BRPI0807521A2

BRPI0807521A2 - Processo e estrutura suporte para o cultivo de células vivas

Info

Publication number: BRPI0807521A2
Application number: BRPI0807521-2A
Authority: BR
Inventors: Guenter Bertholdt
Original assignee: Bioregeneration Gmbh
Priority date: 2007-02-12
Filing date: 2008-02-12
Publication date: 2014-06-03
Also published as: PL2202296T3; EP2121904A2; CN101652471A; RU2009134114A; ATE536403T1; DE102007006843A1; US20100041148A1; EP2202296B1; EP2202296A1; US8993324B2; WO2008098942A2; RU2460785C2; CN101652471B; WO2008098942A3

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO E ESTRUTURA SUPORTE PARA O CULTIVO DE CÉLULAS VIVAS".

Descrição

Antecedentes da Invenção A invenção refere-se a um processo para a cultura de células

vivas de acordo com a cláusula de pré-caracterização de reivindicação 1 e ao uso de uma estrutura compreendendo celulose cristalina. A invenção ain- da refere-se a um processo para a produção de uma estrutura suporte de celulose para a cultura de células vivas de acordo com a cláusula de pré- 10 caracterização de reivindicação 8, para suportar estruturas para a cultura de células vivas de acordo com as cláusulas de pré-caracterização de reivindi- cações 16 a 18, e a um molde oco para a preparação de uma estrutura su- porte de acordo com a cláusula de pré-caracterização de reivindicação 19. Técnica Anterior

É frequentemente desejável cultivar células vivas in vitro, por

exemplo, a partir de células que foram retiradas de um organismo, de modo a implantar as células cultivadas no mesmo organismo e assim obter ou res- taurar uma função de tecido. A cultura de células ou tecidos de células in vitro é frequentemente também referida como "engenharia de tecido". Os 20 tecidos são preferivelmente tecidos macios, por exemplo, pele, músculo ou tecido gorduroso, como oposto a tecido duro ou tecido ósseo.

É conhecida a cultura de células vivas em vasos de cultura, por exemplo, garrafas de cultura ou placas de cultura, onde, cobertas pelo meio nutriente, elas formam uma camada de células ("bidimensional") de camada 25 simples sobre a base do vaso de cultura. Entretanto, as células assim culti- vadas podem diferir em termos de suas propriedades de células do mesmo tipo que são encontradas in vivo em uma unidade de tecido dentro de um organismo, o que pode prejudicar substancialmente seu valor diagnóstico e terapêutico.

Um tecido vivo geralmente consiste em um grande número de

células especializadas que influenciam umas às outras com o auxílio de mo- léculas de sinal, e é suposto que células se auto-orientam dentro de gradien- tes de concentração de substâncias moleculares pequenas e são capazes de se comportar de uma maneira particular. O termo "informação posicionai" é também aqui usado. Entre as células de um tecido existem estruturas su- portes, chamadas a matriz extracelular, que consiste em macromoléculas 5 liberadas pelas células e que estabilizam as células em suas respectivas posições. Se a matriz extracelular é destruída e as células são misturadas, células somáticas diferenciadas, normais não são mais capazes de auto- rearranjo e reconstrução de estruturas perdidas. Foi verificado, entretanto, que estas células podem reassumir sua função normal se elas são coloca- 10 das em sua relação espacial original com as apropriadas células adjacentes.

Uma abordagem conhecida tenta recriar a matriz extracelular através de cultura de células "tridimensionalmente" dentro de estruturas su- porte espaciais, também conhecidas como tablados.. Tablados são pelo me- nos pelo menos estruturas porosas, semelhantes a espuma tendo grande área de superfície interna.

Tablados de materiais biodegradáveis ("reabsorvíveis") são co- nhecidos. Estes são ditos, inter alia, permitirem o crescimento gradual de células no tablado para substituição de tablado por sua própria matriz extra- celular.

O pedido de patente publicado US 2005/0063939 A1 descreve

um tablado apropriado para engenharia de tecido que compreende um polí- mero elastomérico, biodegradável contendo ácido cítrico. A patente EP 1 053 757 B1 descreve um material veículo de colágeno (gelatina). O pedido de patente internacional publicado WO 2006/099137 A1 descreve um tabla- 25 do para cura de ferimento compreendendo fibrina e/ou albumina reticulada. O pedido de patente internacional publicado WO 2002/062961 mostra a pro- dução de tablados a partir de peptídeos que se autoarranjam em unidades maiores (peptídeos de "automontagem") de modo a encapsular células.

