面。该方法还具有工艺简单，能耗低，成本低的优点。

在一方面中，本发明的多孔聚氨酯薄膜按下述工艺步骤及工艺参数制备：

1)将纳米银抗菌粉末加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，超声分散10～15min，功率300w，配成纳米银重量比为1.27～20wt%溶液。然后将聚氨酯(TPU)粒料溶于其中配成浓度为50～100g/L溶液。将粉碎机粉碎过的致孔剂过筛，取粒径在75～150μm之间的颗粒倒入配制好的TPU/DMF溶液中，使致孔剂浓度为500～900g/L；加入带有搅拌器和温度计的混合器中，在室温下机械搅拌20～30min，得到悬浮液；

2)将上述悬浮液静置脱泡3～6h或真空度为0.6～0.8MPa脱泡20～50min；

3)将上述脱泡后的悬浮液倒入聚四氟乙烯模具中，流延均匀，通过倒入的悬浮液的量控制液体薄膜的厚度为1～2mm；

4)将步骤3)装有液体薄膜的模具，在温度100℃放置60～240min，将液体薄膜中的溶剂挥发除去；

5)将步骤4)除去溶剂的含有纳米银抗菌粉末和致孔剂的聚氨酯薄膜在在室温下冷却固化30～70min成型；

6)将步骤5)固化后的含有纳米银抗菌粉末和致孔剂的聚氨酯薄膜放入去离子水(或加用乙醇)中约48h，每天更换一次溶剂，使致孔剂完全溶解；

7)将步骤6)除去致孔剂的薄膜放入40℃烘箱干燥，得到多孔纳米银聚氨酯薄膜，多孔纳米银聚氨酯薄膜的孔径为75～150μm。

所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。

所述致孔剂为氯化钠、卵磷脂、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、淀粉、柠檬酸钠中的至少一种。

所述模板或模具材料为玻璃、聚四氟乙烯或聚酯中的任一种。

所述多孔纳米银聚氨酯薄膜制备方法制备得到多孔纳米银聚氨酯薄膜。

多孔纳米银聚氨酯薄膜用于制作人工皮肤。

对本发明的多孔纳米银聚氨酯薄膜进行以下性能测试：

1、采用扫描电子显微镜观察多孔纳米银聚氨酯薄膜表面孔结构。

2、通过软件计算出多孔纳米银聚氨酯薄膜表面孔洞的平均孔径为75～150μm。

3、力学性能测试，制备的多孔纳米银聚氨酯薄膜力学性能优于目前国内外市场上人工皮肤产品，如Integra。

本发明的多孔纳米银聚氨酯薄膜具有如下优点：

1、本发明采用致孔剂滤出法成孔，孔径分布均匀且可调。

2、制备工艺简单，能耗低，薄膜厚度容易控制。

3、本发明生产过程中不产生废气废液，对环境友好。

4、制备的成品安全性好，对人体的毒副作用小。

5、可用于覆盖全层缺损创面及感染创面。

本发明提供以下各项：

1.一种制备多孔纳米银聚氨酯薄膜的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将纳米银粉末加入可以溶解聚氨酯的溶剂(例如，N,N-二甲基甲酰胺(DMF))中，进行超声分散，得到纳米银的溶液，然后将聚氨酯(TPU)粒料溶于其中，然后加入粒径为75～150μm的致孔剂(例如，氯化钠、卵磷脂、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、淀粉或柠檬酸钠)，将所得的混合物加入混合器中进行机械搅拌，得到悬浮液；

