KR101913776B1 - 3차원 메쉬형 세포칩 - Google Patents

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KR101913776B1
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안정희
이광섭
정주형
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한남대학교 산학협력단
건국대학교 글로컬산학협력단
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Abstract

본 발명은 피라미드 구조의 3차원 메쉬형 세포칩에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 2차원 플레이트가 아닌 3차원 피라미드 구조의 메쉬형 세포칩에 세포를 배양함으로써 in vitro 3차원 세포 성장의 시뮬레이션이 가능하고 체내 반응과 유사한 약물 독성 및 효능 분석이 가능한 피라미드 구조의 3차원 메쉬형 세포칩에 관한 것이다.

Description

3차원 메쉬형 세포칩 {Three-dimensional mesh type cell chip}
본 발명은 세포를 3차원의 입체적 형상으로 배양할 수 있는 3차원 메쉬형 세포칩에 관한 것이다.
세포 기반 칩은 약물, 독성, 화학 물질의 검출뿐만 아니라 이들의 기능을 평가하는 등 다양한 범위로 응용 가능하며, 세포 기반 바이오센서는 항암제에 대한 종양세포의 민감도 평가에 적용될 수 있다. 그러나 이들의 측정 결과는 in vivo 관측 결과와 상이하며, 약물 효과를 살아있는 유기체에서 in vitro로 예측하기란 어려운 실정이다. 따라서 효과적인 약물 스크리닝을 위해 in vivo 환경과 매우 유사한 세포 칩의 개발이 요구되고 있다.
한편, 암세포는 다양한 항암제에 대하여 대부분 저항성을 가지며, 이러한 저항성은 다양한 메커니즘으로 규명된다. 다양한 항암제에 대한 암의 내성은 종종 약물 유출 펌프로 작용하는 능동수송체의 과발현과 관련이 있으며, 조직 (tissue) 구조는 항암제에 대한 종양의 반응뿐만 아니라 종양의 성장 속도를 결정한다. 생체 내 조건과 유사한 세포 생성 및 재현을 위해서는 2차원 또는 3차원 세포 배양 시스템에 대한 정밀한 세포 패턴을 생성하고, 마이크로 시스템에서 단일 세포 수준 (대략 10㎛)의 미세 환경 자극을 제어할 수 있는 생체물질을 기반으로 한 기판의 역할이 중요하며, 3차원 종양세포 모델은 2차원 종양세포 모델보다 생체 내 종양세포와 더 유사하다고 밝혀진 바 있다.
3차원 조직 배양에서 다양한 세포 패터닝 기술로는 마이크로접촉 프린팅 (microcontact printing), 소프트 리소그래피 (soft lithography), 미세유체 (microfluidic) 또는 미세구조 (microstructure) 기반 기술, 물리적 힘에 의한 세포 부착 또는 현탁 제어, 층상 적층 (layer-by-layer assembly) 공정 등이 있다. 그러나 마이크로접촉 프린팅의 경우 대량 생산에 있어서 많은 비용이 필요하며, 미세유체 기반 세포 배양 플랫폼의 경우 스페로이드 (spheroid) 및 3차원 세포 배양을 생산하는데 어려움이 있어 광범위하게 특성화할 수 없기 때문에 제한적이라는 문제점이 있다. 한편, 세포 부착을 능동적으로 조절하는데 사용되는 기질과 지지체는 생체 내에서 세포가 받는 영향과 유사한 3차원 지지 시스템을 제공할 수 있으나, 대량 생산 시 고가의 비용이 유발되며, 3차원 배양체 형성 후 세포 회수 (retrieval)가 어려운 문제가 있다.
따라서 본 발명에서는 종래보다 제조비용 및 제조시간을 낮추고 손쉽게 제조할 수 있도록 나노 스테레오리소그래피 (nano-stereolithography)를 적용하여 균일한 크기의 셀에서 세포의 배열을 가능하게 하는 3차원 메쉬형 세포칩을 개발하였다. 나노 스테레오리소그래피 (nano-stereolithography)는 펨토초 레이저의 이광자 흡수 광중합 (two-photon polymerization, TPP) 현상을 이용한 높은 정밀도를 갖는 3차원 입체 형상 제조기술이며, 이광자 흡수 광중합 현상은 이광자 흡수 색소가 동시에 두 개의 광자를 흡수하여 전기적으로 들뜬 상태가 된 뒤 약간의 에너지를 소실한 후 흡수될 때의 파장보다 더 높은 파장을 가진 빛을 방출하고 다시 바닥 상태로 돌아가는 현상으로, 이때 방출된 단파장의 빛은 광개시제 (photoinitiator)가 흡수하여 전기적으로 들뜬 상태가 되고 일반적으로 10-6초 이내의 짧은 시간에 세 가지 형태로 진행된다. 첫째로 들뜬 상태에서 빛을 방출하여 다시 광개시제로 돌아오거나, 둘째로 라디칼로 화학적 분해가 일어난 뒤 바로 광경화수지 내에 존재하는 산소와 같은 라디칼 소광 물질 (radical quenching agent)과 반응하여 단량체와 결합능력을 상실하는 형태로 변환되거나, 셋째로 라디칼을 유지하면서 단량체와 결합하여 사슬성장중합 반응을 통하여 고분자 물질로 변환되는 부분으로 나누어진다.
본 발명의 3차원 메쉬형 세포칩은 in vitro 3차원 세포 성장을 시뮬레이션할 수 있으며, 약물 독성 및 효능에 대한 분석이 가능하다.
본 발명의 목적은 3차원 메쉬형 세포칩을 제조하여 세포를 배양시킴으로써 2차원 플레이트에서 배양된 세포보다 우수한 특성을 보유하며, 세포 성장 및 약물 저항 등의 in vivo 실험 결과와 유사한 결과를 얻을 수 있는 3차원 메쉬형 세포칩을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여,
입체적 구조를 가지는 3차원 메쉬형 세포칩으로서, 셀이 일정한 간격으로 반복하여 복수 개 배치되어 있고, 상기 복수 개의 상기 셀은 6개의 각 면이 뚫려있는 12개의 기둥으로 이루어진 비어있는 정육면체 형태이며, 유체가 상기 셀의 각 6개 면 방향으로 통과하는 구조의 메쉬형(그물망) 3차원 구조이고, 상기 정육면체 형태의 상기 셀의 한 변 길이는 10 ㎛ 내지 15 ㎛이고, 상기 기둥의 두께는 2 ㎛ 내지 3 ㎛인 것을 특징으로 하는 3차원 메쉬형 세포칩을 제공한다.
