CN111359016B - 一种低抗原性鱼皮组织及其处理方法 - Google Patents

一种低抗原性鱼皮组织及其处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低抗原性鱼皮组织及其处理方法，本发明采用了一系列化学处理后，在最大程度维持皮肤天然结构不被破坏的情况下，通过去除抗原物质、封闭抗原决定簇等手段，有效、快速地清除皮肤组织中的抗原物质。本发明加工助剂低毒无副作用，且残留可控，经处理后的鱼皮组织无细胞毒性，血液相容性好。本发明通过交联降低了材料的抗原性，并使其具有适当的生物降解能力，为拓展材料的应用领域奠定了一定的基础。本发明提供的经过处理后的皮肤组织，拓展了其作为生物医用材料的应用领域。

Description

一种低抗原性鱼皮组织及其处理方法
技术领域
本发明属于生物医用材料的加工领域，具体涉及一种低抗原性鱼皮组织及其处理方法。
背景技术
动物源材料是来源于猪、牛或其他动物组织加工后所得的材料。来源包括动物皮、跟腱、腹膜、骨、小肠粘膜等，可直接脱细胞处理，也可提取加工胶原成分，用于组织工程支架材料。如动物皮肤可经脱细胞处理形成异种皮肤用于皮肤创面的修复，动物骨或软骨可经脱细胞处理形成异体骨组织用于临床坏死骨组织的替换。
动物源材料包括胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖等，可用于加工成人工皮肤、心脏瓣膜、补片、敷料等组织工程支架材料。其中，胶原是是动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％，具有很强的生物活性和生物功能，能参与细胞的迁移、分化和增殖，广泛应用于医疗中。
陆生动物组织一直是人们获取胶原的主要途径，但由于存在疯牛病(BSE)、口蹄疫(FMD)等疾病的传播可能性，陆生哺乳动物胶原制品的安全性受到了质疑，而水产胶原因其丰富的来源和良好的生物相容性正在被广泛研究。我国虽鲜见脱细胞鱼皮基质的相关研究，但对鱼胶原蛋白的生物相容性研究显示，鱼胶原蛋白抗原性较低，且不会引起明显的过敏反应，可作为生物材料用于医学研究。另外，我国是水产大国，随着水产养殖规模的扩大和相关加工业的发展，许多水产品的废弃物如果合理开发，可以形成高附加值的医疗用品，这也同时保护了环境，并开发了海洋资源。
组织原材料的抗原物质包括动物组织内的细胞、杂蛋白、糖胺聚糖、脂肪等非胶原成分。有文献报道，天然胶原分子链存在非螺旋区域的N-端和C-端，侧链氨基暴露较多，也能产生抗原性。当前许多有关清除动物皮肤抗原的报道，一般仅限于脱细胞，然而组织中还存在着大量的非细胞抗原成分，导致产生免疫原性。所以如何通过合理的手段去除天然组织中的抗原成分，成为了开发胶原基生物医用产品的主要关键所在。
发明内容
本发明的目的是提供一种低抗原性鱼皮组织及其处理方法，通过合理的免疫原性物质去除手段，除去天然组织中的细胞成分，同时还可去除细胞抗原，使机体的免疫反应大大降低，从而减少了材料的免疫原性，为脱细胞基质类材料的临床安全性研究提供了依据。
为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
一种低抗原性鱼皮组织的处理方法，所述处理方法包括以下步骤：
(1)取新鲜鱼皮，加入质量分数1～10％的过氧化氢溶液，搅拌，控干废液，水洗后进行脱水；
(2)加入0.01～1mol/L甲酸溶液，搅拌，控干废液，加入0.6～2mol/L氯化钠溶液，搅拌，控干废液，加入质量分数0.5～3％的氢氧化钠溶液，搅拌，控干废液，水洗后进行脱水；
(3)加入质量分数0.1～5％的十二烷基硫酸钠溶液，搅拌，控干废液，水洗后进行脱水；
(4)加入胰蛋白酶溶液，所述胰蛋白酶溶液与所述步骤(1)鱼皮的重量比为5～15∶1，搅拌，控干废液，水洗后进行脱水；
(5)加入质量分数为1～5％脱氧胆酸钠溶液，搅拌，控干废液，水洗后进行脱水；
(6)加入交联溶液，搅拌，控干废液，水洗后进行脱水；
