CN109000956A - 一种全乳腺肿瘤小间隔次连续病理切片制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全乳腺次连续大切片制作方法，包括以下步骤：收集肿瘤标本；连续平行剖开，得到平行剖开的标本块；浸泡固定于浓度为4%中性甲醛溶液中24小时；修剪去除多余的脂肪组织；再次平行原切面连续平行切开成片状；用4%中性甲醛溶液继续固定48小时；采用梯度乙醇依次脱水；用二甲苯透明；在62‑65℃电热恒温培养箱中浸蜡，得到石蜡病理样本；将石蜡病理样本采用轮转式石蜡切片机切片，每一个标本块可连续切片进行包括HE在内的常规病理染色。本发明制作大切片厚度能达到常规切片厚度4‑5μm，组织结构完整，平整，干净无皱褶无污染，无脱片现象，细胞核浆比例清晰，与常规临床染色结果一致。
Description
技术领域
本发明涉及一种病理切片制作方法，特别涉及一种全乳腺肿瘤小间隔次连续病理切片的制作方法，属于医学教学、临床医学实验研究技术领域，特别是科研病理实验技术研究。
背景技术
乳腺病理大切片是指，将乳腺癌患者手术切除的全乳腺及肿瘤标本按一定厚度、均匀地作整体片状切开，取材，最后制作成病理大切片的非常规病理制片技术。利用此技术制备的切片可观察肿瘤全貌及其周围乳腺组织，还可从不同切面观察整个肿瘤在乳腺内的生长特征变化和扩展方式。既可以满足教学要求，加强学生对于乳腺癌病理认识；又可以提高现代医学研究技术，提高乳腺癌发病机理研究深入，为乳腺癌的治疗技术发展提供科学指导。
乳腺病理切片根据取材方法及取材量的不同，分为选择性全乳腺大切片与全乳腺次连续大切片。前者选择性的切取病变部位组织制片，能够清晰的观察研究乳腺癌病变部分的状况；后者将全乳腺标本按照一定间隔距离连续平行切片，能够实现具有空间立体特性研究分析，更加有利于乳腺癌病变部分和正常健康组织之间的相互作用研究。
制作全乳腺次连续大切片，可观察肿瘤全貌及其周围乳腺组织，可以从不同切面观察整个肿瘤在乳腺内的生长特征变化和扩展方式。对于临床医学的教学工作而言，可以帮助学生快速理解构建乳腺癌病变组织的空间立体分布扩散机理。
对于肿瘤医学研究而言，全乳腺次连续大切片可以实现乳腺癌主病灶附近微小病灶新发研究，癌变细胞转移扩散机理研究，对于乳腺癌发病机理、乳腺癌复发机理等临床研究具有重要意义。另外，全乳腺次连续大切片还可以用于医学影像诊断技术开发中的对照验证，提高医学影像学技术水平。
普通的病理组织切片标本技术只能制作小型切片，虽然可以将标本样品先切割成堆叠的小块，然后分别切片，以实现全乳腺的切片观察。但是各个切片之间不具有连续性，无法实现连续切片观察的同一截面全组织状态研究。特别是对于肿瘤的连续生长特性教学、研究不利，增加学生理解病理的难度，或者科学研究的准确性。
发明人研究发现，现有技术无法实现全乳腺次连续大切片制备的主要技术难点有以下几点：
1.乳腺组织结构多样性，在乳腺样品中同时存在乳腺癌病变组织、脂肪、皮肤、乳腺腺体及结缔组织等，各个部分相互嵌入结合在一起，组织结构非常复杂，各部分切片性质不同。制片过程容易出现中心部分组织固定效果不佳，标本容易弯曲变形等一系列问题，导致切片困难。
2.乳腺体积庞大，进行全乳腺次连续病理大切片制作的时候，由于乳腺体积大、取材数量多，需单独制备特殊器皿，而且病理组织切片技术处理流程繁重，耗时，耗力，导致现有切片技术难以实现全乳腺次连续大切片。