상기 3차원 메쉬형 세포칩은 상기 복수 개의 상기 셀이 3개의 층으로 구성된 피라미드 구조인 것을 특징으로 한다.
상기 피라미드 구조는 1층이 8×8의 64개 셀로 이루어지고, 상기 1층 상부에 2층이 6×6의 36개 셀로 적층되고, 상기 2층 상부에 3층이 4×4의 16개 셀로 적층되어 총 116개의 셀로 구성되는 것을 특징으로 한다.
상기 3차원 메쉬형 세포칩은 세포 배양에 의한 세포 증식용, 세포 시험용, 약물활성 시험용 또는 약물독성 시험용인 것을 특징으로 한다.
상기 3차원 메쉬형 세포칩은 이광자 스테레오리소그래피 (two-photon sterolithography, TPS) 공정을 이용하여 제조되며, 레이저 광원 (laser beam source)으로 100 fs 이하의 초단펄스 지속시간 (ultrashort pulse duration)을 갖는 티타늄:사파이어 레이저 (Ti:Sapphire laser)를 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 이광자 스테레오리소그래피 공정은 개구수 1.3인 오일 대물렌즈 (oil-immersion objective lens, ×100)를 이용하여 상기 레이저를 광경화성 고분자 수지에 집광하고, 상기 광경화성 고분자 수지가 고정된 0.1 nm 분해능을 갖는 XYZ 피에조 스테이지 (XYZ piezoelectric stage)를 이용하여 800 ㎛×800 ㎛×250 ㎛의 제작영역에 대해 x, y 및 z축 방향으로 레이저 스캐닝을 제어하며, 고배율 렌즈가 부착된 CCD 카메라를 이용하여 레이저 초점을 조절하고 실시간으로 제조과정을 모니터링 하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 한다.
상기 레이저는 작동주파수 (repetition rate) 80 MHz 및 파장 (wavelength) 780 nm를 가지고, 반파장판 (λ/2 plate)과 편광 빔분할기 (polarizing beam splitter)에 의해 레이저 출력이 조절되며, 최대 주파수 1.0 kHz를 갖는 광학셔터 (optical shutter)에 의해 레이저 전원 (on/off)이 제어되는 것을 특징으로 한다.
상기 광경화성 고분자 수지는 에폭시계 수지인 것을 특징으로 한다.
상기 에폭시계 수지는 SU-8이며, 상기 SU-8은 SU-8 2, SU-8 5, SU-8 10, SU-8 25, SU-8 50, SU-8 100, SU-8 2000.5, SU-8 2002, SU-8 2005, SU-8 2007, SU-8 2010, SU-8 2015, SU-8 2100, SU-8 2150, SU-8 2025, SU-8 2035, SU-8 2050, SU-8 2075, SU-8 3005, SU-8 3010, SU-8 3025, SU-8 3035 및 SU-8 3050로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
상기 1층의 레이저 스캐닝 속도는 30 ㎛/s이며, 상기 2층 및 3층의 레이저 스캐닝 속도는 10 ㎛/s인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 3차원 메쉬형 세포칩에 1종 이상의 세포 또는 상기 세포 배양액을 주입하고, 이를 배양하여 메쉬형 세포칩의 빈 공간에 상기 세포가 부착 및 배양되는　1 단계; 상기 1 단계에서 배양된 세포의 손상, 사멸, 증식, 활성 또는 세포간 상호작용을 분석하는 2 단계;를 포함하는 3차원 메쉬형 세포칩을 이용한 세포분석 방법을 제공한다.
상기 세포 또는 세포 배양액은 질환세포 또는 질환세포의 배양액을 주입하여 배양하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 3차원 메쉬형 세포칩은 2차원 플레이트가 아닌 3차원 피라미드 구조에 세포를 배양시킴으로써 in vitro 3차원 세포 성장의 시뮬레이션이 가능하며, 세포의 본래 특성이 재현되고 in vivo에서와 유사한 활동성을 보이는 효과가 있다. 또한 약물의 효율성 및 독성 검출, 스페로이드에서의 유전자 발현을 포함한 수많은 세포내 화학바이오 분석에 이용될 수 있어 사람의 생리학 연구와 특수화 된 in vitro 모델의 개발에 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 (a) 이광자 스테레오리소그래피 공정, (b) 제조 공정도, (c) 3층 피라미드 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 3차원 메쉬형 세포칩의 SEM 이미지이며, (a) 3차원 메쉬형 세포칩 (scale bar, 50㎛)의 SEM 이미지, (b) 3차원 메쉬형 세포칩의 부분적으로 확대된 SEM 이미지 (scale bar, 20㎛), (c) 3차원 메쉬형 세포칩의 SEM 이미지이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 3차원 메쉬형 세포칩에서 HeLa cancer cells의 SEM과 현미경 이미지이며, (a) 3차원 메쉬형 세포칩의 전체 모습, (b) 2층 암세포의 고배율 이미지, (c) 1층 암세포의 고배율 이미지, (d) 단일 종양 세포의 고배율 이미지, (e) 건강하지 않은 HeLa cells의 저배율 이미지, (f) 2차원 플레이트에서 HeLa cells의 저배율 이미지이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 3차원 메쉬형 세포칩과 2차원 플레이트 세포에서 세포의 현미경 사진을 나타낸 것으로, (a) 3차원 메쉬형 세포칩에서 2일, 3일 및 5일 동안 배양된 HeLa cancer cells에서 F-actin의 면역형광 이미지 및 2차원 세포 플레이트에서 3일 동안 배양된 HeLa cancer cells에서 F-actin의 면역형광 이미지, (b) 2차원 플레이트 및 3차원 메쉬형 세포칩에서의 스페로이드 분포를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 (a) 3차원 메쉬형 세포칩에서 HeLa cancer cells에서 VEGF와 MMP9의 면역형광 이미지, (b) 다양한 세포 밀도에서의 세포 성장 곡선을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 (a) 종양세포 검출 shceme, (b) Qdot-MMP9 결합체의 공초점 이미지 및 SEM 이미지, (c) SERS, (d) Raman spectra를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 (a) MTT 분석법을 이용한 올레아놀릭산의 세포자멸 효능에 대한 그래프, (b) 사멸 세포 검출 그래프, (c) FACS의 정량 데이터, (d) Bax 및 caspase-3의 발현을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 (a) 세포 주기의 유세포분석을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에 따른 3차원 메쉬형 세포칩에 대해 구체적으로 설명한다.
