CN112245661B - 一种tbj组织修复薄膜型支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种TBJ组织修复薄膜型支架及其制备方法。TBJ组织修复薄膜型支架包括有梯度变化的聚合物/陶瓷复合材料区域、聚合物区域和聚合物/陶瓷复合材料区域三个层次区域结构，其制备方法是先通过共混和热压成型得到聚合物薄膜和聚合物/陶瓷复合薄膜，将两种薄膜拼接、热压融合，再通过沿连接线界面的垂直方向进行轴向机械拉伸，得到薄膜型TBJ支架，该支架材料在设计上仿生TBJ组织具有材料成分、结构、机械性能变化的多重梯度特征，且兼具力学增强和离子与力学信号复合调控作用，是一种具备高度仿生组织特征和优异力学性能的腱骨修复支架材料，可以应用于腱骨连接点细胞及胞外基质的再生诱导和功能重建。

Description

一种TBJ组织修复薄膜型支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物材料，具体涉及一种肌腱-骨连接点(Tendon-to-bonejunction,TBJ)修复支架，还涉及一种采用离子掺杂和机械拉制联合构建的可以帮助损伤肌腱TBJ组织修复和功能再生、具有力学增强、多重梯度仿生特征的生物可适配性材料支架的构建方法，属于医用生物材料技术领域。
背景技术
肌腱损伤是一种常见肌骨骼系统连接部位整形外科疾病，主要表现为TBJ急性组织断裂和慢性病变退化的结构损伤。在人体中，TBJ是一种连接肌腱与骨的过渡型多相组织，包括纤维结缔组织、非钙化纤维软骨、钙化纤维软骨和骨。TBJ具有典型的连续梯度结构特征，其成分主要为胶原蛋白、CaP结晶等细胞外基质、以及多细胞组分。显微特征分析表明TBJ内的胶原纤维线性排列程度、细胞形态取向化程度沿肌腱向骨组织过渡方向逐渐降低，而CaP结晶的含量逐渐提高。这种梯度变化的组分和结构特征，使得TBJ能够在约0.1～1mm的极短距离内完成机械性能的迅速提高(包括杨氏模量和抗压强度等)，有效地分散软-硬组织的界面应力，增强肌腱-骨结合强度，实现高强度载荷传递。但是，复杂的组织成分、结构、以及过度的应力集中使得TBJ的功能修复和再生治疗难度增大。当前，临床上最常用的治疗方法为手术直接缝合，但TBJ不能自我再生，患者在术后愈合往往仅能产生力学性能较差的瘢痕组织。
设计和构建具有仿生TBJ天然的力学性能和组织特征的修复材料将为以组织工程为基础的肌腱再生治疗提供有效手段。现有研究已经证明，材料成分的梯度变化以及由成分变化而带来的材料硬度等力学梯度变化都能够被细胞所感应，进而影响其基因表达和功能分化；此外受接触引导机制的影响，当材料表面的梯度取向性结构分别在纳米尺度下接近粘着斑大小和在微米尺度下接近细胞尺寸时，细胞也可识别此特殊结构，分化表达相应组织特异性基因，自发调整细胞水平上的形貌发生和亚细胞水平上的细胞粘附复合体的形成、以及细胞质膜、骨架排列和细胞核的形貌。近年来，聚合物/陶瓷复合材料(Polymer-ceramic composites,PCC)因其独特的材料性能和良好的生物相容性，被广泛用于肌骨骼组织工程和再生医学领域(Wegst,U.G.K.,et al.Bioinspired structuralmaterials.Nature Materials.2015,14(1):23-36.)。其中，CaP结晶可诱导干细胞发生成骨分化，该CaP的梯度分布也可引发材料硬度的梯度变化，进而刺激干细胞相应分化成为特定的肌腱、软骨和骨组织细胞(Liu,W.Y.,et al.Nanofiber Scaffolds with Gradientsin Mineral Content for Spatial Control of Osteogenesis.Acs Applied Materials&Interfaces.2014,6(4):2842-2849.)。与此同时，材料的梯度取向性结构也可诱导细胞表达分化基因，并引导细胞与细胞外基质形成渐进的延展形貌和线性排列。
当前，医用梯度腱骨连接支架材料制备方法复杂，并且存在梯度可控性差、力学性能不足等问题。国际上，Calejo等利用湿纺-钩编技术制备得到梯度界面材料，很大程度上模仿了天然腱骨的结构，然而其对于梯度区间长度的控制依赖于钩编过程，难以在类似天然腱骨的极短距离(约1～2mm)内实现软硬组织过渡；同时，所制备材料尺寸小、操作难度高，难以满足临床的应用要求(I.Calejo,R.Costa-Almeida,R.L.Reis,M.E.Gomes.ATextile Platform Using Continuous Aligned and Textured CompositeMicrofibers to Engineer Tendon-to-Bone Interface Gradient Scaffolds.AdvancedHealthcare Materials.2019,8(15)(2019)e1900200.)