CN105092621B - 显著化生物组织切片膜结构的刻蚀工艺及图像合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的显著化生物组织切片膜结构的刻蚀工艺及图像合成方法，包括：采集生物组织切片，将所述生物组织切片通过扫描电子显微镜SEM观察得到第一生物组织切片图像；将所述生物组织切片进行刻蚀处理得到刻蚀的生物组织切片，并将所述刻蚀的生物组织切片通过所述SEM观察得到第二生物组织切片图像；将所述第一生物组织切片图像和所述第二生物组织切片图像进行融合得到融合的生物组织切片图像。本发明可以提高生物微观结构的三维重建精度和效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别是涉及一种显著化生物组织切片膜结构的刻蚀工艺及图像合成方法。
背景技术
借助于仪器仪表行业和计算机技术的快速发展，生物组织微观重建技术在近些年的发展非常迅速。近一个多世纪以来，在科技快速发展的同时，包括人类在内的整个地球生物界都面临越来越多的威胁，如各种新型疾病的出现、物种的加速消失等。虽然近些年生物医学领域对于个别疾病的研究取得了重大进展，但对于整个地球生物界面临的威胁而言，这样的进展远远不够。只有从最基本层面，即微观尺度上，将生物体的结构、功能以及二者的相互关系研究透彻，我们才能找到从根本上治疗疾病的方法，并能以此预测并预防一些新型疾病的出现。
随着电子显微镜在生物医学研究中的广泛应用，虽然从分辨率方面比传统的光学显微镜提高了2～3个数量级，但电子显微镜对所观察样品的制备要求也更高。自从Watson在1958年首先提出铅化合物可以增加超薄切片中细胞超微结构的反差以来，目前国内外多采用Reynolds在1963年提出的柠檬酸铅作为常规铅染液。但多年来，超薄切片的铅污染却是许多实验室普遍存在的问题，它直接影响着切片的质量和电镜观察效果，原因在于过去所用的铅染液在接触空气中的二氧化碳后易产生碳酸铅沉淀污染切片。而且铅染液不能长期贮存，否则污染会更加严重。为了解决这个问题，Hanaichi等在1986年改进了铅染液配方和染色方法并取得了一定效果。近几年来，德国马克普朗克神经生物学研究所和美国哈佛大学针对生物组织样品扫描电子显微镜SEM成像的制备方法进行了进一步改进，虽然对SEM图像衬度有较大提升，但对于算法自动识别图像中生物组织微观结构还有一定距离。
基于上述生物样品制备技术的发展，生物医学领域主要发展了四种微观重建方式。第一种是序列切片透射电镜成像方法，即ssTEM，该方法先用切片机对生物组织样品块切片，并将序列切片收集在单孔铜网上并根据切片的顺序编号，然后利用TEM成像。第二种是连续样品表面扫描电镜成像方法，即SBEM，这种方式是在扫描电镜内部内置了高精度的钻石刀，通过钻石刀对样品表面进行间歇性等厚度切削，每次切削后利用SEM对暴露出的样品表面进行成像。第三种是聚焦离子束-扫描电镜方式，即FIB-SEM，该方式用FIB的离子束对样品表面进行切削后再利用电子束进行成像。第四种是自动卷带超薄切片机扫描电镜成像方式，即ATUM-SEM，该方法通过自动切片、收集系统将超薄切片收集到专用条带上，然后放入SEM中进行成像。ssTEM是四种微观重建方式中分辨率最高的一种，这得益于TEM本身的高分辨率，其余三种方式都是利用SEM成像。但由于切片是收集在单孔铜网上，并且受制于TEM的视场大小，所以这种方式只适用于体量较小的生物组织微观重建，一般在临床医学方面应用较多。SBEM和FIB-SEM方式由于采用的是对生物组织样品块切削后原位拍照，故其后续图像配准的难度和工作量都大大降低。这两种方式采用的都是对块体断面进行背散射电子成像，并且为了尽可能减少电子束对样品块表面造成的损伤，否则会改变样品块表面的物理化学特性进而影响后续钻石刀或离子束对其进行进一步的切削，拍照时通常选用较低的电压和比较小的图像获取时间，所以得到的图像一般分辨率和信噪比均较差。此外，由于SBEM和FIB-SEM方式对样品而言是破坏性的，所以在进行一些珍贵生物样本或大体量样本的三维重建时，对系统的稳定性要求非常高，尤其是钻石刀的洁净度和FIB离子源的稳定性方面。ATUM-SEM方式的最大优点有两个，一是在拍照前就可以确定序列切片的连续性，二是切片可以重复使用，即当出现个别切片所拍照片满足不了三维重建需要时可以重新拍摄。简而言之，ATUM-SEM方式可以确保生物组织三维重建数据的完整性。目前，SBEM和ATUM-SEM方式在体量较大的生物组织微观重建中应用较多。