본 발명에 의한 3차원 메쉬형 세포칩은 입체적 구조를 가지는 3차원 메쉬형 세포칩으로서, 셀이 일정한 간격으로 반복하여 복수 개 배치되어 있고, 상기 복수 개의 상기 셀은 6개의 각 면이 뚫려있는 12개의 기둥으로 이루어진 비어있는 정육면체 형태이며, 유체가 상기 셀의 각 6개 면 방향으로 통과하는 구조의 메쉬형(그물망) 3차원 구조이고, 상기 정육면체 형태의 상기 셀의 한 변 길이는 10 ㎛ 내지 15 ㎛이고, 상기 기둥의 두께는 2 ㎛ 내지 3 ㎛인 것이 바람직하다.
상기 3차원 메쉬형 세포칩은 상기 복수 개의 상기 셀이 3개의 층으로 구성된 피라미드 구조이며, 상기 피라미드 구조는 1층이 8×8의 64개 셀로 이루어지고, 상기 1층 상부에 2층이 6×6의 36개 셀로 적층되고, 상기 2층 상부에 3층이 4×4의 16개 셀로 적층되어 총 116개의 셀로 구성되는 것이 바람직하다.
상기 3차원 메쉬형 세포칩은 세포 배양에 의한 세포 증식용, 세포 시험용, 약물활성 시험용 또는 약물독성 시험용인 것이 바람직하다.
상기 3차원 메쉬형 세포칩은 이광자 스테레오리소그래피 (two-photon sterolithography, TPS) 공정을 이용하여 제조되며, 레이저 광원 (laser beam source)으로 100 fs 이하의 초단펄스 지속시간 (ultrashort pulse duration)을 갖는 티타늄:사파이어 레이저 (Ti:Sapphire laser)를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 레이저는 작동주파수 (repetition rate) 80 MHz 및 파장 (wavelength) 780 nm를 가지고, 반파장판 (λ/2 plate)과 편광 빔분할기 (polarizing beam splitter)에 의해 레이저 출력이 조절되며, 최대 주파수 1.0 kHz를 갖는 광학셔터 (optical shutter)에 의해 레이저 전원 (on/off)이 제어되는 것을 특징으로 한다.
상기 이광자 스테레오리소그래피 공정은 대물렌즈와 광경화성 고분자 수지가 올려지는 유리판 사이의 개구수 (numerical aperture, NA)가 1.3인 오일 대물렌즈 (oil-immersion objective lens, ×100)를 이용하여 상기 레이저를 광경화성 고분자 수지에 집광하는 것이 바람직하다. 상기 대물렌즈는 대물렌즈와 광경화성 고분자 수지가 올려지는 유리판 사이의 개구수를 높이기 위해 담금 기름을 사용하며, 광경화성 고분자 수지에 레이저 빔을 직접하기 위해 개구수가 높은 대물렌즈를 사용한다.
상기 광경화성 고분자 수지가 고정된 0.1 nm 분해능을 갖는 XYZ 피에조 스테이지 (XYZ piezoelectric stage)를 이용하여 800 ㎛×800 ㎛×250 ㎛의 제작영역에 대해 x, y 및 z축 방향으로 레이저 스캐닝을 제어하며, 고배율 렌즈가 부착된 CCD 카메라를 이용하여 레이저 초점을 조절하고 실시간으로 제조과정을 모니터링 하는 것이 바람직하다.
상기 광경화성 고분자 수지는 에폭시계 수지이며, 상기 에폭시계 수지는 SU-8인 것이 바람직하다. 상기 SU-8은 광감도가 뛰어나며, SU-8 2, SU-8 5, SU-8 10, SU-8 25, SU-8 50, SU-8 100, SU-8 2000.5, SU-8 2002, SU-8 2005, SU-8 2007, SU-8 2010, SU-8 2015, SU-8 2100, SU-8 2150, SU-8 2025, SU-8 2035, SU-8 2050, SU-8 2075, SU-8 3005, SU-8 3010, SU-8 3025, SU-8 3035 및 SU-8 3050로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
상기 1층의 레이저 스캐닝 속도는 30 ㎛/s이며, 상기 2층 및 3층의 레이저 스캐닝 속도는 10 ㎛/s인 것이 바람직하다. 각 층의 뒤틀림 및 찌그러짐 등을 방지하기 위해 각 층마다 레이저 스캐닝 속도를 다르게 하여 각 층의 강도를 조절하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 의한 3차원 메쉬형 세포칩을 이용한 세포분석 방법은 상기 제조방법에 따라 제조된 3차원 메쉬형 세포칩에 1종 이상의 세포 또는 상기 세포 배양액을 주입하고, 이를 배양하여 메쉬형 세포칩의 빈 공간에 상기 세포가 부착 및 배양되는　1 단계; 상기 1 단계에서 배양된 세포의 손상, 사멸, 증식, 활성 또는 세포간 상호작용을 분석하는 2 단계;를 포함한다.
상기 세포 또는 세포 배양액은 질환세포 또는 질환세포의 배양액을 주입하여 배양하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 3차원 메쉬형 세포칩 제조
3차원 메쉬형 세포칩은 이광자 스테레오리소그래피 (two-photon sterolithography, TPS) 방법을 이용하여 제조하였으며, 제조공정을 도 1 (a)에 나타내었다. 레이저는 작동주파수 (repetition rate) 80 MHz, 파장 (wavelength) 780 nm 및 100 fs 이하의 초단펄스 지속시간 (ultrashort pulse duration)을 갖는 티타늄:사파이어 레이저 (Ti:Sapphire laser)를 사용하였다.
광경화성 고분자 수지 SU-8 (Microchem Corp., Newton, MA, USA)을 XYZ 피에조 스테이지 (XYZ piezoelectric stage; 800×800×200 ㎛)에 고정된 커버글라스에 떨어뜨린 후 개구수 1.3인 오일 대물렌즈 (×100)를 이용하여 레이저를 SU-8에 집광하여 고정시켰다. SU-8을 3차원 레이저 스캐닝 데이터에 따라 0.1 nm 분해능을 갖는 XYZ 피에조 스테이지를 이용하여 x, y 및 z축 방향으로 이동시켰으며, 고배율 렌즈가 부착된 CCD 카메라를 이용하여 레이저 초점을 조절하고 실시간으로 제조과정을 모니터링 하였다.