3.全乳腺次连续大切片制作过程中，对于切刀的切入角度、切入力量、速度等有更多的限制，因而对病理技师切片技术要求高。普通病理切片技师很少制作超大病理切片，特别是全乳腺大切片制作基本没有接触过，不熟悉操作，也限制了全乳腺次连续大切片制作。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中只能制作小型病理组织切片，全乳腺次连续大切片技术实现困难，切片结果不理想的问题，提供一种全乳腺次连续大切片制作方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种全乳腺次连续大切片制作方法，包括以下步骤：
(1)取样：收集肿瘤标本。
(2)初切：连续平行剖开，得到平行剖开的标本块。
(3)第一次固定：步骤2切好的标本块，浸泡固定于浓度为4wt％中性甲醛溶液中24小时。
(4)修剪：取出步骤3处理好的样本，修剪去除多余的脂肪组织；再次平行原切面连续平行切开成片状。
(5)第二次固定：将步骤4修剪好的标本拍照，用4wt％中性甲醛溶液继续固定48小时。
(6)脱水：在步骤5第二次固定完成以后，采用梯度乙醇依次脱水；
(7)二甲苯透明：脱水处理完成后，用二甲苯透明。
(8)浸蜡：将步骤7二甲苯透明处理后的样品，在62-65℃电热恒温培养箱中浸蜡，得到石蜡病理样本。
(9)病理切片：将石蜡病理样本采用轮转式石蜡切片机切片，每一个标本块可连续切片进行包括HE在内的常规病理染色。
本发明全乳腺次连续大切片制作方法将制作连续大切片分成多个步骤进行处理，对于大切片的特点将固定分成两次固定，便于初步固定以后修剪多余脂肪，提高大切片制作成形以后的形貌品质。有利于提高样本切片在显微镜下观察研究需要。
一种全乳腺次连续大切片制作方法，包括以下步骤：
(1)取样：收集乳腺浸润性导管癌患者的肿瘤标本，剪去周围明显的多余脂肪及正常腺体组织。
(2)速冻初切：将肿瘤标本放入-80℃冰箱速冻25-40分钟，优选30分钟，取出按照间隔8-15mm，优选10mm，连续平行剖开，得到平行剖开的标本块，同时标记每个切缘缝方位。
(3)第一次固定：步骤2切好的标本块，每个平行切开的剖面放置纱布一张；然后，浸泡固定于浓度为4wt％中性甲醛溶液中24小时，中性甲醛溶液体积是样本体积20倍以上。
(4)修剪：取出步骤3处理好的样本，再次修剪去除多余的脂肪组织；将之前按间隔8-15mm平行切开的每个标本，再次平行原切面按照间隔2-2.5mm的距离，连续平行切开成片状；同时再次标记每块标本各个切缘的方位，并标记每块的位置和每个切缘的方位。
(5)第二次固定：将步骤4修剪好的标本拍照，放入脱水盒，更换新配4％中性甲醛溶液继续固定48小时；更换的新配中性甲醛溶液的体积为样本体积20倍以上。
(6)脱水：在步骤5第二次固定完成以后，采用梯度乙醇依次脱水；
(7)二甲苯透明：脱水处理完成后，用二甲苯透明，先用二甲苯浸泡45min，然后更换二甲苯溶液，再次浸泡45min。
(8)浸蜡：将步骤7二甲苯透明处理后的样品，在62-65℃电热恒温培养箱中浸蜡，得到石蜡病理样本；并对标本再次照相，记录每个标本的位置和每个切缘的方位。
(9)病理切片：将石蜡病理样本采用轮转式石蜡切片机切片，每一个标本块可连续切片进行包括HE在内的常规病理染色。
本发明全乳腺次连续大切片制作方法在现有普通乳腺病例切片技术上进行创新改进。首先利用将标本样品加快速冻初切，制成块状，将块状标本样品利用中性甲醛溶液进行第一次固定，使得乳腺癌标本样转化具备一定强度。然后，进行修剪处理，再次进行剖切，切开成2-2.5mm片状。再然后，用中性甲醛溶液第二次固定，通过两次固定使得全乳腺标本样品具有均匀一拽的固定状态。接着进行脱水、二甲苯透明化处理，将标本样品浸蜡处理，利用轮转式石蜡切片机进行切片，得到连续稳定的大片切片，并进行常规病例染色处理。