Uma possível desvantagem do uso de materiais reabsorvíveis é que eles decompõem muito rapidamente para assegurar a necessária esta- bilidade mecânica. Em partículas, existe o risco de que vasos produzidos com o auxílio de tablados reabsorvíveis não transportarão sangue confia- velmente. Ainda uma possível desvantagem é que material residual perma- nece, o que inicia reações de rejeição ou de corpo estranho. Por estas e ou- tras razões, tablados de materiais não-reabsorvíveis também foram propos- tos.

Relatório descritivo WO 03/070084 descreve um tablado tubular

para a regeneração de vasos sanguíneos a partir de fibras não-reabsorvíveis tais como náilon, SILASTIC®, silicone, poliuretano e poliéster. O pedido de patente publicado internacional WO 2006/096791 mostra o uso de numero- sos polímeros sintéticos reabsorvíveis e não-reabsorvíveis que são disponí- 10 veis atualmente para produção de assim chamados nanofilamentos, a partir dos quais um tablado revestido é para ser construído. Pode ser uma desvan- tagem de materiais não-ressorvíveis que eles iniciam pelo menos leves rea- ções de tecido. Em adição, é possível que os materiais sejam atacados e destruídos no caso de um tempo de implante mais longo no corpo.

Quando cultivando células ou tecidos in vitro, pode ser necessá-

rio tomar-se medidas para suprir nutrientes e/ou oxigênio para as células. No pedido de patente publicado EP 1 230 939 A1 é descrita uma matriz de teci- do vascularizado primária preparada a partir de partes do trato gastrointesti- nal do porco. Durante a preparação deve ser assegurado que uma completa 20 ramificação vascular com artéria entrando e veia saindo está presente. Quando as células animais foram removidas por assim chamados processos de acelularização, a resultante matriz é para ser perfusada com sangue e povoada com células humanas. Desta maneira é dito ser possível suprir mesmo um número relativamente grande de células e maiores espessuras 25 de camadas com nutrientes, minerais e oxigênio suficientes. Uma possível desvantagem, entretanto, é que a matriz usada contém consideráveis quan- tidades de proteína animal e outras moléculas potencialmente imunogênicas. Ainda uma possível desvantagem é a origem animal da matriz torna o pro- cesso de padronização mais difícil.

O pedido de patente publicado internacional WO 2006/042287

A2 mostra um tablado multicamadas com microcanais para uso em enge- nharia de tecido, cujo tablado é revestido com celulose bacteriana. Entretan- to, o tablado descrito ali é otimizado essencialmente para a cultura de tecido de cartilagem e tem estabilidade somente limitada para implante. Em particu- lar, não é claro como revestimento com celulose bacteriana é para ser efetu- ado, porque o procedimento mencionado não conduz a uma camada unifor- 5 me, nem indica como a camada adere ao substrato.

O pedido de patente publicado internacional WO 2001/61026 A1 mostra um processo para a produção de um corpo oco de celulose micro- cristalina de origem bacteriana, cujo corpo oco é dito ser implantável na arté- ria carótida de um rato sem qualquer efeito adverso tal como reação a corpo 10 estranho ou trombose. Entretanto, o processo ali descrito é somente apro- priado para produção de um corpo oco tendo um comprimento de cerca de 20 milímetros.

Problema sustentando a invenção

O objetivo sustentando a invenção é o provimento de um pro- 15 cesso aperfeiçoado para a cultura de células vivas. Um adicional objetivo sustentando a invenção é provimento de um novo uso de uma estrutura compreendendo celulose cristalina. Ainda um objetivo sustentando a inven- ção é prover um processo aperfeiçoado para a produção de uma estrutura suporte compreendendo celulose cristalina, uma estrutura suporte aperfei- 20 çoada para a cultura de células vivas, e um molde oco aperfeiçoado para a produção de uma estrutura suporte compreendendo celulose cristalina. Solução de acordo com a invenção

De modo a obter o objetivo, a invenção ensina um processo para a cultura de células vivas tendo as características de reivindicação 1, o uso 25 de uma estrutura, compreendendo celulose cristalina, tendo as característi- cas de reivindicação 7, um processo para a produção de uma estrutura su- porte tendo as características de reivindicação 8, estruturas suportes tendo as características de reivindicações 16, 17 ou 18, e um molde oco tendo as características de reivindicação 19.