상기 광경화성 고분자 수지 SU-8은 이광자 흡수 물질 (two-photon absorbing material)과 광산발생제 (photo-acid generator)가 첨가된 것이며, 이광자 흡수 물질은 SU-8 감광액에서 광산 (H+)의 발생을 유도한다. 광경화한 후, 광감액을 95℃에서 15분 동안 열처리하여 양이온 중합과정을 통해 경화된 중합체 구조를 제조하였으며, SU-8의 경화되지 않은 부분을 propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) 용액을 이용하여 제거하였다.
실시예 2. 3차원 메쉬형 세포칩 구조의 안정성 평가
도 1(c)에서 보는 바와 같이, 3차원 피라미드 구조는 1층 64개, 2층 36개, 3층 16개로 구성된 총 116개의 개별 셀 단위로 구성되며, 각 셀의 크기는 12×12×12 ㎛이다. 3차원 피라미드 구조는 얇게 연결된 선으로 제조되어 각 셀은 비어있으며, 비어있는 셀 단위 안에서 종양 스페로이드를 3차원 형태로 배양할 수 있다 (도 1 (c)).
일반적인 이광자 광중합 공정에서, 3차원 구조는 층상 적층 (layer-by-layer) 공정을 이용하여 제조하나, 이는 3차원 피라미드 구조의 기둥 (pillar) 제작에 많은 시간을 소요하며, 제조 정밀도에 한계가 있다. 반면, 본 발명에서 사용한 다방면 레이저 스캐닝 공정은 제조 시간이 짧으며, 높은 정밀도를 갖는다. 도 1을 참고하면, x 및 y 면에서 레이저 스캐닝은 바닥 기반을 제조하는 데 이용되며, z축 방향 레이저 스캐닝은 기둥 제조에 이용된다.
PGMEA 용액을 사용하여 3차원 피라미드 구조체를 현상할 때 구조체는 3층 근처에서 뒤틀리게 되는데, 이러한 뒤틀림을 방지하기 위해 구조체는 3층까지 고강성 구조로 제조되어야 하며, 각 층은 강도를 조절하기 위해 각기 다른 스캐닝 속도가 요구된다. 1층의 레이저 스캐닝 속도는 30 ㎛/s, 2층 및 3층의 레이저 스캐닝 속도는 10 ㎛/s로 조정하였으며, 이처럼 2층 및 3층의 레이저 스캐닝 속도를 1층의 레이저 스캐닝 속도보다 감소시킴으로써 1층보다 두꺼운 층을 형성할 수 있다.
도 2는 3차원 메쉬형 세포칩의 3차원 피라미드 구조를 나타낸 것으로, SEM (S-800; Hitachi, Tokyo, Japan)을 이용하여 분석하였으며, 이광자 스테레오리소그래피 공정은 3차원 고분자 미세 구조체의 제조에 매우 효과적임을 확인할 수 있었다 (도 2 (b) 및 (c)). 다방면 레이저 스캐닝 공정은 높은 정밀도를 갖는 오픈 세포 구조를 제조할 수 있음을 확인하였으며, 이 공정은 세포 배양에 응용할 수 있는 정밀한 3차원 미세 구조체를 제조하는 고분해능 3차원 폴리머 패터닝 과정에 상당한 이점을 줄 수 있다.
실시예 3. 3차원 메쉬형 세포칩에서의 세포 배양
플라스틱 챔버 (Lab-Tek R)를 고정하여 세포 칩 챔버 (1×1×0.5 cm)를 제조하였으며, 2차원 세포 칩 및 3차원 메쉬형 세포칩은 같은 크기의 챔버를 이용하였다.
사람의 자궁경부암 HeLa cells (American Type Culture Collection; ATCC, Manassas, VA, USA)을 5% CO2를 포함하는 습한 챔버 내의 10% 소태아혈청 (Hyclone, Logan, UT, USA), 200 mM 글루타민, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 배지에서 37℃에서 배양하였다. 각 2차원 및 3차원 메쉬형 미세구조체의 외부 표면에 5×103 내지 1×105 cells/㎖의 배양 밀도에서 1 ㎖ 세포 현탁액을 접종하고, 세포는 단독 또는 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해된 올레아놀릭산의 특정 농도로 처리하였으며, 세포 배양에서 DMSO의 최종 농도는 0.1% (v/v)로 하였다.
배양된 세포를 인산완충용액 (phosphate buffered saline)에 0.1 ㎍/㎖의 최종 농도로 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 30℃에서 15분 내지 30분 동안 염색하였다.
실시예 4. 3차원 메쉬형 세포칩에서의 암세포 증식 및 생존능 분석
volume seeding 방법을 사용하여 1×105 cells을 2 ㎖ 배지에 도말하였으며, 관찰 결과를 도 3에 나타내었다. 세포를 3차원 세포 칩에 배포할 때, 세포는 배지 내에서 무작위하게 분포하며, 시간이 지난 뒤 고도로 국소화 된 영역, 즉 피라미드의 공간과 기둥의 표면 사이의 접촉 영역에서 세포는 고밀도로 정착하고 축적되었다. 현미경과 SEM으로 분석한 결과, 3차원 기질 (도 3(a-e))과 2차원 플레이트 (도 3(f))에서 배양된 HeLa cells 모양에서 상당한 차이점이 확인되었다.
도 3(a)는 3차원 메쉬형 세포칩에서 종양 스페로이드이며, 도 3(b), 도 3(c) 및 도 3(d)는 각각 3차원 메쉬형 세포칩에서 2층 암세포, 1층 암세포, 단일 종양 세포의 고배율 이미지를 나타낸 것이다. 3차원 메쉬형 세포칩에 배양된 HeLa cells은 높은 세포 생존능을 가지며 훌륭한 세포 모양을 띠었고, 3일 후 3차원 평면 표면에 자란 세포는 확장된 스페로이드 구조를 형성한 반면, 2차원 플레이트에서 HeLa cells은 편평하고, 작은 미세융모를 갖는 모양으로 퍼져있었다. 또한 3차원에서 자란 개개의 세포는 2차원에서 자란 세포보다 스페로이드의 수가 상당히 많았다(도 3(a,f)). 14일 동안 자란 3차원 배양의 일부 영역에서는 HeLa cells이 일부 모여있거나 떨어져있는 등 건강하지 않았다 (도 3(e)). 종래의 기술에서는 3차원 세포 구조를 단일층 패턴으로 성장시켰으나 본 발명에서는 3차원 세포 성장을 가능하게 하는 3층 구조를 개발하여 이를 통해 3차원 공간에서의 세포 배양은 생리학적으로 단일층에서의 세포 배양보다 더 적절함을 확인할 수 있었고, in vivo 고체 종양에서와 형태학상의 유사성을 입증하였다.
