DE1907556C3 - Antibioticum 18 631 R.P. und Verfahren zu dessen Herstellung sowie dieses Antibioticum enthaltende pharmazeutische Mittel - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft das neue Antibioticum 18 631 R. P. der Formel CH,

OH

/Cc

NH-CO CH₂

CH

Il

C(CHj)₂

und ein Verfahren zu dessen Herstellung sowie dieses Antibioticum enthaltende pharmazeutische Mittel.

Das neue Antibioticum besitzt hohe antibakterielle Wirksamkeit gegenüber grampositiven Keimen und eine bemerkenswerte Wirksamkeit gegenüber gewissen gramnegativen Keimen. w)

Seine Wirkung wurde in verschiedenen Versuchen und im Vergleich sowohl gegenüber dem Novobiocin als auch gegenüber dem Erithromycin, das wegen seiner Wirkung auf grampositive Keime bekannt ist, geprüft. Nachstehend sind die hierbei erhaltenen Ergebnisse zusammengestellt.

Bakteriostatische Aktivität von 18 631 R.P. in vitro

Das Antibiotikum 18 b31 R.P. weist eine beträchtliche antibiotische Wirksamkeit gegenüber einer gewissen Anzahl von Bakterien auf, von denen die empfindlichstcn zu denjenigen gehören, die die Färbung nach Gram annehmen. Seine Aktivität ist gegenüber Siaphylokok ken besonders hoch. Es zeigt eine begrenztere Wirksamkeit gegenüber den gramnegativen Bakterien, obgleich es auch hier noch eine bemerkenswerte Wirksamkeit, insbesondere gegen gewisse Neisseria ausübt.

Es zeigt keine gekreuzte Resistenz mit Aureomycin, Streptomycin, Chloramphenicol, Erythromycin, Carbomycin. Spiramycin und Pristinamycin, dagegen jedoch eine beträchtliche gekreuzte Resistens mit Novobiocin.

In der nachfolgenden Tabelle I sind die Konzentrationen von 18 631 R.P. angegeben, die für die ßakteriostase einiger Keime erforderlich sind. Es wurde die minimale Hemmkonzentration mit einer üblichen Verdünnungsmethode bestimmt, d. h. wobei jegliche sichtbare Entwicklung in dem Nährmedium verhindert wird. Als Versuchsmedium wurden die für derartige Versuche üblichen verwendet, vgl. Microbiological Methods, 3. Auflage von Ch. Collins und P. L y η e (Butterworths University Park Press).

Tabelle I

nen der Maus bei Verabreichung auf oralem und subcutanem Wege auf.

In der folgenden Tabelle Il sind die erhaltenen Werte für das erfindungsgemäße Antibiotikum 18 631 R.P. und für Novobiocin gegenübergestellt

Tabelle Il

Geprüfte Bakterienorganismen

Minimale Hemmkonzentraüon in

18631RP Novobiocin

Geprüfte Bakterienorganismen	Minimale
	Hemmkon
	zentration in
Staphylococcus aureus, Stamm 209 P -
ATCC 6538 P	0,005
Staphylococcus aureus, Stamm Smith	0,003
Sarcina lutea - ATCC 9341	0,02
Streptococcus faecalis - ATCC 9790	0,04
Streptococcus viridans (Institut Pasteur)	3
Streptococcus pyogenes haemolyticus
(Stamm Dig 7, Institut Pasteur)	0,05
Diplococcus pneumoniae (Stamm TiI,
Institut Pasteur)	0,03
Neisseriä cararrhalis (A 152 - Institut
Pasteur)	0,005
Neisseriä meningitidis (5813 - Institut
Pasteur)	0,05
Neisseriä gonorrhoeae (A 50 - Institut
Pasteur)	0,4
Lactobacillus casei - ATCC 7469	1
Bacillus subtilis - ATCC 6633	0,6
Bacillus cereus - ATCC 6630	0,5
Mycohacterium species - ACTT 607	10
Escherichia coli - ATCC 9637	10
Proteus vulgaris	13
Klebsieila pneumoniae - ATCC 10031	1
Pseudomonas aeruginosa (Stamm Bass -
Institut Pasteur)	4
Brucella bronchiseptica (CN 387 -
Wellcome Institut)	0,3
Brucella abortus bovis B 19
(52 135 - Institut Pasteur)	0,1
Pasteurella multocida (A 125 -
Institut Pasteur)	7
Treponema (Reiter)	12

Die antibakterielle Wirksamkeit von 18 631 R.P. wurde in vivo bei Versuchstieren bestätigt, die experimentell mit Keimen, wie beispielsweise Streptokokken, Pneuniokokken und Slaphylokokken, infiziert wiireri. D;is Antibioticum hat sich bei der Maus bei Verabreichung auf oralem und subcutanem Wege als besonders wirksam erwiesen. Es weist auch eine sehr gute Präventivwirkung gegen Staphylokokkeninfektio-Staphylococcus aureus, Stamm

209 P - ATCC 6538 P 0,005 0,4

Staphylococcus aureus,	0,003	0,07
Stamm Smith	0,02	0,2
Sarcina lutea - ATCC 9341
Streptococcus faecalis -	0,04	0,6
ATCC 9790
Streptococcus viridans	3	15
(Institut Pasteur)
Streptococcus pyogenes
haemolyticus (Stamm Dig 7,	0,05	0,7
Institut Pasteur)
Diplococcus pneumoniae	0,03	0,8
(Stamm TiI, Institut Pasteur)
Neisseriä catarrhalis (A 152 -	0,005	0,06
Institut Pasteur)
Neisseriä meningitidis (5813 -	0,05	0,2
Institut Pasteur)
Neisseriä gonorrhoeae (A 50 -	0,4	1,6
Institut Pasteur)
Lactobacillus casei - ATCC	1	0,06
7469	0,6	0,8
Bacillus subtilis - ATCC 6633	0,5	1,2
Bacillus cereus - ATCC 6630
Mycobacterium species -	10	6
ATCC 607	10	55
Escherichia coli - ATCC 9637	13	>150
Proteus vulgaris
Klebsiella pneumoniae -	1	1
ATCC 10 031
Pseudomonas aeruginosa
(Stamm Bass - Institut	4	>150
Pasteur)
Brucella bronchiseptica	0,3	8
(CN 387 - Wellcome Institut)
Brucella abortus bovis B 19	0,1	10
(52 135 - Institut Pasteur)
Pasteurella multocida	7	Ί ö A°
(A 125 - Institut Pasteur)	12	6
Treponema (Reiter)

Aktivität bei den experimentellen Infektionen
ander Maus

1. Aktivität an Infektionen mit
grampositiven Kokken

a) Kurativc Aktivität

Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen 18 631 R.P. wurde im Vergleich zu Novobiocin gegenüber Infektio-

non. welche auf intraperitonalcm Wege mit Staphylococcus (Stamm Smith). Streptococcus (Stumm Dig. 7) und Pneumocoecus (Stamm TiI) erzeugt wurde und eine Infektion, welche intravenös mn Staphylococcus (Stamm I 33) erzeugt wurde.

Man injiziert intraperitoneal oder intravenös 0.5 ecm einer 18 Stunden alten Kultur des zu untersuchenden Krregers in einem geeigneten flüssigen Medium, zweckmäßig verdünnt auf 5% in physiologischer Lösung oder in Mucin. Das Beimpfen ruft den Tod der Kontrolliere zwischen 24 bis 48 Stunden hervor.

Das zu untersuchende Antibiotikum wird einmal täglich während 2 oder 3 aufeinander folgenden Tagen oral oder subkutan verabreicht;die erste Verabreichung erfolgt 1 Stunde nach der Beimpfung. Man verwendet Finmal- Dosen, welche in 50 eem/kg enthalten sind. Man untersucht 4 oder 5 steigende Dosen und 10 Mäuse je Dosis. Die 50%ige kurative Dosis (DC™) ist diejenige Dosis ;in Antibiotikum, die nach täglicher Verabreichung vsährend 2 oder 3 Tagen das Überleben der Hälfte der Mäuse während des gesamten Versuches (8 Tage) ermöglicht.

b) Präventive Wirksanikeil

Die präventive Aktiv ität wird an der experimentellen Siaphylomykose der Maus (Staphylococcus Smith) bestimmt.

Das zu untersuchende Antibiotikum wird oral verabreicht. Die Verabreichung ist einmalig und erfolgt 6 Stunden und 24 Stunden vor der Beimpfung mit dem Erreger. Man verwendet einmalige Dosen, welche in 50 cem/kg enthalten sind. Man untersucht 4 oder 5 gestaffelte Dosen und 10 Mäuse je Dosis.

Der Versuchskeim wird intraperiioneal verabreicht (0.5 ecm einer 18 Stunden alten Kuluir in einem üblichen flüssigen Medium, zweckmäßig verdünn! auf 5% in physiologischer Salzlösung oder in Mucin).

Das Beimpfen mit dem betreffenden Keim ruft den Tod der nicht behandelten Tiere in 24 bis 48 Stunden hervor. Die 50%ige präventive Dosis (DP-,,,) für eine Dauer von 6 Stunden oder 24 Stunden ist diejenige Dosis an dem Antibiotikum, welche bei einmaliger Verabreichung ermöglicht, daß die Hälfte der Mäuse welche nach 6 Stunden oder 24 Stunden infizier! wurden, während der gesamten Versuchsdauer (8 Tage nach der Beimpfung) überleben.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen lila und 1Mb zusammengestellt.

Tabelle IHa

Kuraiivc Wirksamkeit bei oraler Verabreichung:

18631 RP.	Über lebende nach dem 8. Tag	% mittleres DC50 Überleben mg/kg in 8 Tagen p. o.	Novobiocin	(Nalnumsalz)	% mittleres Überleben in 8 Tagen	DC50 mg/ kg p.o.
lx-Dosis mg/kg/Tag	10/10	100	1 X-Dosis mg/kg/Tag	Über lebende nach dem 8. Tag	100
50	10/10	100	50	9/9	83
25	8/10	82 7,5	25	8/10	10	18
10	1/10	12	10	1/10	0
5	1/10	11	5	0/10	0
2.5	0/10	0	2,5	0/10
1	10/10	100			100
250	10/10	100	250	10/10	90
100	10/10	100 17	100	7/10	49	80
50	9/10	97	50	1/10	21
25	1/10	34	25	0/10	2
10	10/10	100	10	0/10	65
500	10/10	100 14/1	500	4/10	47
250	3/10	40 14°	250	2/10	0	500
100	0/10	4	100	0/10	0
50	10/10	100	50	0/10	57
500	3/10	62	500	2/10	41
250	1/10	19 300	250	1/10	2	>500
100	0/10	3	100	0/10	3
50	0/10	I	50	0/10	1
25		25	0/10

Staphylococcus Smith

Staphylococcus 133

Streptococcus Dig. 7

Pneumocoecus Til

	1	18 631 RP.	Über lebende nach dem 8. Tag	9 07 556	8	17	50	10/10	Über lebende nach dem 8. Tag	% mittleres Überleben in 8 Tagen	mg/k(j s. t
7	Kurative Aktivität bei subkutaner Verabreichung:	IX-Dosis mg/kg/Tag	10/10				25	9/10	10/10	100
Keim	50	10/10				10	1/10 .	8/10	94
	25	10/10				5	0/10	0/10	18	17
Staphylococcus Smith	K)	8/10		Novobiocin (Natriumsalz)		2,5	0/10	0/10	5
	5	0/10	% mitttlcrcs I)C5O Ix-I)osis Über- Übcrlcben mg/kg mg/kg/Tag lebende in 8 Tagen s. c. nach dem 8. Tag	170				0
	2,5	0/iO	U)O		250	0/10
	1	10/10	100		100	0/10	9/10	29
	250	5/10	100 4	50	0/10	0/10	18	"""•s/i cn
	100	0/10	82			0/10	2	>250
Streptococcus Dig. 7	50	0/10	8	250	1/10	0/10
	25	9/10	0	100	0/10		56
	250	1/10	100	50	0/10	9	""""./^ cn
	100	0/10	62	25	0/10	2	>250
Pneumococcus TiI	50	0/10	10			3
	25		0
			96	Novobiocin (Natriumsalz)
			57	1 x-Dosis mg/kg/Tag
Tabelle IHb		25 I7°	250	% mittleres Überleben in 8 Tagen	DC50 mg/kg p. 0.
Präventive Aktivität:	Über lebende nach dem 8. Tag	5	100	100
Zeit zwischen 18 631 R. P.	10/10		50	82
Behandlung jx Dosis Sektion mg/kg/Tag	10/10		25	6
6 Stunden 250	10/10			0	80
100	10/10	% mittleres DC50 Überleben mg/kg in 8 Tagen p. 0.
50	0/10	100	500
25	0/10	100	250	92
10	10/10	100	100	0
5	10/lj	100	50	0	380
24 Stunden 500	1/10	4		0
250	0/10	1
100	0/10	100
50		100
25	10
0
0

2. Aktivität bei einer Infektion mit einem

gramnegativen Microkokkos

Die kurative Wirksamkeit wurde gegenüber der Infektion mit Neisseria meningitidis (Stamm IP 5813), der intraperitoneal verabreicht wurde, bestimmt

Man injiziert intraperitoneal 0,5 ecm einer 18 Stunden alten Kultur von Neisseria meningitidis in einem Milieu Trypticase Soy Broth (BBL), versetzt mit 10% Ascites, verdünnt mit 2 - ΙΟ-³ Mucin zu 5%.

Das zu untersuchende Antibiotikum wird oral einma täglich während zwei aufeinander folgenden Tager verabreicht Die erste Gabe erfolgt 1 Stunde nach dei Infektion. Man verwendet einmalige Dosen, die in 5C ccm/kg enthalten sind. Man untersucht 4 oder f gestaffelte Dosen und 10 Mäuse je Dosis.

