CN112156231A - 一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料及其制备方法 - Google Patents

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张莲香
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Abstract

本申请公开了一种嗅鞘细胞‑透明质酸水凝胶复合材料及其制备方法，用于制备嗅鞘细胞‑透明质酸水凝胶复合材料，该嗅鞘细胞‑透明质酸水凝胶复合材料可应用于脊髓损伤组织的修复，且具有良好的修复效果。与传统的嗅鞘细胞相比，本申请的嗅鞘细胞‑透明质酸水凝胶复合材料能够有效地提高嗅鞘细胞的存活率，还能填补脊髓组织缺损并与周边组织整合，抑制炎症反应和胶质瘢痕形成，诱导神经纤维再生，能够一定程度地促进脊髓损伤后运动功能的恢复。

Description

一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料及其制备方法
技术领域
本申请涉及组织工程技术领域，尤其涉及一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料及其制备方法。
背景技术
脊髓损伤是主要因外伤所致的疾患，常导致脊髓局部大量神经细胞死亡、纤维束断裂，造成患者损伤平面以下不同程度的感觉、运动及内脏功能障碍。
针对脊髓损伤处神经纤维再生、通路重建及功能恢复，目前常用一种治疗方式是植入已经分化好的胶质细胞，例如嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)，从而有利于神经的再生。嗅鞘细胞具有长突起，可修复原有损伤的神经元轴突，同时能分泌多种神经营养因子(如NGF、BDNF、GDNF)，可以为轴突再生提供适宜微环境，有利于神经的再生，改善脊髓损伤后的神经功能。
目前，采用OECs治疗损伤脊髓，多数采用将嗅鞘细胞注射移植至机体损伤脊髓处的模式，但是，在实际的治疗过程中，脊髓损伤存在较大的组织坏死囊腔，使得植入的OECs缺乏细胞外基质支持以及缺乏血供和必要的生存微环境，因此，移植至损伤脊髓处的OECs在损伤区大量死亡，导致OECs对损伤脊髓治疗的效果欠佳，对轴突再生促进作用较小，对髓鞘形成及机体运动功能恢复也不明显。
发明内容
本申请提供了一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料及其制备方法，以解决现有的嗅鞘细胞在实际移植治疗过程中，存活率较低，对损伤脊髓的治疗效果欠佳的问题。
本申请提供一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤S100，在ED的介导作用下，使HA与ADH进行交联反应，制得HA水凝胶；
步骤S200，采用液氮梯度冷冻法，将HA水凝胶塑形成具有纵向多通道结构的HA水凝胶支架；
步骤S300，采用NaIO4氧化法，将antiNgR连接到具有纵向通道结构的HA支架上，得到接枝antiNgR的HA水凝胶支架；
步骤S400，将接枝antiNgR的HA水凝胶支架置于培养孔板内，调节其PH值至7左右，灭菌后，加入含胎牛血清的DMEM/F-12培养基，浸润24小时后，在培养基内接种经分离、培养得到的嗅鞘细胞，每隔一天更换一次培养基，培养5-7天后，制得嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料。
可选地，步骤S100具体包括，
(1)称取0.04g PLL，加入去离子水溶解，并调节其pH值至11左右；
(2)在PLL溶液中缓慢加入0.2g透明质酸钠，充分搅拌至充分溶解后,加入1.4gADH，搅拌24h，调节该混合溶液的pH值至4.7左右，得到中间混合液；
(3)将0.4g EDC先用去离子水溶解后，再逐滴加入上述得到的中间混合液中，充分搅拌至溶液渐成凝胶；
(4)将上述凝胶用去离子水在超声波清洗器中清洗，清洗后，调节pH值至7，并置于零下80℃冰箱内预冻2h后置入冷冻真空干燥仪内冻干，得到HA水凝胶；
(5)将冻干的HA水凝胶材料置于真空干燥器中备用。
可选地，步骤S200具体包括，
(1)将数个塑料吸管捆扎成一体，塑料吸管的下端采用保鲜膜封口，得到塑形模具；
(2)将HA水凝胶注入塑形模具内，塑形模具周围用聚苯乙烯泡沫塑料严密环绕包裹，除去塑形模具下端的保鲜膜，使塑形模具中的HA水凝胶上下端暴露；
(3)将注有HA水凝胶的塑形模具放入盛有液氮的保温壶中，进行梯度冷冻30min；
(4)将注有HA水凝胶的塑形模具从保温壶中取出，转至冷冻真空干燥仪中进行干燥，干燥后，得到具有纵向多通道结构的HA水凝胶支架，将其放入真空干燥器中备用。