自从十九世纪末科学家首次在显微镜下检测到神经细胞以来，已经发生了很多事情。健康及病变大脑的解剖学、化学和细胞生物学，已经得以广泛的探讨。然而，人的想法和感受如何来自单个细胞的活性？当细胞从网络上分离时会发生什么？目前还不明确。因此，了解神经网络的连接并发现所有这些连接，对于联接组学的目标显然是很重要的。为了更好的理解“大脑是如何工作的”，美国和欧盟相继推出了各自的“脑计划”。但就目前国内外报道的三维重建技术而言，完成大体量生物组织(如鼠脑或人脑)三维重建仍然面临诸多挑战。首先，在生物样品制备和图像获取方面，目前很难获得兼具衬度一致性好、组织结构边缘锐度较理想的图像，且由于SEM成像主要采用图像获取速率较慢背散射电子成像，导致生物组织样品的图像获取周期太长。其次，利用算法对已有报道中所获取到的背散射电子图像进行生物微观组织结构自动识别时遇到了较大挑战，主要表现在识别准确率和效率方面。因此，寻找一种能快速获取到衬度一致性好、组织结构边缘锐度理想的生物组织电子显微图像的方法是生物医学研究领域一直努力的目标。
发明内容
本发明提供的显著化生物组织切片膜结构的刻蚀工艺及图像合成方法，可以提高生物微观结构的三维重建精度和效率。
根据本发明的一方面，提供显著化生物组织切片膜结构的刻蚀工艺及图像合成方法，包括：
采集生物组织切片，将所述生物组织切片通过扫描电子显微镜SEM观察得到第一生物组织切片图像；将所述生物组织切片进行刻蚀处理得到刻蚀的生物组织切片，并将所述刻蚀的生物组织切片通过所述SEM观察得到第二生物组织切片图像；将所述第一生物组织切片图像和所述第二生物组织切片图像进行融合得到融合的生物组织切片图像。
本发明实施例提供的显著化生物组织切片膜结构的刻蚀工艺及图像合成方法，通过采集生物组织切片，将生物组织切片通过扫描电子显微镜SEM观察得到第一生物组织切片图像，将生物组织切片进行刻蚀处理得到刻蚀的生物组织切片，并将刻蚀的生物组织切片通过所述SEM观察得到第二生物组织切片图像，将第一生物组织切片图像和第二生物组织切片图像进行融合得到融合的生物组织切片图像，可以提高生物微观结构的三维重建精度和效率。
附图说明
图1为本发明实施例提供的显著化生物组织切片膜结构的刻蚀工艺及图像合成方法流程图；
图2A为本发明实施例提供的大脑鼠超薄切片在等离子刻蚀前的SEM图像；
图2B为本发明实施例提供的大脑鼠超薄切片在等离子刻蚀后的SEM图像；
图2C为本发明实施例提供的大脑鼠超薄切片在等离子刻蚀前后融合的SEM图像；
图3A为本发明实施例一提供的果蝇脑超薄切片在等离子刻蚀前的SEM图像；
图3B为本发明实施例一提供的果蝇脑超薄切片在等离子刻蚀后的SEM图像；
图3C为本发明实施例一提供的果蝇脑超薄切片在等离子刻蚀前后融合的SEM图像；
图4A为本发明实施例二提供的果蝇脑超薄切片在等离子刻蚀前的SEM图像；
图4B为本发明实施例二提供的果蝇脑超薄切片在等离子刻蚀后的SEM图像；
图4C为本发明实施例二提供的果蝇脑超薄切片在等离子刻蚀前后融合的SEM图像。
具体实施方式
下面结合附图对本发明实施例提供的显著化生物组织切片膜结构的刻蚀工艺及图像合成方法进行详细描述。
图1为本发明实施例提供的显著化生物组织切片膜结构的刻蚀工艺及图像合成方法流程图。
参照图1，在步骤S101，采集生物组织切片，将所述生物组织切片通过扫描电子显微镜SEM观察得到第一生物组织切片图像。
这里，生物组织样品块包括脑组织和肌肉组织等，通过生物组织样品获取生物组织切片的步骤具体如下：
在步骤S1011，通过修块机对生物组织样品块进行粗修，将前端多余的空白树脂尽可能多的去除。
在步骤S1012，然后固定在超薄切片机上，用修块刀精细修整生物组织外树脂，直至目标生物组织露出。
在步骤S1013，然后使用清洁后的钻石刀进行超薄切片，厚度为50～70nm。
在步骤S1014，最后将水槽内的超薄切片收集到玻片或硅片表面，室温下等待切片充分干燥后放入SEM观察，从而获取第一生物组织切片图像。第一生物组织切片图像即为刻蚀前的生物组织切片图像。如选用玻片作为收片载体，在进行SEM观察前需对其表面进行蒸碳处理。