실시예 5. 면역형광법을 이용한 3차원 메쉬형 세포칩에서의 스페로이드 형성 확인
HeLa cells을 3차원 메쉬형 세포칩에서 2일, 3일 및 5일 동안 50-70% 증식할 때까지 성장시켰으며, 또한 HeLa cells을 2차원 플레이트에서 2일 동안 배양하였다. 표지 (marker)로서 1차 항체로 F-actin을 사용하였다.
세포는 Zeiss Axio Imager M1 microscope (Carl Zeiss MicroImaging, Oberkochen, Germany)와 confocal Leica-SP2 UV (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)를 이용하여 LSM imaging software (Carl Zeiss, Jena, Germany)를 통해 관찰하고 이미지를 얻었으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 다수의 단일 세포들이 모여 3차원 구 형태를 이루는 세포 집합체인 스페로이드 (spheroid)의 분포 (population)는 scanning electron microscopy (SEM)와 inverted microscope를 이용하여 측정하였으며, 스페로이드 분포는 14일 동안의 총 스페로이드 수를 평균 스페로이드 수로 나누어 계산하였다.
관찰 결과, 종양 세포의 핵에서 DAPI 염색으로 인한 푸른 형광이 관찰되었다. 단량체로 분해된 F-actin은 핵 근처에서 거칠어진 세포질에 축적되며, actin 세포골격은 급성 종양의 세포 모양이 입방형에서 운동 스핀들(motile spindle) 모양으로 바뀌는 지점인 리딩 에지 (leading edge)에서 F-actin이 풍부한 돌출부의 형성으로 재조직되고, actin 섬유 (actin fiber)는 3차원 메쉬형 세포칩에서 스페로이드를 동반함을 확인하였다. 반면, 2차원 플레이트에서 실 모양의 actin은 부착된 HeLa cells에서 방대한 그물망을 형성하였다. 3차원 메쉬형 세포칩에 배양된 HeLa cells은 높은 생존능을 유지하고 우수한 세포 형태를 가졌으며, 세포 크기가 균일하지 않은 2차원 플레이트에 비해 균일한 세포 크기를 갖는 등 강화된 기능을 확인하였다.
일반적으로 2차원 플레이트에서의 배양은 편평한 형태를 가지며, 쉽게 유지 및 모니터링 할 수 있는 이점이 있으나, 3차원 메쉬형 세포칩은 2차원 표면에서 성장된 세포보다 상당히 많은 스페로이드 수를 갖으며, 도 4(b)에서 보는 바와 같이, 3차원 메쉬형 세포칩은 배양 3일 후에 확장된 스페로이드 구조를 형성하였다. 낮은 시딩 밀도 (seeding density)에서 세포는 인접한 세포 및 배양 배지와 상호작용하여 뼈대 (scaffold)에 부착되고, 빈 공간을 가로질러 확장되면서 배양되어 표면 영역을 최대화한다. 3차원 피라미드에서 배양된 세포는 서로 접착되고 응집되어 있는 반면, 2차원 플레이트에서는 응집되어 있지 않아 쉽게 씻어낼 수 있다.
상기 결과를 통해 기계적 환경이 세포 성장 및 조직 분화에 중대한 역할을 하며, 3차원 배양 시스템이 세포의 모양 변화 및 세포와 세포끼리의 연결을 형성할 수 있도록 하는 어셈블리 구조물 (assembly architecture)로서 많은 이점을 가짐을 알 수 있었다. 또한 스페로이드 형성에 있어서 균일한 암세포의 크기로 배양되며 빠르고 쉽게 이용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 3차원 메쉬형 세포칩에서 성숙 단계 및 스페로이드의 단백질 발현 평가
1) 스페로이드의 단백질 발현 평가
HeLa cells을 3차원 메쉬형 세포칩에서 3일 동안 배양시키고, 세포 형태 및 암의 표지 (marker)로서 혈관표피성장인자 (vascular edothelial growth factor, VEGF)와 제9형 기질금속단백질분해효소 (matrix metalloproteinase 9, MMP9)을 사용하여 염색하였으며, 관찰 결과를 도 5 (a)에 나타내었다.
그 결과, 종양 세포의 핵에서 DAPI로 인한 푸른 형광이 관찰되었으며, 종양 표지 MMP9의 강한 발현은 스페로이드와 기둥 사이의 접촉 영역에서 검출되었다. 혈관신생을 자극하는 VEGF는 in vivo 종양의 전이와 성장을 허용하는 종양세포에서 종종 과발현되며, VEGF는 종양에서 약물 저항의 조절제로 알려진 혈관형성을 자극하기 때문에 VEGF의 상향조절은 항암제의 약물과 독성 스크리닝에 중요한 표지이다.
2) 세포의 성숙 단계 분석
HeLa cells을 3차원 메쉬형 세포칩에서 5×103 내지 1×105 cell/㎖의 다양한 세포 밀도로 3주 동안 종양 스페로이드로 배양하여 현미경으로 관찰하였으며, 종양 세포의 핵에 염색한 DAPI를 이용하여 2일마다 세포 수를 계산하고, 스페로이드 종양의 총 크기는 ImageJ (image.J.nih.gov/ij)를 이용하여 피라미드 구조 (10×10×10 ㎛, 총 116개의 셀)에서 단위 셀 수에 의거하여 계산하였다. 21일 동안 배양한 세포 수는 도 5(b)에 나타내었다.
도 5(b)를 참고하면, 0 내지 5일은 세포 응집 및 스페로이드 형성, 5 내지 13일은 증식 감소 및 안정적인 성장, 13일 이후는 세포 수 감소를 나타내었다. 21일째에 이미지 분석을 기반으로 하여 세포 증식층에서 세포 생존능을 측정한 결과, 세포 생존능은 90% 이상이었다.
