CN109381739A - 一种三维生物支架及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三维生物支架及其制备方法和应用，属于3D打印材料开发技术和生物医学工程技术领域，具体为通过无模直写三维打印技术构建由溶胶凝胶组成的三维有序多孔结构，并通过进一步的固化成型可获得适用于细胞培养的三维生物支架。采用该方法制备的三维陶瓷支架为三维多孔结构，孔隙率10％‑90％可调，孔径尺寸30μm‑1mm可调，为方形孔结构，孔与孔之间三维贯通，该方法获得的生物支架具有良好的生物相容性，可用于骨细胞的培养以及骨组织的修复。

Description

一种三维生物支架及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及3D打印材料开发技术领域和生物医学工程技术领域，具体涉及一种三维生物支架及其制备方法和应用。
背景技术
每年因交通事故和生产安全事故导致众多的创伤骨折，加上骨肿瘤、股骨头缺血性坏死等骨科疾病，造成300多万的骨缺损病例。临床上，由于自体骨来源有限，异体骨和异种骨存在免疫排斥反应，且存在潜在的病原传播危险等缺陷，迫切需要研发骨组织修复材料，用于治疗骨缺损。传统的支架材料及制备技术难以大批量构建形状各异的复杂骨修复材料，无法满足临床上个性化修复的需要。临床需要的骨组织修复支架材料要适用于不同的患者以及不同的症状，其外形及微观结构因人因症而异。这类个性化修复的临床需求迫切需要具有个性化结构和性能的支架材料。3D打印技术，源自快速成型(RapidPrototyping，RP)技术，又称快速原型技术，是当今世界上飞速发展的制造技术之一。快速成型是在计算机辅助设计和制造技术、激光技术和材料科学技术的发展，以及与各种成型技术的结合的基础上出现的一种新型材料加工工艺，基本原理为根据CAD或CT等数据，利用激光、数控技术将原材料精确堆积，在没有传统模具和夹具的情况下，快速制造出任意复杂形状而又具有一定功能的三维实体模型或零件。将快速成型技术应用于生物材料的研制是材料科学和现代制造技术发展的必然结果，快速成型技术的出现，不仅大大缩短了生物材料的开发周期，降低了研发费用，同时解决了近代临床医学创伤技术中一些重大的三维重建的科学技术性难题。特别是在复杂形状的人工骨替代物的制造方面更显示出它的独特优势。快速成型技术快速精确的特点及其发展为组织结构个性化加工提供了一个很好的途径，可以根据病人个性化的要求制作出适用于其特殊要求的修补或移植假肢快速成型生物材料制造是材料科学科与先进制造技术学科交叉的结果，也是当代技术进步的必然结果。
二氧化钛作为一种生物惰性材料，其细胞粘附性和促细胞增殖性良好，有作为新型生物骨修复材料的巨大潜力。采用溶胶凝胶法制备的二氧化钛前驱体具有可调的流变性能，可直接作为一种三维无模直写打印的浆料来制备生物支架，同时，结合溶胶凝胶技术和三维无模直写打印技术可使制备获得的生物支架的网络尺寸更为细小，孔隙以及孔形更加多样，可以满足个性化定制的需求，特别是日益复杂的骨修复应用领域的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三维生物支架及其制造方法和应用，该方法获得的生物支架具有良好的生物相容性，可用于骨细胞的培养以及骨组织的修复。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种三维生物支架，该三维生物支架的材质为以二氧化钛为基的陶瓷材料，该支架为三维多孔结构，孔隙率为10-90％，孔径尺寸为30μm-1mm，孔与孔之间三维贯通。
该三维生物支架的宏观整体尺寸可调，孔的形状能够根据需要进行设计，孔的形状为方形、圆形、三角形和六边形中的一种或几种。
