CN104941000A - 一种三维打印制备牙槽骨支架的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三维打印制备牙槽骨支架的方法，经将陶瓷骨粉复合PVA胶体，应用三维打印的方法，构建出生物相容性和力学性能良好的仿人类牙槽骨三维立体支架模型—PVA/牙槽骨支架，本发明方法制备多得组织工程骨力学压缩性能较好，免疫原性较低，成骨功能良好，有望作为良好的支架材料，适用于构建组织工程骨，也可用于修复形态复杂的骨缺损，如外伤或肿瘤引起的牙槽骨及颌骨缺损。

Description

一种三维打印制备牙槽骨支架的方法

技术领域

本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种三维打印制备牙槽骨支架的方法。

背景技术

3D打印作为一项创新技术，以三维模型数据为基础，运用粉末状金属或塑料等可粘合材料，通过逐层打印的方式来构造物体。3D打印与传统制造方式相比具有明显的成本优势：无需设计模具，不必引进生产流水线。同时，3D打印制作模型的速度快，单个实物的制作费用低，已在工业快速成型、设计模型制造和医疗义肢制作等领域获得应用。近几年，3D打印技术快速发展引起了广泛关注，引起较大影响，是制造业发展的一个新趋势。随着桌面3D打印机及打印材料价格的不断下降，3D打印技术正在向实用化方向迈进。3D打印可以为医学模型制造提供有别于传统制造方式的新思路，可提高模型的制造效率，提供可定制化和个性化的医学模型。

用人工材料制造人工骨，填补骨缺陷位置，是一种十分理想的修复方式。人工骨是用人工材料制造的人骨替代品。理想的人工骨要具有良好的骨传导、骨诱导及骨生成作用。随着对人工骨研究的深入，人工骨的功能不仅仅停留在对骨缺损的替换，而更多的是仿制人体骨骼复杂的非均质多孔结构，进而增大人工骨的生物活性的表面积，从而增强成骨细胞的粘附作用，保证与人体骨骼的可靠长合。为提升人工骨与成骨细胞的接触面积，现有的人工骨大多采用多孔的支架结构。本申请利用羊椎骨煅烧陶瓷骨粉理化成粉、结构和生物相容性的基础上，将陶瓷骨粉复合PVA胶体，应用三维打印的方法，构建出生物相容性和力学性能良好的仿人类牙槽骨三维立体支架模型—PVA/陶瓷骨粉/羊牙槽骨支架，为三维打印在医学领域的运用迈出了重要的一步，具有实际意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种三维打印制备牙槽骨支架的方法，本发明方法制备多得组织工程骨力学压缩性能较好，免疫原性较低，成骨功能良好，有望作为良好的支架材料，适用于构建组织工程骨，也可用于修复形态复杂的骨缺损。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种三维打印制备牙槽骨支架的方法，包括以下步骤：

1)骨骼外部轮廓数据的获取

采用CT扫描骨组织，固定参照点，确定稳定坐标，电压120Kv，电流120mA，扫描层厚为0.625mm，将获得图像保存为标准DICOM类型，刻盘保存，将数据转入计算机工作站；

2)读取DICOM格式文件提取目标组织

利用MIMICS软件读取所得的DICOM格式数据，结合CT的灰度原理，通过阈值调整，调节影像对比度，使目标组织清晰可辨，区域增长分离，去除多余噪点及三角面片，优化下颌骨轮廓，通过阈值调整，三维重建下颌骨模型，保存为STL文件；将该模型文件导入GEOMAGIC软件，进行三角面片优化，局部调整，将颌骨内部髓质神经等去除，获得完整的颌骨外部轮廓；选取右侧正常无牙区段，切除其余部分，得到一段合适大小的目标骨组织轮廓。利用偏移功能，选择1mm厚度皮质骨。充填缝合内外层之间的空洞，以STL文件保存。局部修改错误三角面片，从而得到符合条件的下颌骨三维模型待用；

3)颌骨微观支架材料空间模型的构建

利用CATIA的CAD模块，生成组织工程骨所要求的具有引导细胞、提供附着、满足支撑等功能的空间微观支架CAD模型，在CATIAV5R17软件中，进入机械设计零部件设计，在三维空间中设计支架材料所需的单体结构，进入阵列模块，阵列该单体，使之在空间坐标中拓展，至此得到颌骨支架材料微观结构；