；Samavedi等利用静电纺丝结合可调滚筒收集技术制备出纤维型梯度腱骨材料，其形貌结构表现良好，但杨氏模量(仅为0.8～2MPa)等机械性能不足，远达不到天然腱骨组织几百MPa模量的力学性能要求(S.Samavedi,C.Olsen Horton,S.A.Guelcher,A.S.Goldstein,A.R.Whittington.Fabrication of a model continuously graded co-electrospunmesh for regeneration of the ligament-bone interface.Acta Biomaterialia.2011,7(12):4131-4138.)；在国内，Teng等利用模板填充法结合UV光交联技术获得PGG梯度薄膜，其力学性能较纤维型梯度材料明显提高，但应用受制于复杂的制备流程和苛刻的制备条件(如温度、光照条件、及反应时间)(H.Teng,J.Li,Z.Hou,X.Yan,L.Han,J.Xu,T.Li.Preparation of Compositional Gradient Polymeric Films Based on GradientMesh Template.Polymers.2018,10(6):677)。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是在于提供一种TBJ组织修复薄膜型支架材料，该TBJ组织修复薄膜型支架在设计上仿生TBJ组织具有材料成分、结构、机械性能变化的多重梯度特征，且兼具力学增强和离子与力学信号复合调控作用，是一种具备高度仿生组织特征和优异力学性能的TBJ修复支架材料，可以应用于腱骨连接点细胞及胞外基质的再生诱导和功能重建，为腱骨组织工程在临床上的应用提供合适的修复材料，有望在临床上改善TBJ的再生治疗效果。
本发明的第二个目的是在于提供一种操作简单的制备TBJ组织修复薄膜型支架材料的方法，该方法通过离子掺杂和机械拉制相结合，以制备具备高度仿生组织特征和优异力学性能的腱骨修复支架材料，解决了现有TBJ支架梯度特征连续性差、力学性能不足、制备工艺复杂，无法满足腱骨修复支架材料个性化设计和可重复制造的需求，导致临床治疗效果不佳的难题。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种TBJ组织修复薄膜型支架，其包括三个层次区域结构：中间层为具有梯度变化的聚合物/陶瓷复合材料区域，中间层两侧分别为均一的聚合物区域和均一的聚合物/陶瓷复合材料区域。
作为一个优选的方案，所述均一的聚合物区域由高度取向排列的微纳米尺度沟槽-山脊结构组成。
作为一个优选的方案，所述梯度变化的聚合物/陶瓷复合材料区域中表面沟槽-山脊结构及元素成分呈现梯度线性变化。所述梯度线性变化的元素分布，其中促成骨分化的元素逐渐递增。所述梯度线性变化的沟槽-山脊结构由单轴机械拉伸形成，使该区域具有梯度线性变化的力学性能，包括硬度和杨氏模量。
作为一个优选的方案，所述均一的聚合物/陶瓷复合材料区域由各向同性表面构成或者各向异性沟槽-山脊结构构成。
作为一个优选的方案，所述高度取向排列的微纳米尺度沟槽-山脊结构中沟槽结构相互连通，而山脊结构相互分隔，高度和长度分别在50～2000nm和50～500μm范围内，且山脊表面具有高度线性排列的纳米沟槽-山脊结构(方向与机械拉伸方向平行)。
作为一个优选的方案，所述梯度变化的聚合物/陶瓷复合材料区域中沟槽-山脊结构的山脊长度、高度、数量沿均一的聚合物区域向均一的聚合物/陶瓷复合材料区域递减。
作为一个优选的方案，所述均一的聚合物区域由聚己内酯及其衍生物、聚乳酸及其衍生物、胶原及其衍生物、聚乙醇酸及其衍生物中的至少一种。这些聚合物材料为可拉伸聚合物材料，同时具有热塑性、生物相容性、可降解性等特点。
作为一个优选的方案，所述均一的聚合物/陶瓷复合材料区域由聚合物与CaP微纳米颗粒按质量百分比50～70％:30～50％构成，其中，聚合物为聚己内酯及其衍生物、聚乳酸及其衍生物、胶原及其衍生物、聚乙醇酸及其衍生物中的至少一种。
作为一个优选的方案，所述梯度变化的聚合物/陶瓷复合材料区域中CaP微纳米颗粒由聚合物区域一侧至均一的聚合物/陶瓷复合材料区域一侧梯度增加。
作为一个优选的方案，所述CaP微纳米颗粒为陶瓷、金属陶瓷以及金属与陶瓷复合材料。CaP微纳米颗粒为具有递送生物活性离子的生物可降解无机材料。
作为一个优选的方案，所述CaP微纳米颗粒中掺杂有硅、镁、钴、铁、锶、钽、锌、银、铜中至少一种。
作为一个优选的方案，所述CaP微纳米颗粒中的粒径尺寸小于50μm，陶瓷成分选自磷酸钙及其衍生物、羟基磷灰石及其衍生物中至少一种，钙/磷摩尔比为1.6～1.7。
本发明还提供了一种TBJ组织修复薄膜型支架的制备方法，其包括以下步骤：
1)将聚合物颗粒依次通过双辊开炼、热压成型得到聚合物薄膜；
2)将聚合物颗粒与CaP微纳米颗粒共混复合后，依次通过双辊开炼、过筛、热压成型得到聚合物/陶瓷复合材料薄膜；
3)将聚合物薄膜与聚合物/陶瓷复合材料薄膜通过热压融合，拼接成TBJ支架前体；
4)将TBJ支架前体沿垂直于拼接线轴向拉伸，使应变颈缩刚好越过拼接区域或者扩展至聚合物/陶瓷复合材料区域，即得。