2)对上述悬浮液进行脱泡；

3)将上述脱泡后的悬浮液倒入模具(例如，由玻璃、聚四氟乙烯或聚酯制成的模具)中，流延均匀从而形成液体薄膜；

4)将上述液体薄膜中的溶剂挥发除去；

5)对上述除去了溶剂的液体薄膜进行冷却固化；

6)将上述固化的薄膜放入溶剂(例如，去离子水或乙醇)中，使所述致孔剂完全溶解从而被除去；

7)将上述除去了致孔剂的薄膜干燥，从而得到多孔纳米银聚氨酯薄膜。

2.根据1所述的方法，其中在所述步骤1)中，将纳米银粉末以1.27～20重量%的终浓度加入所述溶剂中。

3.根据1所述的方法，其中在所述步骤1)中，将聚氨酯以50～100g/L的终浓度溶于所述纳米银的溶液中。

4.根据1所述的方法，其中在所述步骤1)中，所述致孔剂在所述所得的混合物中的浓度为500～900g/L。

5.根据1所述的方法，其中在所述步骤3)中，形成的所述液体薄膜的厚度为1～2mm。

6.根据1所述的方法，其中在所述步骤5)中，所述冷却固化在室温进行。

7.使用根据1-6中任一项所述的方法制备的多孔纳米银聚氨酯薄膜。

8.根据7所述的多孔纳米银聚氨酯薄膜在制备用于治疗哺乳动物的皮肤缺损的人工皮肤或外科敷料中的用途。

9.根据8所述的用途，所述哺乳动物选自人、狗、猫、牛、马、兔、猪、小鼠或大鼠，并且优选是人。

10.根据8所述的用途，所述皮肤缺损是皮肤全层缺损或皮肤感染创面。

11.根据7所述的多孔纳米银聚氨酯薄膜在治疗哺乳动物的皮肤缺损中的用途，所述哺乳动物优选选自人、狗、猫、牛、马、兔、猪、小鼠或大鼠，并且更优选是人。

附图说明

图1为根据本发明的一个实施方案的多孔纳米银聚氨酯薄膜的扫描电子显微镜照片。

图2为根据本发明的另一个实施方案的多孔纳米银聚氨酯薄膜的扫描电子显微镜照片。

图3显示制备的多孔纳米银聚氨酯薄膜的细胞毒性实验结果。

图4显示动物实验分别在使用纳米银聚氨酯薄膜和凡士林纱布处理创面后第3天和第7天小鼠创面愈合率的比较。

图5显示动物实验分别在使用纳米银聚氨酯薄膜和凡士林纱布处理创面后小鼠创面完全愈合所需的时间的比较。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

本发明中的纳米银是将粒径做到纳米级的金属银单质，纳米银粒径不大于50nm。

实施例1、以氯化钠为致孔剂制备多孔纳米银聚氨酯薄膜

将纳米银抗菌粉末(购自东莞东格纳米科技有限公司，货号SGA01，其中纯纳米银含量1wt%)14g加入1L DMF中，超声分散15min(功率300w)。然后将TPU粒料溶于其中配成70g/L的溶液(TPU/DMF溶液)；将粉碎机粉碎过的的氯化钠过筛，取粒径在75～150μm之间的颗粒，倒入配制好的TPU/DMF溶液中，其中氯化钠浓度为500g/L，搅拌30min配成悬浮液，静置脱泡5h。将悬浮液倒入聚四氟乙烯模具中，流延均匀，通过倒入的悬浮液的量控制液体薄膜的厚度为0.5～2mm。然后放入100℃烘箱中，挥发溶剂成膜。约3小时后溶剂挥发完毕，取出模具。室温下待聚氨酯薄膜冷却固化50min成型后，放入去离子水中浸泡约48h，每天更换一次溶剂，使氯化钠完全溶解。取出薄膜，放入40℃烘箱干燥，得到多孔纳米银聚氨酯薄膜。采用扫描电子显微镜观察制得的多孔纳米银聚氨酯薄膜的表面结构，结果如图1所示，使用Image-Pro Plus6.0软件，设置标尺为图例标尺，固定选择该标尺，测量所有孔洞的孔径直径，导出到Excel表格中，计算孔径平均值得：薄膜的孔径约为100um。

