JP5744905B2 - 生体試料調製方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生体試料調製方法に関するものである。
従来、高出力のレーザを照射することにより生体組織の組織切片の特定の領域から断片を採取する技術が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。採取された断片は、病変部位などの特定の領域に存在する核酸やタンパク質などの生体分子の解析に使用される。このときに、組織切片を色素で染色して組織形態を顕微鏡で識別可能にすることにより、採取すべき断片の位置が正確に判断される。
Ｌｅｉｃａ ＭＩＣＲＯＳＹＳＴＥＭＳ、"レーザマイクロダイセクション Ｌｅｉｃａ ＬＭＤ７０００"、［ｏｎｌｉｎｅ］、［平成２２年１０月５日検索］、インターネット＜URL：http://www.leica-microsystems.com/jp/products/light-microscopes/life-science-research/laser-microdissection/details/product/leica-lmd7000/＞
しかしながら、組織切片の染色画像で組織形態を詳細に識別するためには、組織切片を数から１０μｍ程度まで薄くする必要がある。したがって、採取した１つの断片に含まれる生体分子は少量であり、解析に十分な量の生体分子を集めるためには、多数の組織切片を用いて何度も断片の採取を繰り返さなければならないという不都合がある。一方、組織切片を厚くすることにより１つの断片から得られる生体分子の量を増やすことができる。しかし、その場合には細胞や組織が厚さ方向に重なるため組織切片全体が略均一に染色される。したがって、採取すべき断片の位置を染色画像から正確に判断できなくなるという問題がある。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、組織切片内の所望の領域から一度の操作で十分な量の生体分子を採取することができる生体試料調製方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、生体組織を一切断面によって薄切する薄切ステップと、該薄切ステップにより薄切された２つの組織切片の内の一方を染色する染色ステップと、該染色ステップにおいて染色された組織切片の染色画像を取得する染色画像撮影ステップと、前記薄切ステップにより薄切された２つの前記組織切片の内の他方を分割線に沿って分割可能な基板上に設置して撮影することによって、前記他方の組織切片に対して、該組織切片を複数の断片に分割する前記分割線が定義付けられた無染色画像を取得する無染色画像撮影ステップと、該無染色画像撮影ステップにおいて取得された無染色画像と、前記染色画像撮影ステップにおいて取得された染色画像とを対応付ける対応付けステップとを含む生体試料調製方法を提供する。
本発明は、生体組織を一切断面によって薄切する薄切ステップと、該薄切ステップにより薄切された２つの組織切片の内の一方を染色する染色ステップと、該染色ステップにおいて染色された組織切片の染色画像を取得する染色画像撮影ステップと、前記薄切ステップにより薄切された２つの前記組織切片の内の他方を分割線に沿って分割可能な基板上に設置して撮影することによって、前記他方の組織切片に対して、該組織切片を複数の断片に分割する前記分割線が定義付けられた無染色画像を取得する無染色画像撮影ステップと、該無染色画像撮影ステップにおいて取得された無染色画像と、前記染色画像撮影ステップにおいて取得された染色画像とを対応付ける対応付けステップとを含む生体試料調製方法を提供する。
本発明によれば、薄切ステップにおいて薄切した他方の組織切片を、無染色画像撮影ステップにおいて取得された無染色画像内の分割線に沿って分割することにより、組織切片の断片を調製することができる。