(7)进行冷冻干燥，再以γ射线辐照灭菌，得到低抗原性鱼皮组织。
进一步的，所述步骤(1)中的鱼为鳗鱼、鲶鱼、罗非鱼或鳕鱼。
进一步的，所述步骤(6)中交联溶液为京尼平溶液、碳化二亚胺溶液或戊二醛溶液。
进一步的，所述交联溶液与步骤(1)鱼皮的重量比为5～15∶1，所述交联溶液温度为20～28℃，搅拌的时间为13～36h。
进一步的，所述步骤(1)中鱼皮和过氧化氢溶液的重量比1∶5～15，所述过氧化氢溶液的温度为20～30℃。
进一步的，所述步骤(2)中甲酸溶液与步骤(1)鱼皮的重量比为5～15∶1；所述氢氧化钠溶液与步骤(1)鱼皮的重量比为5～15∶1。
进一步的，所述步骤(3)中十二烷基硫酸钠溶液与步骤(1)鱼皮的重量比为5～15∶1，所述步骤(5)中脱氧胆酸钠溶液与步骤(1)鱼皮的重量比为5～15∶1。
进一步的，所述步骤(4)中胰蛋白酶溶液的温度为20～28℃、pH为7.8～8.2。
进一步的，所述步骤(7)中γ射线辐照灭菌的剂量为15～22kGy。
本发明还提供了所述处理方法得到的低抗原性鱼皮组织。
进一步的，所述鱼皮为新鲜健康、无病毒的鱼皮。
进一步的，所述步骤(1)搅拌时间为60～120min。
进一步的，所述步骤(2)甲酸溶液的温度为20～28℃，搅拌时间为60～120min；所述步骤(2)中氢氧化钠溶液的温度为20～28℃，搅拌时间为30～120min；加入所述氯化钠溶液搅拌时间为1～24h。
进一步的，所述步骤(3)中十二烷基硫酸钠溶液温度为20～28℃，搅拌时间为30～120min。
进一步的，所述步骤(5)中脱氧胆酸钠溶液的温度为20～32℃。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：本发明提供了一种低抗原性鱼皮组织及其处理方法，在最大程度维持皮肤天然结构不被破坏的情况下，通过去除抗原物质、封闭抗原决定簇等手段，有效、快速地清除皮肤组织中的抗原物质。本发明加工助剂低毒无副作用，且残留可控，经处理后的鱼皮组织无细胞毒性，血液相容性好。通过交联降低了材料的抗原性，并使其具有适当的生物降解能力，为拓展材料的应用领域奠定了一定的基础。经过处理后的鱼皮组织，拓展了其作为生物医用材料的应用领域。
附图说明
图1为实施例1制得的低抗原性鱼皮组织冻干形态；
图2为实施例1制得的低抗原性鱼皮组织水化后形态；
图3为实施例1去除抗原物质前的Van Gieson染色光镜图；
图4为实施例1去除抗原物质后的Van Gieson染色光镜图；
图5为实施例2去除抗原物质前的Van Gieson染色光镜图；
图6为实施例2去除抗原物质后的Van Gieson染色光镜图；
图7为实施例1去除抗原物质前的扫描电镜图；
图8为实施例1去除抗原物质后的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1：
本实施例提供了一种低抗原性鱼皮组织，所述低抗原性鱼皮组织的处理方法具体如下：
(1)选取合适规格的健康鲶鱼，速冻之后剥下皮，去除多余组织，取新鲜鱼皮100重量份，加入温度为20℃的质量分数为1％过氧化氢溶液500重量份，转鼓中处理，转鼓/滚桶转动时，鼓内的动物皮肤组织可受到不断的弯曲、伸展、摔捣、搅拌等机械作用。120min后，控干废液，加入温度为20℃的水500重量份，清洗60min，重复5次，脱水机脱水。
(2)将脱水处理后的鱼皮取出，放回转鼓，加入温度为20℃的0.01mol/L甲酸溶液500～1500重量份，转鼓中处理120min，控干废液，然后换温度为20℃的0.6mol/L氯化钠溶液处理60min，控干废液，再加入温度为20℃的质量分数0.5％氢氧化钠溶液500重量份，转鼓中处理30min，控干废液，加入温度为20℃的水500重量份，清洗60min，重复5次，脱水机脱水；
(3)将脱水处理后的鱼皮取出，放回转鼓，加入温度为20℃的质量分数0.1％十二烷基硫酸钠溶液500重量份，转鼓中处理30min，控干废液，加入温度为20℃的水500重量份，清洗60min，重复5次，脱水机脱水；