作为一个优选的方案，步骤1)中，双辊开炼的工艺参数为：双辊温度高于聚合物熔点5～15℃、转速1～3rpm、开炼时间0.5～1.5h。
作为一个优选的方案，步骤1)中，热压成型的工艺参数为：预加压强4～6MPa、温度高于聚合物熔点5～15℃、保压50～70min，室温冷却8～16h。
作为一个优选的方案，步骤2)中，聚合物颗粒在双辊开炼条件下处于熔融状态，双辊开炼的工艺参数为：双辊温度高于聚合物熔点5～15℃、转速1～3rpm、开炼时间0.4～0.6h；再将CaP微纳米颗粒掺杂加入熔融聚合物，开炼共混50～70min。
作为一个优选的方案，步骤2)中，聚合物/陶瓷复合材料热压成型的工艺参数为：预加压强4～6MPa、温度高于聚合物熔点5～15℃、保压50～70min，室温冷却8～16h。
作为一个优选的方案，步骤3)中，聚合物薄膜与聚合物/陶瓷复合材料薄膜的拼接工艺参数为：280～320℃点焊接聚合物薄膜与聚合物/陶瓷复合材料薄膜，加压80～120N，加热60～100℃保持30～90min，随后进行保压冷却，冷却方式为自然冷却20～30min，或者置于空气中冷却3～5min，或者置于冰水混合物中快速冷却1～2min。
作为一个优选的方案，步骤4)中，轴向拉伸的工艺参数为：拉伸温度不高于聚合物熔点、预设应变值200～1000％、应变速率5～500mm/min。
本发明提供的一种采用纳米陶瓷颗粒掺杂和结构几何各向异性协同功能化的TBJ组织修复薄膜型支架，包括三个层次区域结构(如图1所示)：
均一聚合物区域(P区)：由高度取向排列的微纳米尺度沟槽-山脊结构组成，来源于可拉伸聚合物材料(100wt％)，提供肌腱细胞增殖、成肌腱分化及胞外基质生成的微环境刺激；
梯度变化的聚合物/陶瓷复合材料区域(G区)：由梯度线性变化的表面沟槽-山脊结构、元素成分构成，来源于可拉伸聚合物材料与CaP微纳米颗粒复合物，提供多细胞增殖、梯度变化的组织分化(包括成肌腱样、软骨样和骨样分化成)及胞外基质生成的微环境刺激；
均一聚合物/陶瓷复合材料区域(C区)：由各向同性的PCC表面构成或者各向异性沟槽-山脊的PCC表面构成，来源于可拉伸聚合物材料(50～70wt％)与CaP微纳米颗粒复合物(30～50wt％)，提供细胞增殖、成骨分化及胞外基质生成的微环境刺激。
本发明提供的TBJ支架的制备方法，包括如下具体步骤：
(1)所选聚合物颗粒依次通过双辊开炼、热压成型得到均匀聚合物薄膜，作为TBJ支架均一聚合物区域的前体材料；聚合物双辊开炼的工艺参数为：双辊温度高于聚合物熔点10℃、转速1～3rpm、开炼时间约1h，收集熔融聚合物材料并室温冷却制成约5g/个的圆盘状样品；聚合物热压成型的工艺参数为：预加压强5MPa、温度高于聚合物熔点10℃、保压60min，室温冷却约12h获得均匀聚合物薄膜。
(2)所选聚合物颗粒与CaP微纳米颗粒的共混复合，依次通过双辊开炼、过筛、热压成型得到均匀复合聚合物薄膜，作为TBJ支架均一PCC区域的前体材料；聚合物颗粒在双辊开炼条件下处于熔融状态(温度高于聚合物熔点10℃、转速1～3rpm、开炼时间30min)，CaP微纳米颗粒通过网筛掺杂加入熔融聚合物，质量分数为10～50wt％，开炼共混60min使CaP微纳米颗粒分散均一，收集PCC复合材料并室温冷却制成约5g/个的圆盘状样品；PCC复合材料热压成型的工艺参数为：预加压强5MPa、温度高于聚合物熔点10℃、保压60min，室温冷却约12h得到均匀聚合物薄膜。
(3)将步骤(1)和(2)中所得两种前体材料通过热压融合，拼接成TBJ支架前体；P区与C区拼接的工艺参数为：300℃点焊接P区与C区，加压约100N，加热60～100℃保持30～90min，随后进行保压冷却，冷却方式分别为材料随加热设备自然冷却20～30min，或者将材料置于空气中冷却3～5min，或者将材料置于冰水混合物中快速冷却1～2min中的一种。
(4)将TBJ支架前体沿垂直于拼接线单轴拉伸，轴向拉伸的工艺参数为：拉伸温度不高于聚合物熔点、预设应变值200～1000％、应变速率5～500mm/min，使应变颈缩刚好越过拼接区域或者扩展至PCC区域，以得到连续多重梯度特征、力学增强和制备工艺简单的TBJ支架；梯度区域两端分别为各向异性的聚合物区和各向同性或者各向异性的PCC区域。
本发明具有多重梯度特征、力学增强的仿生TBJ薄膜型支架及其构建方法：首先通过物理共混和热压成型工艺得到均匀的聚合物薄膜、聚合物/陶瓷复合薄膜；随后采用点焊接方法制备出聚合物薄膜与复合薄膜的预拼接体，进而进行热压融合得到拼接体；最后，通过沿连接线界面的垂直方向进行轴向机械拉伸，得到薄膜型TBJ支架。上述TBJ支架的P区功能设计为引导肌腱组织基质成分和高度线性排列结构再生，基于聚合物材料轴向机械拉伸形成的独特多级微纳沟槽-山脊结构；上述TBJ支架的C区功能设计为引导骨组织基质成分和结构再生，基于轴向机械拉伸或未经历轴向机械拉伸的聚合物/陶瓷复合材料实现；上述TBJ支架的G区功能设计为引导腱骨过渡组织梯度基质成分和结构再生，基于轴向机械拉伸的梯度聚合物/陶瓷复合材料实现。