Die 5O°/oige kurative Dosis (DC50) ist diejenige Dosis an Antibiotikum, welche nach täglicher Verabreichung während 2 Tagen das Oberleben der Hälfte der Mäuse während der gesamten Versuchsdauer ermöglicht Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

18 631 R.P.

lx-Dosis
mg/ kg/Tag

Novobiocin (Natriumsalz)

Überlebende % mittleres DC50 nach dem Überleben in mg/kg

8. Tag 8 Tagen p. o.

lx-Dosis mg/kg/Tag	Überlebende nach dem 8. Tag	% mittleres Überleben in 8 Tagen	DC50 mg/kg p. 0.
100	10/10	100
50	10/10	100
25	7/10	70	1 Π
10	1/10	10	19
5	1/10	3
2,5	0/10	0

50 Stunden

25 Stunden

lOStunden

5 Stunden

2,5 Stunden

1 Stunde

10/10 7/10 7/10 7/10 0/10 1/10

100 67 70 67 3 10

5,5

Vergleich mit Erythromycin

1. Bakteriostatische Aktivitäten in vitro:

Sensible Keime

Minimale Hemmkonzentration
μg/ccm

Erythromycin 18 631 R.P.

Staphylococcus aureus 209 P Sarcina lutea ATCC 9341 Streptococcus faecalis ATCC 9 790 Streptococcus pyogenes Dig 7 Diplococcus pneumoniae TiI Bacillus subtilis ATCC 6633

0,2	0,005
0,02	0,02
0,1	0,04
0,03	0,05
0,015	0,03
0,8	0,6

2. Kurative Wirksamkeit bei experimentellen Infektionen der Maus:

Keime

Art der DC₅₀ mg/kg/Tag

Verabreichung _Erythromycin

p. o. s.

18 631 R. P.

p. o. s. c.

Staphylococcus aureus Smith i. p.

Staphylococcus aureus 133 i. v.

Streptococcus pyogenes Dig. 7 i. p.

Toxizität

DieToxizitätdes Antibiotikums 18 631 R.P wurde bei der Maus geprüft und bei oraler und subcutaner Verabreichung bestimmt Bei diesen beiden Verabreichungsarten hat sich das 18 631 R.P. bei einer Dosis von 1 g/kg als atoxisch erwiesen. Die letale Dosis 50% oder DL-,0 wurde ebenfalls bei oraler und subcutaner Verabreichung bestimmt und beträgt:

DL₅₀= Z2g/kgp.o.
1,7 g/kg S.C.

Diese Ergebnisse zeigen, daß das Produkt wenig toxisch ist

Im Vergleich dazu beträgt die DL50 des Novobiocins 1,6 g/kg p.o. und 0,6 g/kg s.c.

Das Antibioticum 18 631 R.P. wird erfindungsgemäß dadurch hergestellt daß man »Streptomyces hygroscopicus DS 9751«, der unter der Nr. NRRL 3418 hinterlegt wurde, oder »Streptomyces albocinerescens DS 21 647«, der unter der Nr. NRRL 3419 hinterlegt wurde, oder »Streptomyces roseochromogenes, var. oscitans 65
350
150

>250
55

7,5-8

17

140-160

DS 12 976«, der unter der Nr. NRRL 3504 hinterlegt wurde, in an sich bekannter Weise in einem üblichen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und das gebildete Antibioticum aus der Kultur in üblicher Weise abtrennt und reinigt.

Proben der erwähnten Stämme sind beim US-Department of Agriculture in Peoria, 111. (USA) hinterlegt und frei zugänglich.

Das Antibioticum 18 631 R.P. stellt ein mikrokristallines weißes Pulver dar und besitzt die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

Schmelzpunkt: 204-206⁰C.

Löslichkeit

Es ist in Dimethylsulfoxyd leicht löslich, in verdünnten starken Basen, Methanol, Äthanol, Aceton, Dioxan, Chloroform, Dimethylformamid und Äthylacetat löslich und in Wasser, wäßrigen Natriumbicarbonatlösungen, verdünnten starken Säuren, Tetrachlorkohlenstoff, Acetonitril und Hexan wenig löslich oder nicht löslich.

Elemeniarzusammensclzung berechnet für Cr,H !,O_nN₂Cl)

C = 60,29% H = 5.35% O = 25.24% N = 4.02% Cl ■■ 5,09%.

Drehvermögen

λ]?¹ = -68° ± 1,5° (c= 1% in Äthanol)

^:&]/& = -199° ±2,5° (C= 1% in Äthanol)

= -80° ± 2° (c = 0,6% in Aceton)

= -224° ± 2,5° (c = 0,6% in Aceton)

Saure-basische Reaktion

Das 18 631 R.P. ist eine schwache Säure, deren Neutraläquivalent gemessen durch potentiometrische Titration einer Lösung in einem Gemisch Methanol-Wasser (25 : 10 Volumina) mit 1/10 n-Natronlauge. 695 beträgt.

Farbreaktionen

Ultraviolett-Spektrum

(Bestimmung mit einer Lösung mit 10 mg/1 in Chloroform)

Absorptionsmaximum bei275nm(E[^ =444) Schulter bei 307 nm (E^_n, = 201)

Absorptionsmaximum bei 337 nm(E|^_m =434)

Dieses Spektrum ist in F i g. 1 wiedergegeben, in der als Abszisse einerseits die Wellenlänge in Nanometer (nm) (unterer Maßstab) und andererseits die Wellenzahlen in cm ' (oberer Maßstab) und als Ordinate die optischen Dichten aufgetragen sind.

Infrarot-Spektrum

(Die Bestimmung wurde an mit Kaliumbromid verpreßtem Produkt vorgenommen)

Dieses Spektrum ist in Fig.2 gezeigt, in der als Abszisse einerseits die Wellenlängen in Mikron (unterer Maßstab) und andererseits die Wellenzahlen in cm-' (oberer Maßstab) und als Ordinate die optischen Dichten aufgetragen sind.

In der nachfolgenden Tabelle sind die Hauptbanden der Infrarot-Absorption (in cm-') für dieses Produkt angegeben:

Tabelle

3440 Sch	1530 st	980 sch
3360 st	1500 Sch	950 st
3300 Sch	1495 Sch	935 m
3100 Sch	1485 sst	855 m
2970 m	1460 m	810st
2920 st	1430 st	780 st
2840 m	1360 st	750 st
2820 Sch	1315st	735 m
2720 sch	1280 m	720 sch
2560 m	1255 sch	695 sch
2100 m	1215 sst	660 Sch
1850 sch	1190 m	645 Sch
1685 sst	1130 st	625 st
1625 st	1110m	605 Sch
1595 sst	1070 st	565 sch
1555 m	1030 st	555 m
1540 Sch	990 st	530 m
		500 m
sst =	sehr stark
St =	stark
m =	mittel
sch =	schwach
Sch =	Schulter

Das 18 631 R.P. ergibt

Stark positive Teste in folgenden Reaktionen:

Reaktion nach Mol i sch,

Reaktion nach Folin-Denis, Permanganat-Schwefelsäure-Reaktion (in der Kälte),

Fehlingsche Reaktion,
Indol-Schwefelsäure-Reaktion, Cystein-Reaktion,

Carbazol- Reaktion,

Reaktion nach D i s c h e (mit Phloroglucin), Reaktion nach Elson-Morgan und Reaktion nach Dische-Borenfreund (nach Desaminierung);

schwach positive Teste in den folgenden Reaktionen:

Reaktion nach P a u I y,

Reaktion nach Adamkiewicz, Reaktion nach T ο 11 e η s und
Reaktion nach Seliwanoff— Roe;

negative Teste in den folgenden Reaktionen:

Reaktion nach M i 11 ο η,

Ninhydrin-Reaktion,

Biuret-Reaktion,
Xanthoprotein-Reaktion,

Diazotierungsreaktion,

Reaktion nach Ehrlich-Salkowsky, Ferrichlorid- Reaktion,

Reak tion nach M ö r η e r,
Reaktion nach Zimmermann — Bitto, Reaktion nach Pechmann,

Reaktion nach Tauber,

Reaktion nach B i a 1,

Reaktion nach Wheeller — Tollens. Ferrisalzreaktion des Maltols,

Reaktion nach Sakaguchi und Reaktion nach N e s s 1 e r.

Dialyse

Das Antibioticum 18 631 — R.P. dialysiert durch eine Membran aus regenerierter Cellulose (Cellophan-Typ).

Chromatographische Wanderung

(Nachgewiesen durch biologische Prüfung auf mit Staphylococcus albus beimpften Nähragarplatten):

Die auf verschiedenen Trägern und unter dem Einfluß verschiedener Lösungsmittel beobachteten Wanderungen sind nachstehend angegeben.

Träger

System (Zusammensetzung in Volumina)

Rf

Papier Arches 302

nichtgepuiTer;

nichtgepuffert

nichtgepufTert

nichtgepuffert

nichtgepulTert

mit Wasser gesättigtes Butanol
Benzol-Methanol (4:1)
NH₄Cl mit 30g/l in Wasser

Buianol-Essigsäure-Wasser
(4:1:5 - obere Phase)

Äthylacetat-Cyclohexan
(1:1) mit Wasser gesättigt

0,95
0,95
0,05

1,00
0,50

Papier Arches 302	Chloroform	0,50
imprägniert mit einer m/3-Phosphatpuffer- lösung von pH 7	Methanol-Wasser (95:5)	0,27
Aluminiumoxyd (Dünnschicht)	Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:5- obere Phase)	1,00
Kieselgel G (Dünnschicht)	Tetrachlorkohlenstoff-Äthanol-Essigsäure (90:6:6)	0,50
Kieselgel G (Dünnschicht)

Die das Antibioticum 18 631 R.P. erzeugenden Organismen gehören zum Genus Streptomyces und werden mit »Streptomyces hygroscopicus DS 9751« (NRRL 3418). »Streptomyces albocinerescens DS 21 647«(NRRL3419)und »Streptomyces roser chromogenes. \ ar. oscitans« (N RRL 3504) bezeichnet.

Diese Organismen wurden aus Erdproben isoliert, die aus folgenden Gebieten stammten:

Südafrika im Falle des Streptomyces hygroscopicus DS 9751 Frankreich im Falle des Streptomyces aibocinerescens DS 21 647 und Indien im Falle des Streptomyces roscochromogenes. \ ar. oscitans.

Die Isolierung dieser Organismen erfolgte nach der folgenden Methode: Eine kleine Menge Erde wird in destilliertem sterilem Wasser suspendiert, und die Suspension wird dann auf verschiedene Konzentrationen \erdiinnt. Eine kleine Menge jeder Verdünnung wird auf die Oberfläche von Petrischalen aufgebracht, die ein Agar-Nährmedium enthalten. Nach einer Inkubation von einigen Tagen bei 26°C werden die Kolonien der Mikroorganismen, die man isolieren will, um ihre Untersuchung fortzusetzen, entnommen und auf Schrägnähragar versetzt, um reichlichere Kulturen zu erhalten.

Der Stamm DS 9751 besitzt Zusammenhänge mit dem Aussehen von Streptomyces hygroscopicus. desse.i wesentliche Charakteristiken von H. D. Tresner und E. J. B a c k u s (Applied Microbiology, 4,243-250,1956) und von S. A. Waksman (The Actinomycetes, II,The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, S. 230 und 231) definiert wurden. Dies ist der Grund, weshalb er Streptomyces hygroscopicus. Stamm DS 9751, genannt wurde.

S. hygroscopicus DS 9751 weist die drei folgenden Merkmale auf, die den drei Charakteristiken entsprechen, durch die H. D. Tresner und E. J. Backus sow ie S. A. Waksman die Species S. hygroscopicus definiert haben: a) Seine Sporenfäden enden im allgemeinen in dichten Spiralen, die in einigen W indungen aufgerollt sind; diese spiralförmigen Sporenfäden sind um häufigsten längs eines Zentralfadens unter Bildung von mehr oder weniger ausgedehnten Trauben angeordnet: b) das sporulierte luft-ausgesetzte Mycel zeigt, wenn es ein gutes Entwicklungsstadium erreicht hat, eine dunkelgraue Färbung, die derjenigen

entspricht, die die Species S. hygroscopicus zeigt; c) auf gewissen Züchtungsmedien, die eine gute Sporulation ermöglichen, treten durch Alterung in den sporulierten Oberflächen schwarze, glänzende, feucht aussehende, für die Species S. hygroscopicus charakteristische

Zonen auf. Im Falle von S. hygroscopicus DS 9751 erfolgt die Umwandlung des dunkelgrauen Sporenteppichs zum schwarzen Überzug nur ziemlich langsam und in unsteter Weise, wobei die Umwandlung im allgemeinen eher auf kleine Stellen, die auf der

sporulierten Oberfläche verteilt sind, beschränkt ist, als auf dem gesamten Sporenteppich aufzutreten. Sie tritt jedoch in Erscheinung und kann beobachtet werden, insbesondere auf Agar mit Hefeextrakt nach Pridham. Agar mit Hafer nach Carvajal, Agar mit

Ovalbumin und Glucose-Asparagin-Agar.