通过本发明方法制备切片样品，切片完整，大片，能够更好的观察到全乳腺病理切片，切片截面连续，能够更好的满足乳腺癌病变组织外周健康组织的同步观察，对于教学工作而言可以更好地帮助学生建立空间想象，增强记忆。
本发明全乳腺次连续隔间大切片制作方法，相比传统制作方法标本样品处理及参数条件优化，样本稳定性提高，切片精确度高，切片难度降低。普通病理技术员即可在独立简便完成制片制作，切片可以制作得到4-5μm，组织结构完整，平整，干净无皱褶的大切片，观察效果非常好。
本发明方法对于乳腺癌全乳取材，并在切片制作过程定位标记，最终切片完成后可以通过标记、定位、拍照等，多种手段确定每一次处理时样本的方位(方向和相对位置)，重新将各个切片排布组织起来，构建出乳腺癌三维立体病理图，无论是用于教学工作，还是用于科学研究，都具有重大意义。三维立体病理图在教学过程中，可以帮助学生快速理解、构建知识体系记忆；在临床医学研究过程中，可以提高空间构型的研究深度，帮助乳腺癌发病机理的分析/确定。优选地，标记每个切缘缝方位是对于样本切开以后每一块标本进行相对位置、相对方向的标记。通过对每一块标本进行标记，可以确保最终切片以后的各个切片之间相对位置相对方向一致，能够实现空间立体三维样本制作和观察。
采用改良手工常规病理普通石蜡样本制作方法及样本大切片工具器皿，利用传统手动式轮转式石蜡切片机切片，苏木素-伊红(HE)染色。可以将制作的大切片，在正置显微镜下对比临床常规制片HE染色结果，观察染色结果，以判断制作方法的稳定性及可靠性。经过发明人多次试验研究确定本发明的样本制作方法具有良好的稳定性和可靠性，能够满足大切片HE染色研究等应用。
进一步，步骤(1)，剪去周围明显的多余脂肪及正常腺体组织。是直接快速的剪去明显的多余组织，在标本样品表面多余组织(如脂肪)非常明显，可以在标本样品新鲜柔软的状态下剪去，对于后续速冻初切、第一次固定处理更加有利。剪去周围明显多余脂肪及正常腺体组织以后，待研究的对象更加突出/显著，更容易提高操作处理的精度。
进一步，步骤(3)和步骤(5)，所述中性甲醛溶液是：4wt％中性甲醛(即10v％中性福尔马林)固定液，中性甲醛溶液配方如下：甲醛(40wt％)100毫升、无水磷酸氢二钠6.5克、磷酸二氢钠4.0克、蒸馏水900毫升。中性甲醛作为固定液能够使得肿瘤组织细胞蛋白质凝固，实现病理组织的固化，按照上述比例进行配制，按需配制，现用现配。
优选地，步骤(5)用手术缝合线将样本固定于脱水盒中，并标记样本方位。经过修剪以后，通过手术缝合线再次缝合固定，利于后续三维重建位置确定，同时防止样本脱水所导致皮肤组织卷曲变形。
进一步，步骤(6)所述梯度乙醇依次脱水过程如下：65v％乙醇2小时，75v％乙醇2小时，85v％乙醇2小时，95v％乙醇I 2小时，95v％乙醇II 16小时，无水乙醇I 2小时，无水乙醇II 2小时，无水乙醇III2小时。其中乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别表示第n次处理，乙醇梯度脱水处理过程中同一浓度的乙醇溶液可能需要反复使用多次，采用乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标记表示多次处理，每次处理完成以后注意更换新鲜溶液进行后续处理。
具体列为表格：