A estrutura suporte de acordo com a invenção pode ser usada

vantajosamente na cultura de células como uma substituição para uma ma- triz extracelular. É um aspecto da presente invenção que ela usa as vantajosas propriedades de celulose cristalina, preferivelmente celulose microcristalina em forma natural, tal como celulose microcristalina produzida pela bactéria Acetobacter xylinum, na preparação de estruturas suportes para a cultura de 5 células vivas.

É uma vantagem obtenível da invenção que as estruturas supor- tes são não-tóxicas e não-imunogênicas. Em particular, é possível para as estruturas suportes não iniciar uma reação imune ou de corpo estranho, ou iniciar somente uma reduzida reação imune ou de corpo estranho, mesmo após implante em um organismo, por exemplo, no organismo humano.

É ainda uma vantagem obtenível da invenção que as estruturas suportes não são ressorvidas. Pelo que é possível assegurar em particular maior estabilidade mecânica durante a cultura das células ou mesmo sobre o prolongado período a seguir.

É uma vantagem obtenível que a estrutura suporte, embora não

seja ressorvida, não interfere, ou interfere menos, com a cultura das células, in vitro e in vivo, em particular porque uma estrutura tendo um baixo teor de celulose já pode assegurar alta estabilidade e o restante da estrutura suporte pode consistir substancialmente em água. Em particular, isto pode assegurar 20 que a substituição de moléculas sinais e/ou o desenvolvimento de gradientes de moléculas sinais, que é de importância para cultura de células. Isto tam- bém pode auxiliar a assegurar que a estrutura suporte não constitui, ou constitui somente um leve obstáculo para a formação ou ligação de uma ma- triz extracelular. É uma adicional vantagem obtenível que a estrutura suporte 25 tem propriedades mecânicas similares ao tecido-alvo. A invenção torna pos- sível um tecido cultivado com a estrutura suporte de acordo com a invenção não diferir, ou diferir menos, em termos de suas propriedades fundamentais de um tecido no qual nenhuma celulose está presente.

É uma vantagem obtenível da presente invenção que a estrutura suporte pode ser produzida por meio de um molde.

Em particular, uma estrutura adaptada para um específico pro- pósito pode ser planejada ou modelada sobre exemplos naturais. É um aspecto do processo de acordo com a invenção para a produção de uma estrutura suporte e do molde oco de acordo com a inven- ção que ele faz uso do princípio de "molde partido".

É um objeto obtenível do processo de acordo com a invenção 5 para a produção de uma estrutura suporte e do molde oco de acordo com a invenção que contornos de caixa de moldar não representam mais um obs- táculo durante retirada de molde. Da mesma maneira, é possível em particu- lar para mesmo moldes ocos de formato complexo serem usados em uma maneira simples. Em particular, é uma vantagem obtenível que mesmo es- 10 truturas suportes de forma complexa, em particular aquelas tendo contornos de caixa de moldar, podem ser produzidas em uma maneira simples.

A invenção pode ser usada, por exemplo, para cultura de dife- rentes tipos de células in vitro, individualmente ou juntas, em uma maneira tal de modo a formar das mesmas uma maior unidade de tecido, que pode 15 ser estudada sobre prolongados períodos de tempo. O processo de acordo com a invenção e as estruturas suportes de acordo com a invenção são a- propriados em particular para a cultura tridimensional de células, por exem- plo, células mamíferas. O processo de cultura e as estruturas suportes tam- bém podem ser usados para a preparação e/ou regeneração de tecido vivo, 20 em particular de órgãos ou tecido humano. A invenção pode ser usada para a recriação de estruturas extracelulares de tecido natural, que são subse- quentemente povoadas com os tipos de células que ocorrem naturalmente naqueles tecidos.

Após terem sido cultivadas in vitro, as células ou tecido pode ser 25 implantado, por exemplo, em um organismo vivo, em particular em um ma- mífero, em particular seres humanos. Entretanto, também é concebível im- plantar a estrutura suporte sem povoar previamente a mesma, de modo a permitir povoamento in vivo. A estrutura suporte pode iniciar a auto - organi- zação das células in vivo através de provimento de uma estrutura. Desta 30 maneira, a invenção pela primeira vez oferece a possibilidade de específica e estavelmente reestruturação de um tecido (macio) in vivo.