在步骤S102，将所述生物组织切片进行刻蚀处理得到刻蚀的生物组织切片，并将所述刻蚀的生物组织切片通过所述SEM观察得到第二生物组织切片图像。
这里，对生物组织切片进行刻蚀处理的步骤具体如下：
在步骤S1021，将表面收集有生物超薄切片的玻片或硅片放置于等离子刻蚀机样品腔室内，用耐高温胶带将其固定在样品台上，关闭舱门并设置刻蚀功率、工艺气体种类及流量、工作压力、刻蚀时间等参数，具体参数的设定可参见表1。
表1
在步骤S1022，然后启动刻蚀程序。当选择较低的功率时，气体(可选择单一气体或混合气体)流量需适当增大，这样才能保证在刻蚀期间等离子体的稳定性。
在步骤S1023，刻蚀结束后，将样品腔室的真空放掉，取出玻片或硅片用于扫描电镜观察，从而得到第二生物组织切片图像，第二生物组织切片图像即为刻蚀后的图像。如选用玻片作为收片载体，在进行SEM观察前需对其表面进行蒸碳处理。
在步骤S103，将所述第一生物组织切片图像和所述第二生物组织切片图像进行融合得到融合的生物组织切片图像。
进一步地，所述将所述第一生物组织切片图像和所述第二生物组织切片图像进行融合得到融合的生物组织切片图像包括：
通过目标函数将所述第一生物组织切片图像的纹理部分和所述第二生物组织切片图像的纹理部分进行配准，从而得到向量场；
根据所述向量场对所述第一生物组织切片图像以所述第二生物组织切片为基准进行校正得到配准图像；
根据所述配准图像和所述第一生物组织切片图像得到所述融合的生物组织切片图像。
进一步地，所述根据所述配准图像和所述第一生物组织切片图像得到所述融合的生物组织切片图像包括：
从所述配准图像和所述第一生物组织切片图像中进行提取得到提取图像；
将所述提取图像融合到所述背底图像中得到所述融合的生物组织切片图像。
进一步地，所述通过目标函数将所述第一生物组织切片图像的纹理部分和所述第二生物组织切片图像的纹理部分进行配准，从而得到向量场包括：
根据公式(1)计算所述目标函数：
J(u,v)＝||BT(x,y)-AT(x+u,y+v)||1+γ·||ux||1+γ·||uy||1+γ·||vx||1+γ·||vy||1 (1)
其中，BT(x,y)为所述第一生物组织切片图像的纹理部分，(x,y)为图像的采样点，AT(x+u,y+v)为通过在x方向平移u，在y方向平移v的第二生物组织切片图像的纹理部分，ux为u在x方向的导数，uy为u在y方向的导数，vx为v在x方向的导数，vy为v在y方向的导数，γ为权重参量。
进一步地，所述根据所述配准图像和所述第一生物组织切片图像得到所述融合的生物组织切片图像包括：
根据公式(2)计算所述融合的生物组织切片图像：
其中，为所述融合的生物组织切片图像保持所述第一生物组织切片图像的明暗信息，具体由公式(3)和公式(4)可知，为所述融合的生物组织切片图像保持所述第一生物组织切片图像的边缘信息，为所述融合的生物组织切片图像保持所述第二生物组织切片图像的边缘信息；
相应地，
其中，‖·‖p是Lp范数，Δ-1是逆拉普拉斯算子，F-1表示傅里叶变换，，M，N表示图像的大小，p，q表示图像二维傅里叶变换的采样点。
本发明实施例提供的显著化生物组织切片膜结构的刻蚀工艺及图像合成方法，通过采集生物组织切片，将生物组织切片通过扫描电子显微镜SEM观察得到第一生物组织切片图像，将生物组织切片进行刻蚀处理得到刻蚀的生物组织切片，并将刻蚀的生物组织切片通过所述SEM观察得到第二生物组织切片图像，将第一生物组织切片图像和第二生物组织切片图像进行融合得到融合的生物组织切片图像，可以提高生物微观结构的三维重建精度和效率。
图2A为本发明实施例提供的大脑鼠超薄切片在等离子刻蚀前的SEM图像。
参照图2A，利用修块机对大鼠脑样品块进行粗修，将前端多余的空白树脂尽可能多的去除，然后固定在超薄切片机上，用修块刀精细修整大鼠脑组织外树脂，直至大鼠脑组织露出。然后使用清洁后的钻石刀进行超薄切片，厚度为50nm。最后将水槽内的超薄切片收集到硅片表面，室温下等待切片充分干燥后放入SEM观察，即得到大脑鼠超薄切片在等离子刻蚀前的SEM图像。