この場合に、染色ステップにおいて染色し、染色画像撮影ステップにおいて撮影した染色画像内の一方の切片は、無染色画像内の他方の組織切片と同一の組織形態を有する。したがって、対応付けステップにおいて無染色画像内の各断片と対応付けられた染色画像内の一方の組織切片の部位を参照することにより、操作者は、各断片が有する組織形態を知り、組織切片の所望の領域の断片を調製または解析することができる。また、断片を採取する方の組織切片は、染色に適した薄さまで薄くする必要がない。したがって、１つの断片に生体分子が豊富に含まれるように、他方の組織切片を一方の組織切片よりも厚く薄切して、一度の操作で十分な量の生体分子を採取することができる。
上記発明においては、前記無染色画像撮影ステップが、前記分割線に沿って分割可能な基板上に前記他方の組織切片を設置して撮影することで、基板上に設置された組織切片を撮影するだけで、組織切片に対して分割線が定義付けられた無染色画像を取得することができる。
上記発明においては、前記対応付けステップが、前記無染色画像および前記染色画像から２つの前記組織切片の輪郭をそれぞれ抽出する輪郭抽出ステップと、該輪郭抽出ステップにより抽出された２つの前記輪郭を一致させるように前記無染色画像と前記染色画像とを重畳する重畳ステップとを含んでもよい。
上記発明においては、前記対応付けステップが、前記無染色画像および前記染色画像から、同一の特徴点を複数抽出する特徴点抽出ステップと、該特徴点抽出ステップにより抽出された特徴点の位置を一致させるように前記無染色画像と前記染色画像を重畳する重畳ステップとを含んでもよい。
このようにすることで、別々の画像内の組織切片を容易にかつより正確に対応付けることができる。
上記発明においては、前記対応付けステップが、前記無染色画像および前記染色画像から、同一の特徴点を複数抽出する特徴点抽出ステップと、該特徴点抽出ステップにより抽出された特徴点の位置を一致させるように前記無染色画像と前記染色画像を重畳する重畳ステップとを含んでもよい。
このようにすることで、別々の画像内の組織切片を容易にかつより正確に対応付けることができる。
上記発明においては、前記対応付けステップの後に、前記組織切片から採取すべき前記断片を指定する指定ステップと、前記組織切片を前記分割線に沿って複数の断片に分割し、前記指定ステップにおいて指定された前記断片を回収する回収ステップとを含む構成であってもよい。
このようにすることで、複数の断片の中から、例えば操作者によって指定された断片を選択的に回収することができる。
このようにすることで、複数の断片の中から、例えば操作者によって指定された断片を選択的に回収することができる。
上記の指定ステップを含む構成においては、前記指定ステップが、前記染色画像に基づいて、前記組織切片から採取すべき位置を特定する特定ステップと、前記無染色画像に基づいて、該特定ステップにより特定された採取すべき位置に対応付けられた断片を決定する決定ステップとを含んでもよい。
このようにすることで、染色画像から判断した所望の組織形態を有する断片のみを選択的に回収することができる。
このようにすることで、染色画像から判断した所望の組織形態を有する断片のみを選択的に回収することができる。
上記発明においては、前記組織切片を前記分割線に沿って複数の断片に分割し、その前記組織切片における位置情報を付して各前記断片を回収する回収ステップを含んでもよい。
このようにすることで、他方の組織切片を分割して回収した後であっても、染色ステップ、染色画像撮影ステップおよび対応付けステップを行うことにより、回収された各断片がどのような組織形態を有するかを、位置情報に基づいて染色画像を参照して知ることができる。これにより、例えば、変性しやすい生体分子を解析したい場合など、他方の組織切片の処理を一方の組織切片の処理よりも優先して迅速に進めることができる。
このようにすることで、他方の組織切片を分割して回収した後であっても、染色ステップ、染色画像撮影ステップおよび対応付けステップを行うことにより、回収された各断片がどのような組織形態を有するかを、位置情報に基づいて染色画像を参照して知ることができる。これにより、例えば、変性しやすい生体分子を解析したい場合など、他方の組織切片の処理を一方の組織切片の処理よりも優先して迅速に進めることができる。