Composição e ainda desenvolvimento da solução de acordo com a invenção A estrutura suporte preferivelmente compreende celulose crista- lina. A estrutura suporte preferivelmente consiste substancialmente em água e celulose cristalina, particularmente e preferivelmente celulose microcristali- na, como é formada pela bactéria Acetobacter xylinum. O material preferido 5 compreende menos que 10 por cento de celulose cristalina. No material pre- ferido, a água está parcialmente ligada e com graus variáveis de resistência à celulose microcristalina. Celulose cristalina provou ser particularmente a- mistosa para tecido em experimentos. Os organismos formadores de celulo- se são preferivelmente bactérias, particularmente e preferivelmente bactérias 10 da linhagem Acetobacter xylinum. É concebível que outros micro-organismos formadores de celulose também sejam usados, tais como, por exemplo, a- propriadas linhagens de Agrobacterium, rhizobium, Sarcina, Pseudomonas, Achromobacter, Aerobacter, e Zooglea. Devido os genes dos complexos de enzimas sintetizando celulose de Acetobacter xylinum serem conhecidos, 15 eles também podem ser introduzidos em outros micro-organismos, como, por exemplo, Escherichia coli, usando conhecidos processos de biologia mo- lecular, como um resultado do que estes organismos também podem sinteti- zar celulose. Estruturas suportes de combinações de celulose cristalina e outros materiais também são concebíveis, entretanto, por exemplo, com po- 20 límeros ressorvíveis ou não-ressorvíveis sintéticos, por exemplo, aqueles mostrados no pedido de patente publicado internacional WO 2006/096791. A totalidade do conteúdo relevante do relatório descritivo mencionado acima é aqui incorporada por referência na presente descrição. Também é concebí- vel que a estrutura suporte compreenda colágeno, como mostrado, por e- 25 xemplo, no relatório descritivo de patente europeia EP 1 053 757, fibrina e/ou albumina, como mostrado no pedido de patente publicado internacional WO 2006/099137 A1, ou tecido natural acelularizado, como mostrado, por exemplo, no pedido de patente publicado Europeu EP 1 230 930 Al. A tota- lidade do conteúdo relevante dos relatórios descritivos mencionados acima é 30 incorporada por referência na presente exposição. O outro material é preferi- velmente substancialmente completamente encerrado por celulose cristalina.

Uma estrutura suporte particularmente verdadeira tem em seu interior uma pluralidade de vazios que são separados uns dos outros. Os vazios podem ser, por exemplo, globulares ou podem formar canais tubula- res, particularmente e preferivelmente canais espirais. Os vazios são particu- larmente e preferivelmente conectados ao exterior da estrutura suporte atra- 5 vés de aberturas, por exemplo, através de canais tubulares. É uma vanta- gem obtenível desta modalidade da invenção que células a serem cultiva- das, ou precursores das células a serem cultivadas, sejam capazes de pene- trar nos vazios a partir do exterior através de aberturas. É também concebí- vel para um meio, por exemplo, um meio nutriente ou sangue, fluir através 10 de um vazio no qual células foram depositadas, de modo a suprir as células com nutrientes e oxigênio ou para influenciar o desenvolvimento das células por meio do fluxo. As aberturas também podem ser usadas para permitir que um produto das células, por exemplo, ceratina, passe para o exterior.

Uma estrutura suporte preferida compreende pelo menos um vazio tubular que ramifica em pelo menos uma localização. Particularmente e preferivelmente, pelo menos uma das ramificações converge novamente em uma diferente localização. Particularmente e preferivelmente, a estrutura suporte compreende um sistema de tubos ramificados e novamente conver- gindo, similar a um sistema vascular. O vazio é preferivelmente conectado ao exterior da estrutura suporte em pelo menos duas localizações através de uma abertura. Particularmente e preferivelmente, as localizações nas quais o vazio ramifica e as localizações nas quais as ramificações convergem no- vamente são dispostas entre as duas localizações nas quais o vazio está conectado ao exterior da estrutura suporte através de aberturas. É uma van- tagem obtenível desta modalidade da invenção que líquidos, por exemplo, soluções nutrientes ou sangue, possa ser feito passar através de ramifica- ções, o líquido sendo introduzido na primeira das duas localizações e nova- mente removido na segunda.

