DE1907556A1

DE1907556A1 - Neues Antibioticum und seine Herstellung durch Zuechtung von Streptomices

Info

Publication number: DE1907556A1
Application number: DE19691907556
Authority: DE
Inventors: Denise Mancy Geb Courtillet; Leon Ninet; Homme Jean Preud
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1968-02-14
Filing date: 1969-02-14
Publication date: 1969-09-18
Also published as: NL155307B; US3682886A; DE1907556C3; GB1208842A; AT284342B; FR95269E; BE728372A; CH492781A; DE1907556B2; DK120310B; NL6902381A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues das im folgenden mit der Nummer 18 6j1 R..P. bezeichnet wird, sein Herstellungsverfahren sowie die medizinischen Zusammensetzungen» die es enthalten. _

Das neue Produkt weist ein ganz besonderes Interesse in Folge, seiner hohen antibakteriellen Wirksamkeit gegenüber Oram-positiven Keimen und einer bemerkenswerten Wirksamkeit gegenüber gewissen Oram-negativen Keimen auf. Es kann aus Medien der künstlichen Züchtung der im folgenden Voll» ständiger identifizierten Mikroorganismen erhalten werden» die dem Oenus Streptomyces angehören und mit "Streptomyces hygroacopieus DS 9 751* (NRRIi5*18), "Streptomyces albocinerescene DS 21 64?" (NRRL 3419) und "Streptomyces roseochromogenes, DS 12 976_S var. osoitans" (NRRL 350*) bezeichnet werden.

9-0 3 87 15 3 7

Das Antibioticum 18 6J1 R.P. liegt in Form eines mikrokristallinen weissen Pulvers vor und besitzt die folgen· den physikalisch-chemischen Eigenschaften:

Schmelzpunkt: 206^eC Löslichkeit: Es ist ini DimethyIsulfoxyd leicht lös lieh,:

in verdünnten starken Basen, Methanol, Äthanol, Aceton, Dioxan, Chloroform« Dimethylformamid und Kthylacetat löslich und in Wasser, wässrigen Natriuinbicarbonatlöeungen, verdünnten starken Säuren, Tetrachlorkohlenstoff, Acetonitril und Hexan wenig löslich oder nicht löslich,

Strukturformel: Elementarzu8aromensetzung (berechnet für

C « 60,29 % H * 5p35 ^ 0 « 25,2* % H"-4,02. Cl «* 5,09 $

909838/1537

g⁰

[ag⁰ · -68^β ♦ 1,5* (β - 1 % in Äthanol)

[ J^ t ²*5* (° - ^Ί * *Π Äthanol)

'«' ~8ö^e * 2^β (e « O,β Jg In

[«3?L * -§24® * 2_fi5^e (ρ - 0,6 % in Aceton)

(Bastismayng mit einer lösung mit 10 mg/1 in Chloroform)s

1 g

bei 275 n» (E^ ^_1n a Schulter bei 307 mn (e] ^ » 201) Äbsorptionsmaxisnuin b«i 337 nin (Ei ⁷Z_n, ■« 4j4)

Dieses Spektrum ist in Fig. 1 wiedergegeben» in der als Abszisse einerseits die Wellenlänge in Manometer (ntn) (unterer Massstab) und andererseits die Wellansahlen in om" (oberer Kassstab) und als Ordinats die optischen Dichten aufgetragen sind,

^fraro^Sjgok^um (Di@ Bestimmung wurde an mit Kalium-

bromid verpresstem Produkt vorgenommen)

Dieses Epektmst iat in Fig. 2 gezeigt, in der als Abszisse die Wellenlängen in Mikron (unterer Massßtab)

909838/15 37

und andererseits die Wellenasahlen in on (oberer Maes« stab) und als Ordinate die optischen Dichten aufgetragen

sind.

In äer nachfolgenden Tabelle I sind die Hauptbanden der Infrarot-Absorption (in cm" ) für dieses Produkt angegebeng

Tabelle

5*40 Soh	155O st	980 seh
5560 st	1500 Seh	950 st
5500 Soh	1495 Sch	955 m
5100 Soh	1485 sst	855 in
2970 in	146O m	810 st
2920 st	1450 st	780 st
2840 in	1560 st	750 st
2820 Sch	1515 st	V, 755 m
2750 sch	1280 ra	720 sch
2560 m	1255 sch	695 seh
2100 m	1215 sst	660 Sch
1850 seh	1190 m	'-, 645 Sch
1685 sst	1150 st	625 st
1625 st	1110 m	605 Sch
1595 sst	1070 st	565 sch
1555 m	1050 st	555 m
1540 Sch	990 st	550 m
		500 ui

90 9838/ 1 537

	» sehr stark	19Q7556
sat	* stark
et	m mittel
m	» schwach
8Ch	« Schulter
Sch

Saure-basische Reaktion:

Das 18 631 R,P. ist eine schwache Säure* deren Neutraläquivalent, gemessen durch potentiometrische Titration einer Lösung in einen Gemisch Methanol-Wasser (25:10 Volumina) mit 1/IOn-Natronlauge, 695 beträgt.

Farbreaktionen$ Das 18 631 R.P. ergibt:

Stark positive Teste in folgenden-Reaktionen: Reaktion nach Mollsoh, Reaktion nach Polin-Denis _s Permanganat-Schwefelsäure-Reaktion (in der Kälte), Fehling'sehe Reaktion, Indol-Schwefelsäure-Reaktion, Cystein-Reaktion, Carb»zol-Reaktion, Reaktion nach Dieehe (mit Phloroglucin), Reaktion nach Elson-Morgan und Reaktion nach Dische-Borenfreund (nach Desaminierung)j

schwach positive Teste in den folgenden Reaktionen: Reaktion nach Pauly, Reaktion nach ,Adamkiewicz, Reaktion nach Tollens und Reaktion nach Seiiwanoff-Rofe't

negative Teste in den folgenden Reaktionen; Reaktion nach Millon, Ninhydrin-Reaktion, Biuret-Reaktion, Xanthoproteln-Reaktion, Dlazotlerungsreaktion, Reaktion nach Ehrllch-Salkowsky, FerriChlorid-Reaktion, Reaktion nach Murner, Reaktion nach Zimmermann«Bitto. Reaktion nach

909838/15 37

19ÜJ5S6

Peohmann, Reaktion nach Tauber. Reaktion nach BIaI₉ Reaktion nach Wheeler-ToIlens, Ferrlsalzreaktlon des Maltols, Reaktion nach Sakaguohi und Reaktion nach Nessler.

Dialyse:

Das Antibioticum 18 631 R*P. dialyslert durch eine Membran aus regenerierter Cellulose ( Cellophan-Typ).

Chromatographische Wanderung» (Machgewlesen durch biologische Prüfung auf mit Staphylococcus albus beimpften agarplatten)t Die auf verschiedenen Trägern und unter dem Einfluss verschiedener Lösungsmittel beobachteten Wanderungen sind in der nachfolgenden Tabelle II angegeben:

Tabelle

II

Träger	System (Zusammensetzung in Volumina)	Rf .-■;	P,95
Papier Arohes		- ■?.	0,95
nichtgepuffert	mit Wasser gesättigtes Butanol	0,05
nlchtgepu ffert	Benzol-Methanol (4:1) -	\m ■,■:...:
nichtgepuffert	HH^Cl mit 30 g/l in Wasser	0,5Ol
nichtgepuffert	Butenol-EssigsKure-Wasser (4»1s5 - obere Phase)	- - . - 0,50 : - - - - ' - - "
hichtgepuffert	Kthylacetat-Cyclohexan (1:1) mit Wasser gesättigt
Papier Arches 502 imprägniert mit einer m/3 Phos- phatpufferlö- sung von pH 7	Chloroform

90 9838/1537

	System.	Rf
	(Zusansmensetzyng in Volumina)
Aluminium»
oxyd (Dtlsn-
schicht)	Methanol-Wasser (95:5)	Op27
Kieselgel O
(Dünnschloht)	Bis tso©l-Essigsäure-Wasser
	(4*1s5 - ober« Phase)	1,00
Kieselgel ö
(DUnneehieht)	Tetrachlorkohlenstoff·
	(90:6*6)	0,50

Bjutterlostatiaqhe .Aktivität voa 18

R.P. in vitro

Dae 1B 631 RoP. weist ©in© beträchtliche antibiotisehe Wlrks&mkeit gegenüber .einer gewissen- Anzahl von Bakterien auf« von denen die etnpfliKSiiehstsa su denjenigen gehören« die die Färbung nach Oram smishmen. Seine Aktivität ist gegenüber Staphylokokken besonders hooh. Es zeigt eine begrenztere Wirksamkeit gegenüber den Gram-negativen Bakterien» obgleich es auch hier noch eine bemerkenswerte Wirksamkeit , insbesondere gegen gewisse Neisseria ausübt,

Ss zeigt kein© gekreuzte Resistenz mit Aureomycin* Streptomycin« Chloramphenicol, Erythromycin, Carbomycin« Spiramycin und Pristinamycln, dagegen Jedoch eine beträchtliche gekreuzte Resistenz mit Novobiocin.

909838/1537

1307558

In der nachfolgenden Tabelle IXX sind die Konten trat lossen von 18 631 RcPo angegeben, die sur Gewährleistung der B&kteriostase einiger Keime erforderlich sind. Sie wurden dureh eine der Üblicherweise zu diesem Zweck angewendeten Verdun*· ziungsmethoden bestimmt. Für jeden Kein: wurde die kleinst® Konzentration an Substanz, die unter definierten Bedisigun» gen jegliche sichtbare Entwicklung in einer geeigneten f?Mh>« bouillon verhindert, bestimmt, Biese minimalen bakteriesta» tischen Konzentrationen sind in/ig Substanz Je com Versuchs« medium ausgedrückt.

Tabelle IXX

Geprüfte Bakterienorganisinen	Minimale bakterio« statische Konzen trationen in ^ig/ecBi.
Staphylococcus aureus, Stamm 209 P -
ATCC 6558 P	0,005
Staphylococcus aureus, Stamm Smith	.0,003. . .
Sarcina lutea - ATCC'93*1	0,02
Streptococcus faecalis - ATCC 9790	0,04. - .
Streptococcus viridans (Institut Pasteur)
Streptococcus pyogenes haemolyticus (Stamm Cig 7, Institut Pasteur)	. ■"-, 0,05." ":
Diploooccus pneumoniae (Stamm TiI, Institut Pasteur)	; --.■■ 0_e03^; ■' ;
Neisseria eafcar halls (A 152 - Institut Pasteur)	0*005
Neisseria meningitidis (5813 - Institut Pasteur)	0,05
Neieseria gonorrhoeae (A 50 - Institut Pasteur)	0,4
Lactobacillus casei - ATCC 7^69	1 : ■ .
Bacillus subtilis - ATCC 6633	0,6

9 0 9 ß 3 8/ 1 5 3 7

Geprüfte Bakterienorganismen	Minimale bakterio- statische Konzen trationen in/ig/com
Bacillus oereuB - AIICC 6630	0,5
Mycobacterium species - ATCC 607	10
Esoheriohia coli - ATCC 9637	10
Proteus vulgaris	¹?
*Klebsiella pneumonia - ATCC 10 031**	1
Pseudomonae aeruginosa (Stamm Bass -Institut Pasteur)	4
Brucella bronohiseptioa (CM 387 -Wellcome Institut)	0,3
. Bruce11a abortus bovis B 19 (52 135 - Institut Pasteur)	0,1
. Pasteure!la multocida (A 125 - Institut Pasteur)	T
Treponema (Reiter)	12

Die antibakterielle Wirksamkeit von 18 631 R.P. wurde in vivo bei Versuchstieren bestätigt, dia experimentell mit Keimen« wie beispielsweise Streptokokken_pPneumokokken und Staphylokokkenρ infiziert waren« Das Antibioticum hat sich bei der Maus bei Verabreichung auf oralem und subcutanera Wege als besonders wirksam erwiesen. Es weist auch eine sehr gute Präventivwirkung gegen Staphyiokokksnlnfektlonen der Maus bei Verabreichung auf oralem und subcutanem Wege auf.

