DE1907556B2

DE1907556B2 - Antibioticum 18 631 r.p. und verfahren zu dessen herstellung sowie dieses antibioticum enthaltende pharmazeutische mittel

Info

Publication number: DE1907556B2
Application number: DE19691907556
Authority: DE
Inventors: Denise Charenton; Ninet Leon; Preud'Homme Jean; Paris; Mancy geb. Courtillet (Frankreich)
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1968-02-14
Filing date: 1969-02-14
Publication date: 1978-01-12
Also published as: NL155307B; US3682886A; DE1907556C3; DE1907556A1; GB1208842A; AT284342B; FR95269E; BE728372A; CH492781A; DK120310B; NL6902381A

Description

CH₂
CH

Il

C(CH₃),

wurde, in an sich bekannter Weise in einem üblichen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und das gebildete Antibioticum aus der Kultur in üblicher Weise abtrennt und reinigt.

3. Pharmazeutische Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an dem Antibioticum 18 631 R.P. gemäß Anspruch 1 neben üblichen inerten Verdünnungsmitteln oder Trägerstoffen.

Die Erfindung betrifft das neue Antibioticum 18 631 R. P. der Formel

CH,
CH₁O

OH

¹V H \

OH

O OH

CO

NH

CH₁

und ein Verfahren zu dessen Herstellung sowie dieses Antibioticum enthaltende pharmazeutische Mittel.

Das neue Antibioticum besitzt hohe antibaktericlle Wirksamkeit gegenüber grampositiven Keimen und eine bemerkenswerte Wirksamkeit gegenüber gewissen gramnegativen Keimen. bf

Seine Wirkung wurde in verschiedenen Versuchen und im Vergleich sowohl gegenüber dem Novobiocin als auch gegenüber dem Erithromycin, das wegen seiner Wirkung auf grampositive Keime bekannt ist, geprüft. Nachstehend sind die hierbei erhaltenen Ergebnisse zusammengestellt.

Bakteriostatische Aktivität von 18 631 R.P. in vitro

Das Antibiotikum 18 631 R.P. weist eine beträchtliche antibiotische Wirksamkeit gegenüber einer gewissen Anzahl von Bakterien auf, von denen die empfindlichsten zu denjenigen gehören, die die Färbung nach Gram annehmen. Seine Aktivität ist gegenüber Staphylokokken besonders hoch. Es zeigt eine begrenztere b-5 Wirksamkeil gegenüber den gramnegativen Bakterien, obgleich es auch hier noch eine bemerkenswerte Wirksamkeit, insbesondere gegen gewisse Neisseria ausübt.

Es zeigt keine gekreuzte Resistenz mit Aureomycin, Streptomycin, Chloramphenicol, Erythromycin, Carbomycin, Spiramycin und Pristinamycin, dagegen jedoch 'ine beträchtliche gekreuzte Resistens mit Novobiocin.

In der nachfolgenden Tabelle I sind die Konzentrationen von 18 631 R.P. angegeben, die für die Bakteriostase einiger Keime erforderlich sind. Es wurde die minimale Hemmkonzentration mit einer üblichen Verdünnungsmethode bestimmt, d. h. wobei jegliche sichtbare Entwicklung in dem Nährmedium verhindert wird. Als Versuchsmedium wurden die für derartige Versuche üblichen verv/endet, vgl. Microbiological Methods, 3. Auflage von Ch. Collins und P. L y η e (Butterworths University Park Press).

Tabelle I

Geprüfte Bakterienorganismen

Minimale Hemmkonzentration in μρ/ccm

Die antibakterielle Wirksamkeit von 18 631 R.P. wurde in vivo bei Versuchstieren bestätigt, die experimentell mit Keimen, wie beispielsweise Streptokokken. Pncumokokken und Staphylokokken, infiziert waren. Das Antibioticum hat sich bei der Maus bei Verabreichung auf oralem und subcutaneni Wege als besonders wirksam erwiesen. Es weist auch eine sehr gute Präventivwirkung gegen Staphylokokkeninfektionen der Maus bei Verabreichung auf oralem und subcutanem Wege auf.

In der folgenden Tabelle Il sind die erhaltenen Werte für das erfindungsgemäße Antibiotikum 18 631 R.P. und für Novobiocin gegenübergestellt.

Tabelle II

Geprüfte Bakterienorganismen

K) Minimale Hemmkonzentretioi. in μg/ccm

18 631RP Novobioc-n

20

Staphylococcus aureus, Stamm 209 P -

ATCC 6538 P 0,005

Staphylococcus aureus, Stamm Smith 0,003

Sarcina lutea - ATCC 9341 0,02

Streptococcus faecalis - ATCC 9790 0,04

Streptococcus viridans (Institut Pasteur) 3

Streptococcus pyogenes haemolyticus _i(1

(Stamm Dig 7, Institut Pasteur) 0,05

Diplococcus pneumoniae (Stamm TiI,

Institut Pasteur) 0,03

Neisseriä cararrhalis (A 152 - Institut

Pasteur) 0,005 "

Neisseriä meningitidis (5813 - Institut

Pasteur) 0,05

Neisseriä gonorrhoeae (A 50 - Institut

Pasteur) 0,4 _w

Lactobacillus casei - ATCC 7469 1

Bacillus subtilis - ATCC 6633 0,6

Bacillus cereus - ATCC 6630 0,5

Mycohacterium species - ACTT 607 10

Escherichia coli - ATCC 9637 10

Proteus vulgaris 13

Klebsiella pneumoniae - ATCC 10 031 1

Pseudomonas aeruginosa (Stamm Bass -

Institut Pasteur) 4

Brucella bronchiseptica (CN 387 -

Wellcome Institut) 0,3

Brucella abortus bovis B 19

(52 135 - Institut Pasteur) 0,1

Pasteurella multocida (A 125 -

Institut Pasteur) 7

Treponema (Reiter) 12

50

55 Staphylococcus aureus, Stamm 209 P - ATCC 6538 P Staphylococcus aureus, Stamm Smith

Sarcina lutea - ATCC 9341 Streptococcus faecalis — ATCC 9790
Streptococcus viridans (Instiiut Pasteur)

Streptococcus pyogenes haemolyticus (Stamm Dig 7, Institut Pasteur)
Diplococcus pneumoniae (Stamm TiI, Institut Pasteur) Neisseriä catarrhalis (A 152 Institut Pasteur)
Neisseriä meningitidis (5813 Institut Pasteur)

Neisseriä gonorrhoeae (A 50 Institut Pasteur)

Lactobacillus casei - ATCC 7469

Bacillus subtilis - ATCC 6633 Bacillus cereus - ATCC 6630 Mycobacterium species ATCC 607

Escherichia coli - ATCC 9637 Proteus vulgaris

Klebsiella pneumoniae ATCC 10 031

Pseudomonas aeruginosa (Stamm Bass - Institut Pasteur)

Brucella bronchiseptica (CN 387 - Wellcome Institut) Brucella abortus bovis B 19 (52 135 - Institut Pasteur) Pasteurella multocida (A 125 - Institut Pasteur) Treponema (Reiter)

0,005 0,4

0,003	0,07
0,02	0,2
0,04	0,6
3	15
0,05	0,7
0,03	0,8
0,005	0,06
0,05	0,2
0,4	1,6
1	0,06
0,6	0,8
0,5	1,2
10	6
10	55
13	>150

4	>150
0,3	8
0,1	10
7	2,
12	6

b0 Aktivität beiden experimentellen Infektionen ander Maus

1. Aktivität an Infektionen mit grampositiven Kokken

a) Kurative Aktivität

Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen 18 631 R.P. wurde im Vergleich zu Novobiocin gegenüber Infcktio-

ncn, welche auf intraperilonalem Wege mit Staphylococcus (Stamm Smith), Streptococcus (Stamm Dig. 7) und Pneumococcus (Stamm TiI) erzeugt wurde und eine Infektion, welche intravenös mit Staphylococcus (Stamm 133) erzeugt wurde.

Man injiziert intraperitoneal oder intravenös 0.5 ecm einer 18 Stunden alten Kultur des zu untersuchenden Erregers in einem geeigneten flüssigen Medium, zweckmäßig verdünnt auf 5% in physiologischer Lösung oder in Mucin. Das Beimpfen ruft den Tod der Kontrolltiere zwischen 24 bis 48 Stunden hervor.

Das zu untersuchende Antibiotikum wird einm täglich während 2 oder 3 aufeinander folgenden Tage oral oder subkutan verabreicht: die erste Verabreichun erfolgt 1 Stunde nach der Beimpfung. Man verwend Einmal-Dosen, welche in 50 ccm/kg enthalten sind. Ma untersucht 4 oder 5 steigende Dosen und 10 Mäuse j Dosis. Die 50%ige kurative Dosis (DC50) ist diejenig Dosis an Antibiotikum, die nach täglicher Verabrei chung während 2 oder 3 Tagen das Überleben de Hälfte der Mäuse während des gesamten Versuche (8 Tage) ermöglicht.

b) Präventive Wirksamkeit

Die präventive Aktivität wird an der experimentellen Staphylomykose der Maus (Staphylococcus Smith) bestimmt.

Das zu untersuchende Antibiotikum wird era! verabreicht. Die Verabreichung ist einmalig und erfolgt 6 Stunden und 24 Stunden vor der Beimpfung mit dem Erreger. Man verwendet einmalige Dosen, welche in 50 ccm/kg enthalten sind. Man untersucht 4 oder 5 gestaffelte Dosen und 10 Mäuse je Dosis.

Der Versuchskeim wird intraperitoneal verabreicht (0,5 ecm einer i 8 Stunden aiten Kuitur in einem üblichen flüssigen Medium, zweckmäßig verdünnt auf 5% in

Tabelle IHa

Kurative Wirksamkeit bei oraler Verabreichung:

physiologischer Salzlösung oder in Mucin).

Das Beimpfen mit dem betreffenden Keim ruft de Tod der nicht behandelten Tiere in 24 bis 48 Stunde hervor. Die 50%ige präventive Dosis (DP™) für ein Dauer von 6 Stunden oder 24 Stunden ist diejenig Dosis an dem Antibiotikum, welche bei einmalige Verabreichung ermöglicht, daß die Hälfte der Maus welche nach 6 Stunden oder 24 Stunden infiziei wurden, während der gesamten Versuchsdauer (8 Tag nach der Beimpfung) überleben.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in den folgende Tabellen lila und 1Mb zusammengestellt.

Keim	18 631 R. P.	Über	% mittleres	DC₅₀	Novobiocin	(Natriumsalz)	% mittleres	DC₅₀
	lx-Dosis	lebende	Überleben	mg/kg	1 x-Dosis	Über	Überleben	mg/k(
	mg/kg/Tag	nach dem	in 8 Tagen	p. 0.	mg/kg/Tag	lebende	in 8 Tagen	p. 0.
		8. Tag				nach dem
		10/10	100			8. Tag	100
Staphylococcus Smith	50	10/10	100		50	9/9	83
	25	8/10	82	7,5	25	8/10	10	18
	10	1/10	12		10	1/10	0
	5	1/10	11		5	0/10	0
	2,5	0/10	0		2,5	0/10
	1	10/10	100				100
Staphylococcus 133	250	10/10	100		250	10/10	90
	100	10/10	100	17	100	7/10	49	80
	50	9/10	97		50	1/10	21
	25	1/10	34		25	0/10	2
	10	10/10	100		10	0/10	65
Streptococcus Dig. 7	500	10/10	100		500	4/10	47	cnn
	250	3/10	40	140	250	2/10	0	j UU
	100	0/10	4		100	0/10	0
	50	10/10	100		50	0/10	57
'ncumococcus Til	500	3/10	62		500	2/10	41
	250	1/10	19	300	250	1/10	2	>50C
	100	0/10	3		100	0/10	3
	50	0/10	1		50	0/10	1
	25			25	0/10

	7	1	P.	Über-	Über	9 07 556	8	50	nach dem	Über	% mittleres	DC₅₀
		g lebende	lebende			25	8. Tag	lebende	Überleben	mg/kg
Kurative Aktivität bei	subkutaner Verabreichung:	nach dem	nach dem			10	10/10	nach dem	in 8 Tagen	S. C.
Keim	18 631 R. P.	8. Tag	8. Tag			5	9/10	8. Tag
	IX-Dosis	10/10	10/10	% mitttleres DC₅₀		2,5	1/10	10/10	100
	mg/kg/Tag	10/10	10/10		Novobiocin (Natriumsalz)		0/10	8/10	94
		10/10	10/10		IX-Dosis Über-	250	0/10	0/10	18	17
		10/10	8/10		Überleben mg/kg mg/kg/Tag lebende	100		0/10	5
Staphylococcus Smith	50	0/10	0/10		in 8 Tagen s. c.	50	0/10		0
	25	0/10	0/10			0/10
	10	10/10	10/10	100	250	0/10	9/10	29
	5	10/10	5/10	100	100		0/10	18
	2,5	1/10	0/10	100 4	50	1/10	0/10	2	>250
	1	0/10	0/10	82	25	0/10	0/10
Streptococcus Dig. 7	250	0/10	9/10	8		0/10		56
	100		1/10	0		0/10	9
	50	0/10	100		2	>250
	25	0/10	62		3
Pneumococcus Til	250		10 ¹⁰°	Novobiocin (Natriumsalz)
	100		0	IX-Dosis
	50		96	mg/kg/Tag
	25	% mittlere;	57		% mittleres	DC₅₀
Tabelle Illb		Überleben	25 ¹⁷°		Überleben	mg/kg
Präventive Aktivität:		in 8 Tagen	5	250	in 8 Tagen	p. o.
Zeit zwischen 18 631 R.			100
Behandlung ._χ _ .	100		50	100
und ·, .™, infpttinn mg/kg/Ta	100		25	82
intektion	100	5 DC₅₀		6	on
	100	ι mg/kg		0	80
6 Stunden 250	4	p. o.	500
100	1		250
50	100		100	92
25	100		50	0
10	10	1 1		0	380
5	0	17	0
24 Stunden 500	0
250
100
50
25	170

2. Aktivität bei einer Infektion mit einem
gramnegativen Microkokkos

Die kurative Wirksamkeit wurde gegenüber der Infektion mit Neisseria meningilidis (Stamm IP 5813), der intraperitoneal verabreicht wurde, bestimmt.