| 梯度乙醇浓度 | 时间 | |
| 脱水1 | 65v％乙醇 | 2小时 |
| 脱水2 | 75v％乙醇 | 2小时 |
| 脱水3 | 85v％乙醇 | 2小时 |
| 脱水4 | 95v％乙醇第一次 | 2小时 |
| 脱水5 | 95v％乙醇第二次 | 16小时 |
| 脱水6 | 无水乙醇第一次 | 2小时 |
| 脱水7 | 无水乙醇第二次 | 2小时 |
| 脱水8 | 无水乙醇第三次 | 2小时 |
进一步，步骤(8)，浸蜡过程中，先采用石蜡硬脂酸混合试剂浸蜡1小时，然后才采用石蜡浸蜡1小时，重新石蜡浸蜡1小时。总共进行三次浸蜡，第一次采用石蜡硬脂酸混合溶液，后面两次采用石蜡。先用石蜡和硬脂酸混合试剂进行浸蜡处理，石蜡浸润渗透效果更好，然后以石蜡浸蜡处理2次，保证充分浸蜡，浸蜡成型效果好，对于切片制作更加稳定可靠。
优选地，石蜡硬脂酸混合试剂中，石蜡与硬脂酸质量比为15-25:1，优选为20:1。硬脂酸主要起到辅助增强石蜡渗透作用，改善样本中部浸蜡效果。
优选地，浸蜡过程中使用的石蜡溶液或石蜡混合溶液和样本的体积比例≥20:1。采用过量的石蜡进行浸蜡处理，提高浸蜡的效果，改善样品的质量。
进一步，步骤(8)所有试剂与样本体积比≥20:1，最后用石蜡包埋机及自制包埋模具在温度为65℃下包埋组织并照相。
优选地，所述石蜡是医用石蜡。
优选地，步骤(8)石蜡先完全融化，取上清，然后放入样本进行浸蜡。将石蜡完全熔化取上清以防止石蜡里少量杂质粘附于组织样本影响切片质量。
进一步，步骤(9)采用轮转式石蜡切片机切片，切片放置在载玻片上染色制成待观察玻片样品。
优选地，步骤(9)使用多聚赖氨酸处理载玻片以防止组织切片脱片，特制适用于大切片按照常规染色过程的染色工具，以提高染色准确性和稳定性。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明全乳腺次连续大切片制作方法利用简单速冻法将样本在短时间内均匀，完整，连续切成薄片，实现乳腺癌标本样的初步切割，避免标本弯曲变形。
2、本发明全乳腺次连续大切片制作方法可以选择使用石蜡硬脂酸混合试剂，有效减少二甲苯的残留及毒性，使组织收缩小，不易变硬变脆，易于切片。
3、本发明全乳腺次连续大切片制作方法对于切片制作过程中，各种溶剂和标本样的体积比例控制，增加所用试剂新鲜度和使用量，利用大量试剂提高样本处理效果，解决样本制作过程中容易出现的制备不良，切片不一致的问题。
4、本发明全乳腺次连续大切片制作方法结合现有病理切片技术，可以利用现有常规病理制备工具，只需要少量配合简单改进的大样本专用简易工具，切片制作过程更加容易实现，制片效率和制片精准度都非常优秀。
5、本发明全乳腺次连续大切片制作方法最终病理切片厚度能达到4-5μm，组织结构完整，平整，干净无皱褶无污染，无脱片现象，细胞核浆比例清晰，与常规临床染色结果一致。实现大切片高品质，有利于教学工作或临床医院研究工作需要。
附图说明：
图1是全乳腺次连续大切片制作过程中的取材。
图2是全乳腺次连续大切片制作过程中的定位标记。
图3是全乳腺次连续大切片制作过程中的梯度乙醇脱水。
图4是全乳腺次连续大切片制作过程中的二甲苯透明。
图5是全乳腺次连续大切片制作过程中的浸蜡。
图6是全乳腺次连续大切片制作过程中的浸蜡后的组织。
图7是全乳腺次连续大切片制作过程中的包埋后的组织。
图8是全乳腺次连续大切片制作过程中的HE染色后的组织切片。
具体实施方式