9 0&&38/1E3 7

Toxlait&tt

Die Toxizität des 18 631 R.P. wurde hauptsächlich bei der Maus geprüft und bei oraler und subcutaner Verabreichung bestimmt. Bei diesen beiden Verabrelohungsarten hat sich das 18 631 R.P. bei einer Dosis von 1 g/kg als atoxisch er» wiesen. Die letale Dosis 50 £ oder DLe₀ wurde ebenfalls bei oraler und subcutaner Verabreichung bestimmt und beträgt s

DL₅₀ m. 2,2 g/kg p-o. 1*7 g/kg s.c.

Diese Ergebnisse zeigen, dass das Produkt wenig toxisch

Die das Antibioticum 18 631 R.P_O erzeugenden Organismen gehören zum Genus Streptomyoes und werden mit "Streptorayees hygrosoopicue DS 9 751" (NRRL 3418), "Streptomyces albocinerescens DS 21 647" (NRRL 3*19) und "Streptomyces roseochromogenes, var. oseitans* (NRRL 3504) bezeichnet.

Diese Organismen wurden aus Erdproben isoliert, die aus folgenden Gebieten stammtent

Südafrika im Falle des Streptomyces hygroscopicue DS 975V Frankreich im Falle des Streptomyoes albocinerescens DS

21 647 und

Indien im Falle des Streptomyces roseoohromogenes, var.

oscitans.

Die Isolierung dieser Organismen erfolgte nach der folgenden Methodes Eine kleine Menge Erde wird in destilliertem sterilem Wasser suspendiert, und die Suspension wird dann auf verschiedene Konzentrationen verdünnt. Eine kleine Menge jeder Verdünnung wird auf die Oberfläche von Petrischalen aufgebracht, die ein Agar-Nährmedium enthalten. Nach einer Inku-

9Q9838/15 37

bation von einigen Tagen bei g6*C werdsn die Kolonien der Mikroorganismen, die man isolieren will« im ihre Untersuchung forfcsuse&zen» entnommen und auf Schrägnähriigar verüb reichlicher* Kulturen au erhalten.

Der Stamm DS 9751 besitzt Zusammenhänge mit dem Aussehen von Streptojnyoass hygrosaopicus, dessen wesentliche Charakteristiken von H.D. TRESHER und E.J. BACKlJS (Applied Microbiology, £, 2&3-S5O, 1956) und von S.A. WAiCSMAN (The Actinomyoetes, H₉ fhe Williame and Wilkins Company, Baltimore, 1961, Seite 230~331) definiert wurden, Dies ist der Grund, weshalb er Streptomyees hygroscopicus, Staaan DS 9751, genannt^ wurde.

S. hygrosecpictiß DS 9751 weist die drei folgenden Merkmale auf, die den drei Charakteristiken entsprechen, durch die H.D. TBESHEH und E.J. BACKUS sowie S„A. WAKSMAN die Species S. hygroscopious definiert habens a) Seine SporenfSden enden im Allgemeinen in dichten Spiralen, die in einigen Windungen aufgerollt sindι diese spiralförmigen Sporenfäden sind am häufigsten lunge ©toe® Zentralfad@ns «nt^r Bildung von mehr oder weniger ausgedehnten Trauben angeordnet2 b) das sporulierte luft«ausgesetzt© Myeel zeigt, wenn es ein gutes Entwioklungestadium erreicht hat, eine dunkelgr&ue Färbung, die derjenigen entspricht, die die Species S. hygroscopicus zeigt1 c) auf gewissen Ztiehtungsmedien, die eine gute Sporulation ermöglichen,, treten durch Alterung in den sporulier« ten OberflKohen schwarte, glänzende_e feucht aussehende, für die Species S. hygroscopicus charakteristische Zonen auf. Im Falle von S. hygroscopicus DS 9 751 erfolgt die Umwandlung des dunkelgrauen Sporenteppichs zum schwarzen Oberzug nur ziemlich langsam und in unsteter Welse, wobei die Umwandlung im allgemeinen eher auf kleine Stellen, die auf der eporulierten Oberflächen verteilt sind, beschränkt lst_c

ν 909838/1537

. "¹²V

als auf den gesamten Sporenteppioh aufzutreten» Sie tritt jedoch in Erscheinung und kann beobachtet werden« insbesondere auf Agar mit Hefeextrakt nach Prldham, Agar mit Hafer nach Carvajal, Agar mit Oyalbunin und Glueose-Asparagin-Agar.

Die von den Kulturen von S. hygrosooplous OS 9 751 gezeigten morphologischen Charakteristiken sind insgesamt denjenigen des Stamiaee S. hygroscopieus sehr ähnlich, der in "The Aetinomyeetes" (S.A. WAKSNAN, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, Seite 230-231) beschrieben 1st, wobei die bemerkenswertesten Unterschiede gegenüber den beschriebenen Charakteristiken darin bestehen, dass S. hygrosoopious CS 9 751 keine Säuerung der Milch, sondern vielmehr eine sehr

b schwache Verschiebung nach dem alkalischen Bereich hin bewirkt (der Anfangs-pH-Wert, der 6,3 beträgt, geht in 1 Monat auf 7,0) und auseerdero auf Agar nach Czapek mit Saccharose nur ein sehr schwaches bräunliches lösliches Pigment liefert_β Der in "The AetinomyceteB* beschriebene Stamm S. hygroscopieuß ruft dagegen eine sehr schwache Säuerung der Milch hervor (der pH-Wert erreicht 6,0) und liefert auf "Saccharose-Nitrat-Agar" ein goldgelbes bis helloranges lös liehe es Pigment. Diese geringen Unterschiede erlauben ersichtlicherweise nicht, den Stamm DS 9 751 als eine Species anzusehen,, die von der Species S. hygroscopic«» verschieden ist, deren Hauptmerkmale, die au ihrer Definition dienen, DS 9 751 im übrigen aufweist. Es sei darauf hingewiesen, dass die Sporen von S. hygroscoplcus

) DS 9 751 zylindrisch bis isodiametrlsch mit stumpfförmigen Enden sind, während diejenigen dee in "The Aetinomyeetes* beschriebenen Stammes S. hygroscopicue oval sind„ doch wird die Form der Sporen von H.D. TREStJER und E.J. BACKUS als variabel in der Species S. hygroscopicus, in der diese verschiedenen Formen angetroffen werden, angesehen.

So hygroscopicus DS 9751 erzeugt auf organischen Medien kein Melaninpigment. Er bildet auf allen seinen Züohtungsmedien

909838/1537

•In vegetatives Myeel, das von schwach gelblich bis gelb oder gelbbraun geht« und die löslichen Pigmente» die er erzeugt, Meisen gelbe bis gelbbraune Töne auf.

S. hygrotcopioue DS 9 751 bildet Sporenfäden_P die im alIgemeinen in dlohten Spiralen enden» die am häufigsten 1 bis 5 Windungen aufweisen, obgleich man gelegentlich Spiralen beobachtet« die eine grössere Ansah! von Windungen bilden, oder auch einige Sporenfäden» die einfach in ihrem Endteil gekrümmt sind» ohne eine vollständige Windung zu bilden, oder auch manch· mal mehr oder weniger schlaffe und auseinandergewickelte Spiralen. Der Sporenteil weist am häufigsten eine Struktur in Traubenforn auf» wobei die spiralförmigen Sporenfäden längs eines Hauptfadens angeordnet sind» der in gewissen Fällen eine ziemlich grosse Länge haben kann. Die Sporen haben eine mehr oder weniger regelmässige kurze zylindrische Form mit Abmessungen von 0,6 bis O»9/1/0,9 bis 1,2 μ. Die spiralförmigen Sporenfäden teilen sich nur sehr langsam unter Freigabe der Sporen und teilen sich ausserdem häufig nur teilweise, wobei dann Verkettungen von einigen Sporen freigesetzt werden, die die Form eines mehr oder weniger vollständigen Kranzes beibehalten. Mikroskopische Prüfungen haben eine Identische Organisation des Sporenteils auf Agar nach Bennett, Agar mit Hafer und mit Tomate nach Pridham und Glucose-Asparagin-Agar gezeigt.

Die ZUchtungscharaktsrlstlken und die biochemischen Eigenschaften des S» hygroscopicus DS 9 751 sind in der folgenden Tabelle IV angegeben. Es sind diejenigen von Kulturen« die ein gutes Entwicklungsstadium erreicht haben und etwa ein Alter von 3 bis 4 Wochen bei 26⁹C haben.. Diese Charakteristiken wurden auf üblicherweise zur Bestimmung der morphologischen Charakteristiken von Stämmen von Streptomyoes verwendeten Nähragar und Bouillons bestimmt, wobei die Kulturen auf Agarmedien auf Schrägagar durchgeführt wurden ο Eine ge-

909838/1537

^: . 1S0755B

wisse Anzahl der verwendeten Züchtungsmedien wurde nach den Rezepturen hergestellt, die in "The Actlnomycetes" (S.A. WAKSHAN, Seite 193-197» CJironlea Botanlca Company, Walthasi, Mass., U.S.A., 1950) angegeben sind. In diesem Falle sind die Medien durch den Buchstaben W₉ dem die Münster folgt, die ihnen in *The Actlnoayeetts" gegeben wurde, bezeichnet. Di· Llteraturstellen für die anderen Züchtungemedien oder die Zusammensetzungen derselben sind die folgenden«

JONES Anm. A* K.I».XWHÄ - Journal of Bacteriology, j|£, 142, (1949)

Anm. Bt Rezeptur W-23» versetzt mit 2 % Agar Anm. Cj "Hiekey and Tresner⁸ß Agar" - T.G. PRXDHAM u. Mitarb. _a Antibiotics Annual, 1956 - 1957» Seite 950

Anm. Di "Yeast Extraot Agar" - T.O. PRIDHAM u. Mitarb., Antibiotics Annual,Ί956-1957* Seite 950

Anm. Si "Tomato Paste Oatmeal Agar" ~ T.O. PRIDHAM u. Mitarb,, Antibiotics Annual, 1956-1957» Seite 950

Anm. Fs W.E. ORUNDY u. Mitarb. - Antibiotics and Chem., 2, 401 (1952)

Anm. Qs 0,5 % Pepton - 0,3 % Fleischextrakt - 0,5 % Tyrosin -2 % Agar

Anm« H: "Melanin formation medium" - The Aotinomyoetea,

Band 2, Seite 333» Nr. 42 -S.A. WAKSMAN, The Williams and Wiiklna Company, Baltimore, (I96I)

Anm. I: W.E, ORUNDY u. Mitarb. <° Antibiotics and Chem.,

JL/310 (1951)

- ■

Anm. J; "Inorganic Salts - Starch Agar" - 'S.Q. PRIDHAM

u. Mitarb., Antibiottos Annual, 1956°1957, Seite 951

Anm. Ki entspricht der Rezeptur W»1, wobei 30 g Saccharose durch 15g Glucose ©raetst sind

Anm. L: entspricht der Rezeptur W~1, wobei 30 g Saccharose durch 15 g Glycerin ersetzt sind

909838/1537

Anm. Ht ¹¹PIaIn Gelatin" - hergestellt nach den Angaben von "Manual of Methode for Pure Culture Study of Bacteria¹¹ dar Society of American Bacteriologists, Geneva, M.Y., 1I₅₀ - 18

Ann. N: "Synthetic medium of DXMMIGK" - (nicht mit Agar

versetzt) - "Manual of Methode for Pure Culture Study . of Bacteria" der Society of American Bacteriologists» Geneva» N.Y., H₅₀ -19

Ama« Oi Entspricht der Rezeptur W-18, wobei die Saccharose weggelassen und durch kleine Filterpapierstreifen, die teilweise in die Flüssigkeit eintauchen« ersetzt ist

Anm. Pf Handelsübliches Magermilohpylver,, nach den Angaben des Herstellers zubereitet

Ana. Qi PUr die Untersuchung der Produktion von HgS von .