Man injiziert intraperiioneal 0,5 ecm einer 18 Stunden allen Kultur von Neisseria mcningitidis in einem Milieu Trypticasc Soy Broth (BBL), versetzt mit 10% Ascitcs, verdünnt mit 2· 10 ^J Mucin zu 5%.

Das zu untersuchende Antibiotikum wird oral einmal täglich während zwei aufeinander folgenden Tagen M) verabreicht. Die erste Gabe erfolgt 1 Stunde nach der Infektion. Man verwendet einmalige Dosen, die in 50 cem/kg enthalten sind. Man untersucht 4 oder 5 gestaffelte Dosen und 10 Mäuse je Dosis.

Die 50%igc kurative Dosis (DCi₀) ist diejenige Dosis an Antibiotikum, welche nach täglicher Verabreichung während 2 Tagen das Überleben der Hälfte der Mäuse während der gesamten Versuchsdaucr ermöglicht. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

ίο

18 631 R. P.	Überlebende nach dem 8. Tag	% mittleres Überleben in 8 Tagen	DC₅₀ mg/kg p. o.	Novobiocin	(Natriumsalz)	% mittleres Überleben in 8 Tagen	DC₅₀ mg/kg p. o.
lx-Dosis mg/kg/Tag	10/10	100		lx-Dosis mg/kg/Tag	Überlebende nach dem 8. Tag	100
50 Stunden	7/10	67		100	10/10	100
25 Stunden	7/10	70		50	10/10	70	1 O
lOSlunden	7/10	67	J,J	25	7/10	10	IV
5 Stunden	0/10	3		10	1/10	3
2,5 Stunden	1/10	10		5	1/10	0
1 Stunde			2,5	0/10

Vergleich mit Erythromycin

1. Bakteriostatische Aktivitäten in vitro:

Sensible Keime

Minimale Hemmkonzentration
Erythromycin 18 631 R. P.

Staphylococcus aureus 209 P
Sarcina lutea ATCC 9341
Streptococcus faecalis ATCC 9790
Streptococcus pyogenes Dig 7
Diplococcus pneumoniae TiI
Bacillus subtilis ATCC 6633

0,2	0,005
0,02	0,02
0,1	0,04
0,03	0,05
0,015	0,03
0,8	0,6

2. Kurative Wirksamkeit bei experimentellen Infektionen der Maus:

Art der DC₅₀ mg/kg/Tag

Verabreichung _Erythromycin

p. O. S. C.

18 631 R. P.

p. O. S. C.

Staphylococcus aureus Smith i. p.

Staphylococcus aureus 133 i. v.

Streptococcus pyogenes Dig. 7 i. p.

Toxizität

Die Toxizität des Antibiotikums 18 631 R.P. wurde bei der Maus geprüft und bei oraler und subcutaner Verabreichung bestimmt. Bei diesen beiden Verabreichungsarten hat sich das 18 631 R.P. bei einer Dosis von 1 g/kg als atoxisch erwiesen. Die letale Dosis 50% oder DLw wurde ebenfalls bei oraler und subcutaner Verabreichung bestimmt und beträgt:

DLw= 2,2 g/kg p.o.
1,7 g/kg S.C.

Diese Ergebnisse zeigen, daß das Produkt wenig toxisch ist. bo

Im Vergleich dazu beträgt die DLso des Novobiocins 1,6 g/kg p.o. und 0,6 g/kg s.c.

Das Antibioticum 18 631 R.P. wird erfindungsgemäß dadurch hergestellt, daß man »Streptomyces hygroscopicus DS 9751«, der unter der Nr. NRRL 3418 hinterlegt b5 wurde, oder »Streptomyces albocinerescens DS 21 647«, der unter der Nr. NRRL 3419 hinterlegt wurde, oder »Slreptoniyces roseochromogenes, var. oscitans

50

55

>250
55

7,5-8

17

140-160

DS 12 976«, der unier der Nr. NRRL 3504 hinterlegt wurde, in an sich bekannter Weise in einem üblichen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und das gebildete Antibioticum aus der Kultur in üblicher Weise abtrennt und reinigt.

Proben der erwähnten Stämme sind beim US-Department of Agriculture in Peoria, III. (USA) hinterlegt und frei zugänglich.

Das Antibioticum 18 631 R.P. stellt ein mikrokristallines weißes Pulver dar und besitzt die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

Schmelzpunkt: 204-206⁰C.

Löslichkeit

Es ist in Dimethylsulfoxyd leicht löslich, in verdünnten starken Basen, Methanol, Äthanol, Aceton, Dioxan, Chloroform, Dimethylformamid und Äthylacetat löslich und in Wasser, wäßrigen Natriumbicarbonatlösungen, verdünnten starken Säuren, Tetrachlorkohlenstoff, Acetonitril und Hexan wenig löslieh oder nicht löslich.

it

Elemcntarzusamnicnsetzung berechnet für Cj₁HkOmN..Cl)

C = 60,29% H = 5.35% O = 25.24% N = 4.02»/n Cl 5.09%.

Drehvermögen

[λ]? = -68° ± 1,5° (c= 1% in Äthanol)

jypX = -199° ±2,5° (c= 1% in Äthanol)

[«]? =-· -80° ± 2° (c = 0,6% in Aceton)

[tx]f,'s = -224° ± 2,5° (c = 0,6% in Aceton)

Ultra violet t-Spekt rum

(Bestimmung mit einer Lösung mit 10 mg/1 in Chloroform)

Absorptionsmaximum bei 275 nm (E!'^ =444) Schulter bei 307 nm (Ei;; = 201)

Absorptionsmaximum bei 337 nm (EJ^, =434)

Dieses Spektrum ist in F i g. 1 wiedergegeben, in der als Abszisse einerseits die Wellenlänge in Nanometer (nm) (unterer Maßstab) und andererseits die Wellenzahlen in cm-' (oberer Maßstab) und als Ordinate die optischen Dichten aufgetragen sind.

Saure-basischc Reaktion

Das 18 631 R.P. ist eine schwache Säure, deren Neutraläquivalent, gemessen durch potcntiometrischc Titration einer Lösung in einem Gemisch Methanol-Wasser (25 : 10 Volumina) mit 1/10 n-Natronlaugc, 695 beträgt.

Infrarot-Spektrum

(Die Bestimmung wurde an mit Kaliumbromid verpreßtem Produkt vorgenommen)

Dieses Spektrum ist in F i g. 2 gezeigt, in der als Abszisse einerseits die Wellenlängen in Mikron (unterer Maßstab) und andererseits die Wellenzahlen in cm-' (oberer Maßstab) und als Ordinate die optischen Dichten aufgetragen sind.

In der nachfolgenden Tabelle sind die Hauptbanden der Infrarot-Absorption (in cm-') für dieses Produkt angegeben:

Tabelle

Farbreaktionen

Das 18 631 R.P. ergibt

Stark positive Teste in folgenden Reaktionen:

Reaktion nach M ο 1 i s c h ,

Reaktion nach Folin-Denis, Permangana t-Schwefelsäure-Reaktion (in der Kälte),

Fehlingsche Reaktion,

Indol-Schwefelsäure-Reaktion,

Cystein-Reaktion,

Carbazol-Reaktion,

Reaktion nach D i s c h e (mit Phloroglucin), Reaktion nach Elson-Morgan und Reaktion nach Dische-Borenfreund (nach Desaminierung);

schwach positive Teste in den folgenden Reaktionen:

Reaktion nach Pa u Iy,
Reaktion nach Adamkiew icz, Reaktion nach T ο 11 e η s und
Reaktion nach Seliwanoff— Roe;

3440 Sch	1530 st	980 sch
3360 st	1500 Sch	950 st
3300 Sch	1495 Sch	935 m
3100 Sch	1485 sst	855 m
2970 m	1460 m	810st
2920 st	1430 st	780 st
2840 m	1360 st	750 st
2820 Sch	1315st	735 m
2720 sch	1280 m	720 sch
2560 m	1255 sch	695 sch
2100m	1215sst	660 Sch
1850 sch	1190 m	645 Sch
1685 sst	1130st	625 st
1625 st	1110m	605 Sch
1595 sst	1070 si	565 sch
1555 m	1030 st	555 m
1540 Sch	990 st	530 m
		500 m
sst =	sehrstark
Si =	stark
m =	mittel
sch =	schwach
Sch =	Schulter

negative Teste in den folgenden Reaktionen:

Reaktion nach M i 11 ο η,

Ninhydrin-Reaktion,

Biuret-Reaktion,
Xanthoprotein-Reaktion,

Diazotierungsreaktion,

Reaktion nach Ehrlich-Salkowsky, Ferrichlorid- Reaktion,

Reaktion nach M ö r η e r.
Reaktion nach Zimmermann — B i 11 ο, Reaktion nach Pechmann,

Reaktion nach Tauber,

Reaktion nach B i a I,

Reaktion nach Wheeller — Tollens, Ferrisalzreaktion des Maltols,

Reaktion nach Sakaguchi und Reaktion nach N e s s 1 e r.

Dialyse

Das Antibioticum 18 631 — R.P. dialysiert durch eine Membran aus regenerierter Cellulose (Cellophan-Typ).

Chromatographische Wanderung

(Nachgewiesen durch biologische Prüfung auf mil Staphylococcus albus beimpften Nähnigarplatteri):

Die auf verschiedenen Trägern und unter dem F.influl.t verschiedener Lösungsmittel beobachteten Wanderungen sind nachstehend angegeben.

Träger

System (Zusammensetzung in Volumina)

Rf

Papier Arches 302

nichtgepuflert

nichtgepuffert

nichtgepuflert

nichtgepuffert

mit Wasser gesättigtes Butanol Benzol-Methanol (4:1) NH₄Cl mit 30g/l in Wasser Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:5- obere Phase) Äthylacetat-Cyclohexan (1:1) mit Wasser gesättigt 0,95
0,95
0,05

1,00
0,50

Papier Arches 302	Chloroform	0,50
imprägniert mit einer m/3-Phosphatpuffer- lösung von pH 7	Methanol-Wasser (95:5)	0,27
Aluminiumoxyd (Dünnschicht)	Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:5- obere Phase)	1,00
Kieselgel G (Dünnschicht)	TetrachlorkohlenslofT-Äthanol-Essigiaure (90:6:6)	0,50
Kjeselgel G (Dünnschicht)

Die das Antibioticum 18 631 R.P. erzeugenden Organismen gehören zum Genus Streptomyces und werden mit »Streptomyces hygroscopicus DS 9751« (NRRL 3418), »Streptomyces albocinerescens DS 21 647« (NRRL3419) und »Streptomyces roseochromogenes, var. oscitar.s« (N RRL 3504) bezeichnet.

Diese Organismen wurden aus Erdproben isoliert, die aus folgenden Gebieten stammten:

Südafrika im Falle des Streptomyces hygroscopicus DS 9751. Frankreich im Falle des Streptomyces albocinerescens DS 21 647 und Indien im Falle des Streptomyces lOseochromogenes, var. oscitans.

Die Isolierung dieser Organismen erfolgte nach der folgenden Methode: Eine kleine Menge Erde wird in destilliertem sterilem Wasser suspendiert, und die Suspension wird dann auf verschiedene Konzentrationen verdünnt. Eine kleine Menge jeder Verdünnung wird auf die Oberfläche von Petrischalen aufgebracht, die ein Agar-Nährmedium enthalten. Nach einer Inkubation von einigen Tagen bei 26°C werden die Kolonien der Mikroorganismen, die man isolieren will, um ihre Untersuchung fortzusetzen, entnommen und auf Schrägnähragar versetzt, um reichlichere Kulturen zu erhalten. so

Der Stamm DS 9751 besitzt Zusammenhänge mit dem Aussehen von Streptomyces hygroscopicus, dessen wesentliche Charakteristiken von H. D. Tresner und E. J. B a ck u s (Applied Microbiology, 4, 243-250,1956) und von S. A. Waksman (The Actinomycetes, 11, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, S. 230 und 231) definiert wurden. Dies ist der Grund, weshalb er Streptomyces hygroscopicus, Stamm DS 9751, genannt wurde.

S. hygroscopicus DS 9751 weist die drei folgenden bo Merkmale auf, die den drei Charakteristiken entsprechen, durch die H. D. Tresner und E. ]. Backus sowie S. A. Waksman die Species S. hygroscopicus definiert haben: a) Seine Sporenfäden enden im allgemeinen in dichten Spiralen, die in einigen Windungen aufgerollt sind; diese spiralförmigen Sporenfäden sind am häufigsten längs eines Zentralfadens unter Bildung von mehr oder weniger ausgedehnten Trauben angeordnet; b) das sporulierte luft-ausgcselzte Mycel zeigt, wenn es ein gutes Entwicklungsstadium erreicht hat, eine dunkelgraue Färbung, die derjenigen entspricht, die die Species S. hygroscopicus zeigt; c) auf gewissen Züchtungsmedien, die eine gute Sporulation ermöglichen, treten durch Alterung in den sporulierten Oberflächen schwarze, glänzende, feucht aussehende, für die Species S. hygroscopicus charakteristische Zonen auf. Im Falle von S. hygroscopicus DS 9751 erfolgt die Umwandlung des dunkelgrauen Sporenteppichs zum schwarzen Überzug nur ziemlich langsam und in unsteter Weise, wobei die Umwandlung im allgemeinen eher auf kleine Stellen, die auf der sporuiierten Oberfläche verteilt sind, beschränkt ist, als auf dem gesamten Sporenteppich aufzutreten. Sie tritt jedoch in Erscheinung und kann beobachtet werden, insbesondere auf Agar mit Hefeextrakt nach Pridham, Agar mit Hafer nach Carvajal, Agar mit Ovalbumin und Glucose-Asparagin-Agar.