将大脑鼠超薄切片进行等离子刻蚀处理得到刻蚀后的SEM图像，具体可参照如图2B所示的大脑鼠超薄切片在等离子刻蚀后的SEM图像。将表面收集有大鼠脑超薄切片的硅片放置于等离子刻蚀机样品腔室内，用耐高温胶带将其固定在样品台上，关闭舱门。按表2设置刻蚀功率、工艺气体种类及流量、工作压力、刻蚀时间，然后启动刻蚀程序。启动后，偏压值在105V至113V之间变化，说明等离子体的状态稳定。待刻蚀结束后，将样品腔室的真空放掉，取出硅片并置于扫描电镜中观察。
表2
将刻蚀后的SEM图像作为背底图像，利用自动识别算法将刻蚀前SEM图像中鼠脑组织结构边界效果较好的细节提取出来融合在背底图像中，融合后的SEM图像具体参照图2C。
图3A为本发明实施例一提供的果蝇脑超薄切片在等离子刻蚀前的SEM图像。
参照图3A，利用修块机对果蝇脑样品块进行粗修，将前端多余的空白树脂尽可能多的去除，然后固定在超薄切片机上，用修块刀精细修整果蝇脑组织外树脂，直至果蝇脑组织露出。然后使用清洁后的钻石刀进行超薄切片，厚度为60nm。最后将水槽内的超薄切片收集到硅片表面，室温下等待切片充分干燥后放入SEM观察，即得到果蝇超薄切片在等离子刻蚀前的SEM图像。
将果蝇超薄切片进行等离子刻蚀处理得到刻蚀后的SEM图像，具体可参照如图3B所示的果蝇超薄切片在等离子刻蚀后的SEM图像。将表面收集有果蝇脑超薄切片的硅片放置于等离子刻蚀机样品腔室内，用耐高温胶带将其固定在样品台上，关闭舱门。按表3设置刻蚀功率、工艺气体种类及流量、工作压力、刻蚀时间，然后启动刻蚀程序。起辉后，偏压值在482V至486V之间变化，说明等离子体的状态稳定。待刻蚀结束后，将样品腔室的真空放掉，取出硅片并置于扫描电镜中观察。
表3
以刻蚀后的果蝇脑切片SEM图像作为背底，利用自动识别算法将刻蚀前SEM图像中果蝇脑组织结构边界效果较好的细节提取出来融合在背底图像中，融合后的SEM图像见图3C。
图4A为本发明实施例二提供的果蝇脑超薄切片在等离子刻蚀前的SEM图像。
参照图4A，利用修块机对果蝇脑样品块进行粗修，将前端多余的空白树脂尽可能多的去除，然后固定在超薄切片机上，用修块刀精细修整果蝇脑组织外树脂，直至果蝇脑组织露出。然后使用清洁后的钻石刀进行超薄切片，厚度为70nm。最后将水槽内的果蝇脑超薄切片收集到玻片表面，室温下等待切片充分干燥并镀碳膜后放入SEM观察，即得到果蝇超薄切片在等离子刻蚀前的SEM图像。
将果蝇超薄切片进行等离子刻蚀处理得到刻蚀后的SEM图像，具体可参照如图4B所示的果蝇超薄切片在等离子刻蚀后的SEM图像。将表面收集有果蝇脑超薄切片的玻片放置于等离子刻蚀机样品腔室内，用耐高温胶带将其固定在样品台上，关闭舱门。按表4设置刻蚀功率、工艺气体种类及流量、工作压力、刻蚀时间，然后启动刻蚀程序。起辉后，偏压值在550V至557V之间变化，说明等离子体的状态稳定。待刻蚀结束后，将样品腔室的真空放掉，取出玻片并在其表面镀一层碳膜(约5nm厚)后置于扫描电镜中观察并拍摄果蝇脑组织显微图像。
表4
以刻蚀后的果蝇脑切片SEM图像作为背底，利用自动识别算法将刻蚀前SEM图像中果蝇脑组织结构边界效果较好的细节提取出来融合在背底图像中，融合后的SEM图像见图4C。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (5)
1.一种显著化生物组织切片膜结构的刻蚀工艺及图像合成方法，其特征在于，所述方法包括：
采集生物组织切片，将所述生物组织切片通过扫描电子显微镜SEM观察得到第一生物组织切片图像；
将所述生物组织切片进行等离子刻蚀处理得到刻蚀的生物组织切片，并将所述刻蚀的生物组织切片通过所述SEM观察得到第二生物组织切片图像；
将所述第一生物组织切片图像和所述第二生物组织切片图像进行融合得到融合的生物组织切片图像。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将所述第一生物组织切片图像和所述第二生物组织切片图像进行融合得到融合的生物组织切片图像包括：
通过目标函数将所述第一生物组织切片图像的纹理部分和所述第二生物组织切片图像的纹理部分进行配准，从而得到向量场；
根据所述向量场对所述第一生物组织切片图像以所述第二生物组织切片为基准进行校正得到配准图像；