4)装配外层皮质骨与内部支架材料

在GEOMAGIC中选取正确的表面生成实体，利用布尔运算功能获得皮质骨与内部支架材料的装配模型，将模型导入Magics12.01经过Stitching以及Overlaps功能优化后，检查有无空洞，有无缺陷，优化后保存STL文件；

5)固高GXYZ303010-XYLE三维打印系统打印支架

将构件的模型及支架系统的STL文件导入PROJETTM3500三维打印系统，在超净台内将羊椎骨煅烧陶瓷骨粉与PVA胶按照打印所需最佳配比方案2：1体积比混合，经行调拌，肉眼观呈面团期前期时将其置入三维打印系统，行打印厚度设定，得到生物可吸收材料的组织工程骨支架，气压设定为110-130PSI，选用0.2mm的喷头，设定打印喷头工作速度为2mm/s，按照预先建立的STL格式文件经行打印，完成三维打印组织工程骨支架的成型，待打印完成后将其置入40℃的烘干箱内过夜完全干燥，最后置于150℃马弗炉中低温加热完成交联反应。

本发明所述的羊椎骨煅烧陶瓷骨粉通过以下方法制备：选用健康成年羊脊椎骨，去除表面骨皮质后切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方体，采用体积分数30％H₂O₂浸泡12h脱蛋白，1:1甲醇/氯仿浸泡12h脱脂，处理重复3次，超声震荡仪清洗，干燥后，浸泡在0.09mol/L焦磷酸钠溶液中，70℃恒温水浴锅温浴12h，取出骨块干燥，经高温微波煅烧炉，在800℃维持3h，碾磨制备成骨粉，60℃消毒、封装、备用。

所述的PVA胶通过以下方法制备：选用超纯水将PVA浓度定为15％wt，水浴99℃4h，待其完全溶解呈透明胶状其中未见絮状物为准，高温高压消毒待用。

本发明的有益效果为：本发明通过改良物理煅烧法，制得羊椎骨煅烧陶瓷骨粉，其具有一定孔隙支架结构，主要化学成份是为羟基磷灰石和一定量的β-磷酸三钙，免疫原性低，生物相容性良好，其有望单独作为支架材料，用于修复较小范围的牙槽骨及颌骨缺损；以固高GXYZ303010-XYLE三维打印系统，羊椎骨煅烧陶瓷骨粉、PVA生物高分子聚合物凝胶为原料，三维打印构建的PVA/牙槽骨支架，其力学压缩性能较好，免疫原性较低，成骨功能良好，有望作为良好的支架材料，适用于构建组织工程骨，也可用于修复形态复杂的骨缺损，如外伤或肿瘤引起的牙槽骨及颌骨缺损。

附图说明

图1是本发明实施例对照组羊椎骨支架骨块；

图2是本发明羊椎骨煅烧陶瓷骨粉物理联合化学组的表面微观结构；

图3是本发明羊椎骨煅烧陶瓷骨粉化学处理组的表面微观结构；

图4是本发明羊椎骨煅烧陶瓷骨粉对照组表面微观结构；

图5是本发明物理联合化学组-X射线衍射分析谱图；a是羟基磷灰石特征峰；b是β-磷酸三钙特征峰；

图6是本发明化学处理组-X射线衍射分析谱图；a是衍射角2-Theta值；b是羟基磷灰石特征峰；

图7是a是衍射角2-Theta值；b是羟基磷灰石特征峰；

图8是不同浸提液与骨髓间充质干细胞增殖曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1 羊椎骨煅烧陶瓷骨粉的制备及生物相容性检测