H.D. TRESNER und F. DANGA _s Journal of Bacteriology« Z§# 2J9-244 {1958)ρ angegebenes Medium

90 98 3 8/1537

Tabelle IV

Kulturmedium	Bntwicklungs-	Vegetatives	Luft -ausgese taster	Lönliehe.	Beobachtungen
Ο)	.grad	Myoel oder	Teil (urafasst CIe-	Pigment	und bioehesBi-
	(S)	Unterseite	sän&tieit von Luft-	T5)	seäe Bigsfi-
		der Kultur	eue^esetst^ii St^r-		sehaftesi
		O)	*csl rnia* Sporula-**		(6)
			tion) (k\
Agar nach
Bennett
(Anm. A)	gut	dick und ge	weiesllch bis	hell	Sporophoren«
		faltet , grau-	hellgrau und	gelb-	teil in ?rau-_r
		liohgelb;	dunkelgraug	braun	btnforimt Spo·
		gelbbraune	s@h? tsüesig ent		r^pti orenJiKden
		Unterseite	wickelt		enden in dloh-
					ten Spiralen
					ait 1 bis 5
					iff indungea ^
Agar nach	gut	diek und ge	Orlttlieh-^Mlees' '
Enereön		faltet» grün«
(Ann. B)		liehgelfes	t0&Q&@lfe
		. Unterseil®			CD
		gelbbraun.			CD
Agar nach	gut ■.. ,,,	dick und ge	"'«w'iea3,ieb Mi ■		■ ■ '■' ■ . U-i
Hickev und		faltet. MIl-	'gy^al4©Bs«=^@lss8^:		' ■ /T\
Treßner		gelbbraunf	*fen '■' "P 1·^ S%**	lieft";	*KJJ*
(Anm. C)		!selige Ibteras-
		i&@ ü5i6er®©i— ,fc@:· ; ' , ■ ' ··'.■,■■

	(2)	(3)	•	sehr hellgreu	(5)	(6);
Agar mit	sehr gut ,	Gelbbraune		lich ble mittel»	gelb
Hefeextrakt		Untere«ite		grau und dunkeX-	braun
nach				grau mit einigen
Pridham			dunkelka-	sehr kleinen
(Anm. D)			stanien-	schwarzen Stellen,
			' braune	die für das .Aus
			Unter-	sehen von "Hygroe-
			. seit®	eopicus* charätk-
				teristiseh sindι
				ssiewlloh gut ent«
				wickelt
				Welssiich bis
Agar mit	sehr gut	dünkelgelb		hellgrau und üitn-	ziem	Sporesiteil
Hafer und		braune Un		kelgraus gut ent»	lich	in Trmmn--' : ^,
mit Toiaa-		terseite		wickelt	dunkel	formg Bp&" °&
te nach			gelb	renfiden ®n~ ■.
Pridham			braun	den in di@h- '
, (Ansn. E)				ten Spiral®^
		Weiss-gräulich		fliit 1 bis 5 Windungfeia
Agar mit	sehr gut	bis hellgrau und	br&un
Hafer		sehr dunkelgrau
nach		mit einigen klei
Carvajal		nen schwarzen'Stel
(Anra, P)		len, die charakte
		ristisch für das
		Aussehen von "Hy-		ι—^ ' "W
		groscopicus" sind$		CJ T" ·.
		sehr gut enttrik-		CTi
		kelf · '		cn
			CD

(1)	*	Agar ait	(2)	(5)	^Γ _m	(5)	(6)
Glucose-	Tyrosin	gut.	Hellgelb«	W«i8slich\| in	hell-
Pe pt on-	(Ana«, G)		braune	Fora von Spu	grSu-
Agar ,	Tyrosin-		Untersei	ren	lich-
(W-7)	Hefeextrakt-		te		gelb-
	Agar				braun
Nühragar	formation		Miteeig ent	Weissllohi in	keines
(W-5)	«ed ium" naeh Waksaan)	sehr	wickelt«	Fora von Spu
	■ jypiir Biit	massig	hellgelb-	ren
	,.O&l^i»-		Hohl Unter
salat nach		seite gelb			•
'Kralnakar (Mmο %)■	nSssig	hellgelb	Weiealiohg aiit-	eenr	keine Lösliöh»
	lieh; gelb	telmMssig ent	schwach	saohung von fy-
	liehe Unter seite	wickelt '	gelMio»
massig	organge-	grüulieh-weiesf	violett«	Siiöung voa Me
	braune Un	in Form von	braun $	lanins negativ
	terseite	Spuren	keine	(di« Ablesimgta
				erfolgten ο*βη
			sung äee	den' Angaben ''
			MediuKS. .	■ä@s.Autors)
mittei-	hellbräun-	■_mimluhMm
missig	lichselbe	heiigrisalishi '
	Unterseite	Si^S@ig ©Ώδ« ;
		wickelt	■- .'	*■ ■ ' "■■* 1 , . . ■ ■ . ■■·■;■ b^;·'.':**

OO Ca) CO

ω;	(2)	O)	welsslisü bis , duß&elgpasi mit	C55 ' -	(6)
Agar mit Ovalbuwin (V-12)	faiesig	gelbe Unter seite	kleinen eehwar-	tiell«
			.aehr'li®!! grlis» liohbi© raittel- grais rait einigen SI® ftlF das to§-
QliKsose- Asparagin- Agar CW-2)	gut	gelbe Unter seite	t^ristiscls sind? siaialieh gut ent= ,wiekelt ■		Sporenteil in Trauben form ί eaäon in Spi- r&len «sit 1 bis 5 Windun-
			weisslieh bis grau5
. Glycerin- A&paragin- Agar (W-3)	gut	hellgelb braune Un terseite	sehr gelb-	CD I O ^ CTi 1 CTi CD

(1)

(2)

StSrke-Hitrat-

.-10)

Agar mit Stttrke »aeh
Pridhaa

Synthetischer Agar
nach

Czapek mit Saccharose (W-1)

Synthe-\ tiseher Agar »ach Csapek mit

(tew. K)

tleeher naeh

p pit QXfserin

nMeeig

ziemlich gut

siealieh

gut

hellgelbe Unterseite

gelbbraune Unterseite

lichgelbe IMterseite

hellgelb-' brmme IM-.' i

welsslleh g&t

einigesi hell™ grauen "

wickelt

graulich-weiss bis hellgrau und dunkelgrau%

massig eratwik> 3t

weisslieh

schwach
gelbbraun

yy von
Stftrkes positiv

(D	(2)	(3)	weieslioh; spür-;	■	(5)	• ;	*	S@r @sil,"äii^'isa@ä'
Züchtung	ziemlich	Ziemlich gut	lieh entwickelt		k«in«e
auf Kar	gut	entwickelt%		gr£ulieh-wels@§
toffeln	•	eohwüeh grSai-.		sehr spirlich
		liehbeige		entwickelt
		hie «ehr heil-	keiner
Reine Ge	mittel-'	wei&eliche Kul«			keines:
latine	massig	tür mit der
ait 12 £		Tendenz« eich		keiner
(Anm. H)		in der verflüs
		sigten Gelati
		ne su aedimeaa-
	_m	tieren			.ItotmwaehuiME '
Glucose-	mittel-	weissliehe Ko	-	keiiiea	von MiferÄfesias
Nitrat-	ffiäSElg	lonien an der
Bouillon		Oberfläche '
nach	* ' I
Dimralek	(I			CD A
{Anm. N)				cn *
Bouillon	massig	flockige EwI-*	k©S,s©a	cn
nach		tür» sedimen-		CTj
Czapek		tiert weise
mit		lieh
Saccharose
(W-18)

co O CD CQ «A> CO

(Ti

(1)

Bouillon nach Czapek nit Cellulose (Anm.Q)

Magermilch

a) 25^fflC

yr'x

zui?

(2)

massig

gut

spärlich

gräuliche Kolonien a» ümr

gut enfcwickel-Ring ρ

schlecht mnfc-' wickelten Ring« orangebrauis

(4)

gr&ilich* auf

sish ass

mid isyf dem in die
eintauchenden Papier befin» äen

keiner oder sehr schwache.

Sparen»

von ,Spi-

(5)

keines

- pH geht β,3 auf 7*0 in I₁ Hm&t '

* die mit

, auf

s 2U--

densporu«

ofu !.Ationhell·

schwaehsind

En-Mikrosko«

dee Spo» nach HlQkey

den und Ätera@88iing®a ;νβη-. ©,5 Ms O «7/1 bis piaoha Psüfusigsn hmb^n ©iti@ identische rente ils auf Ägai" saife @tMi»R® nach Fridhem und imtS Treancr gesaigt.

Unter äen 8pe©i©e, de^en Beschreibung In "Bergey⁰s Manual of Deterainative Bactei?lologyⁿ (?_e Auflage, The Williams and Wilkine Company, Baltiosor·, 1961} oder in "The Actinomyeetes* (XI, S.A. WAKSMAN, Th® Williams and Wilkins Company, Baltl*. enor«» I96I) erfolgt ist, ist die Species, der eich dieser am netsten nShort« S. aburaviensie, der« wie er, kein Melanin mit os^e&ieolMin Medien erzeugt, ein weisses bis hellgraues Luft-aiftsgesetst«® Myoei aufweist und gerade Sporophoren bildet

909838/153

und dees*» vegetatives Mycel auf "Sacoh&rose-Iiitrat-Agar" gelbliohbraun ist. Er ist jedoch mit diesem nicht identisch, da man bei Bezugnahme auf die Beschreibung von S. aburaviensis in "The Actinorayeates" (Seite 166) ersieht, dass S.ahuraviensis, obgleich ein® gewisse Anzahl der von den beiden StSasen geseigten Charakteristiken identisch ist, ein gräulich-olives Wachstum auf Gluoose-Asparagin°Agar und ein blassolives Wachstum auf Kartoffeln ergibt, während S. alboeinereseens DS 21 647 auf Glucose-Asparagin«Agar ©in gelbes Wachstum und auf Kartoffeln ein Wachstuia ergibt , dessen Färbung von schwach bräunliehgelhgrau nash sehr helibräunlich geht. Es sei bemerkt, dass keine grUnliehe oder olive Färbung des vegetativen Myeels von S. albocineresoens DS 21 6kf beobachtet werden konnte. Das vegetative föycel hat stets Färbungen in Tunungen₀ die von hellgelb oder braungelb bis zu gelbbraun gehen, geneigt. Andererseits liefert S. aburaviensis auf Gelatine kein lösliches Pigment, während S. albocineresoens DS 21 64? ein hellgelbes- lösliches Pigment produziert. Ausserdein verwertet S. aburaviensis weder Lactose noch Saccharose und verwertet ausserdeia Inulin* während S. ftlbocinerescens DS St 647 L&etos© und Saccharose verwertet und Inulin nicht verwertet.