可选地，步骤S300，具体包括，
(1)取5mg antiNgR溶于10ml去离子水中，加入100mg NaIO4，轻微搅拌至充分溶解；
(2)将上述混合液倒入透析袋中透析8-10h，每2h更换去离子水1次，除去未反应的NaIO4及其反应残留物，用滤菌器过滤，得到无菌的抗体溶液；
(3)对制备得到的具有纵向多通道结构的HA水凝胶支架进行消毒灭菌，然后将其与无菌的抗体溶液混合，在超净工作台中反应24h，得到接枝antiNgR的HA水凝胶支架。
可选地，步骤S400中，嗅鞘细胞的分离、培养过程具体包括：
1)取新生的SD大鼠，用6％水合氯醛腹腔注射麻醉，取头颅浸入75％的乙醇中消毒3min；
2)在无菌条件下，用眼科镊夹取嗅球，放入盛有PBS液的培养皿中，去除嗅球表面的毛细血管、软脑膜及嗅球内的白质，保留嗅神经层和嗅球颗粒层，将嗅神经层和嗅球颗粒层放入4℃预冷的含胎牛血清的DMEM/F-12培养基内，并用眼科剪将其剪成小组织块；
3)加入胰蛋白酶消化液，转移至离心管内，置于37℃的CO2培养箱内消化15min后，加血清终止消化3min，1000r/min离心10min，弃去上清液；
4)加入含含胎牛血清的DMEM/F-12培养基，悬浮离心彻底洗涤胰蛋白酶，弃去上清液后加入含胎牛血清的DMEM/F-12培养基悬浮培养，用移液管吹打小组织块，至小组织块分散成单细胞混悬液；
5)将单细胞混悬液接种于玻璃培养瓶中，置于37℃的CO2培养箱中培养12小时；
6)将玻璃培养瓶中未贴壁的单细胞混悬液转入新的玻璃培养瓶中，置于37℃的CO2培养箱中培养24小时；
7)将细胞悬液以1×108L-1浓度接种于培养皿中，置于37℃的CO2培养箱中培养，培养期间，每3-5天半量换液1次，得到嗅鞘细胞。
可选地，步骤S400中，嗅鞘细胞接种的浓度为1×109L-1。
本申请还提供一种采用上述方法制备的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料。
本申请提供了一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料及其制备方法，用于制备嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料，该嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料可应用于脊髓损伤组织的修复，且具有良好的修复效果。与传统的嗅鞘细胞相比，本申请的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料能够有效地提高嗅鞘细胞的存活率，还能填补脊髓组织缺损并与周边组织整合，抑制炎症反应和胶质瘢痕形成，诱导神经纤维再生，能够一定程度地促进脊髓损伤后运动功能的恢复。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为HA水凝胶冻干后的大体形态及超微结构，其中，图1-A、图1-B为HA水凝胶冻干后的大体形态图，图1-C的比例尺Scale bar为100μm的HA水凝胶冻干后的微观结构图，图1-D为比例尺Scale bar：50μm的HA水凝胶冻干后的微观结构图；
图2为HA水凝胶支架的外形及内部结构，其中，图2-A为HA水凝胶支架的外观形态，图2-B为HA水凝胶支架的的横断面微观形貌，图2-C为Scale bar：50μm的HA水凝胶支架的纵切面微观形貌，图2-D为Scale bar：100μm的HA水凝胶支架的纵切面微观形貌；
图3为HA水凝胶支架上接枝的antiNgR的免疫荧光染色显示图；
图4为培养的嗅鞘细胞的形貌图；
图5为嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的免疫荧光染色显示图，其中，图5-A、图5-B分别为嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的细胞表达GFAP、p75，图5-C显示Hoechst染色显示的细胞核，图5-D图为上述三种染色的叠加；
图6为嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的微观结构图。
具体实施方式
本申请提供一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的制备方法，用于制备嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料，该嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料可应用于脊髓损伤组织的修复，且具有良好的修复效果。