Die von den Kulturen von S. hygroscopicus DS 9751 gezeigten morphologischen Charakteristiken sind insgesamt denjenigen des Stammes S. hygrosropicus sehr ähnlich, der in »The Actinomycetes« (S. A. W a k s m a η , The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, S. 230 und 231) beschrieben ist, wobei die bemerkenswertesten Unterschiede gegenüber den beschriebenen Charakteristiken darin bestehen, daß S. hygroscopicus DS 9751 keine Säuerung der Milch, sondern vielmehr eine sehr schwache Verschiebung nach dem alkalischen Bereich hin bewirkt (der Anfangs-pH-Wert, der 6,3 beträgt, geht in 1 Monat auf 7,0) und außerdem auf Agar nach Czapek mit Saccharose nur ein sehr schwaches bräunliches lösliches Pigment liefert. Der in »The Actinomycetes« beschriebene Stamm S. hygroscopicus ruft dagegen eine sehr schwache Säuerung der Milch hervor (der pH-Wert erreicht 6,0) und liefert aul »Saccharose-Nitrat-Agar« ein goldgelbes bis hellorangcs lösliches Pigment. Diese geringen Unterschiede erlauben ersichtlicherweisc nicht, den Stamm DS 9751 als eine Species anzusehen, die von der Species S hygroscopicus verschieden ist, deren Hauptmerkmale die zu ihrer Definition dienen, DS 9751 im übriger

aufwcisi. Es sei darauf hingewiesen, daß die Sporen vun S. hygroscopicus DS 9751 zylindrisch bis isodiametrisch mit stumpfförmigen Enden sind, während diejenigen des in »The Actinomyceles« beschriebenen Stammes S. hygroscopicus oval sind, doch wird die Form der Sporen von H. D. Tresner und E. J. B a c k u s als variabel in der Species S. hygroscopicus, in der diese verschiedenen Formen angetroffen werden, angesehen.

S. hygroscopicus DS 9751 erzeugt auf organischen Medien kein Melaninpigment. Er bildet auf allen seinen Züchtungsmedien ein vegetatives Mycel, das von schwachgelblich bis gelb oder gelbbraun geht, und die löslichen Pigmente, die er erzeugt, weisen gelbe bis gelbbraune Töne auf.

S. hygroscopicus DS 9751 bildet Sporenfäden, die im allgemeinen in dichten Spiralen enden, die am häufigsten 1 bis 5 Windungen aufweisen, obgleich man gelegentlich Spiralen beobachtet, die eine größere Anzahl von Windungen bilden, oder auch einige Sporenfäden, die einfach in ihrem Endteil gekrümmt sind, ohne eine vollständige Windung zu bilden, oder auch manchmal mehr oder weniger schlaffe und auseinandergewickelte Spiralen. Der Sporenteil weist am häufigsten eine Struktur in Traubenform auf, wobei die spiralförmigen Sporenfäden längs eines Hauptfadens angeordnet sind, der in gewissen Fällen eine ziemlich große Länge haben kann. Die Sporen haben eine mehr oder weniger regelmäßige kurze zylindrische Form mit Abmessungen von 0,6 bis 0,9 μ/0,9 bis 1,2 μ. Die spiralförmigen Sporenfäden teilen sich nur sehr langsam unter Freigabe der Sporen und teilen sich außerdem häufig nur teilweise, wobei dann Verkettungen von einigen Sporen freigesetzt werden, die die Form eines mehr oder weniger vollständigen Kranzes beibehalten. Mikroskopische Prüfungen haben eine identische Organisation des Sporenteils auf Agar nach Bennett, Agar mit Hafer und mit Tomate nach P r i d h a m und Glucose-Asparagin-Agar gezeigt.

Die Züchtungscharakteristiken und die biochemischen Eigenschaften des S. hygroscopicus DS 9751 sind in der folgenden Tabelle IV angegeben. Es sind diejenigen von Kulturen, die ein gutes Entwicklungsstadium erreicht haben und etwa ein Alter von 3 bis 4 Wochen bei 26°C haben. Diese Charakteristiken wurden auf üblicherweise zur Bestimmung der morphologischen Charakteristiken von Stämmen von Streptomyces verwendeten Nähragar und Bouillons bestimmt, wobei die Kulturen auf Agarmedium auf Schrägagar durchgeführt wurden. Eine gewisse Anzahl der verwendeten Züchtungsmedien wurde nach den Rezepturen hergestellt, die in »The Actinomycotes« (S. A. W a k s man, S. 193—197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U.S.A., 1950) angegeben sind. In diesem Falle sind die Medien durch den Buchstaben W, dem die

Tabelle IV

Nummer folgt, die ihnen in »The Aclinomycetes« gegeben wurde, bezeichnet. Die Literaturstellen für die anderen Züchtungsmedien oder die Zusammensetzungen derselben sind die folgenden:

Anm. A: K. L. ] ο η e s — Journal of Bacteriology, 57,

142,(1949)

Anm. B: Rezeptur W-23, versetzt mit 2% Agar
Anm. C: »Hickey and Tresners Agar« — T. G. ίο Pridham und Mitarb., Antibiotics Annual,

Anm. D: »Yeast Extract Agar« — T. G. P r i d h a in u. Mitarb., Antibiotics Annual. 1956—19J7, Seite 950

Anm. F..: »Tomato Paste Oatmeal Agar« — T. G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950
Anm. F: W. E. G r u η d y u. Mitarb. — Antibiotics and Chcm.,2,401(1952)
Anm. G: 0,5% Pepton - 0,3% Fleischextrakt - 0,5%

Tyrozin — 2% Agar

Anm. H: »Melanin formation medium« — The Actinomycetes, Band 2, Seite 333, Nr. 42 - S. A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore,(1961)

Anm. I: W. E. G r u η d y u. Mitarb. — Antibiotics and

Chem.,1,310(1951)

Anm. J: »Inorganic Salts — Starch Agar« — T. G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, jo 1956-1957, Seite 951

Anm. K: entspricht der Rezeptur W-I, wobei 30 g

Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt sind
Anm. L: entspricht der Rezeptur W-I, wobei 30 g Saccharose durch 15 g Glycerin ersetzt sind Anm. M: »Plain Gelatin« — hergestellt nach den Angaben von »Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria« der Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y., M₅O-18

Anm. N: »Synthetic medium of Dimmick« — (nicht mit Agar versetzt) — «Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria« der Society of American Bacteriologists, Geneva, N. Y., H₅O-19

Anm. O: Entspricht der Rezeptur W-18, wobei die Saccharose weggelassen und durch kleine Filterpapierstreifen, die teilweise in die Flüssigkeit eintauchen, ersetzt ist
Anm. P: Handelsübliches Magermilchpulver, nach den so Angaben des Herstellers zubereitet

Anm. Q: Für die Untersuchung der Produktion von H2S von H. D. Tresner und F. Daηga, Journal of Bacteriology, 76, 239-244 (1958), angegebenes Medium

Kulturmedium	Ent	Vegetatives Mycel	Luftausgesetzter Teil	Lösliches	Beobachtungen
	wicklungs	oder Unterseite der	(umfaßt Gesamtheit von	Pigment	und biochemische
	grad	Kultur	luftausgesetztem Mycel		Eigenschaften
			und Sporulation)
(1)	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)

Agar nach gut dick und gefaltet,

Bennett gräulichgelb;

(Anm. A) gelbbraune Unter

weißlich bis hellgrau hellgelb-
und dunkelgrau; braun

sehr mäßig entwickelt

Sporopherenteil
in Traubenfürm;
Sporopherenfäden enden in dichten
Spiralen mit 1 bis
5 Windungen

	17	19	Vegetatives Mycel oder Unterseite der Kultur	07 556	18
Fortsetzung			(3)
Kulturmedium	Ent wicklungs grad	dick und gefaltet, gräulichgelb, Unterseite gelbbraun	Luflausgesetzler Teil (umfaßt Gesamtheit von luftausgesetztem Mycel und Spekulation)	Lösliches Beobachtungen Pigment und biochemische Eigenschaften
(D	(2)	dick und gefaltet, hellgelbbraun; hellgelbbraune Unter seite	(4)	(5) (6)
Agar nach Emerson (Anm. B)	gut	gelbbraune Unter seite	gräulich-weiß; spärlich entwickelt	orange-braun
Agar nach Hickey und Tresner (Anm. C)	gut	weißlich bis gräulich- weiß; sehr spärlich entwickelt	außerordent lich schwach bräunlich
Agar mit Hefeextrakt nach Pr id harn (Anm. D)	sehr gut	sehr hellgräulich bis mittelgrau und dunkel grau mit einigen sehr kleinen schwarzen	gelbbraun

Stellen, die für das Aussehen von »Hygroscopicus« charakteristisch sind; ziemlich gut entwickelt

Agar mit Hafer und mit Tomate nach Pridham (Anm. E)	sehr gut	dunkelgelbbraune Unterseite	weißlich bis hellgrau und dunkclgrau; gut entwickelt	ziemlich dunkelgelb braun	Sporenteil in Traubenform; Sporenfäden enden in dichten Spiralen mit 1 bis 5 Win dungen
Agar mit Hafer nach Carvajal (Anm. F)	sehr gut	dunkelkastanien braune Unterseite	weiß-gräulich bis hellgrau und sehr dunkelgrau mit einigen kleinen schwarzen Stellen, die charak teristisch für das Aus sehen von »Hygro- scopicus« sind; sehr gut entwickelt	braun
Glucose-Pepton- Agar (W-7)	gut	hellgelb-braune Unterseite	weißlich; in Form von Spuren	hellgräulich- gelbbraun
Nähragar (W-5)	sehr mäßig	mäßig entwickelt hellgelblich; Unter seite gelb	weißlich; in Form von Spuren	keines
Agar mit Tyrosin (Anm. G)	mäßig	hellgelblich; gelbliche Unterseite	weißlich; mittel mäßig entwickelt	sehr schwach gelblich	keine Löslich- machung von Tyrosin
Tyrosin-Hefe- extrakt-Agar (»Melaninforma tionmedium« nach Wakaman) (Anm. H)	mäßig	orangebraune Unterseite	gräulich-weiß; in Form von Spuren	violettbraun; keine Schwärzung des Mediums	Bildung von Me lamin; negativ (die Ablesungen er folgten nach den Angaben des Autors)
Agar mit Calciummalat nach Krainsky (Anm. I)	mittel mäßig	hellbräunlichgelbe Unterseite	weißlich bis hell gräulich; mäßig ent wickelt	keines	Löslichmachung von Malat; positiv

	19	19	Vegetatives Mycel oder Unterseite der Kultur	07 556	20	Beobachtungen und biochemische Eigenschaften
Forlsetzung			(3)			(6)
Kulturmedium	Ent wicklungs grad	gelbe Unterseite	Luftausgesetzter Teil (umfaßt Gesamtheit von luftausgesetztem Mycel und SporuUtion)	Lösliches Pigment
(1)	(2)	gelbe Unterseite	(4)	(5)	Sporenteil in Traubenform; Sporenfäden enden in Spiralen mit 1 bis 5 Windungen
Agar mit Ovalbumin (W-12)	mäßig	hellgelbbraune Unterseite	weißlich bis hellgrau und dunkelgrau mit einigen sehr kleinen schwarzen Stellen, die charakteristisch für das Aussehen von »My- groscopicus« sind; mäßig entwickelt	hellgelb
Glucose- Asparagin-Agar (W-2)	gut	hellgelbe Unterseite	sehr hellgräulich bis mittelgrau und schwarzgrau mit einigen schwarzen Zonen, die für das Aussehen von »Hy- groscopicus« charak teristisch sind; ziem lich gut entwickelt	hellgelb- braun	Hydrolyse von Stärke: positiv
Glycerin- Asparagin-Agar (W-3)	gut	gelbbraune Unter seite	weißlich bis grau; mäßig entwickelt	sehr hell gelbbraun	Hydrolsy von Stärke: positiv
Stärke-Nitrat- Agar (W-IO)	mäßig	hellbräunlichgelbe Unterseite	weißlich mit einigen hellgrauen Stellen; mäßig entwickelt	schwach bräunlich- gelb
Agar mit Stärke nach Pr id harn (Anm. J)	ziemlich gut	hellgelbbraune Unterseite	gräulich-weiß bis hellgrau und dunkel grau; mäßig ent wickelt	schwach gelbbraun
Synthetischer Agar nach Czapek mit Saccharose (W-I)	ziemlich gut	gelbbraune Unterseite	weißlich bis hellgrau; mäßig entwickelt	sehr schwach bräunlich
Synthetischer Agar nach Czapek mit Glucose (Anm. K)	gut	ziemlich gut ent wickelt; schwach gräulichbeige bis sehr hellbräunlich	weißlich; mäßig entwickelt	schwach gelbbraun
Synthetischer Agar nach Czapek mit Glycerin (Anm. L)	mäßig	weißliche Kultur mit der Tendenz, sich in der verflüssig ten Gelatine zu sedimentieren	weißlich; mäßig entwickelt	keines	Verflüssigung der Gelatine: ziemlich gut
Züchtung aufKartoffeln (W-27)	ziemlich gut	weißlich; spärlich entwickelt	keines
Reine Gelatine mit 12% (Anm. M)	mittel mäßig	keiner	keines