所述三维生物支架的制备方法为：首先采用三维打印技术对二氧化钛前驱体浆料(二氧化钛溶胶凝胶前驱体)进行无模直写成型，获得三维有序多孔结构；然后通过高温烧结固化成型获得所需孔隙率的三维生物支架。
所述二氧化钛溶胶凝胶前驱体的制备过程包括如下步骤：
(1)含表面活性剂和金属离子的乙醇溶液的配制：
将表面活性剂、金属醇盐和乙醇均匀混合后获得所述含表面活性剂和金属离子的乙醇溶液；其中：表面活性剂与金属醇盐的比例为(0.2-1)g:10mL，金属醇盐与乙醇的体积比例为1:(0.5-1)；所述金属醇盐为双(乙酰丙酮基)二异丙基钛酸酯(TIA)，所述表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量大于50000)或聚乙二醇。
(2)氨水溶液配制：将浓度28wt.％的氨水、去离子水与乙醇按照1:(0.5-2)：(4-10)体积比例混合后制备而成；
(3)将步骤(1)所得含表面活性剂和金属离子的乙醇溶液与步骤(2)中氨水溶液按体积比例1:(0.5-2)混合，并在50-90℃条件下水解缩聚成凝胶，即得到所述二氧化钛前驱体浆料，所述二氧化钛前驱体浆料为二氧化钛凝胶。
所述高温烧结固化是采用多步保温烧结的工艺进行固化，高温烧结固化过程中保温2-4次。其中：每步保温烧结的过程中，升温速率为0.5-5℃/min，保温温度区间为450-1600℃，保温时间为2-5小时，每步保温后自然冷却到室温。
本发明三维生物支架具有良好的生物相容性，可用于骨细胞的培养以及骨组织的修复。
本发明具有以下优点和有益效果：
1、本发明采用三维打印技术制备的生物支架为三维多孔结构，支架宏观总体结构尺寸可调，孔隙率10-90％可调，孔径尺寸30μm-1mm可调，孔形状(方形、圆形、三角形、六边形)结构可调，孔与孔之间三维贯通。
2、本发明制备的二氧化钛生物支架，具有良好的骨细胞粘附性和促进骨细胞增殖性，可用于骨细胞的培养以及骨组织的修复。
附图说明
图1为二氧化钛生物陶瓷支架光学图。
图2为直径25μm，间距120μm，孔隙率为83％的二氧化钛生物陶瓷支架SEM图。
图3为生物陶瓷支架MC3T3-E1细胞共培养，细胞粘附生长SEM图。
图4为直径33μm，间距108μm，孔隙率为75％的二氧化钛生物陶瓷支架SEM图。
图5为二氧化钛生物陶瓷支架进行MC3T3-E1细胞进行共培养，用cck8试剂盒测细胞增殖数据图。
图6为生物陶瓷支架MC3T3-E1细胞共培养，细胞在1天、3天、5天的增殖活细胞免疫荧光染色激光共聚焦图。。
具体实施方式
下面结合具体的实例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明为三维生物支架及其制备方法和应用，首先通过无模直写三维打印技术构建由溶胶凝胶组成的三维有序多孔结构，并通过进一步的固化成型可获得适用于细胞培养的三维生物支架。所制备的三维陶瓷支架为三维多孔结构，孔隙率10％-90％可调，孔径尺寸30μm-1mm可调，为方形孔结构，孔与孔之间三维贯通，该方法获得的生物支架具有良好的生物相容性，可用于骨细胞的培养以及骨组织的修复。
实施例1
本实施例制备三维生物支架的过程如下：
1.配制二氧化钛前驱体溶胶凝胶浆料：需要的药品有双(乙酰丙酮基)二异丙基钛酸酯(TIA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP，平均分子量55000)、无水乙醇、氨水、去离子水，通过TIA水解获得二氧化钛溶胶凝胶。具体配制方法为，将0.62g的PVP完全溶解到8mL无水乙醇中，再加入12.5mL的TIA，搅拌均匀，标记为溶液①；将1.8mL去离子水和1.34mL氨水(浓度28wt.％)加入到8mL无水乙醇中搅拌均匀，标记为溶液②；将溶液①和②混合均匀，80℃水浴加热搅拌约1小时形成凝胶，此时凝胶的体积约为2mL，将其装入5mL料筒中待用。