No processo de acordo com a invenção para a produção de uma estrutura suporte de celulose, a celulose é preferivelmente celulose cristali- na. Os organismos formadores de celulose são preferivelmente bactérias, particularmente e preferivelmente bactérias da linhagem Acetobacter xyli- num. Vários meios nutrientes são descritos para a cultura de Acetobacter xylinum. Um meio apropriado que é frequentemente usado é meio de Se- hramm and Hestrin, que é descrito em Biochemical Journal 58 de 1954, pp. 345-352. A totalidade do conteúdo relevante do artigo mencionado acima é 5 incorporada por referência na presente exposição. Uma desvantagem deste meio pode ser que ele não é precisamente definido, porque ele contém ex- trato de levedura e peptona.

Um meio inteiramente sintético é preferido para modalidade da presente invenção, como descrito, por exemplo, por Forng et al. em Applied 10 and Environmental Biology of 1989, Vol. 55, No. 5, pp. 1317-1319. A totali- dade do conteúdo relevante do artigo mencionado acima é incorporada por referência na presente exposição. Uma desvantagem deste meio pode ser o crescimento levemente menor das bactérias.

Também é concebível usar assim chamado chá de cogumelo Kombucha para modalidade da invenção. Assim como compreendendo Ace- tobacter xylinum, esta cultura compreende muitos outros organismos em simbiose, tais como leveduras e bactérias, e pode ser suportada por um meio consistindo unicamente em chá preto e sucrose (100 g/L).

No processo de produção de acordo com a invenção, a defor- mação irreversível pode ocorrer, por exemplo, através de deformação plásti- ca, através de uma perda de forma por ruptura ou através de transição pelo menos parcial em um estado líquido ou gasoso de agregação, preferivel- mente por fusão ou evaporação. Entretanto, modalidades da invenção tam- bém são concebíveis nas quais deformação é efetuada através de tratamen- to químico, por exemplo, solvente, ou através de tratamento mecânico, por exemplo, através de ultrassom. A parte do molde oco que é irreversivelmen- te deformada na etapa de retirada de molde é preferivelmente adjacente, antes de deformação, à celulose formada no molde oco. A etapa de retirada de molde de molde oco é preferivelmente realizada após a estrutura suporte ter enchido completamente o molde oco.

Em uma modalidade preferida do processo de produção de a- cordo com a invenção, o molde oco compreende um molde externo e pelo menos um núcleo de molde. É uma vantagem obtenível desta modalidade da invenção que uma estrutura suporte com vazios pode ser formada usan- do o molde oco. Um núcleo de molde é preferivelmente parte do molde oco que é irreversivelmente deformado na retirada de molde. É um aspecto des- 5 ta modalidade da invenção que ela não faz uso do conhecido conceito da técnica anterior de um núcleo de molde que pode ser retirado na retirada de molde. O molde oco também pode compreender mais de um núcleo de mol- de. No caso de uma pluralidade de núcleos de molde, preferivelmente pelo menos um núcleo de molde, particularmente e preferivelmente todos os nú- 10 cleos de molde, são irreversivelmente deformados na etapa de retirada de molde. Durante retirada de molde, o núcleo de molde é preferivelmente tra- tado pelo menos parcialmente com calor. A etapa de retirada de molde pre- ferivelmente compreende fusão pelo menos parcial do núcleo de molde. É possível que todo o núcleo de molde ou somente partes específicas do 15 mesmo sejam fundidas. Por exemplo, é concebível que o núcleo de molde compreenda um ou mais constituintes não-fundíveis que são ligados a, pre- ferivelmente mantidos juntos através de um ou mais constituintes fundíveis.

Em uma modalidade preferida da invenção, o ponto de fusão da parte do molde oco que funde na etapa de retirada de molde está acima de 20 28°C, particularmente e preferivelmente em, ou acima de 30°C, particular- mente e preferivelmente em ou acima de 60°C. É uma vantagem obtenível desta modalidade da invenção que o núcleo de molde permaneça estável durante a cultura de celulose. Em uma modalidade preferida da invenção, o ponto de fusão da parte do molde oco que funde na etapa de retirada de 25 molde está abaixo de 100°C, particularmente e preferivelmente abaixo de 80°C, particularmente e preferivelmente 62°C. É uma vantagem obtenível desta modalidade da invenção que a estrutura suporte de celulose não é danificada quando o núcleo de molde é fundido.