	21	19	Vegetatives Myccl oder Unterseite der Kultur	07 556	22	Beobachtungen und biochemische Eigenschaften
Fortsetzung			(3)			(6)
Kulturmedium	Ent wicklungs grad	weißliche Kolonien an der Oberfläche	Luftausgesetzter Teil (umfaßt Gesamtheit von luftausgesetztem Mycel und Sporulalion)	Lösliches Pigment	Untersuchung von Nitriten: positiv
(D	(2)	flockige Kultur, sedimentiert weißlich	(4)	(5)	Untersuchung von Hitriten: negativ
Glucose-Nitrat- Bouillon nach D i m m i c k (Anm. N)	mittel mäßig	gräuliche Kolonien an der Oberfläche	gräulichweiß; sehr spärlich entwickelt	keines	Verwartung von Cellulose: positiv
Bouillon nach Czapek mit Saccharose (W-18)	mäßig	gut entwickelter Ring, hellbräunlich	keiner	keines	vollständige Peptonisation ohne Koagulation -pH geht von 6,3 auf 7,0 in 1 Monat
Boouillon nach Czapek mit Cellulose (Anm. O)	mäßig	schlecht entwickelter Ring, orangebraun	gräulich, auf den Kolonien entwickelt, die sich an der Oberfläche und auf dem in die Bouil lon eintauchenden Papier befinden	keines	vollständige Peptonisation ohne Koagulation -pH geht von 6,3 auf 7,0 in 1 Monat
Magermilch (Anm. P) a) 25 C	gut	gelbe Unterseite	keiner oder sehr schwache Spuren, weißlich		Produktion von H₂S: negativ
b) 37 C	spärlich	gräulichweiß, in Form von Spuren
Agar nach Tresncr und	mäßig	weißlich, in Form von Spuren	keines

Denga zur
Untersuchung
der Produktion
von H₂S
(Anm. Q)

Der Stamm DS 21 647 entspricht einer Original-Specics, die mit Streptomyces albocinerescens DS 21 647 bezeichnet wurde, auf Grund des Aussehens seines luftausgesetzten Mycels, das zunächst eine weiße Färbung aufweist und sich dann in den sporulierten Zonen zum Zeitpunkt des Auftretens der Sporulation hellgrau färbt. Die Sporulation ist im allgemeinen spärlich und schwach und erfolgt häufig nur sehr langsam. Auf einer gewissen Anzahl von Medien tritt sie überhaupt nicht auf oder nur in einer sehr geringen Menge, wobei das luftausgesetzte Mycel dann weißlich bleibt oder sich außerordentlich hellgrau färbt.

S. albocinarcsccns DS 21 647 erzeugt auf organischen Medien kein Melaninpigment. Hr bildet auf allen diesen Züchlungsmedien ein vegetatives Myccl, das von gelb nach braiingclb oder gelbbraun geht und bildet meistens ein lösliches Pigment mit einer von gelb nach gelbbraun gehenden Farbtönung.

S. albocinerescens DS 21 647 bildet lange, gerade oder schwachgcbogenc Sporophoren, die im allgemeinen nicht verzweigt sind oder gelegentlich eine oder zwei Verzweigungen aufweisen. Seine Sporen sind oval oder zylindrisch mil abgerundeten linden und Abmessungen von 0,5 bis 0,7/1 bis Κ2μ. Mikroskopische Prüfungen haben eine identische Organisation des Sporenteils auf Agar mit Stärke nach Pridham und Agar nach H i c k e y und Tresncr gezeigt.

Unter den Species, deren Beschreibung in »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology« (7. Auflage, The Williams and Wiikins Company, Baltimore, 1961) oder in »The Actinomycetes« (II, S. A. Waksman, The Williamsand Wiikins Company, Baltimore, 1961) erfolgt

τ; ist, ist die Species, der sich dieser am meisten nähert, S. aburavicnsis, der, wie er, kein Melanin auf organischen Medien erzeugt, ein weißes bis hellgraues luftausgesetztes Myccl aufweist und gerade Sporophoren bildet und dessen vegetatives Mycel auf »Saccharose-Nitrat-

bo Agar« gclblichbraun ist. Er ist jedoch mit diesem nicht identisch, da man bei Bezugnahme auf die Beschreibung von S. aburaviensis in «The Actinomycetes« (Seite 166) ersieht, daß S. aburaviensis, obgleich eine gewisse Anzahl der von den beiden Stämmen gezeigten

h^r. Charakteristiken identisch ist, ein griUilich-olivcs Wachstum aufGlucosc-Asparagin-Agarund ein blaßolives Wachstum auf Kartoffeln ergibt, während S. albocinerescens DS 21 647 auf Glueose-Asparagin-Agcr

ein gelbes Wachstum und auf Kartoffeln ein Wachstum ergibt, dessen Färbung von schwachbräunlichgelbgrau nach sehr hellbräunlich geht. Es sei bemerkt, daß keine grünliche oder olive Färbung des vegetativen Mycels von S. albocinerescens DS 21 647 beobachtet werden konnte. Das vegetative Mycel hat stets Färbungen in Tönungen, die von hellgelb oder braungclb bis zu gelbbraun gehen, gezeigt. Andererseits liefert S. aburaviensis auf Gelatine kein lösliches Pigment, während S. albocinerescens DS 21 647 ein hellgelbes lösliches Pigment produziert. Außerdem verwertet S.

aburaviensis weder Lactose noch Saccharose und verwertet außerdem Inulin, während S. albocinerescens DS 21 647 Lactose und Saccharose verwertet und Inulin nicht verwertet.

In der nachfolgenden Tabelle V sind die Züchtungscharakteristiken und die biochemischen Eigenschaften von S. albocinerescens DS 21 647 angegeben, die unter den gleichen Bedingungen wie diejenigen des Stammes S. hygroscopicus DS 9751 beobachtet wurden. Die verwendeten Medien sind die gleichen und sind mit den gleichen Hinweisen bezeichnet.

Tabelle V	Ent wicklungs grad	Vegetatives Mycel oder Unterseite der Kultur	Luftausgesetzter Teil (umfaßt Gesamtheit von luftausgesetztem Mycel und Sporulation)	Lösliches Pigment	Beobachtungen und biochemische Eigenschaften
Kulturmedium	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)
(D	gut	dick und gefaltet, gelb	weißlich; spärlich entwickelt	sehr hell gelbbraun
Agar nach Bennett (Anm. A)	gut	gut entwickelt; gelb bis hellbraun- gelb	weißlich; in Form von Spuren	hellgelb braun
Agar nach Emerson (Anm. B)	gut	sehr gut entwickelt; gräulichgelbbraun; gelbbraune Unterseite	gräulichweiß; sehr spärlich entwickelt	gelbbraun	lange gerade oder schwach gebogene Sporophoren
Agar nach Hickey und Tresner (Anm. C)	gut	dick und gefaltet; gelb	weißlich; sehr mäßig entwickelt	gelbbraun
Agar mit Hefeextrakt nach Pridham (Anm. D)	gut	dick und gefaltet, gelbbraun	weißlich; in Form von Spuren	gelbbraun
Agar mit Hafer und Tomate nach Pridham (Anm. E)	gut	dick und gefaltet, gelb bis gelbbraun	gräulichweiß; spärlich entwickelt	gelbbraun
Agar mit Hafer nach Carvajal (Anm. F)	gut	dick und gefaltet, braungelb	weißlich; in Form von Spuren	braungelb
Glucose- Pepton-Agar (W-7)	mäßig	hellgelblich	keiner	keines
Nähr-Agar (W-5)	mittel mäßig	bräunlichgelb	gräulichweiß; sehr spärlich entwickelt	gelbbraun	teilweise Löslich- machung von Tyrosin
Agar mit Tyrosin (Anm. G)	mittel mäßig	orangebraune Unterseite	hcllgräulich; ziemlich spärlich entwickelt	orangebraun; keine Schwärzung des Mediums	Bildung von Me lanin: negativ (die Ablesungen erfolgten nach den Angaben des Autors)
Tyrosin-Hefe- extrakt-Agar (»Melaninforma tionmedium« nach Wakaman (Anm. H)	mäßig	grünlichgelb	keiner oder weißlich, in Form von Spuren	schwach gräulichgclb	gute Löslich- machung von Malat
Agar mit Calciummalat nach Krainsky (Anm. 1)

	25	19	Vegetatives Mycel oder Unterseite der Kultur	07 556	26	Beobachtungen und biochemische Eigenschaften
Fortsetzung			(3)			(6)
Kulturmedium	Ent wicklungs grad	spärlich entwickelt; schwach gelblichgrau	Luftausgesetzter Teil (umfaßt Gesamtheit von luftausgesetztem Mycel und Sporulation)	Lösliches Pigment
I (i)	(2)	gelb	(4)	(5)
; Agar mit Ovalbumin \ (W-12)	sehr spärlich	gelb	keiner	keines
! Glucose- ■i Asparagin-Agar \ (W-2)	ziemlich gut	braungelb	weißlich; ziemlich gut entwickelt	hellgräulich- gelb	Hydrolyse von Stärke: positiv
< Glycerin- /' Asparagin-Agar \ (W-3) J	mittel mäßig	gelb bis hellbraun gelb; gelbe Unter seite	weißlich; in Form von Spuren	hellgelb	Hydrolyse von Stärke: positiv; lange gerade oder schwach gebogene Sporophoren
5 ΐ Stärke-Nitrat- ij Agar I (W-IO)	mäßig	braungelb; gut ent- wickeli; Neigung zur Rißbildung	keiner oder gräulich weiß, in Form von Spuren	hellgelbbraun
J I Agar mit I Stärke nach i Pridham f (Anm. J)	gut	braungelb; gut ent wickelt; Neigung zur Rißbildung	sehr hellgräulich; sehr mäßig ent wickelt	schwach bräunlich gelb
I Synthetischer I Agar nach I Czapek mit 5 Saccharose I (W-I)	gut	braungelb; gut ent wickelt; Neigung zur Rißbildung	weißlich; sehr mäßig entwickelt	gelbbraun
'i Synthetischer I Agar nach ¹J Czapek mit 1 Glucose i (Anm. K)	gut	sehr gut entwickelt, diel: und gefaltet; braungelb bis gelb braun	gräulichweiß; sehr spärlich entwickelt	gelbbraun
ί Synthetischer i Agar nach i Czapek mit :j Glycerin I (Anm. L)	gut	flockige weißliche Kultur, die in die Gelatine eindringt	keiner oder weißlich, in Form von Spuren	gelbbraun	Verflüssigung von Gelatine: ziemlich rasch
f; Kultur auf ! KartofTeln ί (W-27)	gut	kleine gräulichweiße bis hellgelblichgraue Kolonien an der Oberfläche	keiner	keines oder schwach gräulichbraun	Nitrit-Reaktion: positiv
f Reine Gelatine mit 12% ■ (Anm. M)	mäßig	gelblicher Schleier	keiner	hellgelb; langsame Produktion	Nitrit-Reaktion: positiv
', Glucose-Nitrat- Bouillon nach D i m η i c k (Anm. N)	mäßig	keiner	keines
Bouillon nach Czapek mit Saccharose	mittel mäßig	keiner	blaßgclb

Fortsetzung	Ent wicklungs grad (2)	Vegetatives Mycel oder Unterseite der Kultur (3)	Luftausgesetzter Teil (umfaßt Gesamtheit von luftausgesetztem Mycel und Sporulation) (4)	Lösliches Pigment (5)	Beobachtungen und biochemische Eigenschaften (6)
Kulturmedium (D	keine Ent wicklung				Verwertung von Cellulose: negativ
Bouillon nach Czapek mit Cellulose (Anm. O)	gut	hellgräulichgelber Ring	keiner		Peptonisation ohne Koagulation, be ginnend nach 2 Wochen, vollstän dig in 1 Monat; pH von 6,3 nach 7,0 in 1 Monat gehend
Magermilch (Anm. F) a) 25°C	sehr mäßig	einige hellbraungelbe Kolonien an der Oberfläche	keiner		Koagulation mit folgender Pepto nisation: keine merkliche Ände rung des pH-Werts in 1 Monat
b) 37°C	gut	hellgelbbraun	keiner	schwach braungelb	Produktion von HiS: negativ
Agar nach Tresner und

Danga zur
Untersuchung
der Produktion
von H₂S
(Anm. G)

Die Charakteristiken, die der dritte Mikroorganismus aufweist, erinnern an die Species Streptomyces roseochromogenes (Jensen) Waksman und Henrici, zu denen er nur wenig bedeutende Unterschiede aufweist, von denen der Hauptunterschied in einer Verzögerung der Bildung der Sporulation besteht, die nur in besonders langsamer Weise auftritt und manchmal auf Medien, für die sie für diese Art von Species beschrieben ist, überhaupt nicht auftritt. Diese Eigenschaft ist der Grund, warum dieser neue Stamm mit Streptomyces roseochromogenes, Varietät oscitans, bezeichnet wurde.

S. roseochromogenes, var. oscitans, Stamm DS 12 976 bildet ovale Sporen mit Abmessungen von 0,3 bis 0,4/0,6 bis 0,8 μ. Seine Sporenfäden sind ausgedehnt und rollen sich an ihrem Ende unter Bildung von 1 oder 2 und selten mehr Spiralen zusammen. Sie sind im allgemeinen isoliert auf den luftausgesetzten Mycelfäden, die sie tragen, angeordnet.

Auf den synthetischen Nährmedien entwickelt S. roseochromogenes, var. oscitans, Stamm DS 12 976 allgemein ein gelbes vegetatives Mycel und erzeugt lösliche Pigmente von gelber bis hellgelblichcr Farbe. Auf den organischen Nährniedien ist sein vegetatives Mycel dunkler und nimmt Färbungen an, die von hellgelbbraun bis dunkelbraun gehen und sogar schwärzlichbraun in gewissen Fällen erreichen. Auf diesen Medien erzeugt er mehr oder weniger dunkelbraune lösliche Pigmente, und er bildet ein schwarzes Melaninpigment auf geeignetem Medium mit Tyrosin.