2.编写3D打印程序，设定间距为230μm，选择直径50μm的针头，逐层打印得到二氧化钛前驱体支架。
3.将二氧化钛前驱体支架进行高温处理：升温速率设置在1℃/min，在400℃和600℃各保温4小时后升温至1200℃保温4小时，再分段冷却至室温，得到直径为25μm，间距为120μm的二氧化钛生物陶瓷支架。其光学图如图1所示，其SEM图如图2所示。
4.对二氧化钛生物陶瓷支架进行MC3T3-E1细胞进行共培养，用SEM观察细胞粘附情况，具体步骤如下：
(1)将支架放入96孔板，加100μL培养基浸泡10min，然后吸去培养基；
(2)培养MC3T3-E1成骨细胞至对数生长期，用0.25％胰酶消化细胞配成105个/mL的细胞悬液；
(3)每孔加入100μL细胞悬液，4h后补加100mL培养基，CO2培养箱中培养5天(每2天换1次培养基)。
(4)PBS冲洗支架2次，加2.5％戊二醛固定过夜，梯度乙醇脱水，真空抽干，喷金，SEM观察，细胞粘附结果如图3所示。
实施例2
本实施例制备三维生物支架的过程如下：
1.配制二氧化钛前驱体溶胶凝胶浆料：需要的药品有双(乙酰丙酮基)二异丙基钛酸酯(TIA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP，平均分子量55000)、无水乙醇、氨水、去离子水，通过TIA水解获得二氧化钛溶胶凝胶。具体配制方法为，将0.62g的PVP完全溶解到8mL无水乙醇中，再加入12.5mL的TIA，搅拌均匀，标记为溶液①；将1.8mL去离子水和1.34mL氨水(浓度28wt.％)加入到8mL无水乙醇中搅拌均匀，标记为溶液②；将溶液①和②混合均匀，80℃水浴加热搅拌约1小时形成凝胶，此时凝胶的体积约为2mL，将其装入5mL料筒中待用。
2.编写3D打印程序，设定间距为200μm，选择直径60μm的针头，逐层打印得到二氧化钛前驱体支架。
3.将二氧化钛前驱体支架口进行高温处理：升温速率设置在1℃/min，在400℃和600℃各保温4小时后升温至1200℃保温4小时，再分段冷却至室温，得到直径为33μm，间距为108μm的二氧化钛生物陶瓷支架。其SEM图如图4所示。
4.对二氧化钛生物陶瓷支架进行MC3T3-E1细胞进行共培养，用cck8试剂盒测细胞增殖情况，具体步骤如下：
(1)将支架放入96孔板，加100μL培养基浸泡10min，然后吸去培养基；
(2)培养MC3T3-E1成骨细胞至对数生长期，用0.25％胰酶消化细胞配成105个/mL的细胞悬液；
(3)每孔加入100μL细胞悬液，4h后补加100mL培养基，CO2培养箱中培养1、3、5天(每2天换1次培养基)。
(4)将支架轻轻地移到空白96孔板中，每孔加入150μL含10％cck8的培养基，设置空白孔(不含支架)，培养箱中孵育2h，从孔板中吸出100μL液体，酶标仪测450nm处吸光度，细胞增殖结果如图5所示。
实施例3
本实施例制备三维生物支架的过程如下：
1.配制二氧化钛前驱体溶胶凝胶浆料：需要的药品有双(乙酰丙酮基)二异丙基钛酸酯(TIA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP，平均分子量55000)、无水乙醇、氨水、去离子水，通过TIA水解获得二氧化钛溶胶凝胶。具体配制方法为，将0.62g的PVP完全溶解到8mL无水乙醇中，再加入12.5mL的TIA，搅拌均匀，标记为溶液①；将1.8mL去离子水和1.34mL氨水(浓度28wt.％)加入到8mL无水乙醇中搅拌均匀，标记为溶液②；将溶液①和②混合均匀，80℃水浴加热搅拌约1小时形成凝胶，此时凝胶的体积约为2mL，将其装入5mL料筒中待用。
2.编写3D打印程序，设定间距为200μm，选择直径60μm的针头，逐层打印得到二氧化钛前驱体支架。