1)羊椎骨煅烧陶瓷骨粉的制备

选用健康成年羊脊椎骨，去除表面骨皮质后切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方体。随机分为3组，物理联合化学组，采用体积分数30％H₂O₂浸泡12h脱蛋白；1∶1甲醇/氯仿浸泡12h脱脂，处理重复3次，超声震荡仪清洗；干燥后，浸泡在0.09mol/L焦磷酸钠[Na₄P₂O₇·10H₂O]溶液中，70℃恒温水浴锅温浴12h，取出骨块干燥。经PYRO高温微波煅烧炉程序，当炉内煅烧温度达到800℃时，维持3h。待煅烧完成后，采用碾磨的方法制备成骨粉，60℃消毒、封装、备用。化学处理组，采用甲醇/氯仿、过氧化氢等化学制剂序列脱脂脱细胞脱蛋白同物理煅烧组的化学处理方法，不加煅烧步骤)；对照组，采集的羊椎骨骨松质块，直接置于室温自然晾干，见图1。

2)羊椎骨煅烧陶瓷理化成分及结构观测

a.孔隙率测定方法一(液体置换法)

取各组10块样品用游标卡尺再次精确测量其底面直径和高度，计算体积(V)，将其放入有一定刻度并盛有相同体积甘油的玻璃容器内，得到甘油前后变化的体积V1。采用孔隙率公式＝(1-V1/V)×100％，其中V为骨块所占空间体积，V1为骨块所占空间体积减去孔隙所占的体积，数据输入Microsoft Excel软件储存并计算，取平均值。

b.孔隙率测定方法二(软件分析法)

将骨块样品的扫描电镜照片用Adobe Photoshop CS2软件中直方图(histogram)计算功能，分别统计样品表面孔隙所占象素数a和样品表面所占总象素数A，采用孔隙率公式＝a/A×100％，选取不同视野及多次统计，将数据输入Microsoft Excel软件储存并计算，取平均值。实验中随机挑选各组样品分别采用两种方法测定其孔隙率。

如表1所示，同一分组条件下，采用配对t检验比较两种测定孔隙率方法：①物理联合化学组：根据结果得出液体置换法与软件分析法测定孔隙率的差异无显著性意义(P＝0.16)。②化学处理组、对照组：根据结果得出液体置换法与软件分析法测定孔隙率的差异有显著性意义(P<0.01)。物理联合化学组，具备较多的的孔隙率，适宜作为组织工程化牙槽骨支架原料。

表1 两种方法检测经不同方法处理羊椎体骨松质的平均孔隙率(％)

注：*表示该方法测定条件4组样品数据经SPSS17.0软件Levene检验方差齐性，P>0.05，可认为在同一检测法下总体方差齐性。

c.扫描电镜

实验结果显示，物理联合化学组，材料表面呈天然松质骨的蜂窝状多孔结构，孔径与天然松质骨相似，大孔孔径范围为41.23-780.06μm不等，孔隙内未见杂质影像，各个孔隙之间存在广泛的交通，大孔壁上可见大量微孔存在，孔壁表面粗糙，表面形貌为小梁状和山嵴状，并可见β-磷酸三钙斑片状结构散布，见图2。

化学处理组表面与物理联合化学组相近，大孔孔径为50-600μm，孔隙之间存在广泛的交通，但孔壁上可见少量未去净残留细胞、脂类等杂质成分，见图3；对照组材料表面多数孔隙内可见大量未去除干净的细胞、脂类等杂质影像，各个孔隙之间交通性差，孔壁表面粗糙并可见细胞等杂质黏附，见图4。

d.X射线衍射分析

实验结果显示，物理联合化学组，样品衍射角2-Theta值特征峰尖锐清晰，与标准数据库特征峰值对比中得到主要矿物晶相为羟基磷灰石和一定量的β-磷酸三钙，分子式Ca₅(PO₄)₃OH和Ca₃(PO₄)₂，根据特征峰值偏移程度可见羟基磷灰石较β-磷酸三钙含量多(见图5)。

化学处理组，样品衍射角2-Theta值特征衍射峰值清晰程度较物理煅烧组差，可见许多杂质衍射峰出现，其主要衍射特征峰与标准数据库特征衍射峰值对比中，得知其主要成分为羟基磷灰石，分子式Ca₅(PO₄)₃OH，无β-磷酸三钙特征衍射峰(见图6)。对照组，样品衍射角羟基磷灰石特征衍射峰可见外，其他峰值均不清晰，有大量杂质衍射峰存在，提示该组样品中含有羟基磷灰石，分子式Ca₅(PO₄)₃OH，但无β-磷酸三钙特征衍射峰且杂质较多(见图7)。