(4)将脱水处理后的鱼皮取出，放回转鼓，加入pH为8、温度为20℃的胰蛋白酶溶液500重量份，转鼓中处理60min，控干废液，加入温度为20℃的水500重量份，清洗60min，重复5次，脱水机脱水；
(5)将脱水处理后的鱼皮取出，放回转鼓，加入温度为20℃的质量分数1％脱氧胆酸钠溶液500重量份，转鼓中处理120min，控干废液，加入温度为20℃的水500重量份，清洗60min，重复5次，脱水机脱水；
(6)将脱水处理后的鱼皮取出，放回转鼓，加入温度为20℃的质量分数0.125％戊二醛溶液500重量份，转鼓中处理12h，控干废液，加入温度为20℃的水500重量份，清洗60min，重复5次，脱水机脱水；
(7)将上述步骤完成的鱼皮进行冷冻干燥24h，之后进行包装，再以γ射线辐照灭菌，γ射线辐照灭菌的剂量为15kGy，得到低抗原性鱼皮组织。
实施例2：
本实施例提供了一种低抗原性鱼皮组织，所述低抗原性鱼皮组织的处理方法具体如下
(1)选取合适规格的健康鳗鱼，速冻之后剥下皮，去除多余组织，取新鲜鱼皮100重量份，加入温度为28℃的质量分数为3％过氧化氢溶液1000重量份，转鼓中处理120min，控干废液，加入温度为28℃的水1500重量份，清洗120min，重复3次，脱水机脱水。
(2)将脱水处理后的鱼皮取出，放回转鼓，加入温度为28℃的1mol/L甲酸溶液1000重量份，转鼓中处理120min，控干废液，然后换温度为28℃的1mol/L氯化钠溶液处理12h，控干废液，再加入温度为28℃的质量分数3％氢氧化钠溶液1000重量份，转鼓中处理120min，控干废液，加入温度为20～28℃的水1500重量份，清洗120min，重复3次，脱水机脱水；
(3)将脱水处理后的鱼皮取出，放回转鼓，加入温度为28℃的质量分数0.5％十二烷基硫酸钠溶液500重量份，转鼓中处理60min，控干废液，加入温度为28℃的水1500重量份，清洗120min，重复3次，脱水机脱水；
(4)将脱水处理后的鱼皮取出，放回转鼓，加入pH为8、温度为28℃的胰蛋白酶溶液1500重量份，转鼓中处理30min，控干废液，加入温度为28℃的水1500重量份，清洗120min，重复5次，脱水机脱水；
(5)将脱水处理后的鱼皮取出，放回转鼓，加入温度为28℃的质量分数2.5％脱氧胆酸钠溶液1500重量份，转鼓中处理30min，控干废液，加入温度为28℃的水1500重量份，清洗120min，重复3次，脱水机脱水；
(6)将脱水处理后的鱼皮取出，放回转鼓，加入温度为28℃的25mmol/L碳化二亚胺溶液1500重量份，转鼓中处理12h，控干废液，加入温度为28℃的水1500重量份，清洗120min，重复3次，脱水机脱水；
(7)将上述步骤完成的鱼皮进行冷冻干燥48h，之后进行包装，再以γ射线辐照灭菌，γ射线辐照灭菌的剂量为20kGy，得到低抗原性鱼皮组织。
实施例3
本实施例对实施例1和2得到的低抗原性鱼皮组织进行性能鉴定，具体如下：
1、本发明实施例1得到的低抗原性鱼皮组织形态如图1所示，处理后的脱细胞基质为白色膜状物，正面光滑且致密，几乎无孔隙，反面较为粗糙，并具有一定的强度和韧性，不易撕裂。置于溶液中水化后如图2，材料柔软，便于手术缝合。可根据要求裁成不同的形状和大小。
2、组织切片染色：本发明采用石蜡切片进行Van Gieson染色，通过光学显微镜观察检测的方法来判断动物皮中抗原物质的清除效果，具体方法为：随机取经实施例1和2处理后的材料，剪成1×1cm大小，经10％中性甲醛溶液固定过夜；进行石蜡包埋、切片，材料厚度5μm；然后脱蜡复水；苏木素染后水洗；VG染液染至出现鲜红色；1％盐酸-乙醇分化液分化；无水乙醇脱水；二甲苯透明；通风橱晾干后中性树脂封片，显微镜(CX31RTSF)观察。可见未处理组织中实施例1的材料(图3)和实施例2的材料(图5)胶原呈红色，细胞核呈蓝黑色，表皮呈黄色。经本发明处理后的实施例1的材料(图4)和实施例2的材料(图6)只有红色，证明抗原物质去除效果好。