In der nachfolgenden Tabelle V sind die ZUohtungscharakteristiken und die biochemischen Eigenechaften von S. albocinerescens DS 21 647 angegeben, die unter den gleichen Bedingungen wie diejenigen des Stammes S. hygroscopicus DS 9 751 beobachtet wurden. Die verwendeten Medien sind die gleichen und sind mit den gleichen Hinweisen bezeichnet.

909838/ 1 537

Tab·! le

CD O CO OO

Kulturmedium	Entwicklungs	gut	Vegetatives	Luft-ausgesetzter	Löalichee	Beobachtungen	CD« cd7
(D	grad		Myeel oder	Teil .(umfasst Ge	Pigment	und biochemi
	,, .		Unterseite	samtheit von Luft-	(5)	sche Eigen	cn
		gut	der Kultur	ausgesetztem My-		schaften
Agar nach			0)	cel und Sporula- *tion) ()**	sehr hell	(6)	cb
Bennett		dick und ge	weissliohs spär	gelbbraun
(Anm. A)		faltet, gelb	lich entwickelt
Agar nach	gut			hellgelb-
Emerson		gut entwik-	weissliehs in	braun
(Anm. B)		keltg gelb	Form von Spuren
		bis hell
Agar nach		braungelb
Hiekey				gelbbraun
und		sehr gut ent	gräulioh-weissε		lange gerade
Tresner	gut	wickelt; grau-	sehr spärlich		oder schwach ge
(Annio C)		llchgelb-	entwickelt		bogene Sporo-
		braun; gelb			phoren
		braune Unter
Agar mit		seite		gelbbraun
Hefeextrakt	gut	dick und ge	weissliohs sehr
nach		faltet? gelb	massig entwlk-
Pridham			kelt
(Anm. D)
Agar mit				gelbbraun
Hafer und	dick und ge	weisellchs in
Tomate	faltet, gelb	Form von Spuren
nach ■	braun
Pridham >'C Anm „. E)

(D

(Ti U)

Agar mit	gut
Hafer
nach Carvajal
(Anro. P)
Glucose-	gut
Pepton-
Agar
(W-7)
NShr-Agar	mäßßig
(W-5)
Agar mit	mittel
Tyrosin	massig
(Anm. Q)
Tyrosin-	mittel
Hefeextrakt-	massig
Agar ΓMelanin
formation
medium*
nach
Wttksman
(Anna. H)
Agar mit	massig
Calcium-
malat
nach
Krainsky
(Anm. I) '

(2)

(3)

dick und gefaltet, gelb bis gelbbraun

dick und gefaltet„ braungelb

hellgelblich

briunllchgelb

orangebraune Unterseite

gräulichgelb

gräulich-weiss% spärlich entwickelt

weIsslieh; in Form von Spuren

keiner

gräulich-weiss % sehr spärlich entMickeIt

hellgrllullch;, ziemlich spärlich entwlkkelt

keiner oder weisslich, In Form von Spuren

(5)

gelbbraun

braungelb

keines

gelbbräun

orangebraun; keine Schwärzung des Mediums

schwach gräulichgelb

(6)

teilweise LUsiichmachung yon Tyrosin

Bildung von Melanin: negativ (die Ablesungen erfolgten nach den Angaben des Autors)

gute Löslich· maohung von Malat

O CiD CD

(D	(2)	(3)	{*)	(5)	(6)
Agar mit Ovalbu« min (W-12)	eehr spMr- lieh	spärlich ent- _a wickelt? schwach gelbliehgraü	keiner	keines
Glueose- Asparagin- Agar (W-2)	sleifilich gut	g@lb	weiisslieht Kieüiieh gut . entwickelt	h@l IgT¹Iu- lichg©;lb
Glyeerin- Asparagin- (W-J)	EBlttei- »Issig	gelb	weiseliehs in Fora voia Spu ren	hellgelb
StSrke« Nitrat- Agar (W-10)	mSssig	braungelb	keiner ©der grauIich~ weiss_s in Form von Spuren	hellgelb braun	-Hydrolyse v©n ■ Stirkei positiv
Agar »it Stärke nach Pridh&m (Ansa. J)	gut	gelb bis hei1braun- geIbι gelbe Unterseite	sehr hell- gräulichi sehr mgseig entwickelt	schwach bräunlich- gelb	Hydrolyse von Starkes Positivs lan ge gerade oder schwach gebo gene Sporopho- ren
					CD . CD ■<! ' cn JJ cn ^* CD ·

CD

CD OO

CTt

(ί) .	(a)	O)	(*)	(5)	(6j	» CO-
. Synthe tischer Agar naeh Czapek mit Saccharose -(W-I)	gut	braungelb$ gut entwik- k«£&§ Heiigasng gur Hieateil-				ί CTi. - "" ' . ■.. ' ■ 'CTl „' ^:. .'■■- '■■, ' '. ■■ cn.
Synthe- Agar nmte Czapek mit	gut	braungelb! gut entwik- kelts Neigung	gräulich- «reise ι sehr spärlieh eat-	gelbbräun
(Anm. K)
Synthe tischer Agar nach Czapek Kit	gut	'\gut entwik- '!keit; Meigisng 'zur Eissbl1- dung -'	In Fqsw v®a Spur@n	gelbbraun*
(Anm» L)				■ ■ '^; ■■ '■' ■' ■
				t ■ ■ ■ '

S-'

CD	(2)	O)	keiner	keines oder schwach grKulieh- braun	(6)
ti Kultur auf Kartoffeln (W-27)	gut	sehr gut ent wickelt, dick und gefaltet; braungelb bis gelbbraun	keiner	hellgelb; langsame Produktion
Reine Ge latine mit 120 (Ann. M)	mSssijg	flockige weiss- liehe Kultur» die in die Gela tine eindringt	keiner	keines	VerflUsei- ung von Ge latine: ziemlich rasch
Glucose» Nitrat- Bouillon nach . Dimmlck {Anm. Ki)	massig (ι	kleine graulieh- welase bis hell gelblich-graue . Kolonien an der Oberfläche	keiner	blassgelb	H4trit-H@ak- tioüs positiv
Bouillon nach Czapek mit Saccharose (W-18)	raittel·- mässlg	gelblicher Schleier	I		Mit.rit-iiaak- tions positiv
Bouillon nach Csapek mit Cellulose (Annio Ö)	keine Ent- wicklung			Verwertung von dellu- - loses negativ I I

cn ■cn

OD (U)

(D	(2)	O)	(*)	(5)	(6)
Mager milch (Anm. P) a) 25*C	gut	hellgrSUalieh« gelber Hing	keiner		ohne XoafpiaeM** tion, ©egäa- nend naeh 'S Mo- Qhen, vollst^»·=» dig in 1 Honäti pH von 6,3 nach 7»0 in 1 Monat gehend
b) 37^eC	sehr mäa» aig	einige hell braungelbe Kolonien an der Oberflä che	keiner »		Koagulation ' mit folgender Peptoaieationg keine sasrkilsfe© Kndenmg des pH-Wejpts in 1 Monat
Agar nach t^esner und Dsnga S£ur Uhtersu-* . eSsurase ύ&ν-	gut	heilgelb- braim	keiner	braungelb
von Hg§			.' . ' < ' ' , ' ,		190^r
• ■ ■■ .	■■'-ν '"■ ■■'■ ' ■' ,^:				cn ^u '. . ■ ' . . ■■ ''.cn ■ ν

pie ChÄrakterlstikrri die ύ®τ> toifct© Mikroorganismus aufweist, •rinnern «η die Sp@s£@s -StTeptomyces" rossochromogenee (JENSEN) VMBBiMI. und*'HENRiCX₀ ssa denen.er nur wsnig bedeutende Unter- «ofciede 'ettftieiefe t, vea deaera' $®r Häuptunfceraohled-in einer Ver-

esasietffli&l eaf Medien« filr ehrl@lj®ii ist_s überhaupt

eliaft.isfc ö©r Brrnid* w^nsm dieser

976 bildet

tmd rollen eleh sn Ihrem Spiralen zu·

Auf ä@n 83?safeliefei©@lse?i litsraa©ii©ia. entwickelt S. g®n«a, v&r« oseltfisss? Sfem© DS 12 976 allgOTäsisa ©in gelbes v©g«t&t5Lves Myeel ®ηά erseisgfe lösliche. Pigmenfc® von gelber hellgelbliohtr F@,rb@_e Auf dan organisehsn HMhrmedien ist vegetativem Mjf6@l Sunkl©? und niiwt Färbungen an, die von hie amikalbv&vm gehen und sogar schwMrzlichbraun in gewissen FSLllen ©Freichen» Auf diesen Meüien erzeugt er ssehs⁵ oder'.weniger dunkle braune l$eliehs Pigmente« und er bildet ein ßshwarzes Helaninpignsent auf ge®ignetorn Medium mit Tyrosin. Die Farbe seines sporulierten Luft^ausgesetzten Mycelfi let rosa, doch bildet sich die Sporulation, wie bereits ausgeführt wurde_e nur in ausserordentlich langsamer Weise» wobei eie erst nach mehr als 1-monatig©r Kultur beginnt. Die Medien» die ere^glichten« unter optimalen Bedingungen eine Sporulation zu erreichen» sind ftedien auf der Basis von Stärke mid einem Aseioniumsalg» wie beispielsweise Agar mit Stärke nach PRXBHAM ©der Agar mit Stärke nach ßHUNDY» und es ist un- t®v den üblichen Züchtungsbedingungen eine etwa 2-monatige

909838/15 37

-52- ■■■;;; T90755S

Inkubation btl 2ö*C erforderlich* um zu sehen« Luft-ausgeeetzte My eel auf diesen Hedisn ein® gräulich VOBtL Färbung annimmt, die einen merklichen ©rad von lation zeigt.

Ιώ dft» nachfolgenden Tabelle fI Bind die ristiken und die biochemischen Eigen'ec5haffc©n v©n S chromogeneaevar.ösojltansj! angegebsn, die uater den Bedingungen «ie diejenigen des Stammes B · St^gros@opi@u® 9731 beobaohtet wurden: Die verwendeten Mediea aind 1®^aIl gemeinen die gleichen und tragen die gleichen

Die Hinweise auf die oder die Bestandteile des*^ anderen" tung6m@dien sind die folgenden:

Anis« Rs entspricht der Rezeptur W-18« wobei ^ g

dureh 15 g Glucose ersetzt sind Annio Sj "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria"

Society of American Bacteriologists, Geneva,;'.H·Ϋ·.'

909838/153 7

C=öP

& :_ .„ _

c=3

St"

ca

₃ β @ IS

C3

3 C3

α Sj es <s5

Π (3c=t © Cl gf ©<?3

srf

0 S3

CD.<

&

Pa

θ -m

O ε=3

0 0-, Ö

QiS=J₁S © I^ S>

äog fs £3 &>. ■ DO eg a © Jg ©

g es - (§ ® _«■ föis uag^ δ tS'rf "5=3

«a

«53-O

ca
rf
q

■ si

■ew.gp
© p.

es £

«5=3 "5=3 SU

<δ^ c=3

affl _ © © ο

0 ■ δ &3

3Ü © ©

β. θ

(7=3 .