实施例2、以卵磷脂为致孔剂制备多孔纳米银聚氨酯薄膜

将纳米银抗菌粉末70g加入1L DMF中，超声分散15min(功率300w)。然后将TPU粒料溶于其中配成90g/L的溶液(TPU/DMF溶液)；将粉碎机粉碎过的的卵磷脂过筛，取粒径在100～150μm之间的颗粒，倒入配制好的TPU/DMF溶液中，其中卵磷脂浓度为700g/L，搅拌30min配成悬浮液，真空度为0.6MPa脱泡20min。将悬浮液倒入玻璃板模具中，流延均匀，通过倒入的悬浮液的量控制液体薄膜的厚度为0.5～2mm。然后放入100℃烘箱中，挥发溶剂成膜。约3小时后溶剂挥发完毕，取出模具。室温下待聚氨酯薄膜冷却固化60min成型后，依次浸泡在乙醇和去离子水中各24h，使卵磷脂完全溶解。取出薄膜，放入40℃烘箱干燥，得到多孔纳米银聚氨酯薄膜。采用扫描电子显微镜观察制得的多孔纳米银聚氨酯薄膜的表面结构，结果如图2所示，使用Image-Pro Plus6.0软件，设置标尺为图例标尺，固定选择该标尺，测量所有孔洞的孔径直径，导出到Excel表格中，计算孔径平均值得：薄膜的孔径约为100um。

实施例3、制备的多孔纳米银聚氨酯薄膜的力学性能测试

由实施例1及实施例2制备的样本经5567万能材料试验机进行力学性能测试，测量步骤如下：

1)开机，将所测薄膜条液压固定于试验机上下两夹臂之间；

2)打开测试仪自带软件，设置实验参数，选择拉伸测试；

3)进行测试，直到样品拉断；

4)记录数据以及拷贝实验所得曲线。

结果如下：

实施例4、对制备的多孔纳米银聚氨酯薄膜的进行细胞毒性实验

为检验所制备的多孔纳米银聚氨酯薄膜的细胞毒性，进行如下实验。

1)将样本(由实施例1制得)经钴60辐照消毒、PBS漂洗3次；

2)浸提液的制备：每平方厘米样本加入1ml含10%FBS的DMEM培养液，37℃浸提24小时，得到浸提液；

3)取对数生长期人成纤维细胞制成浓度为1×10⁴/ml的细胞悬液，接种于96孔板进行培养，每孔100μL，24小时细胞贴壁生长后去除原培养基，进行下一步操作；

4)实验组：向培养的成纤维细胞按100μL/孔加入步骤2)中制备的浸提液；对照组：向培养的成纤维细胞加入等量的含10%胎牛血清的DMEM培养基，每组复种4孔；

5)共培养后六天每天进行细胞增殖检测(CCK8)实验，除去原有的浸提液或培养基，并用新的培养基分别对实验组及对照组的细胞洗涤两次，然后每孔细胞加入100μL新的培养基和10μL CCK8试剂（cell countingkit-8，购自日本同仁），37℃下孵育两小时，然后利用酶标仪在450nm波长处检测每孔的光密度，绘制细胞生长曲线，检测多孔纳米银聚氨酯薄膜样品浸提液的细胞毒性。

结果：绘制的细胞生长曲线如3所示。除培养至第六天外，实验组与对照组相比细胞生长无明显差异，故制备的纳米银聚氨酯薄膜无明显的细胞毒性，安全性较高。

实施例5、全层皮肤缺损创面修复实验

1)BALB/C小鼠(购自第三军医大学实验动物中心)全层皮肤缺损创面模型的制备：实验动物予1%戊巴比妥钠腹腔注射(100mg/kg，0.01ml/g)麻醉。背部术区备皮后，固定于俯卧位，术区常规碘伏消毒。使用显微剪沿供体小鼠背部周围剪开皮肤全层，用眼科镊夹住皮肤边缘部，完整揭下背部皮肤，勿撕破皮下肌层及皮下血管网。按此方法于受体小鼠背部制1×1cm全层皮肤缺损创面。取BALB/C小鼠18只，实验组和对照组各9只小鼠，均按上述方法制备创面模型。