下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明试验过程中使用的肿瘤标本均为临床乳腺癌手术切除后弃去的肿瘤标本，主要为手术后丢弃的肿瘤组织。
<实施例1>
收集乳腺浸润性导管癌患者的肿瘤标本，剪去周围明显的多余脂肪及正常腺体组织(肿瘤标本获得以后明显较大的脂肪等，尽可能保留肿瘤标本关键部分，去除不相关的部分，根据临床医生的经验进行实施即可)。将肿瘤标本放入-80℃冰箱速冻30分钟，取出按照间隔15mm连续平行剖开，得到平行剖开的标本块，同时标记每个切缘缝方位(确定每一块标本快的方向及切开以前的排布位置)。将切好的标本块，每个平行切开的剖面放置纱布一张；然后，浸泡固定于浓度为4％中性甲醛溶液中24小时，中性甲醛溶液体积大约是样本体积22倍。
中性甲醛溶液配方方法如下：市售甲醛(40％)100毫升、无水磷酸氢二钠6.5克、磷酸二氢钠4.0克、蒸馏水900毫升，混合搅拌均匀，即为4％中性甲醛溶液。
然后，再次修剪去除多余的脂肪组织；将之前按间隔10mm平行切开的每个标本，再次平行原切面按照间隔2mm的距离，连续平行切开成片状；同时再次标记每块标本各个切缘的方位，并标记每块的位置和每个切缘的方位。
修剪好的标本拍照(照相记录相对位置及方向排布等信息)，放入包埋盒，更换新配4％中性甲醛溶液继续固定48小时；更换的新配中性甲醛溶液的体积为样本体积22倍。再然后，采用梯度乙醇依次脱水。脱水处理完成后，用二甲苯透明，先用二甲苯浸泡45min，然后更换新鲜二甲苯溶液，再次浸泡45min。在62℃电热恒温培养箱中浸蜡；并对标本再次照相，记录每个标本的位置和每个切缘的方位。处理所得石蜡病理样本，采用轮转式石蜡切片机切片，每一个标本块可连续切片进行包括HE在内的常规病理染色。
<实施例2>
参考实施例1的方案进行全乳腺次连续大切片制作。制作过程中拍照如图1-8所示，分别是全乳腺次连续大切片制作过程中图1取材、图2定位标记、图3梯度乙醇脱水、图4二甲苯透明、图5浸蜡、图6浸蜡后的组织、图7包埋后的组织、图8HE染色后的组织切片。
具体的制作过程为：收集乳腺浸润性导管癌患者的肿瘤标本，在患者乳房完整切除后(清扫腋窝淋巴结前)，由手术医师将肿瘤完整地从乳房标本中剜出，剪去周围明显的多余脂肪及正常腺体组织。取肿瘤中间约5×5×2.5mm(长×宽×高)一小块送病理科行临床常规术后石蜡切片检查(post-operation pathology，POP)，其余完整标本取下后立即放入-80℃冰箱速冻35分钟，取出按照间隔10mm连续平行剖开，每个切缘缝不同的缝线标记方位，肿瘤的每个平行切开的剖面放置纱布一张，浸泡固定于20倍体积的浓度为4％中性甲醛24小时(样本与溶液体积比1:20，肿瘤的每个平行切开的剖面放置纱布一张，便于甲醛完全浸入)。
24小时后，取出样本再次修剪去除多余的脂肪组织(之前剪去明显多于的脂肪组织，由于肿瘤标本是柔软的不易处理，所以切片和初步固定以后再次清理)，将之前按间隔10mm平行切开的每个标本，再平行原切面，按照间隔2.5mm的距离再连续平行切开成片状，同时再次标记每块标本各个切缘的方位。并标记每块的位置和每个切缘的方位。每个标本照相后，放入特制的包埋盒，更换25倍体积量的新配4％中性甲醛继续固定至达48小时。标本固定好后，梯度乙醇依次脱水。梯度乙醇处理程序如下：65％乙醇2小时，75％乙醇2小时，85％乙醇2小时，95％乙I 2小时，95％乙醇II 16小时，无水乙醇I 2小时，无水乙醇II 2小时，无水乙醇III2小时，逐渐提高乙醇的浓度，实现缓慢过渡的脱水处理。