Die von den Kulturen von S. hygroscopicus DS 9751 gezeigten morphologischen Charakteristiken sind insgesamt denjenigen des Stammes S. hygroscopicus sehr ähnlich, der in »The Actinomycetes« (S. A. W a k s m a η,

The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, S. 230 und 231) beschrieben ist, wobei die bemerkenswertesten Unterschiede gegenüber den beschriebenen Charakteristiken darin bestehen, daß S. hygroscopicus DS 9751 keine Säuerung der Milch, sondern vielmehr

eine sehr schwache Verschiebung nach dem alkalischen Bereich hin bewirkt (der Anfangs-pH-Wert, der 6,3 beträgt, geht in 1 Monat auf 7,0) und außerdem auf Agar nach Czapek mit Saccharose nur ein sehr schwaches bräunliches lösliches Pigment liefert. Der in »The

t><) Actinomycetes« beschriebene Stamm S. hygroscopicus ruft dagegen eine sehr schwache Säuerung der Milch hervor (der pH-Wert erreicht 6,0) und liefert auf »Saccharose-Nitrat-Agar« ein goldgelbes bis hellorangcs lösliches Pigment. Diese geringen Unterschiede

hi erlauben ersichtlicherweise nicht, den Stamm DS 9751 als eine Species anzusehen, die von der Species S hygroscopicus verschieden ist. deren Hauptmerkmale die /u ihrer Definition dienen. DS 9751 im übrigen

aufweist. Es sei darauf hingewiesen, daß die Sporen von S. hygroscopicus DS 9751 zylindrisch bis isodiametrisch mit stumpfförmigen Enden sind, während diejenigen des in »The Actinomycetes« beschriebenen Stammes S. hygroscopicus oval sind, doch wird die Form der Sporen von H. D. Tresner und E. J. Back u s als variabel in der Species S. hygroscopicus, in der diese verschiedenen Formen angetroffen werden, angesehen.

S. hygroscopicus DS 9751 erzeugt auf organischen Medien kein Melaninpigment. Er bildet auf allen seinen Züchtungsmedien ein vegetatives Mycel, das von schwachgelblich bis gelb oder gelbbraun geht, und die löslichen Pigmente, die er erzeugt, weisen gelbe bis gelbbraune Töne auf.

S. hygroscopicus DS 9751 bildet Sporenfäden, die im allgemeinen in dichten Spiralen enden, die am häufigsten 1 bis 5 Windungen aufweisen, obgleich man gelegentlich Spiralen beobachtet, die eine größere Anzahl von Windungen bilden, oder auch einige Sporenfäden, die einfach in ihrem Endteil gekrümmt sind, ohne eine vollständige Windung zu bilden, oder auch manchmal mehr oder weniger schlaffe und auseinandergewickclte Spiralen. Der Sporenteil weist am häufigsten eine Struktur in Traubenform auf, wobei die spiralförmigen Sporenfäden längs eines Hauptfadens angeordnet sind, der in gewissen Fällen eine ziemlich große Länge haben kann. Die Sporen haben eine mehr oder weniger regelmäßige kurze zylindrische Form mit Abmessungen von 0,6 bis 0,9 μ/0,9 bis 1,2 μ. Die spiralförmigen Sporenfäden teilen sich nur sehr langsam unter Freigabe der Sporen und teilen sich außerdem häufig nur teilweise, wobei dann Verkettungen von einigen Sporen freigesetzt werden, die die Form eines mehr oder weniger vollständigen Kranzes beibehalten. Mikroskopische Prüfungen haben eine identische Organisation des Sporenteils auf Agar nach B e η η e 11, Agar mit Hafer und mit Tomate nach P r i d h a m und Glucose-Asparagin-Agar gezeigt.

Die Züchtungscharakteristiken und die biochemischen Eigenschaften des S. hygroscopicus DS 9751 sind in der folgenden Tabelle IV angegeben. Es sind diejenigen von Kulturen, die ein gutes Entwicklungsstadium erreicht haben und etwa ein Alter von 3 bis 4 Wochen bei 26°C haben. Diese Charakteristiken wurden auf üblicherweise zur Bestimmung der morpho- 45 Anm. O: logischen Charakteristiken von Stämmen von Strcptomyces verwendeten Nähragar und Bouillons bestimmt, wobei die Kulturen auf Agarmedium auf Schrägagar durchgeführt wurden. Eine gewisse Anzahl der verwendeten Zürhtungsmedien wurde nach den Rezepturen hergestellt, die in »The Actinomycotes« (S. A. Waksman, S. 193—197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U.S.A., 1950) angegeben sind. In diesem Falle sind die Medien durch den Buchstaben W, dem die

Tabelle IV

Nummer folgt, die ihnen in »The Actinomycetes« gegeben wurde, bezeichnet. Die Literaturstellen für die anderen Züchtungsmedien oder die Zusammensetzungen derselben sind die folgenden:

Anm. A:

Anm. B: Anm. C:

Anm. D: 15 Anm. E.:

Anm. F:

20 Anm. G:

Anm. H:

25

Anm. I: Anm. J:

i()

Anm. K:

Anm. L:

r> Anm. M

40 Anm. N:

50

Anm. P: Anm. Q:

K. L. J ο η e s — Journal of Bacteriology. 57,

142,(1949)

Rezeptur W-23, versetzt mit 2% Agar

»Hickey and Tresners Agar« — T. G.

P r i d h a m und Mitarb, Antibiotics Annual.

»Yeast Extract Agar« — T.G. Pridham u.

Mitarb, Antibiotics · Annual, 1956—195;,

»Tomato Paste Oatmeal Agar« — T. G.

Pridham u. Mitarb, Antibiotics Annual,

W. E. G r u η d y u. Mitarb. — Antibiotics and

Chem,2,401(1952)

0,5% Pepton — 0,3% Fleischextrakt - 0,5%

Tyrozin — 2% Agar

»Melanin formation medium« — The

Actinomycetes, Band 2, Seite 333, Nr. 42 — S.

A. Waksman, The Williams and Wilkins

Company, Baltimore,(1961)

W. E. G r u η d y u. Mitarb. — Antibiotics and

Chem., 1,310(1951)

»Inorganic Salts — Starch Agar« — T. G.

Pridham u. Mitarb, Antibiotics Annual,

entspricht der Rezeptur W-I, wobei 30 g

Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt sind

entspricht der Rezeptur W-I, wobei 30 g

Saccharose durch 15 g Glycerin ersetzt sind

»Plain Gelatin« — hergestellt nach den

Angaben von »Manual of Methods for Pure

Culture Study of Bacteria« der Society of

American Bacteriologists, Geneva, N.Y,

II50-I8

»Synthetic medium of Dimmick« — (nicht

mit Agar versetzt) — «Manual of Methods

for Pure Culture Study of Bacteria« der

Society of American Bacteriologists, Geneva,

N. Y., H₅₀-19

Entspricht der Rezeptur W-18, wobei die

Saccharose weggelassen und durch kleine

Filterpapierstreifen, die teilweise in die

Flüssigkeit eintauchen, ersetzt ist

Handelsübliches Magermilchpulver, nach den

Angaben des Herstellers zubereitet

Für die Untersuchung der Produktion von

HiS von H. D. Tresner und F. D a η g a ,

Journal of Bacteriology, 76, 239-244 (1958),

angegebenes Medium

Kulturmedium	Ent	Vegetatives Mycel	Luftausgesetzter Teil	Lösliches	Beobachtungen
	wicklungs	oder Unterseite der	(umfaßt Gesamtheit von	Pigment	und biochemische
	grad	Kultur	luftausgesetztem Mycel		Eigenschaften
			und Sporulation)
(D	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)

Agar nach gut dick und gefaltet,

Bennett gräulichgelb;

(Anm. Λ) gelbbraune Unter

weißlich bis hellgrau
und dunkelgrau;
sehr mäßig entwickelt

hellgelbbraun

Sporopherenteil in Traubenform; Sporopherenfaden enden in dichten Spiralen mit 1 bis 5 Winduneen

17

18

Fortsetzung	Ent wicklungs grad	Vegetatives Mycel oder Unterseite der Kultur	Luftausgesetzter Teil (umfaßt Gesamtheit von luftausgesetztem Mycel und Spomlation)	Lösliches Beobachtungen Pigment und biochemische Eigenschaften
Kulturmedium	(2)	(3)	(4)	(5) (6)
(1)	gut	dick und gefaltet, gräulichgelb; Unterseite gelbbraun	gräulich-weiß; spärlich entwickelt	orange-braun
Agar nach Emerson (Anm. B)	gut	dick und gefaltet, hellgelbbraun; hellgelbbraune Unter seite	weißlich bis gräulich- weiß; sehr spärlich entwickelt	außerordent lich schwach bräunlich
Agar nach Hickey und Tresner (Anm. C)	sehr gut	gelobraune Unter seite	sehr hellgräulich bis mittelgrau und dunkel grau mit einigen sehr kleinen schwarzen	gelbbraun
Agar mit Hefeextrakt nach Pridham (Anm. D)

Stellen, die für das Aussehen von »Hygroscopicus« charakteristisch sind; ziemlich gut entwickelt

Agar mit Hafer und mit Tomate nach Pridham (Anm. E)

sehr gut dunkelgelbbraune Unterseite

weißlich bis hellgrau und dunkelgrau; gut entwickelt

ziemlich
dunkelgelbbraun

Sporenteil in Traubenform; Sporenfäden enden in dichten Spiralen mit 1 bis 5 Windungen

Agar mit Hafer nach Carvajal (Anm. F)	sehr gut	dunkelkastanien braune Unterseite	weiß-gräulich bis hellgrau und sehr dunkelgrau mit einigen kleinen schwarzen Stellen, die charak teristisch für das Aus sehen von »Hygro- scopicus« sind; sehr gut entwickelt	braun	keine Löslich- machung von Tyrosin
Glucose-Pepton- Agar (W-7)	gut	hellgelb-braune Unterseite	weißlich; in Form von Spuren	hellgräulich- gelbbraun	Bildung von Me lamin; negativ (die Ablesungen er folgten nach den Angaben des Autors)
Nähragar (W-5)	sehr mäßig	mäßig entwickelt hellgelblich; Unter seite gelb	weißlich; in Form von Spuren	keines	Löslichmachung von Malat; positiv
Agar mit Tyrosin (Anm. G)	mäßig	hellgelblich; gelbliche Unterseite	weißlich; mittel mäßig entwickelt	sehr schwach gelblich
Tyrosin-Hefe- extrakt-Agar (»Melaninforma tionmedium« nach Wakaman) (Anm. H)	mäßig	orangebraune Unterseite	gräulich-weiß; in Form von Spuren	violettbraun; keine Schwärzung des Mediums
Agar mit Calciummalat nach K rain sky (Anm. I)	mittel mäßig	hellbräunlichgeibe Unterseite	weißlich bis hell gräulich: mäßig ent wickelt	keines

	19	19	Vegetatives Mycel oder Unterseite der Kultur	07 556	20	Beobachtungen und biochemische Eigenschaften
Fortsetzung			(3)			(6)
Kulturmedium	Ent wicklungs grad	gelbe Unterseite	Luftausgesetzter Teil (umfaßt Gesamtheit von luftausgesetzlem Mycel und Sporulation)	Lösliches Pigment
[I)	(2)	gelbe Unterseite	(4)	(5)	Sporenteil in Traubenform; Sporenfäden enden in Spiralen mit 1 bis 5 Windungen
Agar mit Ovalbumin (W-12)	mäßig	hellgelbbraune Unterseite	weißlich bis hellgrau und dunkelgrau mit einigen sehr kleinen schwarzen Stellen, die charakteristisch für das Aussehen von »My- groscopicus« sind; mäßig entwickelt	hellgelb
Glucose- Asparagin-Agar (W-2)	gut	hellgelbe Unterseite	sehr hellgräulich bis mittelgrau und schwarzgrau mit einigen schwarzen Zonen, die für das Aussehen von »Hy- groscopicus« charak teristisch sind; ziem lich gut entwickelt	hellgelb braun	Hydrolyse von Stärke: positiv
Glycerin- Asparagin-Agar (W-3)	gut	gelbbraune Unter seite	weißlich bis grau; mäßig entwickelt	sehr hell gelbbraun	Hydrolsy von Stärke: positiv
Stärke-Nitrat- Agar (W-IO)	mäßig	hellbräunlichgelbe Unterseite	weißlich mit einigen hellgrauen Stellen; mäßig entwickelt	schwach bräunlich gelb
Agar mit Stärke nach Pridham (Anm. J)	ziemlich gut	hellgelbbraune Unterseite	gräulich-weiß bis hellgrau und dunkel grau; mäßig ent wickelt	schwach gelbbraun
Synthetischer Agar nach Czapek mit Saccharose (W-I)	ziemlich gut	gelbbraune Unterseite	weißlich bis hellgrau; mäßig entwickelt	sehr schwach bräunlich
Synthetischer Agar nach Czapek mit Glucose (Anm. K)	gut	ziemlich gut ent wickelt; schwach gräulichbeige bis sehr hellbräunlich	weißlich; mäßig entwickelt	schwach gelbbraun
Synthetischer Agar nach Czapek mit Glycerin (Anm. L)	mäßig	weißliche Kultur mit der Tendenz, sich in der verflüssig ten Gelatine zu sedimentieren	weißlich; mäßig entwickelt	keines	Verflüssigung der Gelatine: ziemlich gut
Züchtung auf Kartoffel η (W-27)	ziemlich gut	weißlich; spärlich entwickelt	keines
Reine Gelatine mit 12% (Anm. M)	mittel maßig	keiner	keines

Kulturmedium	Km- wicklungs- grad	Vegetatives Mycel oder Ur lerscilc der Kultur	Lultausgeset/tcr Teil (umfallt Gesamtheit von !unausgesetztem Mycel und Sporulation)	Lösliches Pigment	Beobachtungen und biochemische Kigenschaften
(1)	(2)	O)	(4)	(5)	(M
Glucose-Niirat- Bouillon nach I) i m m i c k (Anm. N)	mittel mäßig	weißliche Kolonien an der Oberlläche	gräulichweiß; sehr spärlich entwickelt	keines	Untersuchung von Nitriten: positiv
Bouillon nach Czapek mit Saccharose (W-18)	mäßig	flockige Kultur, sedimentiert weißlich	keiner	keines	Untersuchung von Hitriten: negativ
Boouillon nach Czapek mit Cellulose (Anm. O)	mäßig	gräuliche Kolonien an der Oberfläche	gräulich, auf den Kolonien entwickelt, die sich an der Oberfläche und auf dem in die Bouil lon eintauchenden Papier befinden	keines	Verwartung von Cellulose: positiv
Magermilch (Anm. P) a) 25 C	gut	gut entwickelter Ring, hellbräunlich	keiner oder sehr schwache Spuren, weißlich		vollständige Peptonisation ohne Koagulation -pH geht von 6,3 auf 7,0 in 1 Monat
b) 37 C	spärlich	schlecht entwickelter Ring, orangebraun	gräulichweiß, in Form von Spuren		vollständige Peptonisalion ohne Koagulation -pH geht von 6,3 auf 7,0 in I Monat
Agar nach Tresner und	mäßig	gelbe Unterseite	weißlich, in Form von Spuren	keines	Produktion von H1S: negativ

Denga zur
Untersuchung
der Produktion
von ii S
(Anm. (Ji

Der Stamm DS 21 647 entspricht einer Original-Species, die mn Streptomyces albocinerescens DS 21 647 bezeichnet wurde, auf Grund des Aussehens seines 'üftausge'v'.zten Vhcels. das zunächst eine weiße Färbung ._:iifweist und sich dann in den sporulierten Zonen zjm Zeitpunkt des Auftretens der Sporulation neiigrau färbt. Die Sporulation ist im allgemeinen spärlich und schwach und erfolgt häufig nur sehr langsam. Auf einer gewissen Anzahl von Medien tritt sie überhaupt nicht auf oder nur in einer sehr geringen Menge, wobei das luftausgesetzte Mycel dann weißlich bleibt oder sich außerordentlich hellgrau färbt

S. albocinarescens DS 21 647 erzeugt auf organischen Medien kein Melaninpigment Er bildet auf allen diesen Züchtungsmedien ein vegetatives Mycel, das von gelb nach braungelb oder gelbbraun geht und bildet meistens ein lösliches Pigment mit einer von gelb nach gelbbraun gehenden Farbtönung.