Durante retirada de molde do molde oco, o núcleo de molde é preferivelmente e substancialmente removido, particularmente e preferivel- mente e quantitativamente, ou seja, sem um resíduo.

A parte do núcleo de molde que funde durante retirada de molde é preferivelmente e substancialmente hidrofóbica. É um aspecto desta mo- dalidade da invenção que é feito uso do fato de que um material hidrofóbico é repelido pela superfície hidrofílica do corpo de celulose. É uma vantagem obtenível desta modalidade da invenção que o molde oco pode ser removido 5 substancialmente e quantitativamente.

Em uma modalidade preferida da invenção, a parte do núcleo de molde que funde durante retirada de molde compreende um material termo- plástico, particularmente e preferivelmente uma cera termoplástica e/ou ma- terial polímero. É uma vantagem obtenível de núcleos de molde de materiais 10 termoplásticos que eles podem ser produzidos por fusão. É ainda uma van- tagem de materiais de cera e/ou polímero que suas superfícies podem ser alisadas simplesmente por polimento, de modo a facilitar a ligação próxima à celulose sintética.

Um preferido material de cera e/ou polímero compreende álcool 15 polivinílico (PVA), particularmente e preferivelmente em uma quantidade de mais de 1 %, particularmente e preferivelmente mais que 50%. Em uma mo- dalidade particularmente preferida da invenção, o material de cera e/ou po- límero consiste substancialmente e completamente em álcool polivinílico. É uma vantagem obtenível desta modalidade da invenção que é possível evitar 20 deixar para trás resíduos tóxicos após remoção do molde oco, porque álcool polivinílico não é tóxico.

Um outro preferido material de cera e/ou polímero é assim cha- mada "cerca verão", que é conhecida de odontologia. É uma vantagem ob- tenível desta modalidade da invenção que o material é tão mecanicamente 25 estável que mesmo estruturas de filigramas são retidas. É uma vantagem obtenível desta modalidade da invenção que é possível evitar deixar para trás resíduos tóxicos após remoção do molde oco, porque cera de verão não é tóxica.

Em um processo de produção preferido, o núcleo de molde tem pelo menos uma tira que ramifica em pelo menos uma localização. Pelo me- nos algumas das ramificações preferivelmente convergem novamente em uma diferente localização. É uma vantagem obtenível desta modalidade da invenção que um sistema de tubos de ramificação e novamente convergen- tes, similar a um sistema vascular, possa ser criado na estrutura suporte. O núcleo de molde é preferivelmente composto por filamentos de cera, preferi- velmente de cera de verão, como conhecido em odontologia. Os filamentos são preferivelmente fundidos uns aos outros.

Uma estrutura suporte preferida produzida pelo processo de produção tem pelo menos uma abertura através da qual o núcleo de molde preferivelmente fundido ou seus resíduos podem deixar o interior da estrutu- ra suporte. A estrutura suporte preferida tem em seu interior pelo menos um 10 rebaixamento, preferivelmente de modo que um núcleo de molde rígido que enche completamente o interior do corpo oco não possa ser removido do corpo oco sem deformação de núcleo de molde. A estrutura suporte preferi- velmente tem em seu interior pelo menos um vazio que é acessível a partir do exterior somente através de passagem por uma porção estreita, a seção 15 transversa da qual é menor que a seção transversa do vazio.

Breve Descrição dos Desenhos

A invenção é explicada ainda em detalhes abaixo com referência a desenhos diagramáticos e modalidades. Nos desenhos:

A Figura 1: mostra uma primeira vista em perspectiva, em forma diagramática, de uma primeira modalidade de um núcleo de molde para o processo de acordo com a invenção para a produção de uma estrutu- ra suporte;

A Figura 2: mostra uma segunda vista em perspectiva, em forma diagramática, da primeira modalidade de um núcleo de molde para o processo de produção de acordo com a invenção;

A Figura 3: mostra uma vista em perspectiva, em forma dia- gramática, de uma segunda modalidade de um núcleo de molde para o pro- cesso de produção de acordo com a invenção;

A Figura 4: mostra uma vista em seção transversa, em forma diagramática, de um arranjo para modalidade de processo de produção de acordo com a invenção.