Die Farbe seines sporulierten luftausgesetzten Mycels ist rosa, doch bildet sich die Sporulation, wie bereits ausgeführt wurde, nur in außerordentlich langsamer Weise, wobei sie erst nach mehr als 1 monatiger Kultur beginnt. Die Medien, die ermöglichten, unter optimalen Bedingungen eine Sporulation zu erreichen, sind Medien auf der Basis von Stärke und einem Ammoniumsalz, wie beispielsweise Agar mit Stärke nach F r i d h a m oder Agar mit Stärke nach G r u η d y, und es ist unter den üblichen Züchtungsbedingungen eine etwa 2monatige Inkubation bei 26°C erforderlich, um zu

so sehen, daß das luftausgesetzte Mycel auf diesen Medien eine gräulichrosa Färbung annimmt, die einen merklichen Grad von Sporulation zeigt.

In der nachfolgenden Tabelle VI sind die Züchtungscharakteristiken und die biochemischen Eigenschaften von S. roseochromogenes, var. oscitans, angegeben, die unter den gleichen Bedingungen wie diejenigen des Stammes S. hygroscopicus DS 9751 beobachtet wurden: Die verwendeten Medien sind im allgemeinen die gleichen und tragen die gleichen Bezeichnungen. Die

öd !Hinweise auf die oder die Bestandteile der anderen Züchtungsmedien sind die folgenden:

Anm. R: entspricht der Rezeptur W-18, wobei 30 g

Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt sind
b5 Anm. S: »Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria«, Society of American Bacteriologists, Geneva, N. Y. 11,»-18

29

30

Tabelle VI

Kulturmedium	Ent	Vegetatives Mycel	Luftausgesetzter Teil	Lösliches	Beobachtungen
	wicklungs	oder Unterseite der	(umfaßt Gesamtheit von	Pigment	und biochemische
	grad	Kultur	luftausgesetztem Mycel		Eigenschaften
			und Spekulation)
(D	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)

Agar nach Hickey und Tr e s η e r (Anm. C)

gut

Agar nach Bennett (Anm. A)

Agar mit Hefeextrakten nach Pridham (Anm. D)

Agar mit Hafer und Tomate nach Pridham (Anm. E)

Glucose-Pepton-Agar (W-7)

Nähr-Agar (W-5)

Tyrosin-Hefeextrakt-Agar zur Bildung von Melanin (Anm. H)

Agar mit Calciummalat nach Krainsky (Anm. F)

Agar mit Ovalbumin (W-12)

Glucose-Asparagin-Agar (W-2)

Glycerin-Asparagin-Agar (W-3)

Stärke-Minersalz-Agar nach Pridham (Anm. J)

Agar mit Stärke nach Grundy (Anm. I)

gut

ziemlich gut

gut

mäßig mäßig

rast keiner

sehr mäßig

ziemlich gut

mäßig

dunkelkastanienfarbene bis schwarzbraune Unterseite

hellgelbbraun

gelbbraune Unterseite

bräunlichgelbgrau; dick und gefaltet, sehr gut entwickelt

grünlichgelbbraun bis orangebraun; sehr gut entwickelt

gräulichgelbbraun

bräunlichschwarz

ungefärbt; in Form von Spuren

lebhaft gelb

gelb

orangegelb bis rötlichorange

gelb bis bräunlichgelb

gelblich weißlich; ziemlich gut schwarzbraun ovale Sporen mit entwickelt; nimmt Abmessungen von

sehr zögernd eine 0,3 bis 0,4/0,6 bis

hellgräulichrosa Fär- 0,8 μ; lange Sporen

bung an, wenn sich die faden, die in 1 odei

die Spekulation bildet 2 Windungen enden

weiß; mäßig entwickelt

weißlich bis gelblichweiß; mäßig entwickelt

weißlich; in Form von Spuren

weißlich; in Form von schwachen Spuren

keiner

weißlich; sehr mäßig entwickelt

keiner

gelbbraun

dunkelorangebraun

schwach gelbbraun

orangebraun bis grünlichbraun

dunkelgelbbraun

gräulichschwarz; ab dem 2. Tag der Züchtung gebildet

keines

Bildung von Melanin: positiv

keine Löslichmachung von Calciummalat

blaßgelb

gelb

keiner oder weißlich, hellorangein Form von schwachen gelb Spuren

weißlich; mäßig entwickelt; nimmt sehr zögernd eine hellgräulichrosa Färbung an, wenn die Sporulation erfolgt

weiß; mäßig entwickelt; nimmt sehr zögernd eine hellgräulichrosa Färbung an, wenn die Sporulation erfolgt

wenig intensiv bräunlich

ovale Sporen mit Abmessungen von 0,3 bis 0,4/0,6 bis 0,8μ; lange Sporen fäden, die in 1 odei 2 Windungen enden; gute Hydrolyse von Stärke

keines

	31	Ent	19	Vegetatives Mycel	07 556	32	Beobachtungen
		wicklungs		oder Unterseite der			und biochemische
Fortsetzung	grad		''.ultur		Lösliches	Eigenschaften
Kulturmedium			Luftausgesetzter Teil	Pigment
	(?)	(3)	(umfaßt Gesamtheit von		(6)
	mäßig	ungefärbt bis gelblich;	luftausgesetztem Mycel		Hydrolyse von
		sehr mäßig ent	und Sporulation)	(5)	Stärke: schwach
(D		wickelt	(4)	keines oder	und langsam
Stärkc-Nitrat-	gut	hellbräunlichgelb	keiner	sehr schwach
Agar				gelblich
(W-IO)				schwach
Synthetischer			keiner	gräulichgelb
Agar nach				braun
Czapek mit	gut	gelb
Saccharose
(W-I)				schwach
Synthetischer			keiner	braungelb
Agar nach
Czapek mit	gut	hellbräunlichgrau
Glucose
(Anm. K)				gräulichgelb
Synthetischer			keiner	braun
Agar nach
Czapek mit	mäßig	gelblicher Schleier			Reduktion von
Glycerin					Nitraten zu Ni
(Anm. L)				sehr blaß	triten: positiv
Stärke-Nitrat-	mäßig	gelbliche flockige	keiner	gelb, ziem	Reduktion von
Bouillon		Kultur		lich zögernd	Nitraten zu Ni
(W-19)				keines	triten: positiv
Bouillon nach			keiner
Czapek mit	keine				Verwertung der
Glucose	Entwick				Cellulose: negativ
(Anm. R)	lung
Bouillon nach
Czapek mit	mäßig	gelblicher Ring			Reduktion von
Cellulose					Nitraten zu
(Anm. O)				bräunlich	Nitriten: negativ
Nitrat-Nähr-	gut	schwärzlichbraun;	keiner
Bouillon		dick und gefaltet,
(Anm. S)		sehr gut entwickelt		bräunlich
Kultur auf	mittel	bräunlichgrau	weißlich; in Form von	schwarz:	Verflüssigung der
Kartoffeln	mäßig		Spuren	reichlich	Gelatine: positiv,
(W-27)				schwärzlich	jedoch langsam,
Reine			keiner	braun;	erst nach Ende von
Gelatine mit				reichlich	1 Monat Züchtung
12%					beginnend
(Anm. M)	gut	schwarz			Produktion von
					H₂S: stark positiv
				schwarz;
Agar nach			keiner	reichlich;
Tresnar und				zu Beginn der
Danga	gut	bräunlicher Ring		Züchtung ge	Peptonisation ohne
(Anm. Q)				bildet	Koagulation: pH
					geht von 6,2 auf
Magermilch			keiner		7,0 bis 7,2 in
(Anm. P)					1 Monat
bei 25°C	mäßig	gelbbrauner Ring			Peptonisation ohne
					Koagulation; pH
					unverändert in
bei 37' C			keiner		1 Monat

Aus der Prüfung der von dem Stamm Streptomyces DS 12 976 gezeigten Charakteristiken folgt, daß dieser der Species S. roseochromogenes (Jensen) Waksm a η und H e η r i c i sehr ähnlich ist, deren Beschreibung in »The Actinomycetes«, Band 2, Seite 268 (S. A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, 1961) gegeben ist. Beim Vergleich mit der Gesamtheit der in diesem Werk beschriebenen Species ist es diejenige Species, mit der er die größte Analogie zeigt, und es existieren zwischen diesen beidein Stämmen so beträchtliche gemeinsame Merkmale und so geringe Unterschiede, daß sie nicht als zwei verschiedene Species angesehen werden können.

Wie S. roseochromogenes (Jensen) Waksman und Henrici gehört der Stamm Streptomyces DS 12 976 zu der Gruppe von Stämmen, die Melaninpigmente bilden. Sein luftausgesetztes Mycel nimmt eine rosa Färbung an, wenn es einen merklichen Sporulationsgrad erreicht, und seine Sporophoren haben spiraligs Enden. Sein vegetatives Mycel weist Färbungen auf, die von blaßgelb bis dunkelbraun gehen, je nach den Medien, in denen ersieh entwickelt, und die von ihm gebildeten löslichen Pigmente, die auf synthetischen Medien fehlen oder hellgelb sind, werden auf den organischen Medien dunkelbraun oder selbst schwarzlichbraun. Er bildet ein schwarzes lösliches Pigment auf Kartoffeln, ein dunkelbraunes lösliches Pigment auf Gelatine, die sich langsam, jedoch in unzweifelhafter Weise verflüssigt, peptonisiert die Milch, ohne sie zu koagulieren, hydrolisiert Stärke, erzeugt H₂S und ω reduziert Nitrate, wobei diese letztere Eigenschaft jedoch nur auf den synthetischen Medien positiv ist.

Die zwischen den beiden Stämmen nachgewiesenen Unterschiede sind gering. Einerseits bildet S. roseochromogenes (Jensen) Waksman and Henrici J5 manchmal Sporenfäden, die zu 3 oder 5 auf ein und demselben Grundfaden gruppiert sind, und gibt so das Bild von Besen oder Quirlen; die Sporenfäden des Stammes DS 12 976 sind üblicherweise isoliert angeordnet, wobei man höchstens manchmal die Vereinigung von 2 Sporenfäden auf ein und demselben Grundfaden antrifft. Außerdem ergibt S. roseochromogenes (Jensen) Waksman und Henrici auf synthetischem Agar nach Czapek mit Saccharose ein ungefärbtes bis blaßgelbes vegetatives Mycel und auf Nähr-Agar ein gräulichgelbes vegetatives Mycel, das anschließend braunrot wird, und bildet auf synthetischem Agar nach Czapek mit Saccharose, auf Glucose-Asparagin-Agar und auf Nähr-Agar ein rosa luftausgesetztes Mycel; der Stamm Streptomyces DS 12 976 gibt auf synthetischem Agar nach Czapek mit Saccharose ein vegetatives Mycel, das viel stärker entwickelt ist und rasch eine bräunlichgelbe Färbung zeigt; auf Nähr-Agar bleibt sein vegetatives Mycel gräulichgelbbraun, ohne anschließend braunrot zu werden, und er bildet insbesondere auf synthetischem Agar nach Czapek mit Saccharose, Asparagin-Agar und Nähr-Agar kein luftausgesetztes Mycel. Man führt diese letztere Tatsache auf die besondere Langsamkeit zurück, die er allgemein zunächst bei der Produktion des luftausgesetzten Mycels auf der Gesamtheit seiner Züchtungsmedien und anschließend bei der Entwicklung seiner Sporulation auf dem luftausgesetzten Mycel, wenn dieses einmal entwickelt ist, zeigt. Dieser Unterschied kann jedoch nicht als Species-Differenzierungskriterium angesehen werden, da das sporulierte luftausgesetzte Mycel, wenn es auf den Medien und unter den Bedingungen, bei denen es erhalten werden kann, beobachtet werden kann, die rosa Farbe desjenigen von S. roseochromogenes aufweist. Es ist dies jedoch die bedeutendste Eigenart, durch die sich der das Antibioticum 18 631 R. P. erzeugende Stamm von S. roseochromogenes (Jensen) Waksman und Henrici unterscheidet, und es ist dies der Grund, weshalb er als eine besondere Varietät dieses Stammes angesehen werden muß und mit »Streptomyces roseochromogenes, var. oscitans«, Stamm DS 12 976 bezeichnet wird.

Die Fähigkeit von Streptomyces hygroscopicus DS 9751, Streptomyces albocinerescens DS 21 647 und Streptomyces roseochromogenes, var. oscitans DS 12 976, verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zur Gewährleistung ihrer Entwicklung zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode von P r i d h a m und Got Hieb (J. of Bact. 56, 107-114, 1948) bestimmt. Der Entwicklungsgrad wurde nach einer Inkubationszeit bei 26°C, welche eine gute Entwicklung des Streptomyces in dem Kontrollmilieu Glucose/ (NH^SCm ermöglichte, auf dem von diesen Autoren angegebenen Grundmedium bestimmt, wobei die Glucose durch die verschiedenen jeweilig untersuchten Kohlenstoffquellen oder das (NH^SCm durch die verschiedenen jeweilig untersuchten Stickstoffquellen ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen VII und VIII zusammengestellt.