낮은 시딩 밀도는 각 well마다 다양한 작은 응집의 형성을 야기시키며, 이를 통해 시딩 밀도는 세포 주기, 약물 흡수, 산소 확산 및 흡수, 세포 부착에 직간접적으로 영향을 미치고, 세포의 행동 변화, 특히 약물 저항에 대한 원인이 됨을 알 수 있었다. 기존의 미량정량판 (microtiter plate)에서 2차원 및 3차원 시딩 밀도는 세포 증식에 영향을 주었으며, 3차원 배양은 2차원 배양보다 증식 비율이 더 낮게 나타난 반면, 본 발명의 3차원 메쉬형 세포칩은 2차원 플레이트보다 세포 성장률이 더 빠르게 증가함을 확인하였다. 암세포의 스페로이드는 잠재적으로 혈관형성 및 암세포 전이과정에서의 종양 성장 및 발달을 연구하기 위한 세포 모델에 이용할 수 있으며, 이로써 3차원 암세포는 동물실험 없이 사람에게서 독성에 대한 약물 화합물을 정확하게 시험하는데 이용될 수 있는 조직 샘플로서 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 7. 항체가 결합된 금 나노입자 제조
금 나노입자 (60 nm)는 BBI International (Cardiff, UK)에서, Anti-MMP9은 Abcam (Cambridge, UK)에서 구매하여 사용하였다. 금 나노입자와 항체를 결합시키기 위해 금 콜로이드 수용액 1 ㎖를 4℃에서 20분 동안 원심분리 (13,000× g)한 후 생성된 펠렛을 공지된 농도 (1-40 ㎍/㎖)의 검출 항체인 Anti-MMP9를 포함하는 배양완충액 (incubation buffer) 1 ㎖에 재현탁 시키고, 항체가 결합된 금 나노입자를 저장완충액 (storage buffer; 0.1% 소태아혈청을 포함하는 배양완충액) 0.5 ㎖에서 재현탁 시켰으며, 4℃에 보관하였다.
실시예 8. 3차원 메쉬형 세포칩에서 HeLa cells의 스페로이드 형성 확인
3차원 메쉬형 세포칩에서 HeLa cells의 스페로이드 형성을 확인하기 위해 3차원 메쉬형 세포칩에서 종양 스페로이드를 5일 동안 성장시킨 후 살아있는 HeLa Cells의 biocomposition을 Raman NTEGRA spectra (NT-MDT, Moscow, Russia)를 이용하여 표면증강 라만 분광법 (surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)으로 측정하였다. 최대 스캔 범위 (XYZ)는 100×100×6 ㎛이며, 분광기의 분해능은 XY면에서 200 nm, Z축에서 500 nm이다. 라만 스펙트라는 785 ㎚ 파장에서 빛을 방출하는 근적외선을 이용하여 1 ㎝-1부터 2500 ㎝-1까지의 범위에서 1초당 10회 스캔한 후 평균을 분석에 이용하였다. 라만 스펙트라는 노출 시간 1초에 걸쳐 수집하고, 격자는 150/500에 초점을 맞추기 위해 사용하였으며, 그 결과를 도 6 에 나타내었다.
SERS를 이용한 3차원 메쉬형 세포칩에서 Qdot-MMP9 항체와 결합된 금 나노입자의 표적 암 검출 scheme을 도 6(a)에 나타내었다. 1단계에서 금 나노입자 (60 nm)를 MMP9 특이항체에 결합시킨 후, 2단계에서 MMP9-금 나노입자를 Q-dot이 결합된 FITC (fluorescein isothiocyanate)로 라벨링하였다. 도 6(b)의 공초점 이미지에서 보는 바와 같이, 평균 사이즈 60 nm를 갖는 금 나노입자-MMP9 항체 결합체는 입자 흡수 효율성, 세포 라벨링 효율성 및 빛 산란 세기의 실험적 결정 후에 사용하기 위해 HeLa cells에서 과발현된 MMP9 암 마커의 SERS 이미지용으로 이용하였다.
HeLa cells에서 금 나노입자 또는 금-MMP9 항체가 결합된 나노입자는 셀의 안쪽에서 관찰되었다. 2차 항체와 결합된 기능적 나노프로브 (functionalized nonoprobes)는 오직 암세포 마커에만 부착되며, 비특이적 바운드 나노프로브 (nonspecificlly bound nanoprobes)는 완충용액에 의해 씻겨지고, 세척 후에 남아있는 나노프로브는 항체-항체 상호작용으로 인해 선택적으로 암 마커에 부착된다.
SERS 나노프로브를 사용한 암세포의 SERS 이미지 결과는 도 6(c,d)에 나타내었으며, SERS 스펙트라는 500-2000 cm-1에서 얻었다. 이러한 스펙트라에서 피크는 주로 785 nm 레이저에 의해 여기된 테스트 분자의 종래의 라만 스펙트럼에 기인하며, 특히 종래 라만 스펙트라는 모든 여기 선을 이용하여 레코드되었는데, 스펙트라 사이의 유사성 때문에 오직 하나만을 선택하여 분석하였다.
피라미드 1층에서 HeLa cells의 라만 스펙트럼은 646, 835, 1120 ,1195, 1292, 1440, 1628 cm-1에서 라만 밴드가 관찰되었다. 아미노산은 646 cm-1 (tyrosine: CC twisting), 1120 cm-1 (proline: C-N stretching, deoxyribose: C-O), 1195 cm-1 (tyrosine and/or phenylalanine: γ9a)에서 피크가 관찰되었으며, 지질의 라만 피크는 1292 cm-1 (lipid〓CH bend, A. proline: CH), 835 cm-1 (phosphodiester), 1440 cm-1 (lipid C-H)에서 관찰되었다. 단백질의 스펙트라는 Amide I (1628 cm-1)와 일치하는 피크로 나타났다.
피라미드 3층에서 HeLa cells의 라만 스펙트럼은 646, 748, 835, 960, 1120, 1195, 1413, 1440, 1620, 1655 cm-1에서 밴드가 나타났다 (도 6(d)). 3층에서 HeLa cells의 새로운 스펙트라는 748 cm-1 (thiamine), 960 cm-1 (proline: C-C, stretching, α-helix), 1413 cm-1 (deoxyribose: stretching COO-)에서 관찰되었다. 835 cm-1의 피크 세기는 감소하였으나 1440 cm-1 피크의 세기는 3층에서 증가하였다. 1625 cm-1에서의 피크는 1620 및 1655 cm-1에서 나뉘었다.