S. albocinerescens DS 21 647 bildet lange, gerade oder schwachgebogene Sporophoren, die im allgemeinen nicht verzweigt sind oder gelegentlich eine oder zwei Verzweigungen aufweisen. Seine Sporen sind oval oder zylindrisch mit abgerundeten Enden und Abmes-

sungen von 0.5 bis 0.7. 1 bis 1,2 μ. Mikroskopische Prüfungen haben eine identische Organisation des Sporenteils auf Agar mit Stärke nach Pridham und Agar nach H i c k e y und Tresner gezeigt.

Unter den Species, deren Beschreibung in »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology« (7. Auflage,The Williams and Wilkins Company, Baltimore. 1961)oderin »The Actinomycetes« (II, S. A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore. 1961)erfolgt ist. ist die Species, der sich dieser am meisten nähert S. aburaviensis, der. wie er. kein Melanin auf organischen Medien erzeugt, ein weißes bis hellgraues luftausgesetztes Mycel aufweist und gerade Sporophoren bildet und dessen vegetatives Mycel auf »Saccharose-Nitrat-Agar« gelblichbraun ist. Er ist jedoch mit diesem nicht identisch, da man bei Bezugnahme auf die Beschreibung von S. aburaviensis in «The Actinomycetes« (Seite 166) ersieht daß S. aburaviensis, obgleich eine gewisse Anzahl der von den beiden Stämmen gezeigten Charakteristiken identisch ist, ein gräulich-olives Wachstum auf Glucose-Asparagin-Agar und ein blaßolives Wachstum auf Kartoffeln ergibt, während S. albocinerescens DS 21 647 auf Glucose-Asparagin-Ager

23

ein gelbes Wachstum und auf Kartoffeln ein Wachstum ergibt, dessen I ärbung von schuachbiäiinlichgelbgrau nach sehr hellbräunlich gehl. Ιλ sei bemerkt. d;iB keine grünliche oder olive Färbung ties vegetativen M>cels von S. albocincrescens DS 21 b47 heobiichtel werden konnte. Das vegetative Mvcel luil stets Färbungen in Tönungen, die von hellgelb oder braungelb bis /ii gelbbraun gehen, gezeigt. Andererseits liefen S. abui.u lensis auf Gelatine kein lösliches Pigment, während S. alboeiiierescens DS 21 fc>47 ein hellgelbes lösliches Pigment produziert. Außerdem verwertet S. 24

aburaviensis weder I .aclose noch Saccharose und verweilet außerdem Inulin, während S. alboeinerescens DS .¹I b47 I.aclose und Saccharose verwertet und Inulin nicht \ erwerlel.

In der nachfolgenden Tabelle V sind die /uchuingscharaklerisuken und die biochemischen Higenschaften von S. alboeinerescens I)S 21 b47 angegeben, die unter den gleichen Bedingungen wie diejenigen des Siainmes S. hvgroscopicus I)S 9751 beobachtet wurden. Die verwendeten Medien sind die gleichen und sind mit den Bleichen Hinweisen bezeichnet.

Tabelle V

Kulturmedium	InI-	Vegetatives Myccl	l.uftausgesclztcr Teil	Lösliches	Beobachtungen
	wieklungs-	oder Unterseite der	(umfaßt Gesamtheit von	Pigment	und biochemische
	grad	Kultur	luftausgeselztem Myeel		F.igenschaften
			und Spekulation)
(1)	(2)	(31	(4)	(5)	(6)

Agar nach Bennett (Anm. A)

Agar nach Pmerson (Anm. B)

Agar nach Mickey und Tr e s η e r (Anm. C)

gut

gut

gut

Agar mit gut

Hefeextrakt nach Pridham (Anm. D)

Agar mit gut

Hafer und Tomate nach Pridham (Anm. E)

Agar mit gut

Hafer nach Carvajal (Anm. F)

Glucose- gut

Pepton-Agar (W-7)

Nähr-Agar mäßia

(W-S)

Agar mit mittel-

Tyrosin mäßig

(Anm. G)

Tyrosin-Hefe- mittelextrakt-Agar mäßig (»Melaninformationmedium« nach Wakaman (Anm. H)

Agar mit Calcrummalat ■ nach Krainsky ιAnm. I)

dick und gefallet, gelb

gut entwickelt; gelb bis hellbraungelb

sehr gut entwickelt; gräulichgelbbraun; gelbbraune Unterseite

dick und gefaltet; gelb

dick und gefaltet, gelbbraun

dick und gefaltet, gelb bis gelbbraun

dick und gefaltet, braungelb

hellgelblich bräunlichgelb

orangebraune Unterseite

mäßig graulichgelb weißlich; spärlich
entwickelt

weißlich; in Form
von Spuren

gräulichwciß; sehr
spärlich entwickelt

weißlich; sehr mäßig entwickelt

weißlich; in Form
von Spuren

sehr hellgelbbraun

hellgelbbraun

gelbbraun

gelbbraun

gelbbraun

lange gerade oder schwach gebogene Sporophoren

gräulichweiß; spärlich gelbbraun entwickelt

weißlich; in Form
von Spuren

keiner

gräulichweiß; sehr
spärlich entwickelt

braungelb

keines

gelbbraun

teilweise Löslichmachung von Tyrosin

hellgräulich; ziemlich orangebraun; Bildung von Mespärlich entwickelt keine lanin: negativ

Schwärzung (die Ablesungen des Mediums erfolgten nach den Angaben des Autors)

keiner oder weißlich, in Form von Spuren

schwach gräulichgeib

gute Löslichmachung von Malat

Fortset/ung	25	19	Vegetatives Mycel oder Unterseite der Kultur (3)	07 556	26	lieobachtungcn und biochemische Eigenschufte η (6)
Kulturmedium (I)	Hnt- wicklungs- grad (2)	spärlich entwickelt; schwach gelblichgrau	Luftuusgcsci/.ter Teil (umral.it Gesamtheit von lullausgcsctztem Mycel und Sporulation) (4)	Lösliches Pigment (5)
Agar mit Ovalbumin (W-12)	sehr spärlich	gelb	keiner	keines
Glucose- Asparagin-Agar (W-2)	ziemlich gut	gelb	weißlich; ziemlich gut entwickelt	hellgräulich- gelb
Glycerin- Asparagin-Agar (W-3)	mittel mäßig	braungelb	weißlich; in Form von Spuren	hellgelb	Hydrolyse von Stärke: positiv
Stärke-Nitrat- Agar (W-IO)	mäßig	gelb bis hellbraun gelb; gelbe Unter seite	keiner oder gräulich weiß, in Form von Spuren	hellgelbbraun	Hydrolyse von ; Stärke: positiv; ■ lange gerade oder [ schwach gebogene \ Sporophoren \
Agar mit Stärke nach Pridham (Anm. J)	gut	braungelb; gut ent wickelt; Neigung zur Rißbildung	sehr hellgräulich; sehr mäßig ent wickelt	schwach bräunlich gelb
Synthetischer Agar nach Czapek mit Saccharose (W-I)	gut	braungelb; gut ent wickelt; Neigung zur Rißbildung	weißlich; sehr mäßig entwickelt	gelbbraun
Synthetischer Agar nach Czapek mit Glucose (Anm. K)	gut	braungelb; gut ent wickelt; Neigung zur Rißbildung	gräulichweiß; sehr spärlich entwickelt	gelbbraun
Synthetischer Agar nach Czapek mil Glycerin (Anm. L)	gut	sehr gut entwickelt, dick und gefaltet; braungelb bis gelb braun	keiner oder weißlich, in Form von Spuren	gelbbraun
Kultur auf Kartoffeln (W-27)	gut	flockige weißliche Kultur, die in die Gelatine eindringt	keiner	keines oder schwach gräulichbraun	Verflüssigung von Gelatine: ziemlich rasch
Reine Gelatine mit 12% (Anm. M)	mäßig	kleine gräulichweiße bis hellgelblichgraue Kolonien an der Oberfläche	keiner	hellgelb; langsame Produktion	Nitrit-Reaktion: positiv
Glucose-Nitrat- Bouillon nach Dimnick (Anm. N)	mäßig	gelblicher Schleier	keiner	keines	Nitrit-Reaktion: positiv
Bouillon nach Czapek mit Saccharose fW-18)	mittel mäßig	keiner	blaßgelb

Fortsel/ung	27	19	Vegetatives Mycel oder Unterseite der Kultur (3)	07 556	28	Beobachtungen und biochemische liigcnschaften (6)
Kulturmedium (1)	linl- wicklungs- grad (2)		Lul'tausgesetztcr Teil (umlalSt Gesamtheit von !unausgesetztem Mycel und Sporulation) (4)	Lösliches Pigment (5)	Verwertung von Cellulose: negativ
Bouillon nach Czapek mit Cellulose (Anm. O)	keine Ent wicklung	hellgräulichgelber Ring			Peptonisation ohne Koagulation, be ginnend nach 2 Wochen, vollstän dig in 1 Monat; pH von 6,3 nach 7,0 in 1 Monat gehend
Magermilch (Anm. F) a) 25 C	gut	einige hellbraungelbe Kolonien an der Oberfläche	keiner		Koagulation mit folgender Pepto nisation: keine merkliche Ände rung des pH-Werts in 1 Monat
b) 37'C	sehr mäßig	hellgelbbraun	keiner		Produktion von H2S: negativ
Agar nach Tresner und	gut	keiner	schwach braungelb

Danga zur
Untersuchung
der Produktion
von H₂S
(Anm. G)

Die Charakteristiken, die der dritte Mikroorganismus aufweist, erinnern an die Species Streptomyces roseochromogenes (Jensen) Waksman und Henrici, zu denen er nur wenig bedeutende Unterschiede aufweist, von denen der Hauptunterschied in einer Verzögerung der Bildung der Sporulation besteht, die nur in besonJers langsamer Weise auftritt und manchmal auf Medien, für die sie für diese Art von Species beschrieben ist. überhaupt nicht auftritt. Diese Eigenschaft ist der Grund, warum dieser neue Stamm mit Streptomyces roseochromogenes, Varietät oscitans, bezeichnet wurde.

S. roseochromogenes, var. oscitans. Stamm DS 12 976 bildet ovale Sporen mit Abmessungen von 0,3 bis 0,4/0,6 bis 0,8 μ. Seine Sporenfäden sind ausgedehnt und rollen sich an ihrem Ende unter Bildung von 1 oder 2 und selten mehr Spiralen zusammen. Sie sind im allgemeinen isoliert auf den luftausgesetzten Mycelfäden, die sie tragen, angeordnet

Auf den synthetischen Nährmedien entwickelt S. roseochromogenes, var. oscitans. Stamm DS 12 976 allgemein ein gelbes vegetatives Mycel und erzeugt lösliche Pigmente von gelber bis hellgelblicher Farbe. Auf den organischen Nährmedien ist sein vegetatives Mycel dunkler und nimmt Färbungen an, die von hellgelbbraun bis dunkelbraun gehen und sogar schwärzlichbraun in gewissen Fällen erreichen. Auf diesen Medien erzeugt er mehr oder weniger dunkelbraune lösliche Pigmente, und er bildet ein schwarzes Melaninpigment auf geeignetem Medium mit Tyrosin.

Die Farbe seines sporulierten luftausgesetzten Mycels ist rosa, doch bildet sich die Sporulation, wie bereits ausgeführt wurde, nur in außerordentlich langsamer Weise, wobei sie erst nach mehr als 1 monatiger Kultur beginnt. Die Medien, die ermöglichten, unter optimalen Bedingungen eine Sporulation zu erreichen, sind Medien auf der Basis von Stärke und einem Ammoniumsalz, wie beispielsweise Agar mit Stärke nach F r i d h a m oder Agar mit Stärke nach G r u η d y, und es ist unter den üblichen Züchtungsbedingungen eine etwa 2monatige Inkubation bei 26°C erforderlich, um zu

so sehen, daß das luftausgesetzte Mycel auf diesen Medien eine gräulichrosa Färbung annimmt, die einen merklichen Grad von Sporulation zeigt.