Tabelle VII	Verwertung durch	negativ	S. albocinerescens	negativ	S. roseochromogenes	negativ	positiv	negativ
Geprüfte Kohlenstoffquellen	S. hygroscopicus		DS 21 647	negativ	var. oscitans	positiv
	DS 9 751				DS 12 976	positiv
				negativ	positiv aber langsam	positiv
	positiv				positiv
D-Ribose	positiv	positiv		positiv
D-Xylose	positiv		negativ
L-Arabinosa	positiv	positiv	negativ
L-Rhamnose	positiv	positiv	negativ
D-Glucose	positiv
D-Galactose	positiv
D-Fructose	positiv
D-Mannose
L-Sorbose

35

36

Fortsetzung

Geprüfte KohlenstolTquellen

Verwertung durch

negativ

positiv

negativ

positiv

S. albocinerescens

negativ

S. roscochromogenes

negativ

positiv

negativ

positiv

S. hygroscopicus

positiv

gering und langsam

DS 21 647

var. oscilans

negativ

DS 9 751

positiv

negativ

DS 12 976

negativ

positiv

S. roscochromogenes

Lactose

positiv

Verwertung durch

positiv

negativ

positiv

var. oscitans

Maltose

positiv

S. hygroscopicus

positiv

positiv aber langsam

DS 12 976

Saccharose

positiv

DS 9 751

positiv

Trehalose

positiv

Cellobiose

positiv

negativ

positiv

Raffinose

positiv

negativ

positiv

Dextrin

positiv

negativ

positiv

Inulin

positiv

negativ

positiv

Stärke

positiv

negativ

positiv

Glykogen

positiv

negativ

positiv

Glycerin

Erythrit

Adonit

S. albocinerescens

Dulcit

DS 21 647

D-Mannit

D-Sorbit

Inosit

Tabelle VIII

Geprüfte StickstofTquellen

NaNO₃ NaNO₂ (NH₄J₂SO₄ (NH₄J₂HPO₄ Uracil

Harnstoff L-Asparagin Glykokoll Sarcosin DL-Alanin DL-Valin

DL-Asparaginsäure

L-Glutaminsäure L-Arginin L-Lysin DL-Serin DL-Threonin DL-Methionin Taurin

DL-Phenylalanin L-Tyrosin DL-Prolin

positiv positiv positiv

negativ positiv positiv

positiv positiv positiv

negativ negativ negativ

positiv positiv positiv

positiv negativ positiv

positiv positiv positiv

positiv aber langsam positiv positiv

positiv positiv positiv

negativ negativ negativ

positiv negativ positiv

positiv positiv positiv

positiv Dositiv Dositiv

	37	Verwertung durch	19 07 556	negativ	38	S. roscochromogenes	negativ	positiv
		S. hygroscopieus				var. oscitans	positiv
Fortsetzung	DS 9 751				DS 12 976	positiv
Geprüfte Stickstoflqucllen				positiv	positiv
	positiv	S. ulbocincrcsccns		positiv
	positiv	HS 21 647

L-Hydroxypyrolin		positiv
Betain
Adenin
Adenosin
Glucosamin
L-Histidin
L-Tryptophan

Das crfindungsgemäße Verfahren wird in der folgenden Weise durchgeführt.

Die Züchtung des einen oder des anderen der zu verwendenden Stämme kann nach jeder beliebigen üblichen aeroben Oberflächenzüchtungsmethode oder Submcrszüchuingsmetliode erfolgen, wobei letztere bevorzugt wird.

Man verwendet zu diesem Zweck verschiedene, in der Technik der Fermentationen übliche Apparaturtypen. Man kann insbesondere den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen:

Streptomyces hygroscopicus DS 9 751
Streptomyces albocinerescons DS 21 647 Stammoder ansatz
Streptomyces roseochromogenes
var. oscitans DS 12 976

4.

Kultur auf Agar

I
Kultur im Kolben unter Bewegung

i
Impfkultur im Fermenter

4·
Produktionskultur im Fermenter

Das Fcrmcntalionsmedium enthält im allgemeinen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle. Mineralstoffe (insbesondere Chloride) und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren, wobei alle diese Bestandteile in Form von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquelle kann man Kohlenhydrate, wie beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Dextrine, Stärke, Melasse, oder andere Kohlcnhydratsubstanzen, wie beispielsweise Zuckeralkohole, z. B. Glycerin oder Mannit, oder gewisse organische Säuren, wie beispielsweise Milchsäure, Citronensäure, Weinsäure und dergleichen, verwenden. CJcwisse tierische oder pflanzliche öle, wie beispielsweise Schnialzöl, Sojaöl oder Baumwollsamenöl, können diese verschiedenen Kohlenhydralquellen mit Vorteil ersetzen oder ihnen beigefügt werden.

Die geeigneten assimilierbaren Sticksloffqucllen sind außerordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise Nitrate, anorganische und organische Ammoniumsalze, Harnstoff und Aminosäuren, sein. Sie können auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in Protein-Form enthalten, zugeführt

:ii werden, wie beispielsweise in Form von Casein Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysaten, Sojamehl Arachismehlen, Fischmehlen, Fleischexlraklen, Hefeextrakten, Distiller's Solubles und Maisquellwasser.

Unter den zugefügten mineralischen Stoffen können

2"> gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- odei Erdalkaliphosphate oder Calcium- oder Magnesiumcarbonat. Andere führen zu dem zur Entwicklung de; Streptomyces und zur Erzeugung des Antibioticums

H) erforderlichen lonengleichgewicht, wie beispielsweise die Alkali- und Erdalkalichloride und -sulfate. Schließlich wirken gewisse in speziellerer Weise als Aktivatoren der Stoffwechselreaktionen des Streptomyces. Es sind dies die Zink, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- unc

Γι Mangansalze.

Zu Beginn der Züchtung sollte der pH-Wert zwischen 6,0 und 7,8, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 liegen Die zur Fermentation optimale Temperatur beträgt 25 bis 28⁰C, doch wird auch bei Temperaturen zwischen 22 und 35°C ein zufriedenstellendes Ergebnis erhalten. Die Belüftung bei der Züchtung kann zwischen ziemlich weiten Werten variieren. Es wurde jedoch gefunden daß Belüftungen von 0,3 bis 2 I Luft je Liter Bouillon unc Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an dem Antibioticum wird nach 4- bis 7tägigei Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hauptsäch lieh von dem verwendeten Medium abhängt.

Das Antibiotikum 18 631 R.P. kann aus der Fermentationsmaischen nach verschiedenen üblicher Methoden isoliert werden.

Die Fermentationsmaische kann bei einem pH-Wer von 7 oder darüber filtriert werden, doch bleibt untci diesen Bedingungen ein beträchtlicher Teil des Antibio tikums in dem Filterkuchen, der ebenfalls zur Extraktior der Wirksubstanz behandelt werden muß. Wenn siel das Antibiotikum in dem Filtrat der Fermenlalionsmai sehe befindet, so unterzieht man diese Lösung cinei Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbarer Lösungsmittel, beispielsweise einem aliphatischen Aiko

w) hol mit 4 oder 5 Kohlenstoffatomen oder einen chlorierten Lösungsmittel, wie Chloroform oder Methy lcnchlorid, oder auch einem Ester, insbesondere Allylacetat.

Vorzugsweise wird jedoch die ganze Fermentations

hi maische mit einem dieser Lösungsmittel extrahiert Unter diesen Bedingungen kann die Extraktion bc einem pH-Wert zwischen 2 und 7 durchgeführt werden Das rohe Antibiotikum wird durch Einengen de;

Extrakts unter vermindertem Druck und anschließendes Ausfällen mit einem Lösungsmittel, in dem das Antibiotikum schwer löslich ist, beispielsweise Äther oder Hexan, erhalten.

Eine andere Arbeitsweise besteht darin, eine Filtration bei einem pH-Wert unter 6 und vorzugsweise bei einem pH-Wert in der Nähe von 5 vorzunehmen. Unter diesen Bedingungen bleibt das gesamte Antibiotikum in dem Filterkuchen, aus dem es mit Wasser, das einen Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht, wie Methanol, Äthanol oder Propanol, enthält, extrahiert werden kann. Der Alkohol wird anschließend durch Verdampfen unter vermindertem Druck entfernt und das Antibiotikum mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie einem der obengenannten Lösungsmittel, extrahiert.

Das Antibiotikum liegt im allgemeinen in Lösung in dem Endkonzentrat in Form der Säure vor. Die Ausfällung des rohen 18 631 R.P. wird dann durch Zugabe von Nalriummethyla! zu dem Konzentrat erleichtert.

Das rohe Antibiotikum 18 631 R.P. kann in Form der Säure oder des Natriumsalzes in einer ersten Stufe durch Fixierung an lonenaustauscherharzen mit stark anionischem Charakter und hoher Porosität, beispielsweise einem Polystyroltrimethylbenzyl-ammonium-Anionenaustauscherharz in Chioridform gereinigt werden, aus denen es mit einem wäßrig-alkoholischen Gemisch, das einen Elektrolyten enthält, vorzugsweise mit einem Gemisch Methanol —Wasser (80 :20 Volumina) mit einem Gehalt von 30 g Ammoniumchlorid je Liter, eluiert wird.

Nach Entfernung des Methanols unter vermindertem Druck wird das Antibiotikum aus den Eluaten mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform oder Äthylacetat, extrahiert. Das Antibiotikum 18 631 R.P. wird dann in Form einer Festsubstanz durch Ausfällung mit einem schwer löslichen Lösungsmittel, wie Hexan oder Tetrachlorkohlenstoff, oder durch Lyophilisation nach Überführung in tert.-Butanol erhalten.

Eine zweite Reinigungsstufe kann durch Chromatographie an einer Aluminiumoxydsäule vorgenommen werden, wobei das Antibiotikum aus einer Lösung in einem wenig polaren Lösungsmittel, wie Älhylacetat, fixiert und dann mit einem polaren Lösungsmittel, in dem es löslicher ist, wie beispielsweise Methanol, eluiert wird.

Die Endreinigung kann nach verschiedenen Methoden, beispielsweise mittels Gegenstromverteilung oder Kristallisation, vorgenommen werden.

Die Reinigung durch Gegenstromverteilung kann beispielsweise mit dem System Tetrachlorkohlenstoff-Chloroform-Methanol-Wasser (10:3:10:2 Volumina) (Verteilungskoeffizient K = 0,65) vorgenommen werden.

Die Kristallisation kann entweder durch Einengen einer Lösung in einem Lösungsmittel, wie beispielsweise Chloroform oder Äthylacelat, oder durch Zugabe eines Lösungsmittels, in dem das Antibiotikum schwer löslich ist, zu einer Lösung des Antibiotikums 18 631 R.P. erfolgen. Geeignete Lösungsmittel-Paare sind z. B. folgende: Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff, Accton-Wasscr, Accton-Acctonitril, Dioxan-Wasser.

Das Antibiotikum 18 631 R.P. kann auf parcntcralem, rektalem oder vorzugsweise oralem Wege verwendet werden.

Zur Behandlung einer Infektion mit grampositiven Keimen beträgt bei einem Erwachsenen die Dosis im allgemeinen zwischen 1 und 3 g je Tag bei oraler odei rektaler Verabreichung und zwischen 0,5 und 2 g je Tag bei parenteraler Verabreichung.

Das Antibiotikum 18 631 R.P. kann als pharmazeutisches Mittel zur oralen Verabreichung in Form von Tabletten, Pillen, Pulver oder Granulaten verwende! werden. In diesen Zusammensetzungen ist das Antibiotikum mit einem oder mehreren inerten Verdünnungs-

ίο mitteln, wie Saccharose, Lactose oder Stärke, vermischt Diese Zusammensetzungen können auch andere inerte Substanzen außer den Verdünnungsmitteln, ζ. Β Magnesiumstearat, enthalten.

Als flüssige Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung kann man pharmazeutisch verwendbare Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere verwenden, die inerte Verdünnungsmittel, wie Wasser oder Paraffinöl, enthalten. Diese Zusammensetzungen können auch andere inerte Substanzen als die Verdünnungsmittel, wie Netzmittel, Süßmittel oder Aromastoffe oder Parfüms, enthalten.

Als pharmazeutische Mittel zur parenteralen Verabreichung eignen sich wäßrige oder nichtwäßrige sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen mit einem Gehalt an dem Antibiotikum 18 631 R.P. Als inerte Lösungsmittel oder inerte Träger kann man Propylengiykoi, Poiyäthylenglykol, pflanzliche Öle, insbesondere Olivenöl, und injizierbare organische Ester, beispielsweise Äthyloleat, verwenden. Diese Mittel können auch übliche Adjuvantien, insbesondere Netzmittel, Emulgiermittel und Dispergiermittel, enthalten. Die Sterilisation kann auf verschiedene Weise erfolgen, beispielsweise mit Hilfe eines bakteriologischen Filters, durch Einbringen von sterilisierenden Mitteln in die Zusammensetzung, durch Bestrahlen oder durch Erhitzen. Sie können auch zum Zeitpunkt des Gebrauchs in sterilem Wasser oder irgendeinem anderen injizierbaren sterilen Medium gelöst werden.

Als Mittel zur rektalen Verabreichung sind Suppositorien, die außer dem wirksamen Produkt Exzipientien wie beispielsweise Kakaobutter oder Suppowachs enthalten, geeignet.

In den folgenden Beispielen wird die angegebene Aktivität stets durch biologische Bestimmung nach der Diffusionsmethode unter Verwendung von Micrococcus pyogenes albus als empfindlichem Keim und bezogen auf eine reine Probe von 18 631 R.P. als Eichmaß mil 1000 μg/mg bestimmt. Diese Aktivität ist in ng/ccm für die Lösungen und in μg/mg für die festen Produkte

so ausgedrückt.