0, δ§

■®. mm

3 Q fö

■ö

■es

g'Ö-9 8 38/ 1 S3 7

es

$9

■■&

S3

89 Q

M ® Si^;

Θ·

SS

»β

uns.

«8 i

ms

/ 1 ζ 2 "7

(D	sehr mgeaig	D)	(*)	(5)	4	hellorftßge- gelb	(6)	' ' ' . '	•	•	oval« Sporen mit Abnefisujä- g«n von O,3 bi© 0,4/0,6 bis 0,8 μ; lang· Spore»» füdesi. die iss 1 oder 2 Win- düngen endenj gute Hydroly» ee von StMrke
Agar nit Oval« bunin (M-12)	slesilieh gut	lebhaft gelb	keiner	blaaeselb	wenig Ißten» 8iv briuis» lieh	1907556
Glueoee- Asparagin- Agar (W-2)	ziemlich gut	gelb
Glycerin- Aeparagln- Agar (W-2)	massig	orange* gelb bis ' rötlieh» orange	keiner oäer welasIJch_f ία FOr¹EJ von ' sahwaehen • Spuren
Stärke- Mineral- salz- Agar nach Pridham (Anm.J)	■	gelb bis briunlieh» gelb	^@i£sli«shg eiässig ent wickelt; nimmt ■' sehr sugersid eine hellgrau- lichrosa Fär bung ans wenn die Spekulation erfolgt

do O CD OO

O)	(2)	O)	' I ■' ' ' ι' ■ " ; ' , '	<♦>■	(5)	■	(6)
Agar	massig	gelblich	Weises rnSssig	keines
mit			entwickelt!
Stärke			nimmt sehr zö
nach			gernd eine
GRUNDY			hellgräulich-
(Anm» I)			rosa Färbung
			an« wenn, die
			Spopulation
			erfolgt
Stärke-	massig	ungefärbt	keiner	keines	Hydrolyse
Nitrat -		bis gelb		oder sehr	von Stfirke;
Agar		lich; sehr		schwach	schwach und
(W-10)		!Bissig ent		gelblich
> , ff		wickelt
Synthe	gut	hellforKunlich-	keiner	schwach
tischer		gelb		grXulioh-
Agar				gelöbraun
nach
Czapek
mit
Saccharose
Synthe	gpt ,;''■"■	ί^;· Wb'',.:■/■■■■."'	, 'keiner ■' ' . '.■■ .'	schwach	■ ' ■ '*
tischer			■' ' ■ ■ ■	braungvlb	I
Agar			■■■.:''..■ ' '■ ^! ' ■ ' ,	*'■'■■'■ ' ■'", '■■ (j[ ,**
nach
Czapek ■				. CQ ¹ ' '■.■ ■'' ■ CD '
Bit
Glucose		■ ■		' ',"■''"'■ ^:" ' ' '^Cn'' ■ ■■
(Änm. K)		■■'.'■■•■'ι¹ .:■'■■ ..:■	■ ^;i'^i;;■■■■.-..' '."■:■ '■■ :ρ7-:'.

(3)

hellbritunlichgrau

gelblioher Schleier

gelbliche flockige Kultur

(4)

keiner

(5)

gräulichgelbbraun

Q blasegelb, Sienlieh zögernd

keines

(6)

von

Hitriteni positiv

Heduktion von Hitraten m Nitriten: positiv

Verwertung

der Celluloses negativ

CD O

CD ·

S)

Kultur auf Kartoffeln

(2)

massig

gut

mitteltüMssig

(3)

gelblicher Ring

echwärzliehbrauni dick und gefaltet $ eehr gut entwickelt

bräunlichgpau

schwarz

keiner

weisslieh} in Form von Spuren

keiner

(5)

brütmllch

bräunlichschwarz; reichlich

schwärzlich« brauns . reichlich

echwars;

su Begimi
der Züchtung tg®°>
bildet

(6)

Reduktion von Nitraten zu Nitriten: negativ

Verflüssigung der Oelatine: positiv, jedoch langsame erst nach Ende von 1 Monat Züchtung beginnend

.'■■.■ '. Produktion von ^;HmS: stiirk p®» sftiv

Pvptonieatioa ohne Komgulationi ü geht ν©© 6„2

CTi CTi (JD

Mi sas*

«1«

ΙΛ

43 4

60

«a

909838/1 S3 .-7

Aus der Prüfung der von. den Stamm Streptomyoes DS 12 976 gezeigten Charakteristiken folgt, dass dieser der Species S · roseochromogenes (Jensen) Waksman und Henrlol sehr ähnlich ist, deren Beschreibung in "The Aotinomycetes", Band 2» Seite 268 (S.A. WAKSMAN, The Williams and Wilins Company, 1961) gegeben 1st. Beim Vergleich mit der Gesamtheit der in diesem Werk beschriebenen Species lat es diejenige Species, mit der er die grusste Analogie zeigte und es e&isties»« zwischen diesen beiden Stämaen so beträchtliche/gemeinsame"Merk-" male und so geringe Unterschiede, dass si® -.nloht als sieit©^ schieden® Species angesehen werden können... . V

W Wie S. roseoohromogenes (Jensen) Wakünan und iteri der Stamm Streptomyoes DS 12 976 zu der Gruppe von die M@I@siisipigmente bilden« Sein Luft-ausgesststes nimmt eine rosa Färbung an, wenn es tionsgrad erreicht, und seine

Enden. Sein vegetatives Mycel weist blasegelb bis dunkelbraun gehen,

er sich entwickelt, υηά al® von ihm ment®« d&@ auf synthetischen

werdest auf den organischen

sehwitaiichbraun. Er bildet ©in

auf Kartoffeln, ein dunkelbraunes lösliches Pigment auf: . latine, die sich lengsam, Jedoch in"' ußswelfelhafter^ Weise " flüssigt, peptonlsiert die Milch, ohne si® zn .k@aguii@?e^ hydrolisisrt stärke, erzeugt HgS wiu reduziert Nitrate_p bei dies® letztere Eigenschaft jedoch nur a«f ägß sehen Medien positiv ist.

Die zwischen den beiden Stämmen nachg@wi®@©o@n sind gering. Einerseits bildet S* roseochromogenes Waksman and Henrlcl manchmal Sporenfäden, die nu.3 oder 5 auf ein und demselben 0s°undfaden gruppiert minus und gibt so ä&s Bild von Besen oder Quirlen; die Sporenfäden des·

9098 38/ 1 537

mes DS 12 976 sind Üblicherweise isoliert angeordnet, wobei man höchstens manohmal die Vereinigung von 2 Sporenfäden auf ein und demselben Grundfaden antrifft. Ausserdem ergibt S. roseoehroiaogenes (Jensen)Waksman und Henricl auf synthetischem Agar nach Czapek mit Saccharose ein ungefärbtes bis blassgelbes vegetatives Mycel und auf Nähr-Agar ein gräulichgelbes vegetatives Mycel, das anschliessend braunrot wird, und bildet auf synthetischem Agar nach Czapek mit Saccharose, auf Glucose-Asparagin-Agar und auf Nähr=» A gar ein rosa Luftausgesetztes Mycelj der Stamm Streptomyees DS 12 976 gibt auf synthetischem Agar nach Czapek mit Saccharose ein vege» tatives Mycel, das viel stärker entwickelt ist und rasch eine bräunllohgelbe Färbung zeigt} auf Nähr«Agar bleibt sein vegetatives Mycel gräulichgelbbraun, ohne anschllessend braunrot zu werden, und er bildet Insbesondere auf synthetischem Agar nach Czapek mit Saccharose, Äsparagln-Agar und Nähr-Agar kein Luft-ausgesetztes Mycelο Man führt diese letztere Tatsache auf die besondere Langsamkeit zurück, die er allgemein zunächst bei der Produktion des Luft-ausgesetzten Mycels auf der Gesamtheit seiher ZUchtungsmedlen und anschllessend bei der Entwicklung seiner Sporulation auf dem Luft-ausgesetzten Mycel« wenn dieses einmal entwickelt 1st, zeigt. Dieser Unterschied kann jedoch nicht als Species-Differenzierungekriterium angesehen werden« da das sporulierte Luft-ausgesetzte Mycel, wenn es auf den Medien und unter den Bedingungen, bei denen es erhalten werden kann, beobachtet werden kann, die rosa Farbe desjenigen von S. roseoehroraogenes aufweist«, Es 1st dies jedoch die bedeutendste Eigenart, durch die sich d@r das Antibioticum 18 β51 R₉P. erzeugende Stamm von S. roseochrosnogenes (Jensen) Waksman und Henrlci unterscheidet, und es ist dies der Grund, weshalb @r als ein© besondere Varietät dieses Stam= mes angesehen werden muss und mit ^wStreptoiaye©s roseochroroogenes, vaxv oscitans, Stamm DS 12 976 bezeichnet wird ο

1907558

Die Fähigkeit von Streptomyeea hygroscopicusDS 9 751» Streptomyces alboclnerescens DS 21 647 und Streptomyees roseochromogenes, var. oscitans, verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zur Gewährleistung ihrer Entwicklung zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode von Pridham und Gottlieb (J. of Bact. ^6, 107-114, 1948) bestümnt. Der Entwicklungsgrad wurde nach einer geeigneten Inkubationszeit bei 26°C auf dem von diesen Autoren angegebenen Grund» medium bestimmt« wobei die Glucose durch di@ verschiedenen Jeweilig untersuchten Kohlenstoffquellen od@r das (NH^)gSQ^ durch die verschiedenen jeweilig untersuchten Stickstoff-Quellen ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in d@n folgenden Tabellen VIX und VIII zusammengestellt.

IS$7

Tabelle VII

Geprüfte Kohlen-

έ. hygroscopicus

positiv

negativ

positiv

negativ

positiv

negativ

positiv

Verwertung durch

negativ

S. roseoohroiiogen··

oseitane

S15 OjTI OJue X ΙβΠ

DS 9 751

positiv

gering und langsam

negativ

var.

aber langsam

positiv

D-Ribose

positiv

negativ

positiv

D-Xylose

positiv

negativ

L-Arablnose

positiv

L-Rhanmose

positiv

negativ

positiv

D-GlUGOße

positiv

negativ

positiv

D-ßalactose

negativ

positiv

D-Fructose

positiv

negativ

D-Mannose

L-Sorbose

positiv

CD

Lactose

negativ

positiv

O

Maltose

, positiv

CD

Saccharose

negativ

positiv

OO

Trehaiose

positiv

OO

Cellobiose

negativ

positiv

OO

Raffinesse

positiv

Dextrin

positiv

er

Inulin

positiv

Starke

negativ

positiv

Glykogen

negativ

positiv

negativ

Glycerin

negativ

negativ

Erythrit

negativ

negativ

Adonit

negativ

Dulcit

negatli?

positiv

negativ

D-Mannit

D-Sorbit

positiv

inosit

S. albocinerescens

DS 21 647

pesiti^

positiv

(JD CD

Tabelle VIII

co ο «ο OD t*> GO

Ca»