本申请的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤S100，在碳二亚胺盐酸盐(EDC)的介导作用下，使透明质酸(HA)与己二酸二酰肼(ADH)进行交联反应，制得HA水凝胶。
本实例中，步骤S100具体实现过程包括：
步骤S110，称取0.04g多聚左旋赖氨酸(PLL)，其分子量范围Mw为150-300kDa，加入去离子水20ml溶解，使用1mol/L的NaOH溶液调节其pH值至11左右；
步骤S120，在PLL溶液中缓慢加入0.2g透明质酸钠，其分子量范围Mw为2.6-2.7million Da，用磁力搅拌器搅拌4-5h使其均匀溶解,用保鲜膜封住烧杯口、备用，以防止干凝；
步骤S130，加入1.4gADH，其分子量范围Mw为174.2Da，搅拌24h，使用1mol/L的HCl溶液调节该混合溶液的pH值至4.7左右，得到中间混合液；
步骤S140，用去离子水溶解0.4gEDC，其分子量范围Mw为191.7Da，将溶解的EDC溶液逐滴加入上述得到的中间混合液中，充分搅拌10-20min至溶液渐成凝胶；
步骤S150，将上述凝胶用去离子水在超声波清洗器中清洗，清洗后，使用1mol/L的NaOH调节凝胶的pH值至7左右，倒入培养孔板或其他容器内，置于零下80℃冰箱内预冻2h后置入冷冻真空干燥仪内冻干，得到HA水凝胶；应当说明，该步骤中，凝胶用去离子水在超声波清洗器中清洗的过程具体为，将凝胶置于超声波清洗器中，用去离子水反复清洗；
步骤S160，将冻干的HA水凝胶材料置于真空干燥器中备用。
冻干前，HA水凝胶呈胶冻状，粘弹性良好。冻干后，HA水凝胶固定成型，如图1-A与1-B所示，呈圆柱体外形，可切成不同厚度的薄片，用于细胞的3D(three dimensional)培养。
图1-C、1-D为HA水凝胶冻干后的微结构，其中，图1-C的比例尺Scale bar为100μm，图1-D的比例尺Scale bar为50μm，如图所示，扫描电镜下，HA水凝胶呈疏松的多孔结构，孔洞分布于整个凝胶，孔壁薄，孔径在20μm-100μm间，其中，以50μm左右孔径为多，另外，孔洞的孔壁上有小孔隙，使孔洞相互交通。
步骤S200，采用液氮梯度冷冻法，将HA水凝胶塑形成具有纵向多通道结构的HA水凝胶支架。
本申请中，步骤S200的具体实现过程包括：
步骤S210，将数个塑料吸管捆扎成一体，塑料吸管的下端采用保鲜膜封口，得到塑形模具。应当说明，本领域技术人员可根据实际需要，选择塑料吸管的数量与直径，例如，采用10个直径为3.5mm的塑料吸管，其均属于本申请的保护范围。
步骤S220，采将HA水凝胶注入塑形模具内，塑形模具周围用聚苯乙烯泡沫塑料严密环绕包裹，除去塑形模具下端的保鲜膜，使塑形模具中的HA水凝胶上下端暴露。
步骤S230，将注有HA水凝胶的塑形模具放入盛有液氮的保温壶中，进行梯度冷冻30min。应当说明，梯度冷冻为本领域常用技术，其具体实现过程将不在此进行赘述。
步骤S240，将注有HA水凝胶的塑形模具从保温壶中取出，转至冷冻真空干燥仪中进行干燥，干燥后，得到具有纵向多通道结构的HA水凝胶支架，并将其放入真空干燥器中备用。
本实例中，HA水凝胶支架外形呈圆柱状，直径为3mm，如图2-A所示。HA水凝胶支架质地柔韧，可根据需要切割成不同形状和大小，扫描电镜观察其横断面呈蜂窝状结构，显示通道密集排列，如图2-B所示。扫描电镜观察HA水凝胶支架的纵切面，可见内部呈纵向多通道结构，通道并行排列，纵向贯通，直径在50μm左右，通道之间借孔隙彼此相通，如图2-C、2-D所示。
步骤S300，采用高碘酸钠(NaIO4)氧化法，将NgR抗体(antiNgR)连接到具有纵向通道结构的HA支架上，得到接枝antiNgR的HA水凝胶支架。
应当说明，NaIO4氧化法是将NgR抗体Fc段的醣残基氧化为醛基，使之与HA水凝胶支架中游离的酰肼基团发生作用，进而将NgR抗体连接到HA水凝胶支架上。另外，本申请中，NgR抗体分子含4条肽链，包括2条重链和2条轻链，其中，2条重链的羧基端为Fc段。
本申请中，步骤S300的具体实现过程包括：
步骤S310，取5mg的antiNgR溶于10ml去离子水中，加入100mg NaIO4，轻微搅拌30min至充分溶解；
步骤S320，将上述混合液倒入透析袋中透析8-10h，每2h更换去离子水1次，除去未反应的NaIO4及其反应残留物，用滤菌器过滤，得到无菌的抗体溶液；
步骤S330，对制备得到的具有纵向多通道结构的HA水凝胶支架进行消毒灭菌，然后将其与无菌的抗体溶液混合，在超净工作台中反应24h，得到接枝antiNgR的HA水凝胶支架。