Beispiel 1
a. Fermentation
Man beschickt einen 170-l-Fermentei· mit:

Der pH-Wert wird mit 95 ecm 10 n-Natronhiugc aul 7,0 eingestellt. Man sterilisiert das Medium durch 40minütigcs Durchlcitcn von Dampf von 122"C. Nach Abkühlen beträgt das Volumen des Mediums 120 I und sein pH-Wert 7,0. Man beimpft mit 200 ecm einci gerührten bzw. geschüttelten Erlcnmcycr-Kultiir von Strcptomyccs albocincrcsccns DS 21 647 (NRRL 3419)

Pcpton(CI~ =3,5%)	1%)	1200 g
Fleischextrakt (Cl- =		600 g
Maisstärke		1200 g
Wasser	ad 1101

Die Züchtung wird bei 30⁰C 22 Stunden unter Bewegen und unter Belüftung mit steriler Luft vorgenommen. Sie ist dann zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet. Die Produktionskultur wird in einem 800-l-Fermenter vorgenommen, der mit den folgenden Substanzen beschickt ist:

»Distiller's Solubbes«(Rückstand von der Alkoholdestillation von Getreide,
»Industrial Wastes« von
Willem Rudolfs, Reinhold
Publishing Corporation, New
York 1953, S. 103) 16 kg

teilweise hydrolysierte Stärke 4 kg

hydratisiertes Kobaltchlorid
(6H₂O) 8 g

Wasser . ad 3301

Nach Einstellen des pH-Werts auf 7,80 mit 1400 ecm lOn-Natronlauge setzt man 2 kg Calciumcarbonat zu und sterilisiert dann das Medium 40 Minuten bei 122°C. Nach Abkühlen wird das Volumen, das 355 I beträgt, durch Zugabe von 40 1 einer sterilen wäßrigen Lösung, die 10 kg Dextrose enthält, und 5 I einer sterilen wäßrigen Lösung, die 800 g Ammoniumsulfat enthält, auf 400 1 aufgefüllt. Der erhaltene pH-Wert der Fermentationsbrühe beträgt 6,90.

Man beimpft dann mit 40 1 der oben beschriebenen Impfkultur aus dem 170-l-Fermenter. Die Züchtung wird bei 3O⁰C 71 Stunden lang unter Rühren mittels eines Turbinenrührers, der mit 260 U/min betrieben wird, und unter Belüftung mit steriler Luft in einer Menge von 25 mVStunde vorgenommen. Der pH-Wert der Maische beträgt dann 7,7 und ihr Volumen 4101. Die vorhandene Antibioticummenge beträgt 5 μg/ccm.

b. Extraktion

930 I der wie oben erhaltenen Fermentationsmaische mit einem Gehalt von 5 μg/ccm werden in einen Bottich eingebracht, der mit einer Rührvorrichtung ausgestattet ist. Der pH-Wert der Maische wird mit 12,6 I 5 η-Salzsäure auf 5 eingestellt. Nach '/2Stündigem Rühren setzt man 50 kg Filtrierhilfe zu und filtriert die Suspension auf einer Filterpresse. Der Filterkuchen wird mit 200 I Wasser gewaschen. Das Filtrat (960 1) wird verworfen. Der Filterkuchen (196 kg) wird unter Rühren in 500 I eines Gemischs von Wasser und Methanol mit einem Gehalt von 400 1 Methanol suspendiert. Der scheinbare pH-Wert des Gemischs wird dann durch Zugabe einer lOn-Natriumhydroxydlösung auf 7 eingestellt. Das Rühren wird '/2 Stunde fortgesetzt. Dann wird die Brühe auf einer Filterpresse filtriert. Das Filtrat wird gesammelt, und der Filterkuchen wird mit 150 1 eines wäßrig-methanolischen Gemischs mit 60 Vol-% Methanol gewaschen. Filtrat und Waschflüssigkeit werden vereinigt und man erhält 675 1 Flüssigkeit mit einem Gehalt an Antibioticum von 5,7 ng/ccm. Der Filterkuchen wird verworfen. Das alkoholische Filtrat wird dann unter vermindertem Druck (35 mm Hg) bei 35⁰C bis zu einem Volumen von 80 I eingeengt. Das Konzentrat wird nun in einen Bottich, der mit einer Rührvorrichtung ausgestattet ist, eingebracht. Man setzt unter Rühren 40 I n-Butanol zu und stellt den pH-Wert der wäßrigen Phase mit 5 n-Sul/.saurc auf 3 ein. Das Rühren wird 30 Minuten fortgesetzt und dann wird die obere Phase nach Dekantieren abgetrennt. Die Extraktion wird mit 40 I n-Butanol wiederholt. Die ausgezogenen Mutterlaugen werden verworfen. Die beiden Extrakte werden vereinigt (102 I) und mit 10 I Wasser gewaschen. Das Waschwasser wird verworfen. Der gewaschene Butanolextrakt wird hierauf unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 37° C auf ein Volumen von 3 1 eingeengt.

Das Konzentrat wird mit einer 25°/oigen Lösung von

Natriummethylat in n-Butanol auf pH 7 neutralisiert.

Das neutralisierte Konzentrat wird in 30 1 Hexan gegeben, wobei ein Niederschlag ausfällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Hexan gewaschen und im Vakuumtrockenschrank (5 mm Hg, 40°C) getrocknet. Man erhält 379 g rohes Antibioticum 18 631 R.P. als Natriumsalz mit einem Gehalt von 8,5 μg/mg.

c. Reinigung — 1. Stufe

1478 g gemäß b. erhaltenes rohes Antibioticum mit einem Gehalt von 8,5 μg/mg werden in 12 1 eines Gemisches von Methanol-Wasser (50 :50 Vol.) gelöst. Die erhaltene Lösung (pH = 7,0) wird in den oberen Teil einer Säule (Innendurchmesser: 15 cm) eingeführt, die 25 1 eines Polystyrol-Trimethylbenzylammonium-Anionenaustauscherharzes in Chloridform, das unter dem Namen »Dowex 1 X 2« im Handel ist, enthält, wobei die Abflußrate auf 3 l/Stunde eingestellt wird. Wenn die gesamte Ausgangslösung durch die Säule geführt ist, wird das Harz von oben nach unten bei einer Einstellung der Rate auf 25 l/Stunde nacheinander mit folgenden Gemischen gewaschen:

Methanol-Wasser (50 :50)

(VolVVoI.) 601

Methanol-Wasser (60 :40)
J5 (VoL/Vol.) mit einem Gehalt

von 10 g/l an NH₄CI 801

Methanol-Wasser (60 :40)

(VoL/Vol.) mit einem Gehalt

von 15 g/l an NH₄Cl 801

Das Antibioticum 18 631 R.P. wird dann mit einem Gemisch Methanol-Wasser (80 :20) mit einem Gehalt von 30 g/l an Ammoniumchlorid eluiert (240 1 mit einer Rate von 30 l/Stunde).

Das Eluat wird unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unterhalb 40° C auf 301 eingeengt, und das Konzentrat (pH = 5,2) wird zweimal mit je 30 1 Chloroform extrahiert.

Der Chloroformextrakt wird unter vermindertem

so Druck auf ein kleines Volumen eingeengt, und das Antibioticum wird in tert.-Butanol durch Konzentrieren übergeführt, indem zu dem Chloroformextrakt tert.-Butanol gegeben und das Chloroform abdestilliert wird. (Volumen der Butylalkohollösung: 1100 ecm). Der unlösliche und inaktive Anteil wird abgetrennt und die Butylalkohollösung lyophilisiert. Man erhält 25 g gereinigtes Antibioticum 18 631 R.P. mit einem Gehalt von320μg/mg.

d. Reinigung — 2. Stufe

10 g Antibioticum 18 631 R.P. von der oben beschriebenen 1. Reinigungsstufe werden in 800 ecm Äthylacetat gelöst. Nach Klärung wird die Lösung auf eine Säule (Innendurchmesser: 50 mm) aufgebracht, die 750 g zuvor mit verdünnter Schwefelsäure gewaschenes Aluminiumoxyd enthält. Die Säule wird mit 5 I Äthylacetat gewaschen, und das Antibioticum wird dann mit 11 Methanol eluiert.

Die Methanollösung wird unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen eingeengt und das Antibioticum wird durch Konzentrieren in Äthylacetat übergeführt, indem zu dem Methanolkonzentrat Äthylacetat gegeben und das Methanol abdestilliert wird. Aus der Äthylacetatlösung kristallisiert das Antibioticum aus. Die Ausbeute beträgt 1,16 g Kristalle mit einem Gehalt von 945 μg/mg.

e. Reinigung — 3. Stufe

41 g des oben erhaltenen Antibioticums aus der Reinigungsstufe 2 werden in 450 ecm Dioxan gelöst. Nach Klärung der Lösung setzt man langsam unter Rühren 450 ecm destilliertes Wasser zu, worauf das Antibioticum 18 631 R.P. auskristallisiert. Nach Filtrieren, Waschen des Kristallisats mit Wasser und Trocknen erhält man 3,6 g des Antibioticums 18 631 R.P. in Form weißer Kristalle mit einem Gehalt von 1000 μg/mg.
Schmelzpunkt: 204⁰C

[x]f 68° ± 1,5°

[«]& = -199° ±2,5°
(c = 1% in Äthanol)

Das UV-Spektrum der Verbindung ist in der F i g. 1 und das Infrarot-Spektrum in F i g. 2 dargestellt.

Gewichtsanalyse in % für C₃₅H₃₇O,, N₂CI
Berechnet:

C = 60,29= H = 5.35, O = 25,24, N = 4,02, Cl = 5,09;
gefunden:

C = 59,4, H =5,45, O = 25,1, N = 4,0, Cl = 5,1.

Beispiel 2
a. Fermentation

In einen 75-l-Fermenter bringt man die folgenden Bestandteile ein:

Maisquellwasser

(50% Trockenextrakt) 800 g

Saccharose · 1200 g

Calciumcarbonat 300 g

Ammoniumsulfat 80 g

Leitungswasser ad 351

Der pH-Wert der Mischung beträgt dann 6,10. Man sterilisiert das Gemisch durch 40minütiges Durchleiten von Dampf von 122°C. Nach dem Abkühlen beträgt das Volumen des Gemisches 401 und der pH-Wert 7,10. Man beimpft nun mit 200 ecm einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur von Streptomyces hygroscopicus DS 9751 (NRRL 3418). Die Kultur wird 48 Stunden unter Rühren und unter Belüftung mit steriler Luft bei 27°C entwickelt. Sie ist dann zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet.

Die Produktionskultur wird in einem 30-l-Fermenter durchgeführt, der mit folgenden Substanzen beschickt ist:

während 40 Minuten. Nach dem Abkühlen beträgt da; Volumen des Mediums 14 I. Es wird durch Zugabe vor 1 1 einer wäßrigen sterilen Lösung, die 30 g Ammonium sulfat enthält, auf 15 I aufgefüllt. Der erhaltene pH-Wer beträgt 7,0.

Man beimpft dann mit 1 I der oben beschriebener Impfkultur aus dem 75-l-Fermenter. Die Züchtung wire bei 27°C 161 Stunden lang unter Rühren mittels eine: Turbinenrührers, der mit 240 U/min betrieben wird, unc ίο unter Belüftung mit steriler Luft in einer Menge von 1 mVStunde durchgeführt. Der pH-Wert der Maische beträgt dann 8,0 und sein Volumen 10.5 I. Die vorhandene Antibioticummenge beträgt 9 μg/ccm.

b. Extraktion

10,5 1 der oben erhaltenen Fermentationsmaische werden in einen mit einer Rührvorrichtung ausgestatteten Bottich eingebracht. Man setzt 10,5 1 n-Butanol unc 500 g Filtrierhilfe zu. Die Suspension wird eine halbe Stunde gerührt und filtriert. Der Filterkuchen wird nacheinander mit 1 I n-Butanol und 1 1 Wasser gewaschen. Das Filtrat wird dekantiert. Die untere wäßrige Phase wird abgetrennt und verworfen. Die organische Phase (11 I) wird dann unter vermindertem Druck (40 mm Hg) bei 30°C auf ein Volumen von 2OC ecm eingeengt. Das in dem Konzentrat vorhandene Antibioticum wird durch Zugabe von 2 I Hexan ausgefällt. Das Antibioticum wird abfiltriert, mit Hexan gewaschen und in einem Vakuumtrockenschrank (40 mm Hg, 35°C) getrocknet. Man erhält 14 g des rohen Antibioticums mit einem Gehalt von 3 μg/mg.

Die Chromatographie des Rohprodukts auf Papier Arches 302, das mit einer Phosphatpufferlösung von pH 7 [Mischung aus 6 ecm einer M/3 ('/3 Mol je Liter]

y, Dinatriumphosphatlösung und 4 ecm einer M/3 ('/] Mol je Liter) Monokaliumphosphatlösung] imprägniert ist mit Chloroform als Entwicklungslösungsmittel ergibi die gleiche Wanderung wie mit dem aus den Kulturer von S. albocinerescens DS 21 647 (NRRL 3419) in

ίο Beispiel Ib isolierten Rohprodukt (Rf = 0,5).

Auf Papier Arches 302 beobachtet man mit einem Gemisch Äthylacetat-Cyclohexanfl : 1), das mit Wasser gesättigt ist, als bewegliche Phase die gleiche Wanderung wie bei dem gemäß Beispiel Ib isolierten Rohprodukt (Rf = 0,5).

Auf Kieselgel G-Dünnschichl erhält man unter Verwendung des Gemischs Tetrachlorkohlenstoff-Äthanol-Essigsäure (90:6:6) als Entwicklungssystem die gleiche Wanderung wie bei dem gemäß Beispiel Ib

so isolierten Rohprodukt (Rf = 0,5).

Das oben erhaltene Rohprodukt wird gemäß Bcispie Ic bis legereinigt.