3)羊椎骨煅烧陶瓷生物相容性检测

材料浸提液的制备：

将羊松质骨按异种骨材料制备方法不同分为3组：物理联合化学组：先经过体积分数30％H₂O₂浸泡12h脱蛋白处理，1∶1甲醇/氯仿浸泡12h脱脂，以上处理重复3次，去离子水冲洗，再进行超声清洗脱细胞1h；之后浸入0.09mol/L焦磷酸钠溶液中，65℃水浴浸泡12h，干燥后再将异种骨材料放入电炉中煅烧，缓慢升温至1000℃，维持2h，缓慢降温冷却后制得异种骨支架材料；消毒后备用。然后用0.22μm的滤器过滤除菌，密封于无菌瓶，置于4℃冰箱中备用。物理组材料：去离子水冲洗，超声清洗脱细胞1h，之后浸入0.09mol/L焦磷酸钠溶液中，65℃水浴浸泡12h，干燥后再将异种骨材料放入电炉中煅烧，缓慢升温至1000℃，维持2h，缓慢降温冷却后制得异种骨支架材料；化学组材料：先经体积分数30％H₂O₂浸泡12h脱蛋白，1∶1甲醇/氯仿浸泡12h脱脂，以上处理重复3次，去离子水冲洗，再进行超声清洗脱细胞1h，晾干后制得异种骨支架材料。

将上述制备的3组羊松质骨材料，分别与含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，按100g/L的比例，置于封闭容器内，37℃浸泡72h，取出材料，将浸提液离心，取上清液，制备出上述3组浸提液。然后用0.22μm的滤器过滤除菌，密封于无菌瓶，置于4℃冰箱中备用。

a.急性毒性实验

取新西兰白兔24只，随机分4组，每组6只，记录每只动物的初始体质量。称质量后，其中3组分别耳缘静脉注射制备的物理组、化学组、物理化学联合组3组材料浸提液(10mL/kg)，对照组用同批号等量生理盐水行兔耳缘静脉注射(10mL/kg)。于注射后第24，48，72小时和第7天观察所有动物的生存状态、毒性表现和死亡情况，并记录体质量变化。7d后4组各取3只动物的肝、脾、肾标本作苏木精-伊红染色。

如表2所示，不同观察时间内，3实验组和对照组动物体质量均呈上升趋势，经完全随机设计方差分析检验，4组间动物体质量日平均增加差异无显著性意义(P>0.05)。7d后处死动物，肝、脾、肾大体观察和组织切片苏木精-伊红染色未见异常。按急性毒性剂量分级，物理联合化学组和物理组材料无毒性；化学组材料有轻度毒性。

表2 不同时间点动物体重变化

b.热源实验

取新西兰白兔9只，分为3组，每组3只。在实验前7d开始预测体温，测肛温前禁食、水2h，兔固定后将温度计插入兔肛门内，深度5.0～6.0cm，5min后读数，1次/h，共4次。体温在38.7～39.5℃之间，最高和最低的差距不超过0.4℃者符合实验要求，予以编号备用。7d后于相同室温和湿度下正式实验。将兔固定后，间隔1h测1次肛温，共2次，以2次温度的平均值为正常体温。测定正常体温15min后，3组自耳缘静脉缓慢推注已预热至37℃的3种材料浸提液，剂量为10mL/kg，注射后1，2，3h测动物肛温，以3次中最高的1次减去正常体温，即为升高的度数。每组3只动物体温升高均在0.6℃以下，且3只动物肛温升高度数在1.4℃以下，则材料合格，表明材料无致热作用。

如表3所示，物理和物理联合化学组注射材料浸提液后3个时间点每组3只动物体温升高均<0.6℃，升高的总数分别为0.55℃和0.58℃，符合<1.4℃的国家标准。说明这两组材料本身不具有致热源作用。化学组注射后3个时间点3只动物体温升高均>0.6℃，升高的总数为2.58℃>1.4℃，不符合医用材料的热源反应要求。经完全随机设计方差分析检验，物理组、物理联合化学与化学组间实验前后动物体温变化差值差异显著(P<0.05)。