이러한 결과로부터 금 나노입자-MMP9 항체 결합체는 조직 깊이를 연구 및 다른 SERS 기반 측정 수행에 있어 매우 효율적임을 확인하였다.
실시예 9. 3차원 메쉬형 세포칩에서 올레아놀릭산의 항암활성 분석
암세포 증식과 세포 생존력에 대한 올레아놀릭산 (oleanolic acid)의 영향을 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; Genetrone, Korea) 분석법을 이용하여 평가하였으며, 그 결과를 도 7(a)에 나타내었다.
세포를 1×105 cells/well 농도로 well plate에 접종하고, 올레아놀릭산을 농도별 (0, 50, 100, 250, 500 ㎍/㎖ DMSO)로 처리한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. MTT 용액 (5 ㎎/㎖)을 첨가한 후 4시간 동안 microplate reader (Asys UVM 340; Biochrom Ltd., Cambridge, UK)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 생존 세포의 비율은 처리된 세포의 평균 흡광도를 처리되지 않은 세포의 평균 흡광도로 나누어 계산하였다. 3차원 메쉬형 세포칩 배양 후, 스페로이드를 0.25% trypsin EDTA로 37℃에서 15분 동안 처리하여 배양된 스페로이드는 단일세포로 분해되었다. 세포를 트리판블루(trypan blue)로 염색한 뒤 hemocytometer를 이용하여 세포 수를 측정하여 세포 생존력을 분석하였다.
분석 결과, 같은 시딩 밀도에서 2차원 및 3차원 배양의 올레아놀릭산의 효능을 비교할 때 반최고치억제농도 (half maximal inhibitory concentration, IC50)에서 통계적으로 상당한 차이가 나타났다. 올레아놀릭산의 세포독성 효과는 의존적 (dose-dependent) 방법으로 증가하며, 올레아놀릭산의 IC50 값은 3차원 메쉬형 세포칩 및 2차원 플레이트에서 각각 345.65 ㎍/㎖, 68.56 ㎍/㎖ 였다.
항암제에 대한 높은 화학저항 (chemoresistance)을 보여주는 세포 스페로이드 현상은 항암제의 침투력 감소, pro-survival 신호 방식 증가 및 약물 저항을 부여하는 유전자 상향조절을 포함하는 여러 메커니즘에 기인하며, 약물 저항은 고체 종양의 처리를 위한 화학요법 치료제의 실패를 야기한다. 스페로이드의 다양한 구조는 약물 저항을 보여주며 다른 발암 분자의 발현으로 인해 영향을 받는다. 따라서, 3차원 모델에서 항암제에 세포의 화학저항성을 증가시키는 것이 요구된다.
실시예 10. 세포 주기 분석 및 세포자멸 측정
HeLa cells를 1×105 cells/well 농도에서 well plate에 접종한 후 세포를 300 ㎕ propidium iodide 용액 (38 mM sodium citrate에서 69 μM)에 4℃에서 현탁시켰다. 올레아놀릭산을 농도별로 (0, 100 ㎍/㎖ DMSO) 혼합한 후 37℃에서 45분 동안 암실에서 배양하였으며, fluorescence0activated cell sorting (FACS) 분석을 위해 튜브로 이동시켰다. 세포 주기 분석은 flow cytometer (Becton Dickinson, CA, USA)를 이용하여 수행하였다.
사멸 세포는 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, San Die해, CA, USA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 Annexin V-FITC/PI 이중염색법으로 정량하였다.
HeLa cells을 100 ㎍/㎖ 올레아놀릭산으로 24시간 동안 처리하였다. 그 후 사멸 세포를 Annexin V-FITC 염색을 이용하여 정량하였다 (도 7(b)). 그 결과, 대조 세포의 생존능은 99.83%였으나, 대조군에서 이른 사멸 세포와 늦은 사멸 세포는 오직 0.06%인 것에 반해, 올레아놀릭산 처리 결과 2차원 플레이트 및 3차원 메쉬형 세포칩에서 각각 46.33%, 5.86% 사멸 세포를 나타내었다 (도 7(c)).
유사한 시딩 밀도에서 2차원 및 3차원 배양에서 올레아놀릭산의 효과를 비교했을 때 사멸 세포의 수에 차이점이 관찰되었다. 3차원 모델에서 종종 보고된 항암제에 대한 증가된 화학저항은 세포 증식 및 저산소증의 효과로 인해 크게 설명된다. 이전 연구 결과에 의하면 올레아놀릭산은 사람 골육종계 세포인 MG-63, U2-OS, HOS와 마우스 골육종계 세포인 LM-8에서 세포자멸을 유도하였으며, 독소루비신은 동일한 수의 단일 세포보다 3차원 배양 시스템에서 더 천천히 스페로이드로 들어간다. 이것은 3차원 메쉬형 세포칩에서 암세포는 in vivo 고체 종양에서 종종 관찰되는 화학 저항과 유사한 다세포의 저항을 제공함을 알 수 있다.
실시예 11. Western Blot 분석
세포자멸은 세포 내에서 카스파제 (caspase)와 엔도뉴클레아제 (endonuclease)의 캐스케이드 (cascade)의 순차적인 활동으로 인해 조직되며, 이러한 효소는 원형질막 거품 (plasma membrane blebbing), 세포 결함, 염색사 응축, 분열 등 세포자멸과 관련된 특징적인 변화를 이끈다. HeLa cells에서 올레아놀릭산이 도입된 세포자멸의 분자 메커니즘을 평가하기 위해 세포자멸 관련 단백질 (Bax 및 caspase-3)의 발현을 western blot 분석을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
먼저, 세포를 차가운 용해 완충액 (lysis buffer)에 용해한 후 unbroken 세포와 핵을 제거하기 위해 균질 현탁액을 500× g로 5분 동안 원심분리한 뒤, 세포의 시토졸 부분인 상청액을 13,000× g로 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 막을 anti-Bax, anti-caspase-3, anti-β-actin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) 중 하나의 항체와 함께 배양한 후 2차 항체인 goat anti-rabbit IgG(H+L) HRP conjugate (Zymax, San Francisco, CA, USA)와 함께 배양시켰다. X-ray film (AGFA, Mortsel, Belfium)을 이용하여 화학발광 및 방사능 사진 촬영을 통해 특정 결합을 검출하였다.