Distiller's Solubles	750 g
(vgl. Angabe im Beispiel 1)	150 g
Dextrose	225 ecm
Sojaöl	0,02 g
Kobaltchlorid mit 6 H₂O	ad 151
Wasser

Nach Einstellung des pH-Werts mit 65 ecm 10 n-Natronlaugc auf pH 8,6 setzt man 75 g Calciumcarbonat zu und sterilisiert dann das Medium bei 122°C

Beispiel 3

4801 einer gemäß Beispiel la hergestellten Fermentationsmaische, die jedoch einen Gehalt von 1 μg/ccn■ aufweist und einen pH von 7,1 besitzt, werden in einer mit einer Rührvorrichtung ausgestatteten Bottich eingebracht. Man setzt 400 I Äthylacetat und dann nach

ho '/2Stündigem Rühren 45 kg Filtrierhilfe zu. Die Suspension wird auf einer Filterpresse filtriert. Der Filterkuchen wird nacheinander mit 801 Äthylacetat unc dann mit 150 I Wasser gewaschen. Das Filtrat (1080 Γ wird dekantiert. Die untere wäßrige Phase wire

b^r> abgetrennt (660 I) und verworfen. Die organische Phase (4201) wird mit 401 Wasser gewaschen. Der gewaschene Extrakt wird unter vermindertem Druck (60 mm Hg) bo 22° C auf ein Volumen von 31 eineecnEt..

Das Konzentrat wird mit 30 I Hexan versetzt und das dabei ausgefallene Antibioticum abfiltriert, mit Hexan gewaschen und in einem Vakuumtrockenschrank '5 mm Hg₁ 40⁰C) getrocknet. Man erhält 37 g rohes Antibioticum 18 631 R.P. mit einem Gehalt von 6 μψη\ξ. Dieses Rohprodukt kann wie in Beispiel ic bis Ie beschrieben gereinigt werden.

Beispiel 4

0,5 g gemäß Beispiel Id hergestelltes und gereinigtes Antibioticum 18 631 R.P. werden in 20 ecm Aceton gelöst und durch langsame Zugabe von 10 ecm Wasser umkristallisiert. Man erhält 0,445 g weiße feine Nadeln des Antibioticums mit einem Gehalt von 994 μg/mg und das die physikalisch-chemischen Eigenschaften des nach Beispiel 1 e erhaltenen Antibioticums besitzt.

Beispiel 5
a. Fermentation
Man beschickt einen 170-l-Fermenter mit:

Pepton(C|- =3,5%) 1200 g

Fleischextrakt (Cl- = 1%) 600 g

Maisstärke 1200 g

Leitungswasser ad 1101

Der pH-Wert wird mit 120 ecm 10n-Natronlauge auf 7,10 eingestellt. Man sterilisiert das Medium durch 40minütiges Durchleiten von Dampf von 122°C. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Mischung 120 I und der pH-Wert 7,10. Man beimpft mit 200 ecm einer gerührten bzw. geschüttelten Kultur von Streptomyces roseochromogenes, var. oscitans DS 12 976 (NRRL 3504). Die Kultur wird bei 30⁰C 27 Stunden unter Rühren und unter Belüftung mit steriler Luft entwickelt. Sie ist dann zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet.

Die Produktionskultur wird in einem 800-I-Fermenter durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen beschickt ist:

Distiller's Solubles

(vgl. Angabein Beispiel 1) 20kg

teilweise hydrolysierte Stärke 5 kg

Kobaltchlorid mit 6 H₂O 10 g

Leitungswasser ad 405 1

Nach Einstellen des pH-Werts mit 1800 ecm 10 n-Natronlaugc auf 7,50 setzt man 2,5 kg Calciumcarbonat zu und sterilisiert das Medium dann bei 122°C während 40 Minuten. Nach Abkühlen beträgt Jas Volumen des Gemisches 450 I. Durch Zugabe von 50 1 einer sterilen wäßrigen Lösung, die 12,5 kg Dextrose enthält und 5 I einer sterilen wäßrigen Lösung, die 1 kg Ammoniumsulfat enthält, wird auf 500 1 aufgefüllt. Der pH-Wert beträgt 6,60.

Man beimpft dann mit 50 1 der oben beschriebenen Impfkultur aus dem 170-l-Fermenter. Die Züchtung wird bei 33°C 119 Stunden unter Bewegung mit Hilfe eines Turbinenrührers, der mit 205 U/min betrieben wird, und unter Belüftung mit steriler Luft in einer Menge von 25 mVStunde durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums beträgt dann 8,60 und das Volumen der Maische 470 1. Die vorhandene Antibioticummenge beträgt 288 Hg/ccm.

b. Extraktion

990 I der oben gemäß a) erhaltenen Fermentationsmaische mit einem Gehalt von 288 μg/ccm werden in einen mit einer Rührvorrichtung ausgestatteten Bottich gebracht. Der pH-Wert der Maische wird mit 10 I 5 η-Salzsäure auf 5 eingestellt. Nach '/2Stündigem Rühren setzt man 50 kg Filtrierhilfe zu und filtriert die j Suspension auf einer Filterpresse. Der Filterkuchen wird mit 2001 Wasser gewaschen und das Filtrat (1025 I] verworfen. Der Filterkuchen (199 kg) wird unter Rührer in 750 I eines Gemischs von Wasser und Methanol mil einem Gehalt von 600 I Methanol suspendiert. Dei

κι scheinbare pH-Wert des Gemischs wird dann durch Zugabe von 1 I 5 η-Natronlauge auf 7 eingestellt. Das Rühren wird 1 Stunde fortgesetzt. Dann wird die Brühe auf einer Filterpresse filtriert. Das Filtrat wird abgetrennt und der Filterkuchen wird mit 100 I eines Gemisches von Wasser und Methanol mit einem Gehall von 60 Vol.-% Methanol gewaschen. Filtrat und Waschflüssigkeit werden vereinigt und man erhält 840 1 Flüssigkeit mit einem Antibioticumgehalt von 285 μg/ccm. Der Filterkuchen wird verworfen. Das alkoholi-

λι sehe Filtrat wird dann unter vermindertem Druck (35 mm Hg) bei 35° C auf ein Volumen von 100 I eingeengt. Das Konzentrat wird in einen mit einem Rührer ausgestatteten Bottich eingebracht. Man setzl 50 I n-Butanol ;i Der pH-Wert der wäßrigen Phase wird mit Hilfe von 5 η-Salzsäure auf 3 eingestellt und das Rühren wird 30 Minuten fortgesetzt. Nach Dekantieren wird dann die obere Phase abgetrennt. Die Extraktion wird mit 30 1 n-Butanol wiederholt. Die ausgezogenen Mutterlaugen werden verworfen. Die

jo beiden Extrakte werden vereinigt (98 I) und mit 10 I Wasser gewaschen. Das Waschwasser wird verworfen Der gewaschene Butanolextrakt wird unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 37°C auf ein Volumen von 3 eingeengt. Das Konzentrat wird mit einer 25°/oiger

α Lösung von Natriummethylat in n-Butanol auf pH 7 neutralisiert. Das neutralisierte Konzentrat wird in 30 Hexan gegeben. Das dabei in Form des Natriumsalze! ausgefallene rohe Antibioticum 18 631 R.P. wire abfiltriert, mit Hexan gewaschen und in einerr Trockenschrank unter vermindertem Druck (5 mm Hg 40⁰C) getrocknet. Man erhält 477 g rohes Antibioticum 18 631 R.P. mit einem Gehalt von 435 μg/mg.

c. Reinigung — 1. Stufe

1345 g gemäß b) erhaltenes Rohprodukt mit einerr Gehalt von 332 μg/mg werden in 30 1 eines Gemisch« Methanol—Wasser (50:50 Volumina) gelöst. Die erhaltene Lösung wird oben auf eine Säule (Innendurchmesser: 15 cm) aufgebracht, die 30 I eines Polystyroltrimethylbenzylatnmonium-Anionenaustauscherharzes ir Chloridform, das unter dem Namen »Dowex 1 X 2« irr Handel ist, enthält, wobei die Menge des Abflüsse; 3 l/Stunde eingestellt wird.

Wenn die gesamte Ausgangslösung durch die SäuU gegangen ist, wird das Harz von oben nach unten be einer Einstellung der Rate auf 25 l/Stunde nacheinandei mit den folgenden Gemischen gewaschen:

M ethanol-Wasser

(50-.50VoIyVoI.) 201

Methanol-Wasser
(60 :40 Vol./Vol.)

b5 mit 15 g/l Ammoniumchlorid 1201

Methanol-Wasser
(70: 30 VoIVVoI.)
mit 15 g/l Ammoniumchlorid 601

Das Antibioticum wird dann mit einem Gemisch Methanol-Wasser (80 :20 Volumina) mit einem Gehalt von 30 g Ammoniumchlorid je Liter eluiert (120 1 in 6 Fraktionen von je 201).

Die Fraktionen 2, 3 und 4, die den Hauptteil der Aktivität enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unterhalb 40° C auf 301 eingeengt.

Das Konzentrat wird ohne Änderung des pH-Werts einmal mit 15 1 und zweimal mit je 7.5 1 Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt, mit 5 1 Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 40⁰C auf 10 1 eingeengt. Die erhaltene Lösung wird nun durch eine Säule (Innendurchmesser: 5 cm) geleitet, die 500 g zuvor bei pH 4 gewaschenes Aluminiumoxid enthält. Wenn die gesamte Lösung durchgeflossen ist, entwickelt man die Säule mit 21 Äthylacetat.

Die austretende Flüssigkeit und die Waschflüssigkeiten werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf 'Ao ihres Volumens eingeengt, wobei Kristallisation eintritt. Nach 2stündigerr. Stehen in einem Eisbad werden die Kristalle abgesaugt, mit 200 ecm kaltem Äthylacetat gewaschen und 24 Stunden bei 40⁰C unter vermindertem Druck von weniger als 5 mm Hg getrocknet. Man erhält 170 g kristallisiertes Antibioticum 18 631 R.P. in Form der freien Säure mit einem Gehalt von 855 μg/mg.

Aus den Fraktionen 5 und 6 der obigen Säulenchromatographie werden in der gleichen Weise 35 g kristallisiertes Antibioticum mit einem Gehalt von 702 μg/mg erhalten. (Durch Einengen der Mutterlaugen und Ausfällen mit Hexan kann man noch 124 g Produkt zur Zurückführung mit einem Gehalt von 250 μg/mg gewinnen).

d. Reinigung — 2. Stufe

276 g des oben erhaltenen Antibioticums aus der Reinigungsstufe 1 werden bei 30⁰C in 2,4 1 eines Gemischs Aceton-Dioxan (5 :1 Volumina) gelöst. Die Lösung wird geklärt und dann innerhalb von 3 Stunden unter langsamem Rühren bei Zimmertemperatur mit 2,5 I Wasser versetzt. Nach Stehenlassen über Nacht bei Zimmertemperatur werden die ausgefallenen Kristalle abgesaugt, mit 11 Wasser gewaschen und 48 Stunden bei 60⁰C unter einem Druck von 1 mm Hg getrocknet.

Man erhält 231 g Antibioticum 18 631 R.P. in Form weißer Kristalle mit einem Gehalt von 990 μg/mg. Die Verbindung besitzt folgende Daten:

Drehvermögen:

[a]ä = -196° ± 2,5°
(C= 1% in Äthanol)

Ultraviolett-Spektrum (Bestimmung mit einer Lösung in Chloroform mit 10 mg/1): ,

Absorptionsmaximum bei 275 nm
Absorptionsminimum bei 298 nm
Schulter bei 307 nm

Absorptionsmaximum bei 338 nm

Gewichtsanalyse in % für C35H37O11N₂CI:

Berechnet:

C = 60,29,

H = 5,35,

O = 25,24,

N = 4,02,

Cl = 5,09,

Gefunden:

C = «0,0 bis 60,3

H = 5,4 bis 5,5

O = 24,9 bis 25,0

N = 3,9 bis 4,1

Cl= 4,75 bis 4,95

Beispiel 6

164 g gemäß Beispiel 5c erhaltenes kristallines Antibioticum 18 631 R.P. werden in 500 ecm Aceton gelöst. Die Lösung wird durch Filtrieren durch eine Schicht Filtrierhilfe (Clarcel DIC) geklärt. Dann setzt man zu der Lösung innerhalb von IV2 Stunden unter langsamem Rühren 4,5 I eines Gemischs Acetonitril— Wasser (50 :50 Volumina) zu. Nach Stehenlassen über Nacht bei Zimmertemperatur werden die gebildeten Kristalle abfiltriert, zuerst mit 1 1 eines Gemischs Aceton—Wasser (50:50 Volumina) und dann mit 1 1 Wasser gewaschen und 48 Stunden bei 50⁰C unter weniger als 5 mm Hg getrocknet. Man erhält 124 g Antibioticum 18 631 R.P. in Form weißer Kristalle mit einem Gehalt von 1000 μ§/π^ und das die physikalischchemischen Eigenschaften des gemäß Beispiel 5d erhaltenen Antibioticums besitzt.

Das folgende Beispiel erläutert eine erfindungsgemäße medizinische Zusammensetzung:

Beispiel 7

Man stellt nach der üblichen Arbeitsweise Tabletten der folgenden Zusammensetzung her:

18 631 R.P. 0,250 g

0,150 g

Stärke

kolloidale Kieselsäure

Magnesiumstearat

0,070 g
0,030 g

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche: Antibioticum 18 631 R. P. der folgenden Formel:

V=O

OH
2. Verfahren zur Herstellung des Aniibioticums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man »Streptomyces hygroscopicus DS 9751«, der unier der Nr. NRRL 3418 hinterlegt wurde, oder »Streptomyces albocinerescens DS 21 647«, der unter der Nr. NRRL 3419 hinterlegt wurde, oder »Streptomyces roseochromogenes, van oscitans DS 12 976«, der unter der Nr. NRRL 3504 hinterlegt

NH-CO

OH