In der nachfolgenden Tabelle VI sind die Züchtungscharakteristiken und die biochemischen Eigenschaften von S. roseochromogenes, var. oscitans, angegeben, die unter den gleichen Bedingungen wie diejenigen des Stammes S. hygroscopicus DS 9751 beobachtet wurden: Die verwendeten Medien sind im allgemeinen die gleichen und tragen die gleichen Bezeichnungen. Die Hinweise auf die oder die Bestandteile der anderen Züchtungsmedien sind die folgenden:

Anm. R: entspricht der Rezeptur W-18, wobei 30 g Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt sind
Anm. S: »Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria«, Society of American Bacteriologists, Gene va, N. Y. 115o-18

	29	Em-	19	Vegeiaiives Mycel	07 556	30	Beobachtungen
		wicklungs		oder Unterseite der			und biochemische
Tabelle VI	grad		Kultur		Lösliches	Eigenschaften
Kulturmedium			Luftausgesetzter Teil	Pigment
	(2l	O)	(umfaßt Gesamtheit von		(6)
	gut	dunkelkastanien-	!unausgesetztem Mycel		ovale Sporen mit
		farbene bis schwarz	und Spekulation)	(5)	Abmessungen von
(D		braune Unterseite	(4)	schwarzbraun	0.3 bis 0,4/0,6 bis
Agar nach			weißlich; ziemlich gut		0.8μ; lange Sporen
Hickey und			entwickelt; nimmt		läden, die in 1 oder
Tresner			sehr zögernd eine		2 Windungen enden
(Anm. C)	gut	hellgelbbraun	hellgräulichrosa Fär
			bung an. wenn sich dk
			die Sporulation bildet	gelbbraun
Agar nach	ziemlich	gelbbraune Unter	weiß; mäßig ent
Bennett	gut	seite	wickelt
(Anm. A)				dunkel-
Agar mit			weißlich bis gelblich	orangebraun
Hefeextrakten	gut	bräunlichgelbgrau:	weiß; mäßig ent
nach Pr id harn		dick und gefaltet, sehr	wickelt
(Anm. D)		gut entwickelt		schwach
Agar mit Hafer			weißlich; in Form	gelbbraun
und Tomale	gut	grünlichgelbbraun	\ on Spuren
nach Pridham		bis orangebraun; sehr
(Anm. E)		gut entwickelt		orangebraun
Glucose-	mäßig	gräulichgelbbraun	weißlich, in Form	bis grünlich
Pepton-Aear			von schwachen	braun
(W-7)	mäßig	bräunlichschwarz	Spuren	dunkel	Bildung von Me
Nähr-Aear			keiner	gelbbraun	lanin: positiv
(W-5)				gräulich-
Tyrosin-Hefe-			weißlich; sehr mäßig	schwarz; ab
extrakt-Agar			entwickelt	dem 2. Tag
zur Bildung	fast	ungefärbt; in Form		der Züchtung	keine Löslich-
von Melanin	keiner	von Spuren		gebildet	machung von
(Anm. H)				keines	Calciummalat
Agar mit			keiner
Calciummalat	sehr	lebhaft gelb
nach Krainsky	mäßig
(Anm. F)				blaßgelb
Agar mit	ziemlich	gelb	keiner
Cvalhumin	gut
(W-121				gelb
Glucose-	ziemlich	orangegelb bis	keiner
Asparagin-Agar	gut	rötlichorange
(W-2)				hellorange-
Glycerin-	mäßig	gelb bis braunlich-	keiner oder weißlich.	gelb	ovale Sporen mit
Asparagin-Aear		gelb	in Form von schwachen		Abmessungen von
(W-3)			Spuren	wenig inten	0,3 bis 0,4/0,6 bis
Stärke-			weißlich; mäßig ent	siv bräunlich	0,8μ; lange Sporen-
Minersalz-Agar			wickelt; nimmt sehr		fäden, die in 1 oder
nach Pridham			zögernd eine hellgräu		2 Windungen
(Anm. J)			lichrosa Färbung an.		enden; gute Hydro
			wenn die Sporulation		lyse von Stärke
	m.iltig	gelblich	erfolgt
				keines
\gai nil			wcili; mäßig ent
Sl.irkc nach			wickelt: nimmt sehr
(ί ι ü η ii >			/iipernd eine
I \llill I)	hellgräiilichrosa Fär
	bung .in. wenn die
	Spotulation erfolgt

	31	Ent	19	Vegetatives Mycel	07 556	32	Beobachtungen
		wicklungs		oder Unterseite der			und biochemische
Fortsetzung	grad		Kultur		Lösliches	Eigenschaften
Kulturmedium			Luftausgesetzter Teil	Pigment
	(2)	C)	(umfaßt Gesamtheit von		(6)
	mäßig	ungefärbt bis gelblich;	!unausgesetztes Mycel		Hydrolyse von
		sehr mäßig ent	und Sporulation)	(5)	Stärke: schwach
(D		wickelt	(4)	keines oder	und langsam
Stärke-Nitrat-	gut	hellbräunlichgelb	keiner	sehr schwach
Agar				gelblich
(WlO)				schwach
Synthetischer			keiner	gräulichgelb
Agar nach				braun
Czapek mit	gut	gelb
Saccharose
(W-I)				schwach
Synthetischer			keiner	braungelb
Agar nach
Czapek mit	gut	hellbräunlichgrau
Glucose
(Anm. K)				gräulichgelb
Synthetischer			keiner	braun
Agar nach
Czapek mit	mäßig	gelblicher Schleier			Reduktion von
Glycerin					Nitraten zu Ni
(Anm. L)				sehr blaß	triten: positiv
Stärke-Nitrat-	mäßig	gelbliche flockige	keiner	gelb, ziem	Reduktion von
Bouillon		Kultur		lich zögernd	Nitraten zu Ni
(W-19)				keines	triten: positiv
Bouillon nach			keiner
Czapek mil	keine				Verwertung der
Glucose	Entwick				Cellulose: negativ
(Anm. R)	lung
Bouillon nach
Czapek mit	mäßig	gelblicher Ring			Reduktion von
Cellulose					Nitraten zu
(Anm. O)				bräunlich	Nitriten: negativ
Nitrat-Nähr-	gut	schwärzlichbraun;	keiner
Bouillon		dick und gefaltet.
(Anm. S)		sehr gut entwickelt		bräunlich
Kultur auf	mittel	bräunlichgrau	weißlich; in Form von	schwarz:	Verflüssigung der
Kartoffeln	mäßig		Spuren	reichlich	Gelatine: positiv,
(W-27)				schwärzlich	jedoch langsam.
Reine			keiner	braun;	erst nach Ende von
Gelatine mit				reichlich	1 Monat Züchtung
12%					beginnend
(Anm. M)	gut	schwarz			Produktion von
					H2S: stark positiv
				schwarz;
Agar nach			keiner	reichlich;
Tresnar und				zu Beginn der
Danga	gut	bräunlicher Ring		Züchtung ge	Peptonisation ohne
(Anm. Q)				bildet	Koagulation: pH
					geht von 6,2 auf 7 Π Kic 7 7 in
Magermilch	keiner
(Anm. P)
bei 25 C

bei 37 C

mäßig gelbbrauner Ring

keiner

1 Monat

Peptonisation ohne Koagulation; pH unverändert in 1 Monat

Aus der Prüfung der von dem Stamm Streptomyces DS 12 976 gezeigten Charakteristiken folgt, daß dieser der Species S. roseochromogenes(Jensen) Waksm a η und H e η r i c i sehr ähnlich ist, deren Beschreibung in »The Actinomycetes«, Band 2, Seite 268 (S. A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, 1961) gegeben ist Beim Vergleich mit der Gesamtheit der in diesem Werk beschriebenen Species ist es diejenige Species, mit der er die größte Analogie zeigt, und es existieren zwischen diesen beiden Stämmen so ι ο beträchtliche gemeinsame Merkmale und so geringe Unterschiede, daß sie nicht als zwei verschiedene Species angesehen werden können.

Wie S. roseochromogenes (Jensen) Waksman und H e η r i c i gehört der Stamm Streptomyces DS 12 976 zu der Gruppe von Stämmen, die Melaninpigmente bilden. Sein luftausgesetztes Mycel nimmt eine rosa Färbung an, wenn es einen merklichen Sporulationsgrad erreicht, und seine Sporophoren haben spiralig* Enden. Sein vegetatives NÜycel weist Färbungen auf, die von blaßgelb bis dunkelbraun gehen, je nach den Medien, in denen er sich entwickelt, und die von ihm gebildeten löslichen Pigmente, die auf synthetischen Medien fehlen oder hellgelb sind, werden auf den organischen Medien dunkelbraun oder selbst schwärzlichbraun. Er bildet ein schwarzes lösliches Pigment auf Kartoffeln, ein dunkelbraunes lösliches Pigment auf Gelatine, die sich langsam, jedoch in unzweifelhafter Weise verflüssigt, peptonisiert die Milch, ohne sie zu koagulieren, hydrolisiert Stärke, erzeugt H₂S und jo reduziert Nitrate, wobei diese letztere Eigenschaft jedoch nur auf den synthetischen Medien positiv ist.

Die zwischen den beiden Stämmen nachgewiesenen Unterschiede sind gering. Einerseits bildet S. roseochromogenes (Jensen) Waksman and H e η r i c i manchmal Sporenfäden, die zu 3 oder 5 auf ein und demselben Grundfaden gruppiert sind, und gibt so das Bild von Besen oder Quirlen; die Sporenfäden des Stammes DS 12 976 sind üblicherweise isoliert angeordnet, wobei man höchstens manchmal die Vereinigung von 2 Sporenfäden auf ein und demselben Grundfaden antrifft. Außerdem ergibt S. roseochromogenes (Jensen) Waksman und H e η r i c i auf synthetischem Agar nach Czapek mit Saccharose ein ungefärbtes bis blaßgelbes vegetatives Mycel und auf Nähr-Agar ein 4^r> gräulichgelbes vegetatives Mycel, das anschließend braunrot wird, und bildet auf synthetischem Agar nach C ζ a ρ e k mit Saccharose, auf Glucose-Asparagin-Agar und auf Nähr-Agar ein rosa luftausgesetztes Mycel; der Stamm Streptomyces DS 12 976 gibt auf synthetischem Agar nach Czapek mit Saccharose ein vegetatives Mycel, das viel stärker entwickelt ist und rasch eine bräunlichgelbe Färbung zeigt; auf Nähr-Agar bleibt sein vegetatives Mycel gräulichgelbbraun, ohne anschließend braunrot zu werden, und er bildet insbesondere auf synthetischem Agar nach Czapek mit Saccharose, Asparagin-Agar und Nähr-Agar kein luftausgesetztes MyceL Man führt diese letztere Tatsache auf die besondere Langsamkeit zurück, die er allgemein zunächst bei der Produktion des luftausgesetzten Mycels auf der Gesamtheit seiner Züchtungsmedien und anschließend bei der Entwicklung seiner Sporulation auf dem luftausgesetzten Mycel, wenn dieses einmal entwickelt ist, zeigt Dieser Unterschied kann jedoch nicht als Species-Differenzierungskriterium angesehen werden, da das sporulierte luftausgesetzte Mycel, wenn es auf den Medien und unter den Bedingungen, bei denen es erhalten werden kann, beobachtet werden kann, die rosa Farbe desjenigen von S. roseochromogenes aufweist. Es ist dies jedoch die bedeutendste Eigenart, durch die sich der das Antibioticum 18 631 R. P. erzeugende Stamm von S. roseochromogenes (Jensen)Waksman und H e η r i c i unterscheidet, und es ist dies der Grund, weshalb er als eine besondere Varietät dieses Stammes angesehen werden muß und mit »Streptomyces roseochromogenes, var. oscitans«. Stamm DS 12 976 bezeichnet wird.

Die Fähigkeit von Streptomyces hygroscopicus DS 9751, Streptomyces albocinerescens DS 21 647 und Streptomyces roseochromogenes, var. oscitans DS 12 976, verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zur Gewährleistung ihrer Entwicklung zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode von Pridham und Gottlieb (J. of Bact. 56, 107-114, 1948) bestimmt. Der Entwicklungsgrad wurde nach einer Inkubationszeit bei 26°C, welche eine gute Entwicklung des Streptomyces in dem Kontrollmilieu Glucose/ (NhU)₂SO₄ ermöglichte, auf dem von diesen Autoren angegebenen Grundmedium bestimmt, wobei die Glucose durch die verschiedenen jeweilig untersuchten Kohlcnstoffquellen oder das (NH₄)JSO₄ durch die verschiedenen jeweilig untersuchten Stickstoffquellen ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen VIl und VIII zusammengestellt.

