CN105906835A - 一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法，其特征在于所述生物材料具有梯度改变的孔洞，可诱导细胞由无序到有序的排列。该生物材料的制备方法如下：在无机胶体晶体的模板上涂覆聚合物溶液，固定后去除模板，按顺序对聚合物簿膜的不同位置进行同一方向上不同程度的拉伸，得到孔洞梯度改变的生物材料。本发明的方法操作简便，制备出的孔洞梯度改变的生物材料可诱导细胞由无序到有序渐变的排列，模拟肌腱‑骨组织连接，对于组织再生尤其是肌腱‑骨组织连接的再生与修复具有潜在的应用前景和现实意义。

Description

一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法
技术领域
本发明属于生物材料及组织工程技术领域，具体涉及一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法。
背景技术
肌腱是连接肌肉与骨组织的过渡组织，在关节活动中担任重要的力量传递作用。肌腱关节的损伤尤其是肩关节及脚踝关节的损伤是机体组织损伤中最易发生的损伤。由于肌肉-骨组织的过渡部分结构复杂，因此该部分的再生修复是组织工程中的难题。
目前已经制备出包含各种细胞外基质的生物材料，同时也制备出了许多用来诱导细胞定向排列和分化的生物材料，如PLGA的纳米纤维等。然而，几乎没有一种基底材料可以同时实现细胞从无序到有序的渐变排列，因此无法满足组织工程尤其是骨连接组织工程等领域的需要。
为了模拟肌腱-骨组织连接的复杂结构，需要一种能够实现细胞在同一基底上从无序到有序渐变排列的方法。本发明因此而来，在无机胶体晶体的模板上涂覆聚合物溶液，固定后去除模板，按顺序对聚合物簿膜的不同位置进行同一方向上不同程度的拉伸，得到孔洞梯度改变的生物材料。本发明的方法操作简便，制备出的孔洞梯度改变的生物材料可诱导细胞由无序到有序渐变的排列，模拟肌腱-骨组织连接。
发明内容
本发明公开了一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法， 制备出的生物材料具有良好的生物相容性，同时可以诱导细胞从无序到有序的渐变排列，对于组织再生尤其是肌腱-骨组织连接的再生与修复具有潜在的应用前景和现实意义。
为了实现上述发明目的，本发明提供的技术方案如下：
在无机胶体晶体的模板上涂覆聚合物溶液，固定后去除模板，按顺序对聚合物簿膜的不同位置进行同一方向上不同程度的拉伸，得到孔洞梯度改变的生物材料。
本发明提供的一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
首先，无机胶体晶体薄膜的制备：将清洗后的载玻片垂直放入盛有无机胶体晶体纳米粒子单分散溶液的容器中，恒温恒湿（温度为25℃和湿度为40%）环境下静置数天，得到表面具有无机胶体晶体微球阵列的模板。
其次，反结构生物材料的制备：将获得的模板水平放置，在表面涂覆聚合物溶液，使其充分渗透胶体晶体微球阵列间隙，待溶液挥发干燥后，去除模板，得到具有纳米孔洞的聚合物薄膜。
再次，反结构生物材料的渐变拉伸：将获得的聚合物薄膜两端用夹具固定，一半垂直放入热水中，另一半保留在水外。对水浴环境中的聚合物薄膜进行匀速数倍拉伸后，取出冷却固定。对获得的薄膜重复此步骤数次后，得到孔洞拉伸梯度改变薄膜。
最后，孔洞梯度改变的生物材料的表面修饰：对获得的孔洞梯度改变的聚合物薄膜进行表面修饰，得到良好生物相容性的孔洞梯度改变的生物材料。
优选的，所述的一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法，其特征在于：所述的无机胶体晶体材料可以为二氧化硅胶体晶体，聚苯乙烯胶体晶体等。粒径大小为500nm。
优选的，所述的一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法，其特征在于：聚合物可以为PS，PMMA，PLGA。
优选的，所述的一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法，其特征在于：最终孔洞拉伸倍数可以为2倍-6倍。
优选的，所述的一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法，其特征在于：步表面修饰可以为胶原蛋白修饰，壳聚糖修饰，海藻酸钙凝胶灌注。
本发明通过以对聚合物簿膜的不同位置进行同一方向上不同程度的拉伸，得到孔洞梯度改变的生物材料。其特征在于所述材料为孔洞梯度改变的生物材料；可诱导细胞的无序-有序渐变排列，模拟肌腱-骨组织连接。
本发明的有益效果是：本发明公开了一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法，按顺序对簿膜的不同位置进行不同程度的拉伸，得到同一块薄膜上孔洞梯度改变的生物材料，可以诱导细胞从无序到有序渐变的排列，对于组织再生尤其是肌腱-骨组织连接的再生与修复具有潜在的应用前景和现实意义。
附图说明
图1、为一种孔洞梯度改变的生物材料制备方法流程图；其中1为在制备出的无机胶体晶体微阵列上灌注聚合物溶液；2为制备出的反结构生物材料；3为生物材料的孔洞梯度拉伸；
图2、观察成纤维细胞在渐变拉伸纳米多孔材料上的排列定向情况结果；图中，图a为细胞在未拉伸多孔材料表面的排列情况，图b为细胞在2倍拉伸多孔材料表面的排列情况，图c为细胞在6倍拉伸多孔材料表面的排列情况。