梯度乙醇脱水处理完成以后，采用二甲苯透明处理，分成两次处理：第一次用二甲苯处理45min，然后更换二甲苯溶液，第二次处理再用二甲苯处理45min。两次二甲苯处理完成以后，肿瘤标本透明化。开始浸蜡，将石蜡与硬脂酸为质量比22:1混合，加热至65℃，充分熔化以后，取上清液，置于63℃电热恒温培养箱中。放入肿瘤标本浸蜡1小时。然后，更换新石蜡继续浸蜡1小时，重复更换石蜡浸蜡1小时，总共浸蜡3次。完成浸蜡后，再次照相以提示每个标本的位置和每个切缘的方位。最后一次浸蜡的时候，用石蜡包埋机及包埋模具，将肿瘤标本完全浸没于石蜡当中，在温度为65℃下包埋组织并照相。
将浸蜡好的样本，自然冷却至室温，得石蜡病理大样本。采用轮转式石蜡切片机切片，每一个标本块可连续切片进行包括HE在内的常规病理染色，使用多聚赖氨酸处理载玻片以防止组织切片脱片，特制适用于大切片按照常规染色过程的染色工具，以提高染色准确性和稳定性。
<实施例3>
总结实施例1-2利用全乳腺肿瘤小间隔次连续组织病理切片制作与常规制片相比较，实施例1-2制备过程中HE染色结果无明显差异，但却解决了传统乳腺病理大切片制作过程出现的固定效果不佳，弯曲变形，切片较厚，质量差，染色容易脱片，不能在普通正置显微镜下观察等一系列技术问题。主要是因为制片过程中针对全乳腺肿瘤标本进行相应的预处理准备，使得样本脱水、透明、浸蜡等效果更好，能够更加优秀的实现样本综合处理效果，使得后续大切片制作更加简单高效。
并有效将前期制备时间由7天缩短至4天，切片厚度由10μm减少到4-5μm，改良载玻片厚度为常规载玻片厚度1.2mm，降低切片难度，提高制作效率。使病理技术工作人员在普通实验条件下，完成制片工作，便于临床医生准确充分了解肿瘤全貌及其周围乳腺组织，还可从不同切面观察整个肿瘤在乳腺内的生长特征变化和扩展方式，为乳腺癌的治疗和预后提供有价值的参考。
其中，实施例2最后制备得到的大切片标本样如图8所示，切片的质量非常的优秀，而且切片连续性好，表现出优秀的大幅度切片特定。和普通切片技术相比，切片的连续长宽幅度更大，能够满足连续幅宽观察研究的需要，而且切片的厚度、均匀度都非常好，观察效果更佳。
<实施例4>
收集乳腺浸润性导管癌患者的肿瘤标本，在患者乳房完整切除后(清扫腋窝淋巴结前)，由手术医师将肿瘤完整地从乳房标本中剜出，剪去周围明显的多余脂肪及正常腺体组织。取肿瘤中间约5×5×2.5mm(长×宽×高)一小块送病理科行临床常规术后石蜡切片检查(post-operation pathology：POP)，其余完整标本取下后30分钟内放入-80℃冰箱速冻26分钟，取出，按照间隔12mm连续平行剖开，每个切缘缝不同的缝线标记方位，在每一个切缝中间放置纱布，浸泡固定于浓度为4％中性甲醛24小时(样本与溶液体积比1:20，肿瘤的每个平行切开剖面放置纱布一张以便于甲醛完全浸入)。
24小时后，取出样本再次修剪去除多余的脂肪组织，将之前按间隔12mm平行切开的每个标本，再平行原切面，按照间隔1.5mm的距离再连续平行切开成片状，同时再次标记每块标本各个切缘的方位。并标记每块的位置和每个切缘的方位。每个标本照相后，放入特制的包埋盒，更换新配4％中性甲醛继续固定至达48小时。标本固定好后，梯度乙醇依次脱水(65％乙醇2小时，75％乙醇2小时，85％乙醇2小时，95％乙I 2小时，95％乙醇II 16小时，无水乙醇I 2小时，无水乙醇II 2小时，无水乙醇III2小时)，二甲苯透明(二甲苯I 45min，二甲苯II 45min，)。