表3 热源实验前后动物体温变化

c.皮内刺激实验

取新西兰白兔6只，实验前24h剪剃动物脊柱两侧各5cm×20cm区域兔毛，椎旁1.5cm选注射点，间距2cm，每只动物脊柱左侧头侧3个点注射生理盐水各0.2mL作为阴性对照，尾侧3个点注射体积分数20％乙醇生理盐水各0.2mL作为阳性对照；右侧头侧3个点注射物理组浸提液各0.2mL，中间3个点注射化学组浸提液各0.2mL，尾侧3个点注射物理联合化学组浸提液各0.2mL，注射后即刻，6，24，48，72h观察注射局部及周围皮肤组织反应，按皮肤反应评分系统对每个注射部位的红斑和水肿组织反应进行评分，计算动物对材料的局部原发刺激指数(primarily stimulationindex，PII)和平均原发刺激指数(averageprimarily stimulation index，APII)。

实验结果，注射物理、物理联合化学组材料浸提液和生理盐水处无明显红斑、水肿和坏死。按皮肤反应评分系统APII为0，属于极轻微刺激。化学组注射48，72h时出现极轻微红斑，APII为0.5，属于轻度刺激。阳性对照组注射处于术后6，24h时出现明显红斑，中心部位水肿明显，48h后红斑加深，72h中心部位坏死，APII为5.28，属于强刺激。

d.细胞毒性实验

采用MTT法检测材料浸提液对羊骨髓间充质干细胞的毒性。取3块96孔培养板，分别为物理联合化学组、物理组、化学组、对照组，共192孔。每孔加入100μL细胞悬液，置入37℃、体积分数5％CO₂培养箱培养24h。倒置相差显微镜观察细胞贴壁后，弃培养板内原培养液。物理组、化学组、物理联合化学组均加入200μL相应的材料浸提液，对照组加入200μL DMEM/F12培养液，每2d换液1次，培养12d。每天每组取4孔测定，每孔加入20μL50g/L的MTT液，继续培养4h，弃去孔中培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，振荡10min，在酶标仪上测定波长490nm吸光度A值，并按照以下公式计算相对增殖率(relative growth rate，RGR)＝(实验组吸光度均值/对照组吸光度均值)×100％。细胞毒性标准分6级评定材料的毒性程度[8-10]：RGR≥100％为0级，75％～99％为1级，50％～74％为2级，25％～49％为3级，1％～24％为4级，0为5级。

实验结果表明，材料浸提液培养羊骨髓间充质干细胞12d后，物理、物理联合化学和对照组3组间A值差异无显著性意义(P>0.05)；前3组与化学组间A值差异有显著性意义(P<0.05)。物理和物理联合化学组细胞相对增殖率均大于90％。这两组材料浸提液对羊骨髓间充质干细胞的细胞毒性为0～1级，表明物理和物理联合化学组材料无细胞毒性。化学组在48h内无细胞毒性，72h后细胞相对增殖率在59％～68％，化学组材料浸提液对羊骨髓间充质干细胞的细胞毒性为2级，表明化学组材料存在细胞毒性，见图8。

实施例2 粘结剂-PVA胶制备及测定

1)配制PVA胶

制备医用高分子生物凝胶聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)，参照ACT Bio Mat[J]，选用超纯水将PVA浓度定为15％wt，水浴99°C4h，待其完全溶解呈透明胶状其中未见絮状物为准，高温高压消毒待用。

2)生物相容性观测

选取SPF级健康4周龄裸鼠10只，体重20～25g，雌雄不限。所有手术操作均在SPF级实验动物房的超净工作台内进行，阿托品+氯胺酮+安定各一支混合稀释至10ml(0.1ml/10g)腹腔注射进行全身麻醉。裸鼠背部以体长、身宽平分为4象限，等距离参照四肢部位切开皮肤1.0cm，向腹部充分游离周围的皮下组织约1cm制备4个皮下囊袋，上肢左右盲袋植入对照组羊椎骨支架(煅烧后)，下肢盲袋左侧植入PVA/羊椎骨煅烧骨组、右侧植入海藻酸钠/羊椎骨煅烧骨组，植入后严密缝合创口。分笼饲养并给予口服抗生素3天。术后4周、8周各处死5只实验动物，将材料与周围组织一并取出，标本大体观察后，以10％甲醛固定，24h后石蜡包埋，切成0.5μm的石蜡切片，行伊红-苏木素(HE染色)后将切片固定封装。