Tabelle Vl!	Verwertung durch	negativ	S. albocinerescens	negativ	S. roseochromogenes	negativ	positiv	negativ
Geprüfte Kohlenstoffquellen	S. hygroscopicus		DS 21 647	negativ	var. oscitans	positiv
	DS 9 751				DS 12 976	positiv
				negativ	positiv aber langsam	positiv
	positiv				positiv
D-Ri böse	positiv	positiv		positiv
D-Xylose	positiv		negativ
L-Arabinosa	positiv	positiv	negativ
L-Rhamnose	positiv	positiv	negativ
D-Glucose	positiv
D-Galactosc	positiv
D-Fructose	positiv
D-Mannose
L-Sorbose

Fortsetzung

Verwertung

19

durch

negativ

negativ

negativ

07 556

negativ

negativ

36

S. roscochromogenes

langsam

negativ

35

Geprüfte KohlensiofTqucllen

S. hygroscopicus

negativ

var. oscitans

DS 9 751

negativ

DS 12 976

negativ

positiv

positiv

negativ

negativ

positiv

Lactose

positiv

positiv aber

Maltose

positiv

negativ

positiv

Saccharose

positiv

positiv

Trehalose

positiv

langsam

S. albocinerescens

negativ

positiv

Cellobiose

positiv

positiv aber langsam

DS 21 647

negativ

positiv

negativ

Raffinose

positiv

positiv

negativ

positiv

negativ

Dextrin

durch

positiv

positiv

negativ

positiv

negativ

Inulin

positiv

S. hygroscopicus

positiv

positiv

negativ

positiv

Stärke

positiv

DS 9 751

positiv

positiv

negativ

negativ

positiv

negativ

negativ

Glykogen

positiv

positiv

negativ

negativ

Glycerin

positiv

positiv

positiv

positiv

negativ

Erythrit

positiv

S. albocinerescens

Adonit

positiv

positiv

DS 21 647

positiv

S. roscochromogenes

Dulcit

positiv

positiv

positiv

var. oscitans

D-Mannit

gering und

positiv

positiv

positiv

positiv

DS 12 976

D-Sorbit

positiv

positiv

nositiv

positiv

positiv

positiv

Inosit

positiv

positiv

positiv

positiv

Tabelle VIII

Verwertung

positiv

positiv

positiv

Geprüfte Stickstoffquellen

positiv

positiv

positiv

positiv

positiv

positiv

positiv

positiv

NaNO3

positiv

NaNO2

positiv

positiv

(NH4J2SO4

positiv

positiv

(NH4)2HPO4

positiv

positiv

Uracil

positiv

positiv

Harnstoff

positiv

positiv

L-Asparagin

positiv

positiv

Glykokoll

positiv

positiv

Sarcosin

positiv

positiv

DL-Alanin

positiv

DL-Valin

DL-Asparaginsäure

L-GIutaminsäure

positiv

positiv

L-Arginin

positiv

positiv

L-Lysin

nositiv

DL-Serin

DL-Threonin

DL-Methionin

Taurin

DL-Phenylalanin

L-Tyrosin

DL-Prolin

	37	Verwertung durch	19 07 556	negativ	38	S. roscochromogenes	negativ	positiv
		S. hvt:ri>M;(>picus				var. oscilans	positiv
ForlNCt/ung	OS 4 751				I)S 12 976	positiv
(icprüfte SlKkslollguellcn				positiv	positiv
	positiv	S. albocincrescens		positiv
	positiv	I)S 21 647
I Hydroxypvrolin		positiv
Betain
Adenin
Adenosin
Glucosamin
L-Histidin
L-Tryptophan

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in der folgenden Weise durchgeführt.

Die Züchtung des einen oder des anderen der /u verwendenden Stämme kann nach jeder beliebigen üblichen aeroben Oberflächenzüehtungsmethode oder Siibmers/ÜL'htungsmethode erfolgen, wobei letztere bevor/iigi wird.

Man verwendet /u diesem Zweck verschiedene, in der Technik der Fermentationen übliche Apparaturtvpen. Man kann insbesondere den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen:

Streptomyces hygroscopicus DS 9 751
Streptomyces albocinerescons DS 21 647 Stammoder ansät: Streptomyces roseochromogenes
ν ar. oscitans DS 12 976

Kultur auf Agar

Kultur im Kolben unter Bewegung
Implkultur im Fermenter
Produktionskultur im Fermenter

Das Fermentationsmedium enthält im allgemeinen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle. Mineralstoffe (insbesondere Chloride) und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren, wobei alle diese Bestandteile in Form von gut definierten Produkte- oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquelle kann man Kohlenhydrate, wie beispielsweise Glucose. Saccharose. Lactose. Dextrine. Stärke. Melasse, oder andere Kohlenhydratsubstanzen, wie beispielsweise Zuckeralkohole, z. B. Glycerin oder Mannit, oder gewisse organische Säuren, wie beispielsweise Milchsäure, Citronensäure. Weinsäure und dergleichen, verwenden. Gew isse tierische oder pflanzliche Öle, wie beispielsweise Schmalzöl. Sojaöl oder Baumwollsamenöl. können diese verschiedenen Kohlenhydratquellen mit Vorteil ersetzen oder ihnen beigefügt werden.

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise Nitrate, anorganische und organische Ammoniumsalze. Harnstoff und Aminosäuren, sein. Sie können auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in Protein-Form enthalten, zugeführt

:<i werden, wie beispielsweise in Form von Casein, Lacialbumin, Gluten und deren Hydrolysates Sojamehl, Arachismehlen, Fischmehlen, Fleischextrakten, Hefeextrakten. Distiller's Solubles und Maisquellwasscr.

Unter den zugefügten mineralischen Stoffen können

:> gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder Calcium- oder Magnesiumcarbonat. Andere führen zu dem zur Entwicklung des Streptomyces und zur Erzeugung des Antibioticums

κι erforderlichen lonengleichgewicht, wie beispielsweise die Alkali- und Erdalkalichloride und -sulfate. Schließlich wirken gewisse in speziellerer Weise als Aktivatoren der Stoffwechselreaktionen des Streptomyces. Es sind dies die Zink. Kobalt-, Eisen-, Kupfer- und

r. Mangansalze.

Zu Beginn der Züchtung sollte der pH-Wert zwischen b,0 und 7.8. vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 liegen. Die /ur Fermentation optimale Temperatur beträgt 25 bis 28 C. doch wird auch bei Temperaturen zwischen 23

4(1 und 35 C ein zufriedenstellendes Ergebnis erhalten. Die Belüftung bei der Züchtung kann zwischen ziemlich weiten Weiten variieren. Es wurde jedoch gefunden, daß Belüftungen von 0.3 bis 2 I Luft je Liter Bouillon und Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale

■η Ausbeute an dem Antibioticum wird nach 4- bis 7tägiger Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt.

Das Antibiotikum 18 631 R.P. kann aus den Fermentationsmaischen nach verschiedenen üblichen

,Ii Methoden isoliert werden.

Die Fermentationsmaische kann bei einem pH-Wert von 7 oder darüber filtriert werden, doch bleibt untei diesen Bedingungen ein beträchtlicher Teil des Antibio tikums in dem Filterkuchen, der ebenfalls zur Extraktior der Wirksubstanz behandelt werden muß. Wenn s\c\ das Antibiotikum in dem Filtrat der Fermentationsmaisehe befindet, so unterzieht man diese Lösung einei Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbarer Lösungsmittel, beispielsweise einem aliphatischen Aiko hol mit 4 oder 5 Kohlenstoffatomen oder einen chlorierten Lösungsmittel wie Chloroform oder Methy lenchlorid, oder auch einem Ester, insbesondere Äthylacetat.

Vorzugsweise wird jedoch die ganze Fermentations maische mit einem dieser Lösungsmittel extrahiert Unter diesen Bedingungen kann die Extraktion be einem pH-Wert zwischen 2 und 7 durchgeführt werden Das rohe Antibiotikum wird durch Einengen de:

l'lxtr;ikts unter vermindertem Druck und ans«, hlkitendes Ausfüllen mil einem Lösungsmittel, in dem d;is Antibiotikum schwer löslich ist. beispielsweise Äther oder I lexan. erhallen.

Iline lindere Arbeitsweise besieht darin, eine Filtralion bei einem pH-Wen unter b und vorzugsweise bei einem pH-Wert in tier Niihe von 5 vorzunehmen. I Inter diesen Bedingungen bleibt das gesamte Antibiotikum in dem I ilterkuclien. aus dem es mit Wasser, das einen Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht, wie Methanol. Äthanol oder l'ropanol. enthalt, extrahiert werden kann. Der Mkohol wird anschließend durch Verdampfen unter vermindertem Druck enllernt und das Antibiotikum mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie einem dei obengenannten Lösungsmittel, extrahiert.

Das Antibiotikum liegt im allgemeinen in Lösung in dem Endkonzentrat in Form dei Saure vor. Die Ausfällung des rohen 18 631 R.P. wird dann durch Zugabe von Natriummethylat zu dem Konzentrat erleichtert.

Das rohe Antibiotikum 18 631 R.P. kann in Form der Säure oder des Natriumsalz.es in einer ersten Stufe durch Fixierung an Ionenaustauscherharze!! mit stark anionischem Charakter und hoher Porosität, beispielsweise einem Polystyroltrimethylbcnzyl-ammonium-Anionenaustuuscherharz. in Chloridform gereinigt werden, aus denen es mit einem wäßrig-alkoholischen Gemisch, das einen Elektrolyten enthält, vorzugsweise mit einem Gemisch Methanol —Wasser (80 : 20 Volumina) mit einem Gehalt von JO g Ammoniumchlorid je Liter, eluiert wird.

Nach Entfernung des Methanols unter vermindertem Druck wird das \ntibiotikum aus den Eluaten mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform oder Äthylacetat, extrahiert. Das Antibiotikum 18 631 R.P. wird dann in Form einer Festsubstanz durch Ausfällung mit einem schwer löslichen Lösungsmittel, wie Hexan oder Tetrachlorkohlenstoff, oder durch Lyophilisation nach Überführung in tert.-Butanol erhalten.

Eine zweite Reinigungsstufe kann durch Chromatographie an einer Aluminiumoxydsäule vorgenommen werden, wobei das Antibiotikum aus einer Lösung in einem wenig polaren Lösungsmittel, wie Äthylacetat, fixiert und dann mit einem polaren Lösungsmittel, in dem es löslicher ist. wie beispielsweise Methanol, eluiert wird.

Die Endreinigung kann nach verschiedenen Methoden, beispielsweise mittels Gegenstromverteilung oder Kristallisation, vorgenommen werden.

Die Reinigung durch Gegenstromverteilung kann beispielsweise mit dem System Tetrachlorkohlenstoff-Chloroform-Mcthanol-Wasser (10:3:10:2 Volumina) (Verteilungskoeffizient K. = 0.65) vorgenommen werden.

Die Kristallisation kann entweder durch Einengen einer Lösung in einem Lösungsmittel, wie beispielsweise Chloroform oder Äthylacetat, oder durch Zugabe eines Lösungsmittels, in dem das Antibiotikum schwer löslich ist, zu einer Lösung des Antibiotikums 18 631 R.P. erfolgen. Geeignete Lösungsmittel-Paare sind z. B. folgende: Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff, Aceton-Wasser, Aceton-Acetonitril, Dioxan-Wasser.

Das Antibiotikum 18 631 R.P. kann auf parenteralem, rektalem oder vorzugsweise oralem Wege verwendet werden.

Zur Behandlung einer Infektion mit grampositiven

Keimen beträgt bei einem Erwachsenen die Dosis im allgemeinen zwischen 1 und i g je Tag bei oraler oder rektaler Verabreichung und zwischen 0,5 und 2 g je Tag bei p.irenteraler Verabreichung.

, Das Antibiotikum 18 631 R.P. kann als pharmazeutisches Mittel zur oralen Verabreichung in Form von Tabletten, Pillen. Pulver oder Granulaten verwendet werden. In diesen Zusammensetzungen ist das Antibiotikum mit einem oder mehreren inerten Verdünnungs-

iii mitteln, wie Saccharose. Lactose oder Stärke, vermischt.

Diese Zusammensetzungen köivien auch andere inerte Substanzen außer den Verdünnungsmitteln. /.. IV Magnesiumstearai.enthalten. ■

Als flüssige Zusammensetzungen zur oralen Verab-

ΙΊ reichling kann man pharmazeutisch verwendbare Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupc und Elixiere verwenden, die inerte Verdünnungsmittel, wie Wasser oder Paraffinöl. enthalten. Diese Zusammensetzungen können auch andere inerte Substanzen als die

in Verdünnungsmittel, wie Netzmittel, Süßmittel oder Aromastoffe oder Parfüms, enthalten.

Als pharmazeutische Mittel zur parenteralen Verabreichung eignen sich wäßrige oder nichtwäßrige sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen mit einem

2ϊ Gehalt an dem Antibiotikum 18 631 R.P. Als inerte Lösungsmittel oder inerte Träger kann man Propylenglykol. Pülyälhylenglykol, pflanzliche Öle, insbesondere Olivenöl, und injizierbare organische Ester, beispielsweise Äthyloleat. verwenden. Diese Mittel können auch

iii übliche Adjuvantien, insbesondere Netzmittel, Emul giermittel und Dispergiermittel, enthalten. Die Sterilisa tion kann auf verschiedene Weise erfolgen, beispielsweise mit Hilfe eines bakteriologischen Filters, durch Einbringen von sterilisierenden Mitteln in die Zusam

j--, mensei/ung. durch Bestrahlen oder durch Erhitzen. Si« können auch zum Zeitpunkt des Gebrauchs in sterilen-Wasser oder irgendeinem anderen injizierbaren steriler Medium gelöst werden.

Als Mittel zur rektalen Verabreichung sind Supposi torien. die außer dem wirksamen Produkt Exzipientien wie beispielsweise Kakaobutter oder Suppowach: enthalten, geeignet.

In den folgenden Beispielen wird die angegeben< Aktivität stets durch biologische Bestimmung nach de Diffusionsmethode unter Verwendung von Micrococcu: pyogenes albus als empfindlichem Keim und bezogei auf eine reine Probe von 18 631 R.P. als Eichmaß mi 1000 ug/mg bestimmt. Diese Aktivität ist in ug/ccm fü die Lösungen und in μg/mg für die festen Produkt!

->o ausgedrückt.