本发明具有多重梯度特征、力学增强的仿生TBJ薄膜型支架的特色功能实现方法：第一，梯度各向异性表面沟槽-山脊结构通过在接近熔点时单轴机械拉伸使半结晶聚合物去结晶和再结晶获得，其中结构梯度的形成由聚合物材料发生的应变程度和陶瓷颗粒掺杂量决定；第二，梯度生物活性元素分布通过聚合物组分延展获得，受聚合物应变伸长程度影响；第三，梯度力学性能通过聚合物组分梯度应变引起的应变增强、陶瓷组分梯度空间分布引起的颗粒增强获得，其中主要表现为硬度和杨氏模量；第四，TBJ支架的增强力学性能通过拉伸引起的应变增强效应、陶瓷材料的颗粒增强效应、拉伸引起的聚合物/陶瓷材料界面分离的缺口增强效应、以及陶瓷颗粒的取向排列效应获得；第五，TBJ支架的生物调节功能通过具有接触引导作用的沟槽-山脊结构和具有生物活性离子递送作用的可降解陶瓷颗粒获得。
与现有TBJ支架相比，本发明技术方案具有以下优点：
1.在TBJ支架材料的设计上，本发明采用离子、几何形貌和材料力学性能信号相结合的方法，使其具备支持、刺激与诱导仿生天然TBJ组织损伤修复和再生的关键生理性功能。本发明提出的聚合物基体材料具有良好的生物相容性和生物可降解性，在与离子掺杂的生物陶瓷微纳米颗粒相结合后，又可被赋予与天然TBJ-ECM相适配的增强的力学性能，丰富的生物活性以及抗菌性能，从而协同提升支架与腱骨组织的可适配性。磷酸钙生物陶瓷微纳米颗粒释放的钙离子、磷酸根离子等可诱导骨组织成分再生，其中掺杂的其他离子的释放也可辅助促进骨组织的生成并具有抗菌效果，抑制细菌增殖对组织修复生长的竞争作用。取向性沟槽-山脊结构递送的几何形貌信号可以通过引导类肌腱细胞线性排列形成与天然肌腱组织近似的有序结构，无取向性多孔结构或孔连接结构可以通过引导骨细胞无序排列形成与天然骨组织类似的各向同性结构。
2.在TBJ支架材料的构建方法上，本发明采用双辊研磨和热压成型技术相结合来获取质地均匀、厚度薄、大面积的聚合物前体膜，通过预拼接与二次热压连接技术获取区域融合的复合聚合物薄膜。传统静电纺丝和冷冻干燥技术制备梯度支架需要与特殊收集装置或后续制备技术(如编织工艺或温控工艺等)相结合，得到的支架不仅缺乏与天然TBJ-ECM相适配的力学性能，更因其工艺流程复杂而限制了大规模生产与应用。本发明提出的机械单向拉制技术借助薄膜在融合区域生物陶瓷微纳米颗粒的断崖式成分变化而导致的材料硬度变化，使得拉伸从肌腱区域至骨骼区域呈渐变式、竞争式发展，从而实现支架材料成分，支架表面微尺度取向性结构和支架力学性能的多维梯度构建。同时，应变增强原理的单向拉制能协同纳米掺杂显著提高材料力学性能，达到与天然TBJ-ECM的硬度和杨氏模量相匹配水准。
3.本发明所获得的TBJ支架材料微观结构和力学性能可调控。采用对拉制温度、拉伸比和拉伸速率的控制，支架材料的G区区间长度及力学性能可调，因此可针对不同患者、不同病损程度进行个性化设计。TBJ支架材料的拉伸过程耗时短(约3～5min)，允许平行制备，其制备效率高，支架材料可重复性强。
综上所述，本发明基于纳米掺杂和机械单向拉制协同作用提出生物可适配多维梯度型肌腱-骨连接点支架的构建方法，所获得的TBJ支架具有诱导腱骨组织修复再生和引导结构重建、功能恢复作用。本发明多维梯度TBJ支架的构建方法中机械单向拉制不仅调控了材料成分，硬度及取向性结构分布，同时增强了支架整体的力学性能以适配天然组织特征。本发明所述的医用TBJ支架的构建工艺流程简单，支架成分、结构和性能可控，具有仿生天然腱骨组织关键性生理环境，可用于组织体外预培养后移植入体内对应部位辅助受损TBJ修复再生和功能重建，并在一定时间内完成体内自我降解吸收或排出，具有较高的潜在临床应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中最终所得梯度支架材料的示意图，其中(a)为P区、G区和C区整体模型；(b)为G区梯度特征特写。
图2为本发明实施例1中的热压薄膜，其中(a)为PCL薄膜及光学显微镜照片；(b)为PCL/Ag,Si-nHA薄膜及光学显微镜照片。
图3为本发明实施例1和对比例1中通过热压连接获得的断面薄膜，其中(a)为热压连接前薄膜；(b)为连接后薄膜整体宏观照片；(c)为断面区光学显微照片；(d)为断面区电子扫描显微镜照片。
图4为实施例1中单轴拉制得到的梯度薄膜支架材料，其中(a)为整体宏观照片；(b)为梯度区光学显微镜照片；(c)为梯度区电子扫描显微镜照片。
图5为实施例2、实施例3中单轴机械拉制得到的薄膜支架，其中(a)为实施例2中复合薄膜支架的宏观图和光学显微图；(b)为实施例3中复合薄膜支架的宏观图和光学显微图。
图6为对比例2、对比例3中单轴机械拉制得到的薄膜支架，其中(a)为对比例2中PCL薄膜支架的宏观图和光学显微图；(b)为对比例3中PCL/AgSi-nHA薄膜支架的宏观图和光学显微图。
图7为针对实施例1、实施例2和实施例3中最终所获梯度薄膜支架材料所进行的单轴拉伸力学测试的应力-应变曲线。
图8为针对实施例2、对比例1、对比例2和对比例3中最终所获薄膜支架材料所进行的单轴拉伸力学测试的应力-应变曲线。
图9为针对实施例2中所获热压连接后薄膜进行的三区域支架对比力学测试，其中(a)为三区域力学测试流程设计图，(b)为三区域力学测试所得应力-应变曲线。
具体实施方式