2)实验组：将实施例1制备的样本裁剪为1×1cm大小，无菌生理盐水冲洗后，用2/0缝线间断缝合于小鼠背部创面上；对照组使用凡士林油纱布覆盖创面。

3)术后于第3天、第7天从实验组中分别取3只小鼠打开创面检查愈合情况，并拍照记录，对于对照组进行同样的操作。小鼠于观察创面后即采用断颈法处死。剩余的6只小鼠(每组各剩余3只)在术后第八天拆线，待仿生皮肤及凡士林纱布自然脱落时即为创面完全愈合（同时观察创面以确定创面已完全上皮化），记录创面完全愈合所需时间。

4）利用Image Pro Plus6.0对第3天和第7天各组创面照片进行分析，计算残余创面面积（创缘所包围的面积），并按下式计算创面愈合率：

创面愈合率=（原始创面面积-残余创面面积）/原始创面面积

5）使用spss17.0软件分别对第3天和第7天两组创面愈合率及两组创面完全愈合所需时间采用独立样本t检验进行统计学分析，结果如下：

表1.第3天和第7天小鼠创面愈合率(%)

统计分析见图4

表2.创面完全愈合所需时间（天）

统计分析见图5

结果：纳米银聚氨酯薄膜植入部位均未见红肿及过敏现象，无渗出液、脓液及脓肿形成，术区组织未见充血、水肿及坏死，各时间点各组创面愈合率的比较如4所示，统计分析结果显示：同时期相比，纳米银聚氨酯薄膜植入组小鼠创面愈合率明显较高，即愈合速度加快；创面愈合时间的比较如5所示，统计分析结果显示：纳米银聚氨酯薄膜植入组较对照组愈合时间明显缩短。

Claims (15)

1.一种制备多孔纳米银聚氨酯薄膜的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将纳米银粉末加入能够溶解聚氨酯的溶剂中，进行超声分散，得到纳米银的溶液，然后将聚氨酯(TPU)粒料溶于其中，然后加入粒径为75～150μm的致孔剂，将所得的混合物加入混合器中进行机械搅拌，得到悬浮液；

2)对上述悬浮液进行脱泡；

3)将上述脱泡后的悬浮液倒入模具中，流延均匀从而形成液体薄膜；

4)将上述液体薄膜中的溶剂挥发除去；

5)对上述除去了溶剂的液体薄膜进行冷却固化；

6)将上述固化的薄膜放入溶剂中，使所述致孔剂完全溶解从而被除去；

7)将上述除去了致孔剂的薄膜干燥，从而得到多孔纳米银聚氨酯薄膜。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述能够溶解聚氨酯的溶剂是N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述致孔剂选自氯化钠、卵磷脂、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、淀粉和柠檬酸钠。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述模具是由玻璃、聚四氟乙烯或聚酯制成的模具。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤6)中的溶剂是去离子水或乙醇。

6.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤1)中，将纳米银粉末以1.27～20重量％的终浓度加入所述溶剂中。

7.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤1)中，将聚氨酯以50～100g/L的终浓度溶于所述纳米银的溶液中。

8.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤1)中，所述致孔剂在所述所得的混合物中的浓度为500～900g/L。

9.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤3)中，形成的所述液体薄膜的厚度为1～2mm。

10.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤5)中，所述冷却固化在室温进行。

11.使用根据权利要求1-10中任一项所述的方法制备的多孔纳米银聚氨酯薄膜。

12.根据权利要求11所述的多孔纳米银聚氨酯薄膜在制备用于治疗哺乳动物的皮肤缺损的人工皮肤或外科敷料中的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，所述哺乳动物选自人、狗、猫、牛、马、兔、猪、小鼠或大鼠。

14.根据权利要求12所述的用途，所述哺乳动物是人。

15.根据权利要求12所述的用途，所述皮肤缺损是皮肤全层缺损或皮肤感染创面。