Beispiel 1 a. Fermentation Man beschickt einen 170-l-Fermenter mit:

Der pH-Wert wird mit 95 ecm 10 η-Natronlauge au 7,0 eingestellt. Man sterilisiert das Medium durcl 40minütiges Durchleiten von Dampf von 122° C. Nacl Abkühlen beträgt das Volumen des Mediums 120 1 um sein pH-Wert 7,0. Man beimpft mit 200 ecm eine gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur voi Streptomyces albocinerescens DS 21 647 (NRRL 3419

Pcpton(Cl- =3,5%)	1%)	1200 g
Fleischextrakt (Cl- =		600 g
Maisstärke		1200 g
Wasser	ad 1101

Die Züchtung wird bei 30"C 22 Stunden unter Bewegen und unter Belüftung mit steriler Luft vorgenommen. Sie ist dann zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet. Die Produklionskultur wird in einem 800-l-Fermcnter vorgenommen, der mit den folgenden Substanzen beschickt ist:

»Distiller's Solubbes« (Rückstand von der Alkoholdestillation von Getreide,
»Industrial Wastes« von
Willem Rudolfs, Reinhold
Publishing Corporation, New
York 11953, S. 103) 16 kg

teilweise hydrolysierte Stärke 4 kg

hvdratisiertes Kohnltchlorid
(6H₂O) 8 g

Wasser . ad 3301

Nach Einstellen des pH-Werts auf 7,80 mit 1400 ecm 2« lOn-Natronlauge setzt man 2 kg Calciumcarbonat zu und sterilisiert dann das Medium 40 Minuten bei 122°C. Nach Abkühlen wird das Volumen, das 355 I beträgt, durch Zugabe von 40 I einer sterilen wäßrigen Lösung, die 10 kg Dextrose enthält, und 5 I einer sterilen wäßrigen Lösung, die 800 g Ammoniumsulfat enthält, auf 400 I aufgefüllt. Der erhaltene pH-Wert der Fermentationsbrühe beträgt 6,90.

Man beimpft dann mit 40 1 der oben beschriebenen Impfkultur aus dem 170-l-Fermenter. Die Züchtung wird m bei 30⁰C 71 Stunden lang unter Rühren mittels eines Turbinenrührers, der mit 260 U/min betrieben wird, und unter Belüftung mit steriler Luft in einer Menge von 25 mVStunde vorgenommen. Der pH-Wert der Maische beträgt dann 7,7 und ihr Volumen 410 1. Die vorhandene J5 Antibioticummenge beträgt 5 μg/ccm.

b. Extraktion

930 I der wie oben erhaltenen Fermentationsmaische mit einem Gehalt von 5 μg/ccm werden in einen Bottich ίο eingebracht, der mit einer Rührvorrichtung ausgestattet ist. Der pH-Wert der Maische wird mit 12,6 I 5 η-Salzsäure auf 5 eingestellt. Nach V2stündigem Rühren setzt man 50 kg Filtrierhilfe zu und filtriert die Suspension auf einer Filterpresse. Der Filterkuchen wird mit 200 I Wasser gewaschen. Das Filtrat (960 1) wird verworfen. Der Filterkuchen (196 kg) wird unter Rühren in 500 I eines Gemischs von Wasser und Methanol mit einem Gehalt von 400 I Methanol suspendiert. Der scheinbare pH-Wert des Gemischs wird dann durch Zugabe einer 10 n-Natriumhydroxydlösung auf 7 eingestellt. Das Rühren wird '/; Stunde fortgesetzt. Dann ' -ird die Brühe auf einer Filterpresse filtriert. Das Filtrat wird gesammelt, und der Filterkuchen wird mit 150 1 eines wäßrig-methanolischen Gemischs mit 60 Vol-°/o Methanol gewaschen. Filtrat und Waschflüssigkeit werden vereinigt und man erhält 675 I Flüssigkeit mit einem Gehalt an Antibioticum von 5,7 μg/ccm. Der Filterkuchen wird verworfen. Das alkoholische Filtrat wird dann unter vermindertem «) Druck (35 mm Hg) bei 35°C bis zu einem Volumen von 80 1 eingeengt. Das Konzentrat wird nun in einen Bottich, der mit einer Rührvorrichtung ausgestattet ist, eingebracht. Man setzt unter Rühren 40 1 n-Butanol zu und stellt den pH-Wert der wäßrigen Phase mit 5 η-Salzsäure auf 3 ein. Das Rühren wird 30 Minuten fortgesetzt und dann wird die obere Phase nach Dekantieren abgetrennt. Die Extraktion wird mit 40 I n-Butanol wiederholt. Die ausgezogenen Mutterlaugen werden verworfen. Die beiden Extrakte weiden vereinigt (102 I) und mit 10 I Wasser gewaschen. Das Waschwasser wird verworfen. Der gewaschene Butanolextrakt wird hierauf unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 37"C auf ein Volumen von 3 I eingeengt. Das Konzentrat wird mit einer 25%igcn Lösung von Nairiumniethylat in n-Butanol auf pH 7 neutralisiert. Das neutralisierte Konzentrat wird in 30 I Hexan gegeben, wobei ein Niederschlag ausfällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Hexan gewaschen und im Vakuumtrockenschrank (5 mm Hg, 40⁰C) getrocknet. Man erhält 379 g rohes Antibioticum 18 631 R.P. als Natriumsalz mit einem Gehalt von 8,5 ng/mg.

c. Reinigung — 1. Stufe

1478 g gemäß b. erhaltenes rohes Antibioticum mit einem Gehalt von 8,5 μg/mg werden in 12 I eines Gemisches von Methanol-Wasser (50:50 Vol.) gelöst. Die erhaltene Lösung (pH = 7,0) wird in den oberen Teil einer Säule (Innendurchmesser: 15 cm) eingeführt, die 25 I eines Polystyrol-Trimethylbenzylammonium-Anionenaustauscherharzes in Chloridform, das unter dem Namen »Dowex 1 X 2« im Handel ist, enthält, wobei die Abflußrate auf 3 l/Stunde eingestellt wird. Wenn die gesamte Ausgangslösung durch die Säule geführt ist, wird das Harz von oben nach unten bei einer Einstellung der Rate auf 25 l/Stunde nacheinander mit folgenden Gemischen gewaschen:

Methanol-Wasser(50:50)

(VoL/Vol.) 601

Methanol-Wasser (60 :40)

(VoL/Vol.) mit einem Gehalt

von 10 g/l an NH₄CI 801

Methanol-Wasser (60 :40)

(VoL/Vol.) mit einem Gehalt

von 15 g/l an NH₄Cl 801

Das Antibioticum 18 631 R.P. wird dann mit einem Gemisch Methanol-Wasser (80 : 20) mit einem Gehalt von 30 g/l an Ammoniumchlorid eluiert (240 1 mit einer Rate von 30 l/Stunde).

Das Eluat wird unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unterhalb 40°C auf 301 eingeengt, und das Konzentrat (pH = 5,2) wird zweimal mit je 30 I Chloroform extrahiert.

Der Chloroformextrakt wird unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen eingeengt, und das Antibioticum wird in tert.-Butanol durch Konzentrieren übergeführt, indem zu dem Chloroformextrakt tert.-Butanol gegeben und das Chloroform abdestilliert wird. (Volumen der Butylalkohollösung: 1100 ecm). Der unlösliche und inaktive Anteil wird abgetrennt und die Butylalkohollösung lyophilisiert. Man erhält 25 g gereinigtes Antibioticum 18 631 R.P. mit einem Gehalt von 320 μg/mg.

d Reinigung — 2. Stufe

10 g Antibioticum 18 631 R.P. von der oben beschriebenen 1. Reinigungsstufe werden in 800 ecm Äthylacetat gelöst. Nach Klärung wird die Lösung auf eine Säule (Innendurchmesser: 50 mm) aufgebracht die 750 g zuvor mit verdünnter Schwefelsäure gewaschenes Aluminiumoxyd enthält. Die Säule wird mit 5 1 Äthylacetat gewaschen, und das Antibioticum wird dann mit 1 1 Methanol eluiert.

Die Methanollösung wird unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen eingeengt und das Antibioticum wird durch Konzentrieren in Äthylacetat übergeführt, indem zu dem Methanolkonzentrat Aihylacetal gegeben und das Methanol abdcstillicrt wird. Aus der -, Äthylacetatlösung kristallisiert das Antibioticum aus. Die Ausbeute beträgt 1,16 g Kristalle mit einem Gehalt von 945 μg/mg.

e. Reinigung — 3.Stufe

4,1 g des oben erhaltenen Antibioticums aus der Reinigungsstufe 2 werden in 450 ecm Dioxan gelöst. Nach Klärung der Lösung setzt man langsam unter Rühren 450 ecm destilliertes Wasser zu, worauf das Antibioticum 18 631 R.P. auskristallisiert. Nach Filtrie- η ren, Waschen des Kristallisats mit Wasser und Trocknen erhält man 3,6 g des Aniibioticums 18 631 R.P. in Form weißer Kristalle mit einem Gehalt von 1000 μg/mg.
Schmelzpunkt: 204⁰C

\μ\Ό° = -68° ± 1,5° [λ]", = -199° ± 2,5°
(c= 1% in Äthanol)

Das UV-Spektrum der Verbindung ist in der Fig. 1 und das Infrarot-Spektrum in F i g. 2 dargestellt.

Gewichtsanalyse in % fürCijH^OnN^Cl

Berechnet:

C = 60,29, H = 5,35, O = 25,24, N = 4,02, Cl = 5,09;
gefunden:

C = 59.4, H = 5,45, O = 25,1, N = 4,0. Cl = 5,1. jo

Beispiel 2
a. Fermentation

In einen 75-1-Fermenter bringt man die folgenden Bestandteile ein:

40

Der pH-Wert der Mischung beträgt dann 6,10. Man sterilisiert das Gemisch durch 40minütiges Durchleiten von Dampf von 122°C. Nach dem Abkühlen beträgt das Volumen des Gemisches 401 und der pH-Wert 7,10. Man beimpft nun mit 200 ecm einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur vor. Streptomyces hygroscopicus DS 9751 (NRRL 3418). Die Kultur wird 48 Stunden unter Rühren und unter Belüftung mit steriler Luft bei 27°C entwickelt. Sie ist dann zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet.

Die Produktionskultur wird in einem 30-1-Fermenter durchgeführt, der mit folgenden Substanzen beschickt ist:

Maisquellwasser	800 g
(50% Trockenextrakt)	1200 g
Saccharose	300 g
Calciumcarbonat	80 g
Ammoniumsulfat	ad 351
Leitungswasser

Distiller's Solubles	750 g
(vgl. Angabe im Beispiel 1)	150 g
Dextrose	225 ecm
Sojaöl	0,02 g
Kobaltchlorid mit 6 H2O	ad 151
Wasser

60

Nach Einstellung des pH-Werts mit 65 ecm 10 η-Natronlauge auf pH 8,6 setzt man 75 g Calciumcarhonat zu und sterilisiert dann das Medium bei 122° C

65 während 40 Minuten. Nach dem Abkühlen beträgt das Volumen des Mediums 14 I. Es wird durch Zugabe von 1 I einer wäßrigen sterilen Lösung, die 30 g Ammoniumsulfat enthält, auf 15 I aufgefüllt. Der erhaltene pH-Wert beträgt 7.0.

Man beimpft dann mit 1 I der oben beschriebenen Impfkultur aus dem 75-l-Fcrmenter. Die Züchtung wird bei 27'C 161 Stunden lang unter Rühren mittels eines Turbinenrührers, der mit 240 U/min betrieben wird, und unter Belüftung mit steriler Luft in einer Menge von 1 m'/Stunde durchgeführt. Der pH-Wert der Maische beträgt dann 8,0 und sein Volumen 10,5 I. Die vorhandene Antibioticummenge beträgt 9 μg/ccm.

b. Extraktion

10,5 1 der oben erhaltenen Fermentationsmaische werden in einen mit einer Rührvorrichtung ausgestatteten Bottich eingebracht. Man setzt 10,5 I n-Butanol und 500 g Filtrierhilfe zu. Die Suspension wird eine halbe Stunde gerührt und filtriert. Der Filterkuchen wird nacheinander mit 1 I n-Butanol und 1 I Wasser gewaschen. Das Filtrat wird dekantiert. Die untere wäßrige Phase wird abgetrennt und verworfen. Die organische Phase (11 1) wird dann unter vermindertem Druck (40 mm Hg) bei 30°C auf ein Volumen von 200 ecm eingeengt. Das in dem Konzentrat vorhandene Antibioticum wird durch Zugabe von 2 I Hexan ausgefällt. Das Antibioticum wird abfiltriert, mit Hexan gewaschen und in einem Vakuumtrockenschrank (40 mm Hg, 35°C) getrocknet. Man erhält 14 g des rohen Antibioticums mit einem Gehalt von 3 μg/mg.

Die Chromatographie des Rohprodukts auf Papier Arches 302, das mit einer Phosphatpufferlösung von pH 7 [Mischung aus 6 ecm einer M/3 ('/3 Mol je Liter) Dinatriumphosphatlösung und 4 ecm einer M/3 ('/3 Mol je Liter) Monokaliumphosphatlösung] imprägniert ist, mit Chloroform als Entwicklungslösungsmittel ergibt die gleiche Wanderung wie mit dem aus den Kulturen von S. albocinerescens DS 21 647 (NRRL 3419) in Beispiel Ib isolierten Rohprodukt (Rf = 0,5).

Auf Papier Arches 302 beobachtet man mit einem Gemisch Äthylacetat-Cyclohexan (1 : 1), das mit Wasser gesättigt ist, als bewegliche Phase die gleiche Wanderung wie bei dem gemäß Beispiel Ib isolierten Rohprodukt (Rf = 0,5).

Auf Kieselgel G-Dünnschicht erhält man unter Verwendung des Gemischs Tetrachlorkohlenstoff-Äthanol-Essigsäure (90:6:6) als Entwicklungssystem die gleiche Wanderung wie bei dem gemäß Beispiel Ib isolierten Rohprodukt (Rf = 0,5).

Das oben erhaltene Rohprodukt wird gemäß Beispiel Ic bis legereinigt.