为了更好地理解本发明说明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
在温度为室温(21℃)、应变速率为10mm/min、应变为600％的条件下，一种基于纳米掺杂和机械单向拉制协同构建的生物可适配性梯度肌腱-骨连接点支架通过如下方法制备得到：
第一步：复合生物陶瓷微纳米颗粒的制备
按设计将0.6mol/L的Ca(OH)2溶液和0.03mol/L的AgNO3溶液混合后逐滴加入到0.40mol/L的H3PO4和0.06mol/L的SiC8H20O4的混合溶液中，通过浓氨水调节溶液pH值为10.5，保持时间为3h，反应后获得悬浊液在室温静置冷却12h，经固液分离、洗涤、干燥后研磨成粉末，在氮气保护气氛中于300℃下热处理4h得到Si和Ag掺杂的生物陶瓷微纳米颗粒，其中Si可诱导并促进组织成骨过程，Ag在组织形成过程中具有良好抗菌效果。
第二步：肌腱区域前体聚合物膜的制备
按设计将PCL颗粒添加至双辊研磨机中，设置研磨机参数为双辊温度90℃，双辊速率1.8rpm。机械研磨2小时后，收集所得PCL并切成圆盘形状(每个圆盘约5g)，随后将其冷却至24℃完全固化得到PCL圆片。将一圆片放入液压平板硫化机，设置压力800MPa，下板加热80℃、加热时间30min，随后上板加热70℃、加热时间30min。加热完毕自动加压，设置保压60min，最后等待自然冷却10～12h，取出PCL薄膜。
第三步：骨骼区域前体复合聚合物膜的制备
按设计将PCL颗粒添加至双辊研磨机中，设置研磨机参数为双辊温度90℃，双辊速率1.8rpm。待PCL完全熔化后，将AgSi-nHA颗粒(10wt％)添加到双辊研磨机中，与PCL机械研磨2小时。收集所得PCL/AgSi-nHA复合材料并切成圆盘形状(每个圆盘约5g)，随后将其冷却至24℃完全固化得到PCL/AgSi-nHA圆片。将圆片置于液压平板硫化机中，设置下板加热80℃，加热时间30min。结束后手动微调上升下板，设置上板加热70℃，加热时间30min。加热完毕自动加压，设置保压60min，随后等待自然冷却10～12h，取出PCL/AgSi-nHA薄膜。
第四步：肌腱-骨骼区域多维梯度的制备
按设计各取PCL和PCL/AgSi-nHA薄膜2×3cm2转移至不锈钢板上，将两矩形薄膜2cm一侧紧密拼接，设置电烙铁温度305℃，在拼接缝上下两端点向中心进行1.5mm点焊，正反面共计点焊2次。于热烘胶机平台上从底往上依次叠放不锈钢片、预拼接薄膜、不锈钢板，并自上往下施加压力75kPa，设置热烘胶机参数为加热温度80℃，时间60min。结束后将上下板片与薄膜共同转移至室温桌面，继续加压75kPa保持5min冷却后取出得到连接后薄膜(长度不小于6cm，宽度不小于2cm，面积不小于12cm2)。
沿长度方向居中取连接后薄膜6×0.5cm2，固定拉伸应变范围为连接区域上下0.5cm，将预处理后的复合薄膜在室温条件下(21℃)进行机械单向拉制，设置参数为应变速率10mm/min，预设应变值600％。释放拉力后取出过渡区域上下0.5cm内薄膜，最终获得应变增强的多维梯度薄膜支架。
薄膜支架材料呈现出颜色的均匀梯度变化：在P区呈现透明状，在G区过渡发展成为白色半透明状，在C区发展为白色不透明状。支架材料的宽度约为3.5mm、整体长度约为51mm，其中G区区间长度不超过1mm。
实施例2
在温度接近PCL熔点(55℃)、应变速率为10mm/min、应变为600％的条件下，一种基于纳米掺杂和机械单向拉制协同构建的生物可适配性梯度肌腱-骨连接点支架通过如下方法制备得到。
第一步：复合生物陶瓷微纳米颗粒的制备
按设计将0.6mol/L的Ca(OH)2溶液和0.03mol/L的AgNO3溶液混合后逐滴加入到0.40mol/L的H3PO4和0.06mol/L的SiC8H20O4的混合溶液中，通过浓氨水调节溶液pH值为10.5，保持时间为3h，反应后获得悬浊液在室温静置冷却12h，经固液分离、洗涤、干燥后研磨成粉末，在氮气保护气氛中于300℃下热处理4h得到Si和Ag掺杂的生物陶瓷微纳米颗粒，其中Si可诱导并促进组织成骨过程，Ag在组织形成过程中具有良好抗菌效果。
第二步：肌腱区域前体聚合物膜的制备
按设计将PCL颗粒添加至双辊研磨机中，设置研磨机参数为双辊温度90℃，双辊速率1.8rpm。机械研磨2小时后，收集所得PCL并切成圆盘形状(每个圆盘约5g)，随后将其冷却至24℃完全固化得到PCL圆片。将一圆片放入液压平板硫化机，设置压力800MPa，下板加热80℃、加热时间30min，随后上板加热70℃、加热时间30min。加热完毕自动加压，设置保压60min，最后等待自然冷却10～12h，取出PCL薄膜。
第三步：骨骼区域前体复合聚合物膜的制备
按设计将PCL颗粒添加至双辊研磨机中，设置研磨机参数为双辊温度90℃，双辊速率1.8rpm。待PCL完全熔化后，将AgSi-nHA颗粒(10wt％)添加到双辊研磨机中，与PCL机械研磨2小时。收集所得PCL/AgSi-nHA复合材料并切成圆盘形状(每个圆盘约5g)，随后将其冷却至24℃完全固化得到PCL/AgSi-nHA圆片。将圆片置于液压平板硫化机中，设置下板加热80℃，加热时间30min。结束后手动微调上升下板，设置上板加热70℃，加热时间30min。加热完毕自动加压，设置保压60min，随后等待自然冷却10～12h，取出PCL/AgSi-nHA薄膜。