Geprüfte Stick

S. hygroscopicus

9 751

: ■

negativ

Verwertung durch

S» albocinerescens

21 647

S. roseoehronogene«

negativ

positiv

negativ

positiv

stoffquellen

BS

negativ

DS

var. osoltans

positiv

negativ

positiv

negativ

positiv

positiv ^§
: :.ί^: v-:-'-:^:':^::V"^;-;#

positiv

. ; ■ .."■ . " ■ ■ '■ ' ' ■ '

positiv

NaNO₂

positiv

negativ

positiv

negativ

positiv

(NH^)₂SO₄

positiv

(NH₁^)₂HPO₄

positiv

Uracll

positiv

Harnstoff

positiv

negativ

positiv

L-Aaparagin

positiv

QIykokoll

positiv

positiv aber langsam

positiv

Sarcosin

positiv

DL-AlanIn

positiv

OLrYaIIn

positiv

DL-Asparaginsäure

positiv

!,-Glutaminsäure

positiv

L-Arglnin

positiv

L-Ly8in

·■'■■'.'' '

positiv

negativ

DL-Serln

negativ

DL-Threonin

positiv

neegmfciv

DL-Methionin

positiv

Taurln

positiv

'; ' . , *

DL-Phenylalanin

positiv

' ' ^: ■'' '

L-Tyrosin

positiv

DL-Prolin

L-Htydrpxyprölin

; ·

cn CD

Fortsetzung Tabelle VIII

Oepriifte Sfeiekstoff- quellen	Verwertung durch	S. hygroseopleus DS 9 751	S. alboeinereaoens DS 21 647	S. roaeochroBOgenee var« osoItans
Betain Adenin Ädenosiß Glucosamin -^Histidin . L-Tryptophan	positiv	negativ	negativ positiv positiv positiv positiv positiv

CO

cn cn. CD

Das Verfahren zur Herstellung des Antibiotioums 18 631 R.P. besteht Im wesentlichen darin, Streptomyces hygroscoplcus , OS 9 751* Streptomyoes alboolnerescens DS 21 647 oder Streptomyces roeeochromogenes, var. osoitane auf einem geeigneten Medium . und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und an-Söhliessend das Im Verlaufe der Züchtung gebildete Antibioticum abzutrennen.

Die Züchtung des einen oder des anderen dieser Stämme kann nach jeder beliebigen aeroben Oberfl&chenzUohtungsmethode oder Submerszüchtungsmethode erfolgen» doch 1st diese letztere aus Gründen der Bequemlichkeit zu bevorzugen.

Man verwendet zu diesem Zweck die verschiedenen Apparaturtypen» die jetzt üblicherweise in der Technik der Fermentationen verwendet werden« Man kann insbesondere den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen!

Streptomyces hygrosaoplcus DS 9751 Streptomyc@s alboolnerescens DS 21 64?

oder

,■ var.-. oseitans

Stammansätζ

Kultur mit Agar Kultur iss Kolben unt@r Bewegung Itnpfkultur im Percenter Produktionskultur im Fermenter

■■ -*7 - "-. 19G7556

Das Ferraentatlonsroedium soll im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenetoff quelle und eine assimilierbare Stickstoff quelle, Mineralstoffe (insbesondere Chloride) und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Bestandteile in Fora von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen_p wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft« zugeführt werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoff quelle k&gm man Kohlehydrate, wie beispielsweise Gluoose, Saccharose, Lactose, Dextrine, Stärke, Melasse, oder andere Kohlenydratsubstanzen, wie beispielsweise Zuckeralkohole, z.B., Glycerin oder Mannit, oder gewisse organische Säuren, wie beispielsweiseMilchsäure, Citronensäure, Meinsäure und dergleichen„ verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche öle, wie beispielsweise Schmalzöl, Sojaöl oder Bauimrollsamenöl, können diese verschiedenen Kohlqhydratquellen mit Vorteil ersetzen oder ihnen beigefügt werden.

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind ausserordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise Hitrats, anorganic sohe und organische Ammoniumsalze, Harnstoff und Aminosäuren, seinο Sie können auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in protidiseher Form enthalten, zugeführt werden, wie beispielsweise in Form von Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysates Sojamehl, Arachlsmehlen, Fischmehlen, Fleischextrakten _t Hefeextrakten, Distiller's Solubles und Malsquellwasser.

Unter den zugefügten mineralischen Stoffen können gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphos-

909838/153 7

phate odes» Calcium- oder m uem zur Entwicklung des des Äistibiotieums erfordsrtietai beispielsweise die Alkalifate. Schließlich wirken als Aktivatoren der Es sind dies die

7,8,

kann

jedoch gefunden^ das

öios®.

In®-den vorstehenden

Produktion des Antibi©ti®«js 18 63 lQsm±n@n Bedingungen a®r scopiuus DS 9 751 β S. roseochromogenes, var. osöitaa© lsi variieren und jedem besonderen können.

Das Antibioticum 18 63I R.P. maischen nach verschiedenen Methoden

909838/1537

guagen «in betraOfrtl&eher Teil des Antlbiotieums in dem Filterkuchen, der ebenfalls sur Extraktion der Wirksubstans behandelt «erden muss*, Venn sieh das Antibioticum in des FiltPÄt äer Feneeatatienesaieohe befindet, so untersieht san diese LitS&ujsg einer Extraktion mit einem mit Wasser aiehtmlsehbaren lösungsmittel, wie beispielsweise einest allphatieehe» Alkohol Hit fc oder 5 Kohlenstoffatomen oder einem chlorierten. läufigem! ttel, wie beispielsweise Chloroform oder Methylenehlorld» oder auch einem Ester, insbesondere Kthylaoetat.

Es ist Jedoch zu bevorzugen« die ganze Fermentationsmalsche mit einem dieser Lösungsmittel zn extrahieren« Unter diesen Bedingungen kann die Extraktion bei einem pH-Wert zwischen Z und 7 durchgeführt wttMsn, Sa@ rohe Antibioticum wird durch Einengen d©s Extrakts unter vermindertsm Druck und

Das Antibioticum liegt im all&emim®n M LBmng, Im. dem Endkonzentrat in Wovm dar Säur©' wr. Die ÄusfSllung de®- rohen 18 6J1 E»P· wird dann durch Zugabe vom tetriummethy lat su dem

909838/1 S3 7

Das rohe Antibioticum 18 6j1 R.P. kam In. Form der oder des Natriumsalzes in einer ersten Stufe diarefo." Fixierung an lonenaustauscherharzen mit stark anionisctas Charakter und hoher Porosität, wie beispielsweise Uoitfey-Hars 1 X S im Chlor id zyklus, gereinigt werden, aus-"denes* es mit einem wässrig-alkoholischen Gemisch, das einen-Elektro lyten enthält," vorzugsweise· mit einem Üeminoh Wasser (80:20 Volumina) mit. einem Gehalt von 50 g. ehlorid je Liter, eluiert wird;

Nach Entfernung des Methanols unter wraindeps©® B?*aek. wirddas Antibioticum aus den Eluaten. suit ©inem-SBit-'tiassor·· nicht mischbaren Lösungsmittels vorzugsweise Shlorofoni oämr

* acetat, extrahiert. Das Antibioticum■ 18 63% HuP-in Form einer F©stsiabstanz diarefi humtillwog ®tt sehl@eht@o Lösungsmittel» w
Tetrachlorkohlenstoff _s oöer
führung in tert_;-Butariol erhalten,

ι ο

Die zweite Reinigungsstufe keea d^5?©li ehrosmfeograptsi© en einer Alumininamoxydß^l© ^csrgeaoiasn w®vumm_e bioticum aus einer Lösung in ein« tJg&iig polai»©Eä mittel, wie beispielsweise Kthylaeu&at_p fixi@g>fe mit. einem polaren Lbsungsmifctels in a®m es lS@ii©ta©'r lm%_s

Z-3&® beispielsweise Methanols eluiert wird« ^:

öux'eh
werden

©Q wit d©si

0 9 8- 2 i / 1 S % Ί

s@fol@ehten erfolgen.

_s ohne

besehrgstkeR

voss-

Kaiis -und

Eichasass mit 1000 in ^üg/coia flit* äie ohne, sie sfeets dwrch

ynter

als empfindIi-Probe von 1.8^s 63Ί R₁P, Aktivität istfür die festen Pro-

Beispiel 1

Xn einen 75

teile eins

eil© folgenden

Maiecpiellwasser (50 ^ Trocken

extrakt)

Saccharose CaleiiasBearbonat ÄiüiBoii£issssulfat

800 g

' 1£30 g

300 g

80 g

ad 35 1

Der iÄ!-Wert beträgt dann 6,10, Man sterilisiert das Medium durch ^0-minüfciges Durehleiten von Dampf von 122⁹C₀ Nach Abkühlen beträgt d&3 Volumen des Mediums 40 1 und sein pH-Wert 7*10. Man beimpft mit 200 -ecm'einer gerührten bzw.

909838/1 5.37

geschüttelten Erlenmeyer-Kultur von Streptomyces hygroscopicus DS 9 751 ο Die Kultur wird 48 Stunden unter Bewegen und unter Belüftung mit steriler Luft bei 2?*C entwickelt« Sie ist darm zur Beimpfung der Produktlonekultur geeignet«

Die Produktionskultür wird in einem JO ■1-Fermeater führtp der mit folgenden Substanzen«beschickt istg

Distiller's Solubles 750g

Dextrose 15Ö g

Sojaöl S25 ecm

Kobaltchlorid mit 6 H_g0 0,02 g

Wasser ad 15 1

ecm Nach Einstellung des pH-Werts mit 65ftsat 10n-Natronlaiige auf pH 8,6 setzt man 75 g Calciumcarbonat m« und sterili- · siert dann das Meditna bei 128³C während 40 Hinuten» H&oh Abkühlen beträgt das Volumen des Mediums 14 I₉ Es wird durch Zugabe von 1 1 einer wässrigen sterilen Lösung,, die 30 g Ammoniumsulfat enthält, auf 15 1 aufgefüllt« Der erhaltene pH-Wert beträgt 7,0.

Man beimpft dann mit 1 1 der oben beschriebenen Xmpfkultur aus dem 75 1-Fermenter. Die Züchtung wird bei 2J⁹G den lang unter Rühren mittels eines TurbinanrührerSs ä@r mit 24o U/min betrieben wird, und unter Belüften mit steri ler Luft in einer Menge von 1 nr/Stunde durchgeführt. Der pH^Wert der Maische beträgt dann 8_fi0 und sein Volumen 10,5 Ι» Die vorhandene Antibiotlcummeng© beträgt'-"9 /ag/eem·

909 8 3 8/1537

Beispiel 2

Man beschickt einen 170 l-Fermenter

Pepton (Cl" » 3,5"*} ' 1200 g

* Fleischextrakt (Cl* - 1 £} oCO g

Maisstärke 1200 g

Wasser ad 110 1

Der pH-Wert wird mit 95 ecm 1On«Natronlauge auf 7,0 eingestellt. Man sterilisiert das Medium dureh 40-mlnütige8 Durchleiten von Dampf von 122*0« Mach Abkühlen beträgt das Volumen des Mediums 120 1 und sein pH-Wert T₉Oc Man beimpft mit 200 ecm einer gerührten bsw, -geschüttelten Srlenraeyer-Kultur von Streptomyees albociBeresceras DS 21 647« Di@ 2üehtiang wird Bei 30®C SS Stunden crater Bs^e^n und sinter Belüftung mit

ist äam itar B@£s?pfun@ der

16 h

/4 P A F] 1 δ 3-7

. . - 5* - 13Ö755B

flan beimpft dann mit 4o I der oben beschriebenes® impftolfcw

aus dem 170 i-Fermenter. Die Züchtung wird bei ^o®c 71 Stm-

den lang unter Bewegen mittels eines Turbinenröhre'!»«; der mit 2βθ U/min betrieben wirt^tend unter Belüften nit tuffc in eine? Menge von 25 sr/Stunde vorgenommn Wert der Maische betrügt dann 7 #7 und ihr Votassess 410 Die vorhandene Antibtotiausmtenge betrigt

ist. Der pi auf 5 eingestellt. s@tat man 50 kg Filtrierhilfe zu und- fiifcrierfe

d P A CtI

ι δ 3-7

nit 5n-Salzsäure auf 3 ein. Das Bewegen wird 30 Minuten fortgesetzt. Dann wird die obere Phase nach Dekantieren abgetrennt und gewonnen. Die Extraktion wird mit 4o 1 n-Butanol wiederholt, Die ausgesogenen Mutterlaugen werden verworfen. Die bellen Extrakte werden vereinigt (102 1) und mit 10 1 Wasser gewaschen. Das Waschwasser wird verworfen» Der gewaschen« Butanolextrakt wird untef vermindertem Druck (20 mm Kg) bei 37*C auf ein Volumen von 3 1 eingeengt.