Beispiel 3

480 I einer gemäß Beispiel la hergestellten Fermentationsmaische, die jedoch einen Gehalt von 1 μg/ccm aufweist und einen pH von 7,1 besitzt, werden in einen mit einer Rührverrichtung ausgestatteten Bottich eingebracht. Man setzt 4001 Äthylacetat und dann nach '/jstündigem Rühren 45 kg Filtrierhilfe zu. Die Suspension wird auf einer Filterpresse nitriert. Der Filterkuchen wird nacheinander mit 801 Äthylacetat und dann mit 150 1 Wasser gewaschen. Das Filtrat (1080 1) wird dekantiert. Die untere wäßrige Phase wird abgetrennt (6601) und verworfen. Die organische Phase (4201) wird mit 401 Wasser gewaschen. Der gewaschene Extrakt wird unter vermindertem Dmck (60 mm Hg) bei 22° C auf ein Volumen von 31 eingeengt.

Das Konzentrat wird mit 30 I Hexan versetzt und das dabei ausgefallene Antibioticum abfiltriert. mit Hexan gewaschen und in einem Vakuumtrockenschrank (5 mm Hg. 40''C) getrocknet. Man erhält 37 g rohes Antibioticum 18 631 R.P. mit einem Gehalt von 6 ug/mg. Dieses Rohprodukt kann wie in Beispiel Ic bis Ie beschrieben gereinigt w erden.

Beispiel 4

0,5 g gemäß Beispiel 1d hergestelltes und gereinigtes Antibioticum 18 631 R.P. werden in 20 ecm Aceton gelöst und durch langsame Zugabe von 10 ecm Wasser umkristallisiert. Man erhält 0.445 g weiße feine Nadeln des Antibioticum mit einem Gehalt vcn 994 iig/mg und das die physikalisch-chemischen Eigenschaften des nach Beispiel Ie erhaltenen Antibioticums besitzt.

Beispiel 5
a. Fermentation
Man beschickt einen 170-1-Fermenter mit:

Pepton(CI =3.5%) 1200 g

Fleischextrakt (Cl = 1%') 600 g

Maisstärke 1200 g

Leitungswasser ad 1101

Der pH-Wert wird mit 120 ecm K)n-Natronlauge auf 7.10 eingestellt. Man sterilisiert das Medium durch 40minütiges Durchleiten von Dampf von 122^rC. Nach Abkühlen beirägt das Volumen der Mischung 120 I und der pH-Wert 7.10. Man beimpft mit 200 ecm einer gerührten bzw. geschüttelten Kultur von Streptomyces roseochromogenes. var. oscitans DS 12 976 (NRRl. 3504). Die Kultur wird bei 3OC 27 Stunden unter Rühren und unter Belüftung mit steriler Luft entwickelt. Sie ist dann zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet.

Die Produktionskultur w ird in einem 800-l-Ferinentcr durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen beschickt ist:

Distiller's Solubles

(vgl. Angabe in Beispiel 1) 20kg

teilweise hydrolysierte Stärke 5 kg

Kobaltchlorid mit 6 H;O 10g

Leitungswasser ad 405 I

Nach Einstellen des pH-Werts mit 1800 ecm 10 η-Natronlauge auf 7.50 setzt man 2.5 kg Caiciumearbonat zu und sterilisiert das Medium dann bei 122" C während 40 Minuten. Nach Abkühlen beträgt das Volumen des Gemisches 450 L Durch Zugabe von 50 I einer sterilen wäßrigen Lösung, die 12,5 kg Dextrose enthält und 5 I einer sterilen wäßrigen Lösung, die 1 kg Ammoniumsulfat enthält, wird auf 500 I aufgefüllt. Der pH-Wert beträgt 6.60.

Man beimpft dann mit 50 I der oben beschriebenen Impfkultur aus dem 170-l-Fermenter. Die Züchtung wird bei 33 C 119 Stunden unter Bewegung mit Hilfe eines Turbinenrührers, der mit 205 U/min betrieben wird, und unter Belüftung mit steriler Luft in einer Menge von 25 mVStunde durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums beträgt dann 8.60 und das Volumen der Maische 470 I. Die vorhandene Antibioticummenge beirägt 288 iig Cv.m.

h. l'xiraktion

¹WO 1 de'" 'hen genial', .ι) erhaltenen Fermcn'ationsmaische ihm einem Gehalt von 288 ug ecm werden in einen mit einer Rührvorrichtung ausgestatteten Bottich gebracht. Der pH-Wert der Maische wird mit 10 I 5 n-Salz.säure auf 5 eingestellt. Nach Vjstündigem Rühren setzt man 50 kg Filiriei hilfe zu und filtriert die Suspension auf einer Filterpresse. Der Filterkuchen wird mit 200 I Wasser gewaschen und das Filtrat (1025 1) verworfen. Der Filterkuchen (199 kg) wird unter Rühren in 750 I eines Gemischs von Wasser und Methanol mit einem Gehali von 600 1 Methanol suspendiert. Der scheinbare pH-Wert des Gemischs wird dann durch Zugabe von 1 I 5 η-Natronlauge auf 7 eingestellt. Das Rühren wird 1 Stunde fortgesetzt. Dann wird die Brühe auf einer Filterpresse filtriert. Das Filtrat wird abgetrennt und der Filterkuchen wird mit 100 1 eines Gemisches von Wasser und Methanol mit einem Gehalt von b0 VoL-⁰Zo Methanol gewaschen. Filtrat und Waschflüssigkeit werden vereinigt und man erhält 840 I Flüssigkeit mi; einem Antibioticumgehalt von 285 iig/ccm. Der Filterkuchen wird verworfen. Das alkoholische Filtrat wird dann unter vermindertem Druck (35 mm Hg) bei 35 C auf ein Volumen von 100 I eingeengt. Das Konzentrat wird in einen mit einem Rührer ausges'atteten Bottich eingebracht. Man set/i 50 I η Butanol zu. Der pH-Weit der wäßrigen Phase wird mit Hilfe von 5 η-Salzsäure auf 3 eingestellt und das Rühren win. 30 Minuten fortgesetzt. Nach Dekantieren wird dann die obere Phase abgetrennt. Die Extraktion wird mit 30 I n-Butanol wiederholt. Die ausgezogenen Mutterlaugen werden verworfen. Die beiden Extrakte werden vereinigt (98 1) und mit 10 I Wasser gewaschen. Das Waschwasser wird verworfen. Der gewaschene Butanolextrakt wird unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 37⁼C auf ein Volumen von 3 1 eingeengt. Das Konzentrat wird mit einer 25%igen Lösung von Natriummethylat in n-Butanol auf pH 7 neutralisiert. Das neutralisierte Konzentrat wird in 30 I Hexan gegeben. Das dabei in Form des Natriumsalzes ausgefallene rohe Antibioticum 18 631 R.P. wird abfiltriert. mit Hexan gewaschen und in einem Trockenschrank unter vermindertem Druck (5 mm Hg, 40^cC) getrocknet. Man erhält 477 g rohes Antibioticum 18 631 R.P. mit einem Gehalt von435iig/mg.

c. Reinigung — I.Stufe

1345 g gemäß b) erhaltenes Rohprodukt mit einem Gehalt von 332 ug/mg werden in 30 1 eines Gemischs Methanol —Wasser (50:50 Volumina) gelöst. Die erhaltene Lösung wird oben auf eine Säule (Innendurchmesser: 15 cm) aufgebracht, die 30 I eines Polystyroltrimethylbenzylammonium-Anionenaustauscherharz.es in Chloridform. das unter dem Namen »Dowex 1 X 2« im Handel ist, enthält, wobei die Menge des Abflusses 3 l/Stunde eingestellt wird.

Wenn die gesamte Ausgangslösung durch die Säule gegangen ist. wird das Harz von oben nach unten bei einer Einstellung der Rate auf 25 l/Stunde nacheinander mit den folgenden Gemischen gewaschen:

Methanol-Wasser

(50 : 50 VoL/Vol.) 20 I

Methanol-Wasser

(bO 14OVoLzAOI.)

mit 1 5 g'l AmmoniLimchlvirid 1201

Methanol-Wasser

(70 : 30 VoL/Vol.)

mit I 5 g/l 'Nmmonnmk-hlorid 60 1

Das Antibioticum wird dann mit einem Gemisch Methanol-Wasser (80 :20 Volumina) mit einem Gehalt voo 30 g Ammoniumchlorid je Liter eluiert (120 I in 6 Fraktionen von je 201).

Die Fraktionen 2, 3 und 4, die den Hauptteil der Aktivität enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unterhalb 40⁰C auf 30! eingeengt

Das Konzentrat wird ohne Änderung des pH-Werts einmal mit 15 1 und zweimal mit je 7.5 1 Äthylacetat extrahiert Die Extrakte werden vereinigt mit 5 1 Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 4O⁰C auf 101 eingeengt. Die erhaltene Lösung wird nun durch eine Säule (Innendurchmesser: 5 cm) geleitet die 500 g zuvor bei pH 4 gewaschenes Aluminiumoxid enthält Wenn die gesamte Lösung durchgeflossen ist, entwickelt man die Säule mit 21 Äthylacetat

Die austretende Flüssigkeit und die Waschflüssigkeiten werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf ^J/io ihres Volumens eingeengt, wobei Kristallisation eintritt. Nach 2stündigem Stehen in einem Eisbad werden die Kristalle abgesaugt, mit 200 ecm kaltem Äthylacetat gewaschen und 24 Stunden bei 40⁰C unter vermindertem Druck von weniger als 5 mm Hg getrocknet. Man erhält 170 g kristallisiertes Antibioticum 18 631 R.P. in Form der freien Säure mit einem Gehalt von 855 μg/mg.

Aus den Fraktionen 5 und 6 der obigen Säulenchromatographie werden in der gleichen Weise 35 g kristallisiertes Antibioticum mit einem Gehalt von 702 μg/mg erhalten. (Durch Einengen der Mutterlaugen und Ausfällen mit Hexan kann man noch 124 g Produkt zur Zurückführung mit einem Gehalt von 250 μg/mg gewinnen).

d. Reinigung — 2. Stufe

276 g des oben erhaltenen Antibioticums aus der Reinigungsstufe 1 werden bei 30° C in 2,4 I eines Gemischs Aceion-Dioxan (5 :1 Volumina) gelöst. Die Lösung wird geklärt und dann innerhalb von 3 Stunden unter langsamem Rühren bei Zimmertemperatur mit 2,5 I Wasser versetzt. Nach Stehenlassen über Nacht bei Zimmertemperatur werden die ausgefallenen Kristalle abgesaugt, mit 1 I Wasser gewaschen und 48 Stunden bei 6O⁰C unter einem Druck von 1 mm Hg getrocknet.

Man erhält 231 g Antibioticum 18 631 R.P. in Form weißer Kristalle mit einem Gehalt von 990 μg/mg. Die Verbindung besitzt folgende Daten:

Drehvermögen:

[λ]? = -67° ± 1,5°
I«]S = -195° ±23°
[C= l«/o in Äthanol)

Ultraviolett-Spelctrum (Bestimmung mit einer Lösung in Chloroform mit 30 mg/1):

Absorptionsmaximum bei 275 nm
Absorptionsminimura bei 298 nm
Schulter bei 307 nm

Absorptionsmaximum bei 338 nm

Gewichtsanalyse in % für C;
Berechnet:

C = 60,29,

H = 5,35,

O = 25,24,

N = 4,02,

Cl = 5,09,

Gefunden:

C = 60,0 bis 603

H = 5,4 bis 5^

O = 24,9 bis 25,0

N = 3,9 bis 4,1

Cl = 4,75 bis 4,95

Beispiel 6

164 g gemäß Beispiel 5c erhaltenes kristallines Antibioticum 18 631 R.P. werden in 500 ecm Aceton gelöst. Die Lösung wird durch Filtrieren durch eine Schicht Filtrierhilfe (Clarcei DIC) geklärt Dann setzt man zu der Lösung innerhalb von I¹/2 Stunden unter langsamem Rühren 4,5 I eines Gemischs Acetonitril — Wasser (50 : 50 Volumina) zu. Nach Stehenlassen über Nacht bei Zimmertemperatur werden die gebildeten Kristalle abfiltriert, zuerst mit 1 I eines Gemischs Aceton —Wasser (50:50 Volumina) und dann mit 1 I Wasser gewaschen und 48 Stunden bei 50⁰C unter weniger als 5 mm Hg getrocknet. Man erhält 124 g

S3 Antibioticum 18 631 R.P. in Form weißer Kristalle mit einem Gehalt von 1000 μg/mg und das die physikalischchemischen Eigenschaften des gemäß Beispiel 5d erhaltenen Antibioticums besitzt.

Das folgende Beispiel erläutert eine erfindungsgemäße medizinische Zusammensetzung:

Beispiel 7

Man stellt nach der üblichen Arbeitsweise Tabletten der folgenden Zusammensetzung her:

18 631 R.P.	0,250 g
Stärke	0,150 g
kolloidale Kieselsäure	0,070 g
Magnesiumstearat	0,030 g

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

1. Palentansprüche: 1. Antibioticum 1863IR. P. der folgenden Formel:

   CH

   CI

   CH,O

   CH,
2. 2. Verfahren zur Herstellung des Antibioticums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man »Streptomyces hygroscopicus DS 9751«, der unter der Nr. NRRL 3418 hinterlegt wurde, oder »Streptomyces albocinerescens DS 21 647«, der unter der Nr. NRRL 3419 hinterlegt wurde, oder »Streptomyces roseochromogenes, var. oscitans DS 12 976«, der unter der Nr. NRRL 3504 hinterlegt wurde, in an sich bekannter Weise in einem üblichen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und das gebildete Antibioticum aus der Kultur in üblicher Weise abtrennt und reinigt.
3. 3. Pharmazeutische Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an dem Antibioticum 18 631 R.P. gemäß Anspruch 1 neben üblichen inerten Verdünnungsmitteln oder Trägerstoffen.