术后4周切片表现：两实验组和对照组材料皮下可见大量纤维结缔组织及表皮毛细血管，实验材料周围发现有结缔组织增生并有大量的巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、成纤维细胞和单核细胞浸润。对照组支架材料边缘呈毛刺状，PVA/羊椎骨煅烧骨组边缘发现有结缔组织增生，其间有大量的巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、成纤维细胞和单核细胞浸润，毛细血管扩张、充血，有疏松的纤维囊壁形成。术后8周切片表现：对照组支架边缘可见毛刺状表现，少量炎细胞浸润；PVA/羊椎骨煅烧骨组表皮下炎细胞明显增多，毛细血管扩张比术后四周未见明显改善，支架材料周围结缔组织结构异常，未见破骨细胞粘附；

本实验结果发现，PVA凝胶组短期无吸收，力学强度较好，但PVA凝胶组出现一例实验样本表皮有溃烂，其余样本未见明显异常，分析其原因可能为术后感染，或PVA存在潜在致炎反应。

实施例3 三维打印数据建模与实体打印

样本与来源：选取离体大尾绵羊颌骨一只，由新疆医科大学第一附属医院实验动物科学部提供，两岁龄，母，无牙列缺失，口内牙齿未见明显龋坏，待用。

实验材料设备：CT扫描机(LIGHTSPEED 64螺旋CT，美国通用公司)。ROJETTM3500、固高GXYZ303010-XYLE三维打印系统。软件：Mimics 10.01(Materialise’s Interactive Medical Image ControlSystem)，Geomagic studio 12，CATIA V5R17，Magics 12.01。

实验用材料：PROJETTM3500成型光固化树脂，支撑石蜡，羊椎骨煅烧陶瓷骨粉，海藻酸钠粉末，去离子水等。

1)骨骼外部轮廓数据的获取

将选取的离体羊下颌骨置于CT扫描平台上，模拟躺卧位。固定参照点，确定稳定坐标。CT扫描从该下颌骨双侧颏突顶部开始至下颌骨下缘连续扫描，电压120Kv，电流120mA，扫描层厚为0.625mm，确定扫描比例，且各扫描层均按此比例扫描。扫描完毕后将获得图像保存为标准DICOM类型，刻盘保存，将数据转入计算机工作站。

2)读取DICOM格式文件提取目标组织

利用MIMICS软件读取所得的DICOM格式数据，结合CT的灰度原理，通过阈值调整，调节影像对比度，使目标组织清晰可辨，区域增长分离，去除多余噪点及三角面片，优化下颌骨轮廓，通过阈值调整，三维重建下颌骨模型，保存为STL文件。将该模型文件导入GEOMAGIC软件，进行三角面片优化，局部调整，将颌骨内部髓质神经等去除，获得完整的颌骨外部轮廓。选取右侧正常无牙区段，切除其余部分，得到一段合适大小的目标骨组织轮廓。利用偏移功能，选择1mm厚度皮质骨。充填缝合内外层之间的空洞，以STL文件保存。局部修改错误三角面片，从而得到符合条件的下颌骨三维模型待用。

3)颌骨微观支架材料空间模型的构建

利用CATIA的CAD模块，生成组织工程骨所要求的具有引导细胞、提供附着、满足支撑等功能的空间微观支架CAD模型，设定200-500微米合适孔径为初始单位及精度。在CATIA V5R17软件中。进入机械设计零部件设计，在三维空间中设计支架材料所需的单体结构。进入阵列模块，阵列该单体，使之在空间坐标中拓展，至此得到颌骨支架材料微观结构。

4)装配外层皮质骨与内部支架材料

在GEOMAGIC中选取正确的表面生成实体，利用布尔运算功能获得皮质骨与内部支架材料的装配模型，将模型导入Magics12.01经过Stitching以及Overlaps功能优化后，检查有无空洞，有无缺陷，优化后保存STL文件。