A Figura 5: mostra uma vista em perspectiva, em forma dia- gramática, de uma modalidade de uma estrutura suporte de acordo com a invenção.

Descrição com referência a uma modalidade

As Figuras 1 e 2 mostram um arranjo 1 para a produção de uma estrutura suporte de celulose de apropriados núcleos de molde 2, 3 de fila- mentos de cera enrolados helicoidalmente, por exemplo, de cera de verão. Os filamentos são dispostos em dois planos, os filamentos em cada plano sendo orientados substancialmente paralelos uns aos outros. Os filamentos de cera 2 no primeiro plano são orientados em um ângulo de, por exemplo, 90° em relação àqueles 3 do segundo plano. Os dois planos estão direta- mente acima um do outro e são mostrados destacados na Figura 1 somente por razões de clareza. Filamentos 2 do primeiro plano tocam filamentos 3 do segundo plano em algumas localizações. Os filamentos de cera em espiral podem ser produzidos em um processo de extrusão, por exemplo. O arranjo 1 é apropriado para produção de uma estrutura suporte de celulose que tem vazios helicoidais, alguns dos vazios helicoidais sendo conectados a outros através de aberturas.

Uma segunda modalidade de um núcleo de molde para o pro- cesso de acordo com a invenção para a produção de uma estrutura suporte 20 é mostrada na Figura 3. Gotas globulares de cera 4, por exemplo, tendo um diâmetro de aproximadamente 50 a 100 μιτι, são suspensas sobre fios finos, por exemplo, fios de cera ou fios de aço 5, que são ancorados a um corpo 6, por exemplo, a uma placa 6. O arranjo é apropriado para a produção de uma estrutura suporte tendo uma pluralidade de vazios globulares, que são pro- 25 duzidos pelas gotas de cera 4, os vazios sendo conectados ao exterior da estrutura suporte por canais estreitos, que são produzidos pelos fios 5.

Uma modalidade de um arranjo para modalidade do processo de acordo com a invenção para a produção de uma estrutura suporte é mostra- da em forma diagramática na Figura 4. Um vaso estéril 7 é enchido com uma 30 solução nutriente estéril 8 consistindo em 20 g de glicose, 5 g de extrato de levedura, 5 g de bactopeptona, 2,7 g de fosfato de sódio e 1,15 g de monoi- drarto de ácido cítrico, pH 6,0, e inoculada com uma cultura preliminar de 3 dias de Acetobacter xylinium (por exemplo, Gluconacetobacter xylinus, DSM No. 2325, DSZM Brunswick). Quando, após cerca de 7 dias, uma camada 9 de celulose tendo uma espessura de cerca de 3 mm foi formada sobre a su- perfície do líquido, a camada 9 é suportada por uma rede 10 de Teflon (poli 5 tetra flúor etileno expandido ePTFE, por exemplo, GLIDE dental floss, W.L. Gore and Associates Inc.), que é grampeada em uma estrutura de vidro transportada por suportes de vidro. Um molde oco tendo uma pluralidade de planos com núcleos de molde 11, 12, 13 de cerca de verão é colocado sobre a superfície de celulose 9 suportada pela rede 10 e cultivada a 28°C em uma 10 incubadora.

Geralmente demora de 2 a 3 semanas para o molde oco tornar- se povoado com as bactérias e completamente enchido com celulose. Du- rante este tempo deve ser assegurado que o meio 8 que foi consumido ou evaporado seja substituído, se necessário. Quando o molde oco é enchido 15 completamente com celulose, a estrutura suporte é removida e então aque- cida a cerca de 65°C de modo que os núcleos de molde fundem e deixam para trás vazios na estrutura suporte. Aquecimento ao mesmo tempo serve para esterilizar a estrutura suporte.