具体实施方式
应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1 孔洞梯度改变的生物材料的制备
1. 二氧化硅胶体晶体薄膜的制备：
将清洗后的载玻片垂直放入盛有粒径500nm的二氧化硅纳米粒子单分散乙醇溶液的容器中，温度25℃湿度40%的环境下静置5天左右，得到表面具有二氧化硅胶体晶体微球阵列的模板。
2. 反蛋白石结构纳米多孔生物材料的制备：
将步骤1获得的模板水平放置，在表面涂覆质量分数为30%（体积百分比）的聚苯乙烯甲苯溶液，使其充分渗透二氧化硅纳米微球阵列间隙，待溶液挥发干燥后，用4%（体积百分比）氢氟酸腐蚀模板，使聚苯乙烯薄膜从载玻片上分离，得到具有纳米多孔的聚苯乙烯薄膜。
3. 纳米多孔生物材料的部分拉伸：
将步骤2获得的聚苯乙烯薄膜的一部分垂直放入70℃的纯水中，另外一部分保留在水浴外。对水浴环境中的聚苯乙烯薄膜进行匀速2倍拉伸后，迅速放到10℃纯水中固定1分钟。
4. 纳米多孔生物材料的拉伸部分的再拉伸：
将步骤3获得的聚苯乙烯薄膜的拉伸部分的一半垂直放入70℃的纯水中，另外一半保留在水浴外。对水浴环境中的聚苯乙烯薄膜进行匀速3倍拉伸后，迅速放到10℃纯水中固定1分钟。
实施例2 孔洞梯度改变的生物材料上的细胞培养：
1. 生物材料的I型胶原蛋白灌注：
将实例1获得的拉伸渐变的聚苯乙烯薄膜紫外灭菌消毒后，浸泡在I型胶原蛋白中，37℃培养箱中放置3小时后取出，用PBS缓冲液冲洗薄膜，得到结构为“无拉伸-2倍拉伸-6倍拉伸”的富含胶原蛋白的模拟肌腱-骨组织连接的生物材料。
2. 成骨细胞的接种:
选取大鼠肌腱成纤维细胞，用培养基稀释成浓度为2×105/ml的细胞悬液，接种到步骤1获得的梯度孔洞薄膜上。
3. 细胞排列的荧光染色观察
细胞培养24h后，用Calcein-AM荧光染料对步骤2中的细胞进行染色，观察成纤维细胞在渐变拉伸纳米多孔材料上的排列定向情况。图2为观察结果。图中，图（a）为细胞在未拉伸多孔材料表面的排列情况，图（b）为细胞在2倍拉伸多孔材料表面的排列情况，图（c）为细胞在6倍拉伸多孔材料表面的排列情况。可以看到，细胞在渐变拉伸纳米多孔材料表面为无序-有序的渐变排列。图中标尺为400μm。
实施例3 孔洞梯度改变的生物材料的生物相容性测试：
1.孔洞梯度改变的生物材料的细胞毒性测试：
采用MTT细胞毒性测试法，对生物材料基底上和普通培养皿上培养的成纤维细胞进行细胞毒性测试来观察生物材料的生物毒性。测试结果显示，生长于孔洞梯度改变的生物材料基底上与普通培养皿上的细胞活力无统计性差异。
2.孔洞梯度改变的生物材料的细胞活力测试：
用Calcein-AM和碘化丙啶（PI）溶液分别对生物材料上的细胞进行荧光染色。Calcein-AM可以对活细胞染色，PI溶液可以对死细胞染色，在荧光显微镜下分别显示为绿色和红色。通过对细胞进行染色后，用荧光显微镜同时观察生物材料基底上活细胞和死细胞的数目。结果显示，生物材料基底上几乎全为绿色荧光的活细胞，生物材料基底上的成纤维细胞活力旺盛。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法，其特征在于所述的生物材料通过如下方法制得：在无机胶体晶体的模板上涂覆聚合物溶液，固定后去除模板，按顺序对聚合物簿膜的不同位置进行同一方向上不同程度的拉伸，得到孔洞梯度改变的生物材料。
2.根据权利要求1所述的一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）无机胶体晶体薄膜的制备：
将清洗后的载玻片垂直放入盛有无机胶体晶体纳米粒子单分散溶液的容器中，温度为25℃和湿度为40%的环境下静置数天，得到表面具有无机胶体晶体微球阵列的模板；
（2）反结构生物材料的制备：
将步骤（1）获得的模板水平放置，在表面涂覆聚合物溶液，使其充分渗透胶体晶体微球阵列间隙，待溶液挥发干燥后，去除模板，得到具有纳米孔洞的聚合物薄膜；
（3）反结构生物材料的渐变拉伸：
将步骤（2）获得的聚合物薄膜两端用夹具固定，一半垂直放入热水中，另一半保留在水外，
对水浴环境中的聚合物薄膜进行匀速数倍拉伸后，取出冷却固定，
对获得的薄膜重复此步骤数次后，得到孔洞拉伸梯度改变薄膜；
（4）孔洞梯度改变的生物材料的表面修饰
对步骤（3）中获得的孔洞梯度改变的聚合物薄进行表面修饰，得到生物相容性良好的孔洞梯度改变的生物材料。
3.根据权利要求2所述的一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，无机胶体晶体材料为二氧化硅胶体晶体，聚苯乙烯胶体晶体；所述的粒径大小为500nm。
4.根据权利要求2所述的一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，聚合物为PS、PMMA或PLGA。
5.根据权利要求2所述的一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，孔洞拉伸最终倍数为2倍-6倍。
6.根据权利要求2所述的一种孔洞梯度改变的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，表面修饰为胶原蛋白修饰、壳聚糖修饰或海藻酸钙凝胶灌注。
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