3.将二氧化钛前驱体支架口进行高温处理：升温速率设置在1℃/min，在400℃和600℃各保温4小时后升温至1200℃保温4小时，再分段冷却至室温，得到直径为33μm，间距为108μm的二氧化钛生物陶瓷支架。
4.对二氧化钛生物陶瓷支架进行MC3T3-E1细胞进行共培养，用Calcein-AM活细胞染色，具体步骤如下：
(1)将支架放入96孔板，加100μL培养基浸泡10min，然后吸去培养基；
(2)培养MC3T3-E1成骨细胞至对数生长期，用0.25％胰酶消化细胞配成105个/mL的细胞悬液；
(3)每孔加入100μL细胞悬液，4h后补加100mL培养基，CO2培养箱中培养1、3、5天(每2天换1次培养基)。
(4)用PBS配制Calcein-AM的终浓度为2μmol/L的染色液，往支架中加入适量染色液，室温孵育15min，用激光共聚焦显微镜进行观察。细胞粘附增殖结果如图6所示。
由上述实施例可以看出，采用无模直写三维打印技术可以实现结构可控的三维多孔生物陶瓷支架制备，该支架具有良好的骨细胞粘附性和促骨细胞增殖性。
上述实施例仅作参考，具有和本专利相似或者从本专利思路出发而延伸的三维打印技术制造二氧化钛生物支架的制造方法，均在本专利的保护范围。

Claims (9)

1.一种三维生物支架，其特征在于：该三维生物支架的材质为以二氧化钛为基的陶瓷材料，该支架为三维多孔结构，孔隙率为10-90％，孔径尺寸为30μm-1mm，孔与孔之间三维贯通。
2.根据权利要求1所述的三维生物支架，其特征在于：该三维生物支架的孔的形状能够根据需要进行设计，孔的形状为方形、圆形、三角形和六边形中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的三维生物支架的制备方法，其特征在于：该方法首先采用三维打印技术对二氧化钛前驱体浆料进行无模直写成型，获得三维有序多孔结构；然后通过高温烧结固化成型获得所需孔隙率的三维生物支架。
4.根据权利要求3所述的三维生物支架的制备方法，其特征在于：所述二氧化钛溶胶凝胶前驱体的制备过程包括如下步骤：
(1)含表面活性剂和金属离子的乙醇溶液的配制：
将表面活性剂、金属醇盐和乙醇均匀混合后获得所述含表面活性剂和金属离子的乙醇溶液；其中：表面活性剂与金属醇盐的比例为(0.2-1)g:10mL，金属醇盐与乙醇的体积比例为1:(0.5-1)；
(2)氨水溶液配制：将浓度28wt.％的氨水、去离子水与乙醇按照1:(0.5-2)：(4-10)体积比例混合后制备而成；
(3)将步骤(1)所得含表面活性剂和金属离子的乙醇溶液与步骤(2)中氨水溶液按体积比例1:(0.5-2)混合，并在50-90℃条件下水解缩聚成凝胶，即得到所述二氧化钛前驱体浆料。
5.根据权利要求4所述的三维生物支架的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述金属醇盐为双(乙酰丙酮基)二异丙基钛酸酯，步骤(3)中得到的二氧化钛前驱体浆料为二氧化钛凝胶。
6.根据权利要求4所述的三维生物支架的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇。
7.根据权利要求3所述的三维生物支架的制备方法，其特征在于：所述高温烧结固化是采用多步保温烧结的工艺进行固化，其中：每步保温烧结的过程中，升温速率为0.5-5℃/min，保温温度区间为450-1600℃，保温时间为2-5小时，每步保温后自然冷却到室温。
8.根据权利要求7所述的三维生物支架的制备方法，其特征在于：所述高温烧结固化过程中保温2-4次。
9.根据权利要求1所述的三维生物支架的应用，其特征在于：该生物支架应用于细胞的培养与骨组织的修复。
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