5)PROJET 3500三维打印实体模型

将构件的模型及支架系统的STL文件导入PROJETTM3500三维打印系统，通过对模型的分层，支撑材料的设定，打印成型材料为光固化丙烯酸树脂，支撑材料为无毒可分解石蜡，打印该模型，得到组织工程骨实体模型。从而证明了利用三维打印技术在成型组织工程骨仿生结构方面的可行性，以及CAD模型设计的完整性和正确性。

6)三维打印PVA/陶瓷骨粉/羊牙槽骨支架

固高GXYZ303010-XYLE三维打印系统，羊椎骨煅烧陶瓷骨粉，PVA生物高分子聚合物凝胶，三维打印构建组织工程化仿羊牙槽骨。

在超净台内将松质骨粉末与PVA按照打印所需最佳配比方案2：1体积比混合，经行调拌，肉眼观呈面团期前期时将其置入三维打印系统。行打印厚度设定，在此为0.2mm并完成分层，工作机头归零，仅容放置两张A4纸张厚度。打印该模型，得到生物可吸收材料的组织工程骨支架。气压设定为110-130PSI，选用0.2mm的喷头，设定打印喷头工作速度为2mm/s，按照预先建立的STL格式文件经行打印，完成三维打印组织工程骨支架的成型。待打印完成后将其置入40℃的烘干箱内过夜完全干燥，最后置于150℃马弗炉中低温加热完成交联反应。

实施例4力学性能及生物相容性等检测

1)力学性能检测

万能力学试验机检测，实验组为PVA/羊牙槽骨支架，对照组为4％藻酸钠/羊椎骨粉支架。当纵坐标为试验力KN横坐标为变形mm的试验力力值可见，三维打印支架的所能承受的试验力约为1.5KN，所产生的形变约为4.5mm，4％藻酸钠/羊椎骨粉支架所能承受的试验力约为0.038KN，所产生的形变约为6mm。由此，三维打印PVA/羊牙槽骨支架材料的屈服强度明显高于4％藻酸钠/羊椎骨粉支架，其所能承受的应力约为海藻酸钠组的39倍。同时PVA/羊牙槽骨支架的曲线较为光滑，而海藻酸钠/羊椎骨粉支架的波动较为明显，表明PVA/羊牙槽骨支架在承受力的过程中，其产生的形变为偏向塑性形变，而其过程中产生断裂、坍塌现象不明显，这一现象与其中的PVA成分的高分子凝胶的性质较为吻合，同时更加贴近天然松质骨成分的力学特性。

2)生物相容性检测

制备PVA/羊牙槽骨支架材料浸提液，方法同上。皮内刺激试验：取新西兰白兔6只，实验前24h剔除白兔脊柱左侧5cm×20cm区域兔毛，椎旁1.5cm选择注射点，间距2cm，左头侧三点为注射生理盐水0.2ml的阴性对照；尾测三点为注射20％乙醇生理盐水0.2mL的阳线对照，中间三点注射材料浸提液0.2mL。注射后6，24，48，72h观察注射局部及周围皮肤组织反应，按皮肤反应评分系统对每个注射部位的红斑及水肿反应进行评分，计算动物对该材料的局部原发刺激指数和平均原发刺激指数。

实验结果显示，注射三维打印支架材料浸提液和生理盐水处，无明显红斑、水肿和坏死。按皮肤反应评分系统APII为0，属于极轻微刺激。阳性对照组注射处于注射后6、24h出现明显红斑，中心部位水肿明显，48h后红斑加深，72h中心部位坏死，APII为5.28，属于强刺激。

3)MTT法检测BMSCs增殖活性(复合PVA支架)