第四步：肌腱-骨骼区域多维梯度的制备
按设计各取PCL和PCL/AgSi-nHA薄膜2×3cm2转移至不锈钢板上，将两矩形薄膜2cm一侧紧密拼接，设置电烙铁温度305℃，在拼接缝上下两端点向中心进行1.5mm点焊，正反面共计点焊2次。于热烘胶机平台上从底往上依次叠放不锈钢片、预拼接薄膜、不锈钢板，并自上往下施加压力75kPa，设置热烘胶机参数为加热温度80℃，时间60min。结束后将上下板片与薄膜共同转移至室温桌面，继续加压75kPa保持5min冷却后取出得到连接后薄膜(长度不小于6cm，宽度不小于2cm，面积不小于12cm2)。
沿长度方向居中取连接后薄膜6×0.5cm2，固定拉伸应变范围为连接区域上下0.5cm，将预处理后的复合薄膜在接近PCL熔点的高温条件下(55℃)进行机械单向拉制，设置参数为应变速率10mm/min，预设应变值600％。释放拉力后取出过渡区域上下0.5cm内薄膜，最终获得应变增强的多维梯度薄膜支架。
薄膜支架材料的C区颜色相较实验例1明显变淡，呈白色半透明状。支架宽度基本保持不变，整体长度约为58.5mm，回缩量有所降低。支架G区区间长度可大幅增长，长度约为3mm。
实施例3
在温度为室温(21℃)、应变速率为10mm/min、应变为1000％的条件下，一种基于纳米掺杂和机械单向拉制协同构建的生物可适配性梯度肌腱-骨连接点支架通过如下方法制备得到：
第一步：生物陶瓷微纳米颗粒的制备
按设计将0.6mol/L的Ca(OH)2溶液和0.03mol/L的AgNO3溶液混合后逐滴加入到0.40mol/L的H3PO4和0.06mol/L的SiC8H20O4的混合溶液中，通过浓氨水调节溶液pH值为10.5，保持时间为3h，反应后获得悬浊液在室温静置冷却12h，经固液分离、洗涤、干燥后研磨成粉末，在氮气保护气氛中于300℃下热处理4h得到Si和Ag掺杂的生物陶瓷微纳米颗粒，其中Si可诱导并促进组织成骨过程，Ag在组织形成过程中具有良好抗菌效果。
第二步：肌腱区域前体聚合物膜的制备
按设计将PCL颗粒添加至双辊研磨机中，设置研磨机参数为双辊温度90℃，双辊速率1.8rpm。机械研磨2小时后，收集所得PCL并切成圆盘形状(每个圆盘约5g)，随后将其冷却至24℃完全固化得到PCL圆片。将一圆片放入液压平板硫化机，设置压力800MPa，下板加热80℃、加热时间30min，随后上板加热70℃、加热时间30min。加热完毕自动加压，设置保压60min，最后等待自然冷却10～12h，取出PCL薄膜。
第三步：骨骼区域前体复合聚合物膜的制备
按设计将PCL颗粒添加至双辊研磨机中，设置研磨机参数为双辊温度90℃，双辊速率1.8rpm。待PCL完全熔化后，将AgSi-nHA颗粒(10wt％)添加到双辊研磨机中，与PCL机械研磨2小时。收集所得PCL/AgSi-nHA复合材料并切成圆盘形状(每个圆盘约5g)，随后将其冷却至24℃完全固化得到PCL/AgSi-nHA圆片。将圆片置于液压平板硫化机中，设置下板加热80℃，加热时间30min。结束后手动微调上升下板，设置上板加热70℃，加热时间30min。加热完毕自动加压，设置保压60min，随后等待自然冷却10～12h，取出PCL/AgSi-nHA薄膜。
第四步：肌腱-骨骼区域多维梯度的制备
按设计各取PCL和PCL/AgSi-nHA薄膜2×3cm2转移至不锈钢板上，将两矩形薄膜2cm一侧紧密拼接，设置电烙铁温度305℃，在拼接缝上下两端点向中心进行1.5mm点焊，正反面共计点焊2次。于热烘胶机平台上从底往上依次叠放不锈钢片、预拼接薄膜、不锈钢板，并自上往下施加压力75kPa，设置热烘胶机参数为加热温度80℃，时间60min。结束后将上下板片与薄膜共同转移至室温桌面，继续加压75kPa保持5min冷却后取出得到连接后薄膜(长度不小于6cm，宽度不小于2cm，面积不小于12cm2)。
沿长度方向居中取连接后薄膜6×0.5cm2，固定拉伸应变范围为连接区域上下0.5cm，将预处理后的复合薄膜在室温条件下(21℃)进行机械单向拉制，设置参数为应变速率10mm/min，预设应变值1000％，接近PCL/Ag,Si-nHA薄膜的应变极限。释放拉力后取出过渡区域上下0.5cm内薄膜，最终获得应变增强的多维梯度薄膜支架。
薄膜支架C区颜色稍有变淡。支架宽度明显收窄，约为2.6mm，整体长度约为83.5mm。支架G区区间长度小幅增长，约为2.1mm。
对比例1
本对比例说明单向拉制对薄膜支架梯度界面形成的影响。
第一步：生物陶瓷微纳米颗粒的制备
按设计将0.6mol/L的Ca(OH)2溶液和0.03mol/L的AgNO3溶液混合后逐滴加入到0.40mol/L的H3PO4和0.06mol/L的SiC8H20O4的混合溶液中，通过浓氨水调节溶液pH值为10.5，保持时间为3h，反应后获得悬浊液在室温静置冷却12h，经固液分离、洗涤、干燥后研磨成粉末，在氮气保护气氛中于300℃下热处理4h得到Si和Ag掺杂的生物陶瓷微纳米颗粒，其中Si可诱导并促进组织成骨过程，Ag在组织形成过程中具有良好抗菌效果。