3、扫描电镜观察：以扫描电镜(JSM-7500，购自日本JEOL公司)观察实施例1制得的低抗原性鱼皮组织，其中，图7为去除抗原物质前的皮片的断面，存在较多的蛋白多糖、糖蛋白等。经处理后，皮片孔隙率增大见图8，证明大部分抗原物质也被去除。
4、DNA定量：通过对实施例1和2制得的低抗原性鱼皮组织进行DNA提取，测定脱细胞后材料中残留的DNA含量，具体方法为：称取一定量脱细胞基质，用基因组DNA提取试剂盒(海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司)提取DNA，通过超微量紫外分光光度计(NanoDropTM One/OneC，购自美国Thermo Fisher公司)对提取的DNA进行定量，结果见表1。
表1 DNA含量的测定
未处理皮片 实施例1 实施例2
DNA含量(ng/mg) 223 42 27
实验结果表明，经过处理后DNA的残留量大大降低，说明抗原性也随之降低。
5、力学性能检测：根据国家标准《GBT1040.4-2006塑料拉伸性能测定第4部分：各向同性和正交各向异性纤维增强复合材料的试验条件》测定材料的力学性能。具体方法为：取实施例1和2制得的低抗原性鱼皮组织，按照标准制备成5.0cm×0.5cm的哑铃状，用电子万能试验机((WDW-1，购自济南友创试验机有限公司)以20mm/min的速度拉伸，得到应力-应变曲线，根据应力-应变曲线计算最大应力和断裂伸长率，结果见表2。
表2材料的最大应力及断裂伸长率
实施例1 实施例2
最大应力MPa 6.2 3.5
断裂伸长率％ 66 38
上述结果说明：实施例1和2制得的低抗原性鱼皮组织具有良好的力学性能。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种低抗原性鱼皮组织的处理方法，其特征在于：所述处理方法包括以下步骤：
（1）取新鲜鱼皮，加入质量分数1~10%的过氧化氢溶液，搅拌，控干废液，水洗后进行脱水；
（2）加入0.01~1mol/L甲酸溶液，搅拌，控干废液，加入0.6~2mol/L氯化钠溶液，搅拌，控干废液，加入质量分数0.5~3%的氢氧化钠溶液，搅拌，控干废液，水洗后进行脱水；
（3）加入质量分数0.1~5%的十二烷基硫酸钠溶液，搅拌，控干废液，水洗后进行脱水；
（4）加入胰蛋白酶溶液，所述胰蛋白酶溶液与所述步骤（1）鱼皮的重量比为5~15:1，搅拌，控干废液，水洗后进行脱水；
（5）加入质量分数为1~5%脱氧胆酸钠溶液，搅拌，控干废液，水洗后进行脱水；
（6）加入交联溶液，搅拌，控干废液，水洗后进行脱水；所述交联溶液为京尼平溶液、碳化二亚胺溶液或戊二醛溶液；所述交联溶液与步骤（1）鱼皮的重量比为5~15:1，所述交联溶液温度为20~28℃，搅拌的时间为13~36h；
（7）进行冷冻干燥，再以γ射线辐照灭菌，得到低抗原性鱼皮组织；
所述步骤（2）中甲酸溶液与步骤（1）鱼皮的重量比为5~15:1；所述氢氧化钠溶液与步骤（1）鱼皮的重量比为5~15:1；所述步骤（3）中十二烷基硫酸钠溶液与步骤（1）鱼皮的重量比为5~15:1，所述步骤（5）中脱氧胆酸钠溶液与步骤（1）鱼皮的重量比为5~15:1。
2.根据权利要求1所述一种低抗原性鱼皮组织的处理方法，其特征在于：所述步骤（1）中的鱼为鳗鱼、鲶鱼、罗非鱼或鳕鱼。
3.根据权利要求1所述的一种低抗原性鱼皮组织的处理方法，其特征在于：所述步骤（1）中鱼皮和过氧化氢溶液的重量比1:5~15，所述过氧化氢溶液的温度为20~30℃。
4.根据权利要求1所述的一种低抗原性鱼皮组织的处理方法，其特征在于：所述步骤（4）中胰蛋白酶溶液的温度为20~28℃、pH为7.8~8.2。
5.根据权利要求1所述的一种低抗原性鱼皮组织的处理方法，其特征在于：所述步骤（7）中γ射线辐照灭菌的剂量为15～22kGy。
6.权利要求1~5所述的处理方法得到的低抗原性鱼皮组织。
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