本発明によれば、組織切片内の所望の領域から一度の操作で十分な量の生体分子を採取することができるという効果を奏する。
以下に、本発明の一実施形態に係る生体試料調製方法について図面を参照して説明する。
本実施形態に係る生体試料調製方法は、図１に示されるように、生体組織から２枚の組織切片１，２を切り出す薄切ステップＳ１と、一方の組織切片１を染色する染色ステップＳ２と、染色された一方の組織切片１を撮影する染色画像撮影ステップＳ３と、分割線３を有する基板４上に他方の組織切片２を貼り付けた状態で撮影する無染色画像撮影ステップＳ４と、取得された染色画像５および無染色画像６のそれぞれから組織切片１，２の輪郭７，８を抽出する輪郭抽出ステップ（対応付けステップ）Ｓ５と、染色画像５および無染色画像６を重畳する重畳ステップ（対応付けステップ）Ｓ６と、重畳された画像に基づいて組織切片２から採取すべき位置を指定する指定ステップＳ７と、他方の組織切片２から指定された位置を回収する回収ステップＳ８とを備えている。
本実施形態に係る生体試料調製方法は、図１に示されるように、生体組織から２枚の組織切片１，２を切り出す薄切ステップＳ１と、一方の組織切片１を染色する染色ステップＳ２と、染色された一方の組織切片１を撮影する染色画像撮影ステップＳ３と、分割線３を有する基板４上に他方の組織切片２を貼り付けた状態で撮影する無染色画像撮影ステップＳ４と、取得された染色画像５および無染色画像６のそれぞれから組織切片１，２の輪郭７，８を抽出する輪郭抽出ステップ（対応付けステップ）Ｓ５と、染色画像５および無染色画像６を重畳する重畳ステップ（対応付けステップ）Ｓ６と、重畳された画像に基づいて組織切片２から採取すべき位置を指定する指定ステップＳ７と、他方の組織切片２から指定された位置を回収する回収ステップＳ８とを備えている。
薄切ステップＳ１においては、一切断面によって切断された２枚の組織切片１，２を作成する。すなわち、２枚の組織切片１，２は、共通の組織形態の断面を有する。一方の組織切片（以下、染色用切片と言う。）１は、染色画像の観察に適した厚さである１から１０μｍ程度の厚さに薄切する。他方の組織切片（以下、解析用切片と言う。）２は、染色用切片１より厚く、例えば、５０から１００μｍ程度の厚さに薄切する。
染色ステップＳ２においては、染色用切片１を染色する。染色とは、色素による染色の他に、酵素と反応させて生体分子を発光させる処理など、生体分子を各種の顕微鏡で可視化するための処理を示し、解析すべき生体分子に応じて適宜決めることができる。
染色画像撮影ステップＳ３においては、染色ステップＳ２において染色された染色用切片１を顕微鏡で拡大して撮影することにより染色画像５を取得する。基板４は、染色用切片１を貼り付け可能な平面を有するものであればよい。基板４は、好ましくは、顕微鏡で透過光像を観察できるようにガラスなどの可視光に透明な材料からなるものが用いられる。基板４は、樹脂や金属などの可視光に対して半透明または不透明な材料からなるものが用いられてもよい。
無染色画像撮影ステップＳ４においては、例えば、明視野顕微鏡によって解析用切片２を拡大して撮影する。取得された無染色画像６内には、図２Ａに示されるように、解析用切片２とともに基板４に形成された分割線３も表示される。これにより、解析用切片２に対して分割線３の位置が定義付けられた無染色画像６を容易に取得することができる。
分割線３は、その位置において操作者が基板４を分割することができるように構成されたものであり、例えば、基板４に形成された溝である。溝は、レーザ加工や化学エッチング、ダイシング、または、ガラス切りなどを用いた操作者の手作業により形成することができる。これにより、操作者が基板４を表面方向に引っ張ることにより、図２Ｂに示されるように、分割線３の位置において基板４を複数の小片４ａに分割することができる。このときに、基板４上に貼り付けられた解析用切片２も、基板４とともに分割線３に沿って複数の断片２ａに分割することができる。分割線３の間隔は、解析用切片２から採取すべき断片２ａの大きさによって適宜変更可能である。分割線３の間隔は、解析用切片２内から十分に細かい位置精度で所望の領域の断片２ａを採取しつつ、採取した断片２ａに十分な量の生体分子が含まれているように、０．０５から５．０ｍｍが好ましい。