A Figura 5 mostra um exemplo de uma estrutura suporte 14 que foi produzida por meios de um núcleo de molde formado por filamentos de cera que foram fundidos para formação de uma rede 15 de fios de ramifica- ção e novamente convergindo. Os filamentos de cera usados são filamentos de cera de verão, que são comercialmente disponíveis no campo dentário. Quando a celulose encheu completamente o molde oco tendo os filamentos de cera intertecidos 15 como núcleo de molde, a estrutura suporte 14 é re- movida e aquecida a 65°C de modo a fundir os filamentos de cera interteci- dos. A cera assim pode ser removida substancialmente e completamente da estrutura suporte 14. Ali permanece um vazio de tubos de ramificação e no- vamente convergentes, similar a um sistema vascular. O vazio é conectado ao exterior da estrutura suporte em duas localizações através de uma aber- tura. As localizações nas quais o vazio ramifica e as localizações nas quais as ramificações novamente convergem são dispostas entre as duas localiza- ções nas quais o vazio está conectado ao exterior da estrutura suporte 14 através de aberturas.

Claims

1. Processo para a cultura de células vivas, onde as células são cultivadas sobre uma estrutura suporte (14), caracterizado pelo fato de que a estrutura suporte (14) compreende celulose cristalina.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a estrutura suporte (14) compreende celulose microcristalina.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado em que a celulose microcristalina foi formada por bactérias das espécies Aceto- bacter xylinum ou por complexos de enzimas para síntese de celulose que foram obtidos daquelas espécies.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado em que a estrutura suporte (14) tem em seu interior uma pluralidade de vazios que são separados uns dos outros.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado em que a estrutura suporte compreende pelo me- nos um vazio tubular (15) que ramifica em pelo menos uma localização.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado em que pelo menos algumas das ramificações convergem novamente em uma diferente localização.

7. Uso de uma estrutura compreendendo celulose cristalina co- mo uma estrutura suporte (14) para a cultura de células vivas.

8. Processo para a produção de uma estrutura suporte (14) compreendendo celulose cristalina para a cultura de células vivas, compre- endendo as etapas de: - preparação de um molde oco; - cultura de organismos de formação de celulose em um espaço interior formado pelo molde oco, de modo a permitir que a estrutura suporte cresça no espaço interior; - retirada de molde do molde oco; caracterizado em que pelo menos parte (2,3,4) do molde oco é irreversivel- mente deformada na etapa de retirada de molde de molde oco.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado em que o molde oco compreende um molde externo e pelo menos um núcleo de molde (2, 3, 4, 5), e pelo menos parte do núcleo de molde (2,3,4,5) é irrever- sivelmente deformada na etapa de retirada de molde.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado em que o núcleo de molde (2,3,4,5) é substancialmente removido na etapa de retirada de molde de molde oco.

11. Processo de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracteri- zado em que a etapa de retirada de molde compreende fundição pelo menos parcial do núcleo de molde (2, 3, 4, 5).

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado em que o ponto de fusão da parte (2,3,4) do núcleo de molde (2, 3, 4, 5) que funde na etapa de retirada de molde está acima de 28°C.

13. Processo de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracteri- zado pelo fato de que a parte (2, 3, 4) do núcleo de molde (2, 3, 4, 5) que funde durante retirada de molde é substancialmente hidrofóbica.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado em que a parte (2, 3, 4) do núcleo de molde (2, 3, 4, 5) que funde durante retirada de molde compreende um material polímero e/ou cera termoplástico.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, caracterizado em que o núcleo de molde (2,3,4,5) tem pelo menos um fio que ramifica em pelo menos uma localização.

16. Estrutura suporte (14) para a cultura de células vivas, carac- terizada em que ela foi produzida de acordo com um dos processos como definidos nas reivindicações 8 a 15.

17. Estrutura suporte (14) para a cultura de células vivas, tendo pelo menos um vazio tubular (15) que ramifica em pelo menos uma localiza- ção, onde pelo menos algumas das reivindicações convergem novamente em uma diferente localização, caracterizada em que a estrutura suporte (14) compreende celulose cristalina.

18. Estrutura suporte (14) para a cultura de células vivas, tendo em seu interior uma pluralidade de vazios que são separados uns dos ou- tros, caracterizada em que a estrutura suporte (14) compreende celulose cristalina.

19. Molde oco para a produção de uma estrutura suporte (14) compreendendo celulose cristalina para a cultura de células vivas, caracteri- zado em que ele compreende um núcleo de molde (2,3,4,5) que é formado pelo menos parcialmente por álcool polivinílico e/ou cera de verão (summer wax).