第二步：肌腱区域前体聚合物膜的制备
按设计将PCL颗粒添加至双辊研磨机中，设置研磨机参数为双辊温度90℃，双辊速率1.8rpm。机械研磨2小时后，收集所得PCL并切成圆盘形状(每个圆盘约5g)，随后将其冷却至24℃完全固化得到PCL圆片。将一圆片放入液压平板硫化机，设置压力800MPa，下板加热80℃、加热时间30min，随后上板加热70℃、加热时间30min。加热完毕自动加压，设置保压60min，最后等待自然冷却10～12h，取出PCL薄膜。
第三步：骨骼区域前体复合聚合物膜的制备
按设计将PCL颗粒添加至双辊研磨机中，设置研磨机参数为双辊温度90℃，双辊速率1.8rpm。待PCL完全熔化后，将AgSi-nHA颗粒(10wt％)添加到双辊研磨机中，与PCL机械研磨2小时。收集所得PCL/AgSi-nHA复合材料并切成圆盘形状(每个圆盘约5g)，随后将其冷却至24℃完全固化得到PCL/AgSi-nHA圆片。将圆片置于液压平板硫化机中，设置下板加热80℃，加热时间30min。结束后手动微调上升下板，设置上板加热70℃，加热时间30min。加热完毕自动加压，设置保压60min，随后等待自然冷却10～12h，取出PCL/AgSi-nHA薄膜。
第四步：肌腱-骨骼区域梯度的制备
按设计各取PCL和PCL/AgSi-nHA薄膜2×3cm2转移至不锈钢板上，将两矩形薄膜2cm一侧紧密拼接，设置电烙铁温度305℃，在拼接缝上下两端点向中心进行1.5mm点焊，正反面共计点焊2次。于热烘胶机平台上从底往上依次叠放不锈钢片、预拼接薄膜、不锈钢板，并自上往下施加压力75kPa，设置热烘胶机参数为加热温度80℃，时间60min。结束后将上下板片与薄膜共同转移至室温桌面，继续加压75kPa保持5min冷却后取出得到连接后薄膜(长度不小于6cm，宽度不小于2cm，面积不小于12cm2)。
沿长度方向居中取连接后薄膜1×0.5cm2，获得梯度薄膜支架。
薄膜支架材料整体表面平整光滑，颜色由P区的白色半透明状断面连接至C区的黄色半透明状，没有形成均匀过渡的G区。
对比例2
本对比例说明单一聚合物组分对薄膜支架梯度界面形成的影响。
第一步：PCL聚合物膜的制备
按设计将PCL颗粒添加至双辊研磨机中，设置研磨机参数为双辊温度90℃，双辊速率1.8rpm。机械研磨2小时后，收集所得PCL并切成圆盘形状(每个圆盘约5g)，随后将其冷却至24℃完全固化得到PCL圆片。将一圆片放入液压平板硫化机，设置压力800MPa，下板加热80℃、加热时间30min，随后上板加热70℃、加热时间30min。加热完毕自动加压，设置保压60min，最后等待自然冷却10～12h，取出PCL薄膜。
第二步：支架表面梯度的制备
按设计取PCL薄膜2×6cm2，于热烘胶机平台上从底往上依次叠放不锈钢片、PCL薄膜、不锈钢板，并自上往下施加压力75kPa，设置热烘胶机参数为加热温度80℃，时间60min。结束后将上下板片与薄膜共同转移至室温桌面，继续加压75kPa保持5min冷却后取出得到热压后薄膜(长度不小于6cm，宽度不小于2cm，面积不小于12cm2)。
沿长度方向居中取热压后薄膜6×0.5cm2，固定拉伸应变范围为长度方向上中线区域上下0.5cm，将处理后薄膜在21℃条件下进行机械单向拉制，设置参数为应变速率10mm/min，预设应变值600％。释放拉力后取出长度方向中线区域上下0.5cm范围内薄膜，获得应变增强的PCL梯度薄膜支架。
薄膜支架材料整体呈均一透明状，支架整体长度约为49mm，宽度约为3.5mm，未见均匀过渡区域。
对比例3
本对比例说明生物纳米陶瓷掺杂对薄膜支架梯度界面形成的影响。
第一步：复合生物陶瓷微纳米颗粒的制备
按设计将0.6mol/L的Ca(OH)2溶液和0.03mol/L的AgNO3溶液混合后逐滴加入到0.40mol/L的H3PO4和0.06mol/L的SiC8H20O4的混合溶液中，通过浓氨水调节溶液pH值为10.5，保持时间为3h，反应后获得悬浊液在室温静置冷却12h，经固液分离、洗涤、干燥后研磨成粉末，在氮气保护气氛中于300℃下热处理4h得到Si和Ag掺杂的生物陶瓷微纳米颗粒，其中Si可诱导并促进组织成骨过程，Ag在组织形成过程中具有良好抗菌效果。
第二步：PCL/AgSi-nHA聚合物膜的制备
按设计将PCL颗粒添加至双辊研磨机中，设置研磨机参数为双辊温度90℃，双辊速率1.8rpm。待PCL完全熔化后，将AgSi-nHA颗粒(10wt％)添加到双辊研磨机中，与PCL机械研磨2小时。收集所得PCL/AgSi-nHA复合材料并切成圆盘形状(每个圆盘约5g)，随后将其冷却至24℃完全固化得到PCL/AgSi-nHA圆片。将圆片置于液压平板硫化机中，设置下板加热80℃，加热时间30min。结束后手动微调上升下板，设置上板加热70℃，加热时间30min。加热完毕自动加压，设置保压60min，随后等待自然冷却10～12h，取出PCL/AgSi-nHA薄膜。
第三步：支架表面梯度的制备