그 결과, 올레아놀릭산 처리는 2차원에서 HeLa cells에 대하여 Bax 및 caspase-3의 레벨을 크게 증가시켰으나 3차원 세포 칩에서는 감소하였다 (도 7(d)). 그러나 Bax 및 caspase-3의 발현은 이러한 결과와 달랐으며, FACS 데이터에서 유사한 패턴이 관찰되었다. 올레아놀릭산 처리는 2차원에서 Bax 및 caspase-3 세포 레벨의 증가로 인해 HeLa cells에서 세포자멸을 더욱 강화하였다. Bax는 미토콘드리아성 분열을 통해 세포 죽음을 조절하며 이것은 cytosol에 cytochrome의 방출의 결과를 불러온다.
세포 주기 진행의 억제는 암세포 증식에 한계를 가져오며, 2차원 플레이트 및 3차원 메쉬형 세포칩에서의 세포 주기 진행에서 항암제의 효과를 조사하기 위해서 HeLa cells을 처리하고 유세포분석기 (flow cytometry)를 이용하여 HeLa cells을 분석하였다. 도 8(b)에서 보는 바와 같이, 올레아놀릭산 처리는 3차원 대조 세포와 비교하였을 때 G1기에서 세포의 비율을 상당히 증가시켰으나 S기에서는 세포의 비율이 감소하였다 (P<0.05). 3차원 메쉬형 세포칩에서 G1기의 세포 비율은 2차원 플레이트보다 높았으며, S기에서는 세포 비율이 감소하였다. 상기 결과로부터 3차원 메쉬형 세포칩이 2차원 플레이트 세포 배양보다 항암제에 대한 더 강한 저항을 보이며, 따라서 약물 개발에 중요한 응용성을 갖는다는 것을 확인하였다.
이상, 본 발명을 예시적으로 설명하였으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 사상과 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 아래의 청구범위에 의해서 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술은 본 발명의 권리범위에 포함하는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

  1. 입체적 구조를 가지는 3차원 메쉬형 세포칩으로서,
    셀이 일정한 간격으로 반복하여 복수 개 배치되어 있고,
    상기 복수 개의 상기 셀은 6개의 각 면이 뚫려있는 12개의 기둥으로 이루어진 비어있는 정육면체 형태이며,
    유체가 상기 셀의 각 6개 면 방향으로 통과하는 구조의 메쉬형(그물망) 3차원 구조이고,
    상기 정육면체 형태의 상기 셀의 한 변 길이는 10 ㎛ 내지 15 ㎛이고, 상기 기둥의 두께는 2 ㎛ 내지 3 ㎛이고,
    상기 메쉬형 3차원 구조는 레이저 광원 (laser beam source)으로서 100 fs 이하의 초단펄스 지속시간 (ultrashort pulse duration)을 갖는 티타늄:사파이어 레이저 (Ti:Sapphire laser)를 사용하는 이광자 스테레오리소그래피 (two-photon sterolithography, TPS) 공정을 이용하여 3개의 층으로 제조되어,
    1층이 8×8의 64개 셀로 이루어지고, 상기 1층 상부에 2층이 6×6의 36개 셀로 적층되고, 상기 2층 상부에 3층이 4×4의 16개 셀로 적층되어 총 116개의 셀로 구성된 피라미드 구조이며,
    상기 1층의 레이저 스캐닝 속도는 30 ㎛/s로, 상기 2층 및 3층의 레이저 스캐닝 속도는 10 ㎛/s로 제조된 것을 특징으로 하는 3차원 메쉬형 세포칩
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 3차원 메쉬형 세포칩은 세포 배양에 의한 세포 증식용, 세포 시험용, 약물활성 시험용 또는 약물독성 시험용인 것을 특징으로 하는 3차원 메쉬형 세포칩
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 이광자 스테레오리소그래피 공정은 개구수 1.3인 오일침지 대물렌즈 (oil-immersion objective lens)를 이용하여 상기 레이저를 광경화성 고분자 수지에 집광하고, 상기 광경화성 고분자 수지가 고정된 0.1 nm 분해능을 갖는 XYZ 피에조 스테이지 (XYZ piezoelectric stage)를 이용하여 800 ㎛×800 ㎛×250 ㎛의 제작영역에 대해 x, y 및 z축 방향으로 레이저 스캐닝을 제어하며, 고배율 렌즈가 부착된 CCD 카메라를 이용하여 레이저 초점을 조절하고 실시간으로 제조과정을 모니터링 하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 3차원 메쉬형 세포칩
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 레이저는 작동주파수 (repetition rate) 80 MHz 및 파장 (wavelength) 780 nm를 가지고, 반파장판 (λ/2 plate)과 편광 빔분할기 (polarizing beam splitter)에 의해 레이저 출력이 조절되며, 최대 주파수 1.0 kHz를 갖는 광학셔터 (optical shutter)에 의해 레이저 전원 (on/off)이 제어되는 것을 특징으로 하는 3차원 메쉬형 세포칩
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 광경화성 고분자 수지는 에폭시계 수지인 것을 특징으로 하는 3차원 메쉬형 세포칩
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 에폭시계 수지는 SU-8이며,
    상기 SU-8은 SU-8 2, SU-8 5, SU-8 10, SU-8 25, SU-8 50, SU-8 100, SU-8 2000.5, SU-8 2002, SU-8 2005, SU-8 2007, SU-8 2010, SU-8 2015, SU-8 2100, SU-8 2150, SU-8 2025, SU-8 2035, SU-8 2050, SU-8 2075, SU-8 3005, SU-8 3010, SU-8 3025, SU-8 3035 및 SU-8 3050로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 3차원 메쉬형 세포칩
  11. 삭제
  12. 제 1항에 따른 3차원 메쉬형 세포칩에 1종 이상의 세포 또는 상기 세포 배양액을 주입하고, 이를 배양하여 메쉬형 세포칩의 빈 공간에 상기 세포가 부착 및 배양되는　1 단계;
    상기 1 단계에서 배양된 세포의 손상, 사멸, 증식, 활성 또는 세포간 상호작용을 분석하는 2 단계;를 포함하는 3차원 메쉬형 세포칩을 이용한 세포분석 방법
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 세포 또는 세포 배양액은 질환세포 또는 질환세포의 배양액을 주입하여 배양하는 것을 특징으로 하는 3차원 메쉬형 세포칩을 이용한 세포분석 방법
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