在62℃电热恒温培养箱中浸蜡，第一次浸蜡采用石蜡硬脂酸混合试剂40分钟，石蜡与硬脂酸为质量比20:1；然后，第2-3次浸蜡采用石蜡II浸蜡1小时，石蜡III浸蜡1小时。浸蜡完成后，再次照相以提示每个标本的位置和每个切缘的方位。注意：所有试剂与样本体积比为20:1，最后用石蜡包埋机及自制包埋模具在温度为65℃下包埋组织并照相。
石蜡病理大样本采用轮转式石蜡切片机切片，每一个标本块可连续切片进行包括HE在内的常规病理染色，注意：使用多聚赖氨酸处理载玻片以防止组织切片脱片，特制适用于大切片按照常规染色过程的染色工具，以提高染色准确性和稳定性。在切片的过程中切片技师反应，上述方案处理好的石蜡包埋样品切片稳定，没有任何弯曲变形，并且切片能够达到更低的薄度(3-6μm)。对于后续组织切片在显微镜下观察的效果更好。
其中，每一次制备切片的时候，样本都使用全新配制的处理试剂进行加工处理。
<实施例5>
按照实施例4的方法制作全乳腺肿瘤小间隔次连续组织病理制片，全乳腺肿瘤小间隔次连续病理切片制作方法，乳腺癌全乳取材，并做定位标记，采用改良手工常规病理普通石蜡样本制作方法及自制特殊制备大切片样本相关工具器皿，手动式轮转式石蜡切片机切片，苏木素伊红(HE)染色，制作出高品质全乳腺次连续病理大切片。对于每块标本做好编号记录，记录每块标本位置及排布顺序、方向等。在制作过程中，随时观察，必要的时候进行拍照记录。可以将切片制作过程中和教学过程结合起来，增强学生的记忆。
制作得到的大切片可以用于临床医学研究，在正置显微镜下，对比临床常规制片HE染色结果，观察染色结果，对比研究肿瘤组织生长扩展情况及方向。结果切片厚度能达到常规切片厚度4-5μm，组织结构完整，平整，干净无皱褶无污染，无脱片现象，细胞核浆比例清晰，与常规临床染色结果一致。表明本发明全乳腺次连续病例大切片的制作结果达到临床常规切片的品质等级或以上，满足临床研究要求。同时，所得切片具备连续病例大切片的特点，对于教学工作中学生理解建立深入的立体构想具有很好的帮助。
<对比例1>
采用与实施例4类似的方案制作大切片，收集乳腺浸润性导管癌患者的肿瘤标本，在患者乳房完整切除后(清扫腋窝淋巴结前)，剪去周围明显的多余脂肪及正常腺体组织。直接将完整标本放入-20℃冰箱速冷40分钟，取出，按照间隔15mm连续平行剖开。在速冷以后切片的时候，标本样品柔软度还是较高，切片的平整度不佳，初步切片花费时间相比于实施例4增加2倍，而且初步切片的平整度较差。然后按照和实施例4相同的方案进行第一次固定、修剪、第二次固定、脱水、二甲苯透明、浸蜡。然后，采用轮转式石蜡切片机切片，结果切片过程出现局部轻微弯曲变形的问题，导致全乳腺次连续大切片形貌存在局部瑕疵，观察过程中出现空白区域，对于研究或教学使用都存在严重干扰。
<对比例2>
采用与实施例4类似的方法制作大切片，收集同样的肿瘤标本，精细修剪除去多余的脂肪及腺体组织，放入-80℃冰箱速冻26分钟，取出，按照间隔3mm连续平行剖开。由于平行切片的片较薄，样本的形貌出现轻微变形。然后，在每一个切缝中间放置纱布，浸泡固定于浓度为4％中性甲醛72小时(样本与溶液体积比1:30)，每隔24小时，翻转样本一次，使得样本充分浸泡固定。标本固定好后，和实施例4采用相同的梯度乙醇依次脱水、二甲苯透明、浸蜡。石蜡病理大样本采用轮转式石蜡切片机切片，切片发现部分样本切片由于存在轻微变形，在切片的时候有变形褶皱。而且，样本固定效果不佳，存在少量组织细胞自溶，在显微镜下观察的时候，分辨率降低，分辨效果不佳。
<对比例3>