按设计取PCL/AgSi-nHA薄膜2×6cm2，于热烘胶机平台上从底往上依次叠放不锈钢片、PCL/AgSi-nHA薄膜、不锈钢板，并自上往下施加压力75kPa，设置热烘胶机参数为加热温度80℃，时间60min。结束后将上下板片与薄膜共同转移至室温桌面，继续加压75kPa保持5min冷却后取出得到热压后薄膜(长度不小于6cm，宽度不小于2cm，面积不小于12cm2)。
沿长度方向居中取热压后薄膜6×0.5cm2，固定拉伸应变范围为长度方向上中线区域上下0.5cm，将处理后薄膜在21℃条件下进行机械单向拉制，设置参数为应变速率10mm/min，预设应变值600％。释放拉力后取出长度方向中线区域上下0.5cm内薄膜，获得应变增强的PCL/AgSi-nHA梯度薄膜支架。
薄膜支架材料整体呈均一白色，支架整体长度约为50mm，宽度约为4mm，未形成均匀过渡区域。

Claims (9)

1.一种TBJ组织修复薄膜型支架，其特征在于：包括三个层次区域结构：中间层为具有梯度变化的聚合物/陶瓷复合材料区域，中间层两侧分别为均一的聚合物区域和均一的聚合物/陶瓷复合材料区域；
所述均一的聚合物区域由高度取向排列的微纳米尺度沟槽-山脊结构组成；
所述梯度变化的聚合物/陶瓷复合材料区域中表面沟槽-山脊结构及元素成分呈现梯度线性变化；
所述均一的聚合物/陶瓷复合材料区域由各向同性表面构成或者各向异性沟槽-山脊结构构成。
2.根据权利要求1所述的一种TBJ组织修复薄膜型支架，其特征在于：
所述高度取向排列的微纳米尺度沟槽-山脊结构中沟槽结构相互连通，而山脊结构相互分隔，高度和长度分别在50~2000nm和50~500μm范围内，且山脊表面具有高度线性排列的纳米沟槽-山脊结构；
所述梯度变化的聚合物/陶瓷复合材料区域中沟槽-山脊结构的山脊长度、高度、数量沿均一的聚合物区域向均一的聚合物/陶瓷复合材料区域递减。
3.根据权利要求1所述的一种TBJ组织修复薄膜型支架，其特征在于：
所述均一的聚合物区域由聚己内酯及其衍生物、聚乳酸及其衍生物、胶原及其衍生物、聚乙醇酸及其衍生物中的至少一种；
所述均一的聚合物/陶瓷复合材料区域由聚合物与CaP微纳米颗粒按质量百分比50~70% : 30~50%构成，其中，聚合物为聚己内酯及其衍生物、聚乳酸及其衍生物、胶原及其衍生物、聚乙醇酸及其衍生物中的至少一种；
所述梯度变化的聚合物/陶瓷复合材料区域中CaP微纳米颗粒由聚合物区域一侧至均一的聚合物/陶瓷复合材料区域一侧梯度增加。
4.根据权利要求3所述的一种TBJ组织修复薄膜型支架，其特征在于：
所述CaP微纳米颗粒中掺杂有硅、镁、钴、铁、锶、钽、锌、银、铜中至少一种；
所述CaP微纳米颗粒中的粒径尺寸小于50μm，陶瓷成分选自磷酸钙及其衍生物、羟基磷灰石及其衍生物中至少一种，钙/磷摩尔比为1.6~1.7。
5.权利要求1~4任一项所述的一种TBJ组织修复薄膜型支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将聚合物颗粒依次通过双辊开炼、热压成型得到聚合物薄膜；
2）将聚合物颗粒与CaP微纳米颗粒共混复合后，依次通过双辊开炼、过筛、热压成型得到聚合物/陶瓷复合材料薄膜；
3）将聚合物薄膜与聚合物/陶瓷复合材料薄膜通过热压融合，拼接成TBJ支架前体；
4）将TBJ支架前体沿垂直于拼接线轴向拉伸，使应变颈缩刚好越过拼接区域或者扩展至聚合物/陶瓷复合材料区域，即得。
6.根据权利要求5所述的一种TBJ组织修复薄膜型支架的制备方法，其特征在于：
步骤1）中，双辊开炼的工艺参数为：双辊温度高于聚合物熔点5~15℃、转速1~3 rpm、开炼时间0.5~1.5h；
步骤1）中，热压成型的工艺参数为：预加压强4~6MPa、温度高于聚合物熔点5~15℃、保压50~70min，室温冷却8~16h。
7.根据权利要求5所述的一种TBJ组织修复薄膜型支架的制备方法，其特征在于：
步骤2）中，聚合物颗粒在双辊开炼条件下处于熔融状态，双辊开炼的工艺参数为：双辊温度高于聚合物熔点5~15℃、转速1~3 rpm、开炼时间0.4~0.6h；再将CaP微纳米颗粒掺杂加入熔融聚合物，开炼共混50~70min；
步骤2）中，聚合物/陶瓷复合材料热压成型的工艺参数为：预加压强4~6MPa、温度高于聚合物熔点5~15℃、保压50~70min，室温冷却8~16h。
8.根据权利要求5所述的一种TBJ组织修复薄膜型支架的制备方法，其特征在于：步骤3）中，聚合物薄膜与聚合物/陶瓷复合材料薄膜的拼接工艺参数为：280~320℃点焊接聚合物薄膜与聚合物/陶瓷复合材料薄膜，加压80~120N，加热60~100℃保持30~90min，随后进行保压冷却，冷却方式为自然冷却20~30min，或者置于空气中冷却3~5min，或者置于冰水混合物中快速冷却1~2min。
9.根据权利要求5所述的一种TBJ组织修复薄膜型支架的制备方法，其特征在于：步骤4）中，轴向拉伸的工艺参数为：拉伸温度不高于聚合物熔点、预设应变值200~1000%、应变速率5~500mm/min。
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