图3为HA水凝胶支架上接枝的antiNgR的免疫荧光染色显示图，通过免疫荧光染色试验显示图可知，antiNgR已经成功地接枝到HA水凝胶支架上。
步骤S400，将接枝antiNgR的HA水凝胶支架置于培养孔板内，调节其PH值至7左右，灭菌后，加入含胎牛血清的DMEM/F-12培养基，浸润24小时后，在培养基内接种经分离、培养得到的嗅鞘细胞，每隔一天更换一次培养基，培养5-7天后，制得嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料。实际制备过程中，在培养5-7天后，可用共聚焦显微镜或其他显微镜观察细胞生长情况并进行细胞计数，若接枝antiNgR的HA水凝胶支架上附着有大量嗅鞘细胞，则判定制备得到嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料。
应当说明，培养孔板的类型有多种，例如6、12、24、96孔培养孔板，本领域技术人员可根据实际需要选择合适孔数的培养孔板，其均属于本申请的保护范围。另外，本实例中，在培养基内接种嗅鞘细胞，其接种浓度为1×109L-1。当然，本领域技术人员可根据实际需要调整接种密度，其均属于本申请的保护范围。
步骤S400中，嗅鞘细胞的分离、培养过程具体包括：
1)取新生的SD大鼠，用6％水合氯醛腹腔注射麻醉，取头颅浸入75％的乙醇中消毒3min；
2)在无菌条件下，用眼科镊夹取嗅球，放入盛有PBS液的培养皿中，去除嗅球表面的毛细血管、软脑膜及嗅球内的白质，保留嗅神经层和嗅球颗粒层，将嗅神经层和嗅球颗粒层放入4℃预冷的含胎牛血清的DMEM/F-12培养基内，并用眼科剪将其剪成小组织块；
3)加入胰蛋白酶消化液，转移至离心管内，置于37℃的CO2培养箱内消化15min后，加血清终止消化3min，1000r/min离心10min，弃去上清液；
4)加入含含胎牛血清的DMEM/F-12培养基，悬浮离心彻底洗涤胰蛋白酶，弃去上清液后加入含胎牛血清的DMEM/F-12培养基悬浮培养，用移液管吹打小组织块，至小组织块分散成单细胞混悬液；
5)将单细胞混悬液接种于玻璃培养瓶中，置于37℃的CO2培养箱中培养12小时；
6)将玻璃培养瓶中未贴壁的单细胞混悬液转入新的玻璃培养瓶中，置于37℃的CO2培养箱中培养24小时；
7)将细胞悬液以1×108L-1浓度接种于培养皿中，置于37℃的CO2培养箱中培养，培养期间，每3-5天半量换液1次，得到嗅鞘细胞。
图4为培养的嗅鞘细胞的形貌图，如图4所示，培养的嗅球细胞胞体呈梭形或三角形，伸出细长的突起，突起之间形成连接。
将嗅鞘细胞与接枝antiNgR的HA水凝胶共同培养，对制备的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料进行免疫荧光染色测试，图5为嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的免疫荧光染色显示图，其中，图5-A、图5-B分别为嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的细胞表达GFAP、p75，图5-C显示Hoechst染色显示的细胞核，图5-D图为上述三种染色的叠加。通过图5中的免疫荧光染色显示图可知，嗅鞘细胞在接枝antiNgR的HA水凝胶支架上存活良好。
图6为嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的微观结构图,如图6所示，嗅鞘细胞在接枝antiNgR的HA水凝胶支架上粘附生长，伸出细长突起，突起之间形成连接。
本申请还提供由上述方法制备的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料，制备的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料可应用于脊髓损伤组织的修复，且具有良好的修复效果。与传统的嗅鞘细胞相比，本申请的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料能够有效地提高嗅鞘细胞的存活率，还能填补脊髓组织缺损并与周边组织整合，抑制炎症反应和胶质瘢痕形成，诱导神经纤维再生，能够一定程度地促进脊髓损伤后运动功能的恢复。
以上所述的本申请实施方式并不构成对本申请保护范围的限定。

Claims (7)

1.一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S100，在ED的介导作用下，使HA与ADH进行交联反应，制得HA水凝胶；
步骤S200，采用液氮梯度冷冻法，将HA水凝胶塑形成具有纵向多通道结构的HA水凝胶支架；