根据所述配准图像和所述第一生物组织切片图像得到所述融合的生物组织切片图像。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述根据所述配准图像和所述第一生物组织切片图像得到所述融合的生物组织切片图像包括：
从所述配准图像和所述第一生物组织切片图像中进行提取得到提取图像；
将所述提取图像融合到所述第二生物组织切片图像中得到所述融合的生物组织切片图像。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述通过目标函数将所述第一生物组织切片图像的纹理部分和所述第二生物组织切片图像的纹理部分进行配准，从而得到向量场包括：
根据下式计算所述目标函数：
J(u,v)＝||BT(x,y)-AT(x+u,y+v)||1+γ·||ux||1+γ·||uy||1+γ·||vx||1+γ·||vy||1
其中，BT(x,y)为所述第一生物组织切片图像的纹理部分，(x,y)为图像的采样点，AT(x+u,y+v)为通过在x方向平移u，在y方向平移v的第二生物组织切片图像的纹理部分，ux为u在x方向的导数，uy为u在y方向的导数，vx为v在x方向的导数，vy为v在y方向的导数，γ为权重参量。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述根据所述配准图像和所述第一生物组织切片图像得到所述融合的生物组织切片图像包括：
根据下式计算所述融合的生物组织切片图像：
<mfenced open = "" close = "">
<mtable>
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<mtd>
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<msub>
<mi>min</mi>
<mi>R</mi>
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<mi>p</mi>
</msubsup>
<mo>)</mo>
</mrow>
</mtd>
</mtr>
</mtable>
</mfenced>
其中，为所述融合的生物组织切片图像保持所述第一生物组织切片图像的明暗信息，为所述融合的生物组织切片图像保持所述第一生物组织切片图像中x方向的边缘信息，为所述融合的生物组织切片图像保持所述第一生物组织切片图像中y方向的边缘信息；
相应地，
<mrow>
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<mrow>
<mo>(</mo>
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<mo>-</mo>
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<mo>)</mo>
</mrow>
</mrow>
</mfrac>
<mo>)</mo>
</mrow>
</mrow>
其中，‖·‖p为Lp范数，Δ-1为逆拉普拉斯算子，F-1为傅里叶变换，M，N为图像的大小，p，q为图像二维傅里叶变换的采样点。
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| Plasma etching and ashing: A technique for demonstrating internal structures of helminths using scanning electron microscopy;C.J. Veltkamp et al;《Journal of Helminthology》;20060430;第80卷;第79-82页 * |
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| 影响扫描电镜图像质量的因素分析;周广荣;《现代仪器》;20101231(第6期);第57-59页 * |
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