基板４を引っ張る方法に特に限定はないが、例えば、表面に沿う方向に伸展可能な粘着シート上に基板４を接着し、粘着シートを表面に沿う方向に引っ張ることにより基板４を容易に分割することができる。
分割線３は、例えば、予め分割されて粘着シート上に整列された複数の小片４ａ同士の隙間によって構成されていてもよい。このようにすることで、操作者が基板４を表面方向に引っ張ったときにより確実に基板４を分割することができる。
分割線３は、例えば、予め分割されて粘着シート上に整列された複数の小片４ａ同士の隙間によって構成されていてもよい。このようにすることで、操作者が基板４を表面方向に引っ張ったときにより確実に基板４を分割することができる。
輪郭抽出ステップＳ５においては、図３に示されるように、染色画像５から染色用切片１の輪郭７を抽出し、図４に示されるように、無染色画像６から解析用切片２の輪郭８および分割線３を抽出する。輪郭７，８および分割線３を抽出する方法としては、例えば、隣り合った画素間の明度の差分または微分を利用する方法など、周知の方法を用いることができる。輪郭７，８がより鮮明に抽出されるように適宜画像処理を施してもよい。画像処理としては、例えば、ガンマカーブ補正、明暗調整、コントラスト強調、輝度の２値化、明度の反転、メジアンフィルタ等によるノイズ除去などが挙げられる。
重畳ステップＳ６においては、図５に示されるように、抽出した２つの輪郭７，８の位置を一致させるように染色画像５および無染色画像６を重畳して表示する。２つ輪郭７，８を一致させるためには、例えば、輪郭７，８の相互相関値がもっとも大きくなる相対位置において２つの画像５，６を重畳すればよい。これにより、染色用切片１と解析用切片２との各位置が対応づけられるとともに、重畳して表示された画像内において、解析用切片２に対して定義されたのと同様の位置関係で染色用切片１に対しても分割線３が定義される。
ここで、染色画像５および無染色画像６内の各切片１，２は、向きや表裏が異なったり異なる顕微鏡やカメラで撮影されたことにより倍率が異なったりすることがある。したがって、抽出した輪郭７，８がより正確に一致するように、一方の画像を回転、反転または縮小拡大させるなど、適宜画像５，６を操作してもよい。
指定ステップＳ７においては、操作者が、重畳して表示された画像のうち染色画像５の組織形態を観察することにより採取すべき領域を決定し、決定した領域と一致する位置に配された断片２ａを指定する。例えば、分割線３によって区画された断片２ａに行番号Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄと列番号１，２，３，…とを付し、行番号および列番号の組み合わせを用いて採取すべき断片２ａの位置を指定する。
回収ステップＳ８においては、基板４および解析用切片２を分割線３に沿って分割し、指定ステップＳ７において操作者により指定された位置の断片２ａを選択して回収する。これにより、染色画像５に基づいて決定した領域と同様の組織形態を有する断片２ａを、基板４の小片４ａに貼り付けられた状態で解析用切片２から採取することができる。回収した断片２ａからは、生体分子として、例えば、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質などを解析することができる。
この場合に、本実施形態によれば、薄い染色用切片１に比べて厚い解析用切片２から採取された断片２ａには十分な量の生体分子が含まれている。したがって、解析に十分な量の生体分子を収集するために従来多数の染色用切片を用いて断片の採取を何度も繰り返す必要があった作業を、１回または数回の作業で済ますことができるという利点がある。
また、このように厚い解析用切片２の場合、厚さ方向に細胞や組織が重なっているため、染色したときに全体が略均一に染まってしまい、組織形態を顕微鏡で識別することが困難である。そこで、解析用切片２と同一の組織形態を有する薄い染色用切片１を作成し、染色用切片１の染色画像５と解析用切片２の無染色画像６とを対応付けることにより、染色用切片１を参照して解析用切片２の各位置における詳細な組織形態を知ることが可能となる。これにより、解析用切片２からであっても所望の部位の断片２ａを採取することができるという利点がある。