Das Konzentrat wird mit einer 25 feigen Lösung von Natriumtnethylat in n-Butanol auf pH 7 neutralisiert. Das neutralisierte Konzentrat wird in 30 1 Hexan ausgefällt. Das Antibioticum wird durch Filtrieren isoliert, mit Hexan gewaschen und ic Vakuumtrookenschrank (5 ram Hg* ko°C) getrocknet. Man erhält so 379 g rohes 18 631 FLPo mit einem Gehalt von 8,5 yug/mg.

Beispiel

TO ,5 1 Ferment at lonsmaische j. die aus der in Beispiel 1 beschriebenen Fermentation stammen» werden in einen mit einer Vorrichtung zum Bewegen ausgestatteten Bottich eingebracht, Man setzt 10,5 1 n-Butanol und 500 g Piltrierhilfe zu, Die Suspension wird eine halbe Stunde gerührt und filtriert. Der Filterkuchen wird nacheinander mit 1 1 n-Butanol und 1 1 Wasser gewaschen. Das FlItrat v?ird dekantiert. Die untere wässrige Phase wird abgetrennt und verworfen. Die or= ganische Phase (11 1) wird gewonnen und dann unter vermindertem Druck (40 mm Hg) bei 30®C auf ein Volumen von 200 ecm eingeengt.

Das in dem Konzentrat vorhandene Antibioticum wird mit 2 1 Hexan ausgefällt. Das Antibioticum wird durch Filtrieren isoliert» mit Hexan gewaschen und in einem Vakuumtrocken-

9 09838/15 37

schrank (40 mn Hg« j55*G) getrocknet _e rohe® Antibioticum mit einem ueha.lt voa-3 ag/i

<SlirQi8©,tograpiii@ des Rohprodukts _«uf^: siit. ©te©:? sa/3 PhosphatpafferXSsim ist*. Rife. Chloroform* als EnfwieklisngsMsmigaiiittel di@ gl®l©fe© Wanderung wie mit d®K aws alboein©r@sg#ns DS 81 64? iß Beispiel j 'dukt (Rf ® Q'.5). - ■ '-■"■

Auf Papier Arches 302 beobachtet., man. mit einemaoetat« C^elohexan (IsI)₉ dae^: mit Waeßer -'ges&Lttägfe &®t>_§ *ale beweglicher Phase die gleiche Wanderung wie bsi c Kulturen von S, alboeinerescens DS 21 647 .g@eSs_.s isolierten Eohprodukt (Rf «0,5)·

Auf Kieselgel ©-Dünnschicht erhält man unter Oemischs Tetrachlorkohlenstoff-Kthanol-Essigeäisr® {9O$6t6} als Entwicklungssystem die gleiche Wanderung wie mit den Kulturen von S, älbocinerescens DS 21 647 gemSss Beispiel isolierten Kohprodukt (Rf · Q_#5).

48p 1 Fenaentationsinaisohe^ die getaHss Beispiel 2 hergestellt ist» Jedoch einen Gehalt von 1/lg/ocm aufweist.-und ®in@n pH von 7»1 besitzt, werden in einen mit einer Vorriohttang s«m Bewegen ausgestatteten Bottich eingebracht. Men setzt400 1 Kthyiac®tat und dann nach 1/S«stUndigem Bewegen 4§ kg Filtrierhilfe zu. Die Suspension wird auf einer Filterpresse filtriert. Der Filterkuchen wird nacheinander mit 80 1 Sthylaoetat und dann mit 150 1 Wasser gewaschen. Das Fiitrat wird dekantierte Die untere wässrige Phase wird abgetrennt

909838/1537

(66ο 1) und verworfen, Die organisch® mit 40 1 Wasser gewaschen. B@? vermindertem Druck (60 mm Hg) bei 3 !.eingeengt.

1) wird
wird unter Vo lyasen von

D&s Konsentrat wirö mit 30 1 tioufi wird durch Filtrieren in einem Vakuürafcro©k@iia©tarrali (^ müg^ 40^eC) erhalt so 37 g rohes 18

Das Antlblo· . und

mit @in@sfi Qehmlt ψοη 6fög/m&

β Rohprodukt, das wie in Beispiel 3 hergestellt wurde« Jedoch einen @ehalt von 3*B^ig/nig aufweist_e ^@rd©n in 12 1 eines Oesisehs Methanol^asser (50i50 Volumina) gelöst. Die erhaltene Lösung (pH « 7»p) wird in ά@η oberen Teil einer Säule (Innendurchmessers 15 css) eingeführt, di@ 25 1 Harz Dowex 1 X 2 im Chloridayklus enthält» wobei die Abfluaerate auf 3 1/ Stunde eingestellt wird. *

Wenn die gesamte Anfangslöming durch die Säule geführt ist, wird das Harz von oben nach unten bsi einer Einstellung d@r Rate auf 25 l/Stunde nacheinander mit folgenden Gemischen g waschen t

Methanol-Wasser (56%50) (Vol. Methanol-Wasser (60s40) (VoI,/Vol.)

mit einem Gehalt von 10 g/l an

Methanol-Wasser (60s40) (VoI./Vol.)

mit einem Gehalt von 15 g/l an NHCl

60 1
80 1

80 1

Das Antibioticum 18 6^1 ReP, wird dann mit einem Gemisch Methanol-Wasser (8OsSO) mit einem Gehalt von 30 g/l an Am·

909838/15 37

ltalerV (£%Ο 1 mit einer Häte

tos Elumt wird unt@r vermisiderten Druck, und ratur unterhalb 40⁹C auf 30 1 eingeengt, und (pH «■ 5»S) «ird sweiraal rait je 30 1 Chlorofora

Der Chlorof©«®xtrakt wird unter veiniindertee. Bruoic wfr ©Iss kleines V@Iu§i@n eingeengt^ undias. Antibiofcie« Butanol dureh Konzentrier®» übsrg@rahrt> (Volnpsa ISstings 1100 com),

Beiapiel 7

10 g geüiSss Beispiel 6 erhaltenes 13 6^1 H_eF« Xtbylaoetat gelöst. Haeh Elärung wird die Ie (Xnn@ndurehiness@r5 50 mm) aufgebracht», di® TSOg verdünnter Schwefelsäure get?asch@si@8 Alpßinitasiiosqrd enthalt Die Säule wird mit 5 1 K thy lacetat gewaschen ₉ und das tieum wird dann mit 1 1 Methanol eiuiert.

Die üsthanoliesung wird unter vermindertem Druck auf ein ki@I nes Volumen eingeengt und das Antibioticum ^ird durch &onz@n<? trieren in ftthylacetat übergeführt■, aus dem es auskristallieiert. Man erhält so 1,16 g Kristalle mit einem Gehalt von

Beispiel 8

4,1 g Antibioticum» das unter den in Beispiel 7 Bedingungen hergestellt wurde» warden in 450 'ecm Bioxass

90 9838/1537

~£β° £ 1#3 ^# '■ ■ Wife- " ~¹"^@ "* ^8f5i

(e «β 1 ^ irs Kthanol)

,-rj w ■ 0 * 25*1 % H * 4_s0

Cl as 5₉1 <p|

0*5 β äes -Kie in Beispiel T b©setol@to@n gereinigten Anti= biotioass nerdeii In 20 oem Äeafcon @©18st und durch langsame ■Zagatbe von 10 ecm Wasser uinkrist&lllsiert. Man erhält so 0*4*5 g wel88® feine ifedeltt mit einem Gehalt von 994/ag/;ng_f <ti· die physikaliseh-chensischsn Eigenschaften des nach Beispiel 3 erhaltenen Produkts b@@it2@n<,

Beispiel 10

Him beschickt einen 170 JL»Fermenter mit s

Pepton (Cl" «3,5 S^) 1200 g

Fleischextrakt (Cl"'- 1 %) 600 g

909838/1537

Maisstärke 1200 g Leitungswasser ad 110 1

Der pH-Wert wird mit 120 com 10n-Natronlauge auf ?; 10 eingestellt. Nah sterilisiert das Medium durch 40-nlnufcigea D«reh~ leiten von Dampf von 122⁴C. Nach Abkühlen betrögt das Volumen der Bouillon 120 1 und der pH-Wert 7,10. Nan beimpft rait-200 ecm einer gerührten bzw. geschüttelten Kultur von Strepto* myoes roseoehromogenes, var. oscitans DS 12 976. Die Kultur wird bei JO®C 27 Stunden unter Bewegen und unter Belüftung mit steriler Luft entwickelt. Sie 1st dann zar Beimpfungder Produktionskultur geeignet.

P Die Produktionskultur wird in einem 800 !»Fermenter durchs®- führt, der mit den folgenden Substanzen beschickt istt

Distillers Solubles 20 kg

teilweise hydrolysierte Stärke 5 kg

KobaltChlorid mit 6 HgO 10g Leitungswasser ad 405 1

Nach Einstellen des pH-Werts mit 1800 ecm lOn-Natronlauge auf 7*50 setzt man 2,5 kg Caloiumcarbonat zu und sterilisiert das Medium dann bei 122"C während 40 Minuten. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 450 I₉ Die Bouillon wird . durch Zugabe von 50 1 einer sterilen wässrigen Lösung, die * 12,5 kg Dextrose enthält und 5 1 einer sterilen Wässrigen Lö« sung, die 1 kg Ammoniumsulfat enthält, auf 500 1 aufgefüllt» Der pH-Wert beträgt 6,60.

Man beimpft mit 50 1 der oben beschriebenen Impfkultur aus dem 170 1-Fermenter,, Die Züchtung wird bei 33⁸G 119 Stunden unter Bewegen mit Hilfe eines Turblnenrührers,."," der mit 205 U/min betrieben wird, und unter Belüftung mit steriler Luft

9 09838/1537

In einer Rate von 25 «^/Stunde durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums betrügt dann 8,60 und das Volumen der Maische 4?o 1. Die vorhandene Antibloticummenge betragt

Beispiel 11

990 1 der unter den Bedingungen von Beispiel 10 erhaltenen Peraentatlonsnaleche mit einen Gehalt von 288/ug/ecro werden in einen alt einer Vorrichtung zum Bewegen ausgestatteten Bottich gebracht. Der pH-Wert der Maisehe wird mit 10 1 5n-Salsatfure auf 5 eingestellt. Nach 1/2-stundigen* Bewegen setzt nan 30 kg Filtrierhilfe su und filtriert die Suspension auf einer Filterpresse.