采用与实施例4类似的方法制作大切片，收集同样的肿瘤标本，不进行预先修剪处理，直接将肿瘤标本样品放入-80℃冰箱速冻处理，保留多余脂肪和腺体组织，然后进行第一次固定处理，在第一次固定处理以后再进行精细修剪处理。其中，第一次固定处理的参数和实施例4保持一致。在精细修剪处理的时候，发现多余脂肪组织和腺体组织使得肿瘤标本的第一次固定效果不佳，主要是大块的脂肪组织对于固定的阻碍4％中性甲醛溶液的渗透作用，使得组织初步固定不均匀。进而在继续再次平行剖切的时候，我们发现肿瘤标本又出现了轻微变形，预期对于连续病例大切片的连续性存在不利。后续按照实施例4相同的方法进行修剪、第二次固定、乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡。利用轮转式石蜡切片机切片，结果切片中果然出现了轻微的弯曲变形，应该是精细修剪处理再次切片时候组织变形的残留影响。
Claims (10)
1.一种全乳腺次连续大切片制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取样：收集肿瘤标本；
（2）初切：连续平行剖开，得到平行剖开的标本块；
（3）第一次固定：步骤2切好的标本块，浸泡固定于浓度为4wt%中性甲醛溶液中24小时；
（4）修剪：取出步骤3处理好的样本，修剪去除多余的脂肪组织；再次平行原切面连续平行切开成片状；
（5）第二次固定：将步骤4修剪好的标本拍照，用4wt%中性甲醛溶液继续固定48小时；
（6）脱水：在步骤5第二次固定完成以后，采用梯度乙醇依次脱水；
（7）二甲苯透明：脱水处理完成后，用二甲苯透明；
（8）浸蜡：将步骤7二甲苯透明处理后的样品，在62-65℃电热恒温培养箱中浸蜡，得到石蜡病理样本；
（9）病理切片：将石蜡病理样本采用轮转式石蜡切片机切片，每一个标本块可连续切片进行包括HE在内的常规病理染色。
2.如权利要求1所述全乳腺次连续大切片制作方法，其特征在于，所述中性甲醛溶液是：4wt%中性甲醛固定液。
3.如权利要求2所述全乳腺次连续大切片制作方法，其特征在于，中性甲醛溶液配方如下：40wt.%甲醛100毫升、无水磷酸氢二钠 6.5克、磷酸二氢钠 4.0克、蒸馏水 900毫升。
4.如权利要求1所述全乳腺次连续大切片制作方法，其特征在于，步骤（5）用手术缝合线将样本固定于脱水盒中，并标记样本方位。
5.如权利要求1所述全乳腺次连续大切片制作方法，其特征在于，步骤（6）所述梯度乙醇依次脱水过程如下：65v%乙醇2小时，75v%乙醇 2小时，85v%乙醇 2小时，95v%乙醇I 2小时，95v%乙醇II 16小时，无水乙醇I 2小时，无水乙醇II 2小时，无水乙醇III2小时。
6.如权利要求1所述全乳腺次连续大切片制作方法，其特征在于，步骤（8），浸蜡过程中，先采用石蜡硬脂酸混合试剂浸蜡1小时，然后才采用石蜡浸蜡1小时，重新石蜡浸蜡1小时。
7.如权利要求1所述全乳腺次连续大切片制作方法，其特征在于，石蜡硬脂酸混合试剂中，石蜡与硬脂酸质量比为15-25:1。
8.如权利要求1所述全乳腺次连续大切片制作方法，其特征在于，浸蜡过程中使用的石蜡溶液或石蜡混合溶液和样本的体积比例≥20:1。
9.如权利要求1所述全乳腺次连续大切片制作方法，其特征在于，步骤（9）采用轮转式石蜡切片机切片，切片放置在载玻片上染色制成待观察玻片样品。
10.如权利要求1所述全乳腺次连续大切片制作方法，其特征在于，步骤（9）使用多聚赖氨酸处理载玻片以防止组织切片脱片。
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