また、染色用切片１と解析用切片２との位置を対応付ける方法として、それぞれの組織切片１，２の対応する位置にマーカを付す方法が考えられる。この方法の場合、マーカを付す位置を決めるために２つの組織切片１，２を詳細に比較し、高い位置精度でマーカを付す必要がある。したがって、作業が煩雑である上に工程数が増えるという不都合があった。これに対して、本実施形態によれば、２つの組織切片１，２を撮影してそれらの画像を重畳して表示するだけでよいので、簡便な作業で２つの組織切片１，２の対応付けを行うことができるという利点がある。
なお、本実施形態においては、解析用切片２の断片２ａの位置と染色用切片１の位置とを対応付けた後に、解析用切片２を分割して所望の断片２ａを選択的に回収することとしたが、これに代えて、図６に示されるように、解析用切片２を分割して全ての断片２ａを回収した後に、染色画像５を撮影して各断片２ａの位置と染色用切片１の位置とを対応付けてもよい。
この場合に、各断片２ａを、解析用切片２内におけるその位置情報を付して回収する。例えば、図７に示されるように、断片２ａをマルチウェルプレート９に回収するときには、各断片２ａの位置情報である行番号および列番号と、回収する先のマルチプレート９のウェルの位置とを対応付けてリスト１０に記録しておく。これにより、どの位置のウェルにどの位置の断片２ａが収容されているかを回収した後でも知ることができる。
このようにすることで、解析用切片２を用いた処理を優先して進めて各断片２ａに含まれる生体分子の解析を行った後に、各解析結果がどのような組織形態の断片２ａから得られたものであるのかを、各断片２ａの位置情報からその各断片２ａと対応する染色用切片１の部位を探して参照することにより知ることができる。これにより、解析用切片２を作成してから生体分子が解析されるまでの時間が短縮されるので、例えば、ｍＲＮＡのように分解されやすい生体分子であっても新鮮なうちに迅速に解析を行って正確な解析結果を得ることができる。
また、本実施形態においては、染色画像５と無染色画像６を重畳させるために各画像５，６から組織切片１，２の輪郭７，８を抽出することとしたが、これに代えて、各画像５，６から同一の特徴点を複数抽出し、抽出した特徴点の位置が一致するようにこれらの画像５，６を重畳してもよい。このようにしても、２つの組織切片１，２がぴったり重なるように画像５，６を重畳させることができる。
特徴点としては、例えば、組織切片１，２の鋭くとがった箇所や、管腔構造などを用いることができる。特徴点の抽出は、例えば、ユーザが各画像５，６内に入力することにより行われる。このときに指定する特徴点の数は２つ以上であればよいが、重畳するときの位置精度を向上するために３つ以上であることが好ましい。
また、４つ以上の特徴点を抽出し、４つ以上の中から３つの特徴点を採用し、採用した３つの特徴点が一致するときの２つの画像５，６の相互相関値を算出し、最も相互相関値が高かったときの特徴点の組み合わせを最終的に採用することとしてもよい。このようにすることで、例えば、ユーザが指定した特徴点のうち、位置が２つの画像５，６間でずれている特徴点が存在しても、２つの組織切片１，２がより正確に一致するように２つの画像５，６を重畳することができる。
また、本実施形態においては、分割線３が形成された基板４に解析用切片２を貼り付けることにより、解析用切片２に対して該解析用切片２が分割される分割線３を定義づけることとしたが、これに代えて、解析用切片２を撮影した後に撮影された無染色画像６内で分割線を定義し、この定義された分割線に従って解析用切片２を分割することとしてもよい。分割線は、操作者が無染色画像６に入力することにより定義されてもよく、画像処理によって定義されてもよい。