步骤S300，采用NaIO4氧化法，将antiNgR连接到具有纵向通道结构的HA支架上，得到接枝antiNgR的HA水凝胶支架；
步骤S400，将接枝antiNgR的HA水凝胶支架置于培养孔板内，调节其PH值至7左右，灭菌后，加入含胎牛血清的DMEM/F-12培养基，浸润24小时后，在培养基内接种经分离、培养得到的嗅鞘细胞，每隔一天更换一次培养基，培养5-7天后，制得嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料。
2.根据权利要求1所述的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的制备方法，其特征在于，步骤S100具体包括，
(1)称取0.04g PLL，加入去离子水溶解，并调节其pH值至11左右；
(2)在PLL溶液中缓慢加入0.2g透明质酸钠，充分搅拌至充分溶解后,加入1.4g ADH，搅拌24h，调节该混合溶液的pH值至4.7左右，得到中间混合液；
(3)将0.4g EDC先用去离子水溶解后，再逐滴加入上述得到的中间混合液中，充分搅拌至溶液渐成凝胶；
(4)将上述凝胶用去离子水在超声波清洗器中清洗，清洗后，调节pH值至7，并置于零下80℃冰箱内预冻2h后置入冷冻真空干燥仪内冻干，得到HA水凝胶；
(5)将冻干的HA水凝胶材料置于真空干燥器中备用。
3.根据权利要求1所述的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的制备方法，其特征在于，步骤S200具体包括，
(1)将数个塑料吸管捆扎成一体，塑料吸管的下端采用保鲜膜封口，得到塑形模具；
(2)将HA水凝胶注入塑形模具内，塑形模具周围用聚苯乙烯泡沫塑料严密环绕包裹，除去塑形模具下端的保鲜膜，使塑形模具中的HA水凝胶上下端暴露；
(3)将注有HA水凝胶的塑形模具放入盛有液氮的保温壶中，进行梯度冷冻30min；
(4)将注有HA水凝胶的塑形模具从保温壶中取出，转至冷冻真空干燥仪中进行干燥，干燥后，得到具有纵向多通道结构的HA水凝胶支架，将其放入真空干燥器中备用。
4.根据权利要求1所述的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的制备方法，其特征在于，步骤S300，具体包括，
(1)取5mg antiNgR溶于10ml去离子水中，加入100mg NaIO4，轻微搅拌至充分溶解；
(2)将上述混合液倒入透析袋中透析8-10h，每2h更换去离子水1次，除去未反应的NaIO4及其反应残留物，用滤菌器过滤，得到无菌的抗体溶液；
(3)对制备得到的具有纵向多通道结构的HA水凝胶支架进行消毒灭菌，然后将其与无菌的抗体溶液混合，在超净工作台中反应24h，得到接枝antiNgR的HA水凝胶支架。
5.根据权利要求1所述的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的制备方法，其特征在于，步骤S400中，嗅鞘细胞的分离、培养过程具体包括：
1)取新生的SD大鼠，用6％水合氯醛腹腔注射麻醉，取头颅浸入75％的乙醇中消毒3min；
2)在无菌条件下，用眼科镊夹取嗅球，放入盛有PBS液的培养皿中，去除嗅球表面的毛细血管、软脑膜及嗅球内的白质，保留嗅神经层和嗅球颗粒层，将嗅神经层和嗅球颗粒层放入4℃预冷的含胎牛血清的DMEM/F-12培养基内，并用眼科剪将其剪成小组织块；
3)加入胰蛋白酶消化液，转移至离心管内，置于37℃的CO2培养箱内消化15min后，加血清终止消化3min，1000r/min离心10min，弃去上清液；
4)加入含含胎牛血清的DMEM/F-12培养基，悬浮离心彻底洗涤胰蛋白酶，弃去上清液后加入含胎牛血清的DMEM/F-12培养基悬浮培养，用移液管吹打小组织块，至小组织块分散成单细胞混悬液；
5)将单细胞混悬液接种于玻璃培养瓶中，置于37℃的CO2培养箱中培养12小时；
6)将玻璃培养瓶中未贴壁的单细胞混悬液转入新的玻璃培养瓶中，置于37℃的CO2培养箱中培养24小时；
7)将细胞悬液以1×108L-1浓度接种于培养皿中，置于37℃的CO2培养箱中培养，培养期间，每3-5天半量换液1次，得到嗅鞘细胞。
6.根据权利要求1所述的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的制备方法，其特征在于，步骤S400中，嗅鞘细胞接种的浓度为1×109L-1。
7.一种权利要求1-6任一项所述方法制备的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料。
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