取生长良好的2代细胞，0.25％胰蛋白酶消化后，制成浓度约为1×104/ml细胞悬液，以每孔2000个接种至96孔板中，每孔体积200微升，置于在37℃，5％CO₂，饱和湿度下培养，每2-3天换液1次。每天倒置相差显微镜下观察细胞生长状态，同时每天取4孔行细胞计数，连续8d。以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线，并记录细胞快速增殖及稳定期。孔内放置2×5×4的打印支架并将细胞与支架复合培养，分别于细胞接种的第1d-8d，各取5孔，加入MTT(5mg/ml)溶液40微升，标准条件下(37℃，5％CO2)继续培养4h，终止培养。小心吸去空内培养液后，每孔加入400微升DMSO，置于多功能酶标仪内，100次/min，震荡10min，使材料表面结晶充分溶解。选择490nm波长，测定各孔内吸光值(A)值。以干细胞直接接种于孔板底部作为对照，结果进行统计学分析。

实验结果表明，材料浸提液培养羊骨髓间充质干细胞8d后，实验组和对照组A值差异无显著性意义(P>0.05)。三维打印支架实验组细胞相对增殖率均大于90％。说明该组材对羊骨髓间充质干细胞的细胞毒性为0～1级，表明该三维打印支架材料无细胞毒性。

Claims (6)

1.一种三维打印制备牙槽骨支架的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)骨骼外部轮廓数据的获取：采用CT扫描骨组织，将获得图像保存为标准DICOM类型，刻盘保存，将数据转入计算机工作站；

2)读取DICOM格式文件提取目标组织：利用MIMICS软件读取所得的DICOM格式数据，结合CT的灰度原理，优化骨轮廓，三维重建骨模型，保存为STL文件，利用GEOMAGIC软件，选取合适大小的目标骨组织轮廓，以STL文件保存；

3)微观支架材料空间模型的构建：利用CATIA的CAD模块，生成组织工程骨所要求的具有引导细胞、提供附着、满足支撑的功能的空间微观支架CAD模型，在CATIA V5R17软件中在三维空间中设计支架材料所需的单体结构，进入阵列模块，得到骨支架材料微观结构；

4)装配外层皮质骨与内部支架材料：在GEOMAGIC中选取正确的表面生成实体，利用布尔运算功能获得皮质骨与内部支架材料的装配模型，将模型导入Magics12.01经过Stitching以及Overlaps功能优化后，检查有无空洞，有无缺陷，优化后保存STL文件；

5)固高GXYZ303010-XYLE三维打印系统打印支架：将构件的模型及支架系统的STL文件导入PROJETTM3500三维打印系统，在超净台内将羊椎骨煅烧陶瓷骨粉与PVA胶按比混合，置入三维打印系统，行打印厚度设定，得到生物可吸收材料的组织工程骨支架，待打印完成后将其置入40℃的烘干箱内过夜完全干燥，最后置于150℃马弗炉中低温加热完成交联反应。

2.根据权利要求1所述的一种三维打印制备牙槽骨支架的方法，其特征在于：步骤(1)中扫描电压120Kv，电流120mA，扫描层厚为0.625mm。

3.根据权利要求1所述的一种三维打印制备牙槽骨支架的方法，其特征在于：步骤(5)中打印条件为气压设定为110-130PSI，选用0.2mm的喷头，设定打印喷头工作速度为2mm/s，按照预先建立的STL格式文件经行打印，完成三维打印组织工程骨支架的成型。

4.根据权利要求1所述的一种三维打印制备牙槽骨支架的方法，其特征在于：羊椎骨煅烧陶瓷骨粉与PVA胶混合物的体积比为2:1。

5.根据权利要求4所述的一种三维打印制备牙槽骨支架的方法，其特征在于：所述的羊椎骨煅烧陶瓷骨粉通过以下方法制备：选用健康成年羊脊椎骨，去除表面骨皮质后切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方体，采用体积分数30％H₂O₂浸泡12h脱蛋白，1:1甲醇/氯仿浸泡12h脱脂，处理重复3次，超声震荡仪清洗，干燥后，浸泡在0.09mol/L焦磷酸钠溶液中，70℃恒温水浴锅温浴12h，取出骨块干燥，经高温微波煅烧炉，在800℃维持3h，碾磨制备成骨粉，60℃消毒、封装、备用。

6.根据权利要求4所述的一种三维打印制备牙槽骨支架的方法，其特征在于：所述的PVA胶通过以下方法制备：选用超纯水将PVA浓度定为15％wt，水浴99℃4h，待其完全溶解呈透明胶状其中未见絮状物为准，高温高压消毒待用。