また、本実施形態においては、染色画像５と無染色画像６とを重畳した状態で採取すべき断片２ａを指定することとしたが、これに代えて、染色画像５と無染色画像６とを並べて別々に表示し、２つの画像５，６を比較することにより採取すべき断片２ａを指定してもよい。この場合、まず、染色画像５を観察して採取すべき位置を特定し（特定ステップ）、２つの画像５，６内の組織切片１，２を見比べて、特定した位置と対応する位置の断片２ａを決定する（決定ステップ）。このようにしても、解析用切片２から、所望の組織形態を有する領域の断片２ａを指定して採取することができる。
また、本実施形態においては、解析用切片２の分割前に無染色画像６を撮影することとしたが、これに代えて、分割後に各断片２ａの無染色画像６を撮影し、画像処理によって分割線３の位置において各断片２ａをつなぎ合わせることにより、分割前の状態の解析用切片２を再現してもよい。このようにしても、上述した実施形態と同様にして、解析用切片２と染色用切片１との位置の対応付けを行うことができる。
１ 染色用切片
２ 解析用切片
２ａ 断片
３ 分割線
４ 基板
４ａ 小片
５ 染色画像
６ 無染色画像
７，８ 輪郭
９ マルチウェルプレート
１０ リスト
Ｓ１ 薄切ステップ
Ｓ２ 染色ステップ
Ｓ３ 染色画像撮影ステップ
Ｓ４ 無染色画像撮影ステップ
Ｓ５ 輪郭抽出ステップ（対応付けステップ）
Ｓ６ 重畳ステップ（対応付けステップ）
Ｓ７ 指定ステップ
Ｓ８ 回収ステップ
２ 解析用切片
２ａ 断片
３ 分割線
４ 基板
４ａ 小片
５ 染色画像
６ 無染色画像
７，８ 輪郭
９ マルチウェルプレート
１０ リスト
Ｓ１ 薄切ステップ
Ｓ２ 染色ステップ
Ｓ３ 染色画像撮影ステップ
Ｓ４ 無染色画像撮影ステップ
Ｓ５ 輪郭抽出ステップ（対応付けステップ）
Ｓ６ 重畳ステップ（対応付けステップ）
Ｓ７ 指定ステップ
Ｓ８ 回収ステップ
Claims (6)
- 生体組織を一切断面によって薄切する薄切ステップと、
該薄切ステップにより薄切された２つの組織切片の内の一方を染色する染色ステップと、
該染色ステップにおいて染色された組織切片の染色画像を取得する染色画像撮影ステップと、
前記薄切ステップにより薄切された２つの前記組織切片の内の他方を分割線に沿って分割可能な基板上に設置して撮影することによって、前記他方の組織切片に対して、該組織切片を複数の断片に分割する前記分割線が定義付けられた無染色画像を取得する無染色画像撮影ステップと、
該無染色画像撮影ステップにおいて取得された無染色画像と、前記染色画像撮影ステップにおいて取得された染色画像とを対応付ける対応付けステップとを含む生体試料調製方法。 - 前記対応付けステップが、前記無染色画像および前記染色画像から２つの前記組織切片の輪郭をそれぞれ抽出する輪郭抽出ステップと、該輪郭抽出ステップにより抽出された２つの前記輪郭を一致させるように前記無染色画像と前記染色画像とを重畳する重畳ステップとを含む請求項１に記載の生体試料調製方法。
- 前記対応付けステップが、前記無染色画像および前記染色画像から、同一の特徴点を複数抽出する特徴点抽出ステップと、該特徴点抽出ステップにより抽出された特徴点の位置を一致させるように前記無染色画像と前記染色画像を重畳する重畳ステップとを含む請求項１に記載の生体試料調製方法。
- 前記対応付けステップの後に、前記組織切片から採取すべき前記断片を指定する指定ステップと、
前記組織切片を前記分割線に沿って複数の断片に分割し、前記指定ステップにおいて指定された前記断片を回収する回収ステップとを含む請求項１から請求項３のいずれかに記載の生体試料調製方法。 - 前記指定ステップが、前記染色画像に基づいて、前記組織切片から採取すべき位置を特定する特定ステップと、前記無染色画像に基づいて、該特定ステップにより特定された採取すべき位置に対応付けられた断片を決定する決定ステップとを含む請求項４に記載の生体試料調製方法。
- 前記組織切片を前記分割線に沿って複数の断片に分割し、その前記組織切片における位置情報を付して各前記断片を回収する回収ステップを含む請求項１から請求項３のいずれかに記載の生体試料調製方法。
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