Der Filterkuchen wird mit SOO 1 Wasser gewaschen und das FiI-trat (1025 1) verworfen. Der Filterkuchen (199 kg) wird unter Bewegen in 750 1 eines Gemiaohs von Wasser und Methanol mit einen Gehalt von 600 1 Methanol suspendiert. Der scheinbare pH-Wert des Oemiachs wird dann durch Zugabe von 1 1 5n-Natronlauge auf 7 eingestellt.

Das tnbewegunghalten wird 1 Stunde fortgesetzt ο Dann wird die Brtthe auf einer Filterpresse filtriert. Das Flltrat wird gewonnen» und der Filterkuchen wird mit 100 1 eines öemischs von Wasser und Methanol mit einem Gehalt von 60 Vol„=# Methanol gewaschenο Die Gesamtheit von Flltrat und Waschflüssigkeit macht 840 1 mit einem Gehalt von 285 yag/ecm aus. Der Filterkuchen wird verworfen« Das alkoholisch® Flltrat wird unter vermindertem Druck (35 mm Hg) bei 35⁹C auf ein Volumen von 100 1 eingeengt. Das Konzentrat wird in ©inen mit einem Rührer ausgestatteten Bottich eingebracht. Man setzt 50 1 n-Butanol zu₀ Der pH-Wert der wässrigen Phase wird mit Hilf® von 5n->SalssKure auf 3 eingestellt. Das Inbewegunghalten wird 30 Minuten fortgesetzte Nach Dekantieren wird dann die obere Phase abgetrennt und gewonnen. Die Extraktion wird mit 30 1

909838/ 1 537

n-Butanol wiederholt. Die ausgezogenen Mutt®rlaugen werden \ verworfen. Die beiden Extrakte werden vereinigt (98 1) und mit 10 λ Wasser gewaschen· Das Waaohwasser wird verworfene Der gewaschene Butanolextrakt wird unter vermindertem Druck 20 am Hg bei 57⁰C auf ein Volumen von 3 1 eingeengt«

Das Konzentrat wird mit einer 25 $lgen Lösung von Natriummethylat in n-Butanol auf pH 7 neutralisiert. Das neutralisierte Xonsentrat wird in 30 1 Hexan ausgefällt. Das in Form des Natriumsalzes ausgefallene rohe Antibioticum wird dur©h Filtrieren isoliert, mit Hexan gewaschen und in @£E©irflocken** schrank unter vermindertem Druck (5 Kim Hg» 4o^eC) getrocknet» Man erhält so 477 g rohes 18 631 RcP. mit einest Gehalt von 435

Beispiel 12

g Rohprodukt« das wie in Beispiel 11 hergestellt wurä@ und einen Gehalt von 332 jag/mg aufweist* werden in 30 1 eines Gemisch© Methanol-Wasser (50250 ¥oluraina) gelöst. Die erhaltene Lösung wird oben auf eine Säule (Innendurchmesser? 15-cm)' aufgebracht» die 30 1 Harz Dowex 1 X 2 im Chlorzyklus ent« hält« wobei die Rate des Abflusses auf 3 1/Stwide eingestellt wird,, ■ _ ' ; - ^:

Wenn die gesamte AnfangslSsung durch die Säule gegangen ist _e _r. wird das Harz von oben nach unten bei einer Einstellung der Rate auf 25 l/Stunde nacheinander mit den folgenden Gemische gewascheng

Methaaol-tfasser (5Os5O Methanol-Wasser (60s40 A)

Methanol-Wasser (70 §30 VoloAol»)

90 9 838/1537

Das Antibioticum wird denn nit einem Gemisch Methanol-Vfnseer (Bo j2ö Volumina) mit eine» Gehalt von 30 g Ammoniumöhlorid je Liter eliaiert (190 1 in 6 Fraktionen von Je 20 I)

9*ektiutmn Ä, 3 und 4, aie den Hauptteil der Aktivität enthalten, «erden vereinigt und unter vermindertem Druck einer Temperatur unterhalb 40*C auf 30 1 eingeengte

Das Konsentrat wird ohne Knäerung des pH-Werts einmal mit 15 1 und stMlmil ait Je IS 1 Kthylaoetafc extrahiert.

Die Extrakte werden vereinigt, mit 5 1 Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei einer "Temperatur unter 40⁹C auf 10 1 eingeengt.

Die so erhaltene lösung wird durch eine Säule (Innendurchmesser t 5 o«) geleitet, die 500 g zuvor bei pH 4 gewaschenes AluminiUKOxyd enthält. Wenn die gesamte Lösung durchge flossen ist« entwickelt man die Säule mit 2 1 Kthylacetat«

Die austretende Flüssigkeit und die WaschflUssigkeiten wer den vereinigt und unter vermindertem Druck auf 1/10 ihres Volumens eingeengt, was zur Kristallisation führt. Nach 2-stUndiger Reifung in einem EiBbad werden die Kristalle abgesaugt, mit 200 ecm kaltem ftthylacetat gewaschen und 24 Stunden bei 40*C unter venaindertem Druck von weniger als 5 um Hg getrocknet. Man erhält so 170 g kristallisiertes 18 631 K.P. in Form der freien Säure mit einem Gehalt von 855/ig/eg.

Aus den Fraktionen 5 und 6 der Chromatographie an Dowex 1X2 isoliert man in der gleichen Weise 35 g kristallisiertes Produkt in For» der freien Säure mit einem Gehalt ▼on 702 jag/ng. (Durch Einengen der Mutterlaugen und Aus=

9098 38/ 1537

fallen mit Hexan kann man noch 124 g Produktzur ZurückfUhrung mit einem Gehalt von 230 lag/mg gewinnen).

Beispiel 13

276 g gemäss Beispiel 12 hergestelltes Antibioticum werdeii bei 30'C In 2,4 1 eines Gemische Aceton-Dioxan (5rl Volumina) gelöst. Die Lösung wird geklärt und dann innerhalb von 3 Stunden unter langsamem Bewegen bei Zimmertemperatur mit 2,5 1 Wasser versetzt.

Nach Stehenlassen über Nacht bei Zimmertemperatur werden P Kristalle abgesaugt, mit 1 1 Wasser gewaschen «sad"48'-Stundenbei 60^eC unter einem Druck von 1 aas Hg getrocknet _β

Man erhält so 2^1 g 18 6^1 R.p. in Form d@s* fr@i@si

als weisse Kristalle mit einem Gehalt von 990 pg/mg und folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

Elementaranalyset

C « 60,0-60,5 % H « 5,4 - 5,5 % 0 * 24,9 - 25*0 %■

N- 3,9-4,1 Cl « 4,75-4,95^5

berechnet für

C « 60,29 % H m 5,35 % 0 » 25*24 >" N » 4*02

Cl- 5,09 ^

9 0 9 8 3 8/1537

Drehvermögen:

[α]*⁰ « -67° ±.1,3· CaJg₆ --196° * 2,5

(ο « 1 ^ in Äthanol)

Ultraviolett-Spektrum (Bestimmung mit einer Lösung in Chloroform mit 10 mg/1):

Abaorptionsmaximum bei 275 nm . Absorptionsminimura bei 298 nm Schulter bei 307 nm Absorptionsmaximum bei 338 nm

Beispiel 14

164 g kristallines Antibioticum in Form der freien Säure _s das geraäss Beispiel 12 erhalten ist _a werden In 500 ecm Aceton gelöst. Die Lösung wird durch Filtrieren durch eine Schicht Filtrierhilfe (Clarcel DlC)'geklärt„ Dann setzt man ihr innerhalb von 1 1/2 Stunden unter langsamem Bewegen 4«5 eines Gemische Acetonitril-Wasser (5Os5O Volumina) zu. Nach Stehenlassen über Nacht bei Zimmertemperatur werden die gebildeten Kristalle abfiltriert« mit 1 1 eines Gemische Aceton-Wasser (50:50 Volumina) und dann mit 1 1 Wasser gewaschen und 48 Stunden bei 50 ⁹C unter weniger als 5 mm Hg getrocknet. Man erhält so 124 g 18 63I R.P₀ in Form der freien Säure als weisse Kristalle mit ein@m Gehalt von 1000 jJg/nig» die die physikalisch-chemischen Eigenschaften" des gemäss Beispiel 13 erhaltenen Produkts aufweisen α ■"

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die medizinischen Zusammensetzungen» die das Antibioticum 18 63I RoP. oder eines seiner Salze in reiner Form oder zusammen mit jedem be-

909838/1537

-« -■ 1907558

liebigen anderen vertraglichen Produkt, das Inert oder selbst physiologisch wirksam ist (wie beispielsweise ein Antibioticum) enthalten. Diese Zusammensetzungen können auf parenteralem, rektalem oder vorzugsweise oralem Wege verwendet werden· In diesem letzteren Fall kann das Antibioticum 18 63I H.P. alt einem Penicillin, das durch die Magenacldität nicht zerstört wird, wie beispielsweise Penicillin V, kombiniert werdenο

Der Mengenanteil an Wirksubstanz in diesen Zusammensetzungen kann je nach dem gewünschten therapeutischen Effekt variieren·

Zur Behandlung einer Infektion mit ßrara-posltiven K@isien beträgt bei einem Erwachsenen die Dosis im allgemeinen zwischen 1 und 3 g Je Tag bei oraler oder rektaler Verabreichung und zwischen 0,5 und 2 g je Tag bei parenteral©? Verabreichung.

Als feste Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können Tabletten, Pillen, Pulver oder Granulate verwendet werden. In diesen Zusammensetzungen 1st da© wirksame Produkt mit einem oder mehreren Inerten Verdünnungsmitteln, wie beispielsweise Saccharose, Lactose oder Stärke» vermischt. Diese Zusammensetzungen können auch andere Substanzen als die Verdünnungsmittel, wie beispielsweise ein Gleitmittel, z.Bo Magneslumstearat, enthalten.

Als flüssige Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung kann man pharmazeutisch verwendbare Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere verwenden, die inerte Verdünnungsmittel, wie beispielsweise Wasser oder Parafflnöl, enthalten. Diese Zusammensetzungen können auch andere Substanzen als die Verdünnungsmittel, wie beispielsweise Netzmittel, Süssroittel oder Aromastoffe oder Parfüms, enthalten.

9 09838/1537

Di« *rf tadttngsgem&Bsen Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung kennen wässrige oder nichtwilesrlge sterile Ltfcuagen· Suspensionen oder Emulsionen sein. Ale Lösungsmittel oder Träger kann man Propylenglykol, Polyäthylenglykol, pflanzliche öle. Insbesondere Ollvenül, und injizierbare organische Ester, wie beispielsweise Kthyloleat verwen» den. Diese Zusammensetzungen können auch Adjuvantien« insbesondere Netzmittel» Emulgiermittel und Dispergiermittel, enthalten. Die Sterilisation kann auf verschiedene Welse er« folgen, beispielsweise mit Hilfe eines bakteriologischen Filters» durch Einbringen von sterilisierenden Mitteln in die Zusammensetzung« durch Bestrahlen oder durch Erhitzen. Sie können auch zum Zeltpunkt des Gebrauchs in sterilem Wasser oder irgendeinem anderen Injizierbaren sterilen Medium ge-= löst werden.

Die Zusammensetzungen zur rektalen Verabreichung sind Supposltorlen, die ausser dem wirksamen Produkt Exeipientien, wie beispielsweise Kakaobutter oder Suppowachs enthalten.

Das folgende Beispiel erläutert eine erfindungsgenigsse medizinische Zusammensetzung.

Beispiel 15

Man stellt nach der üblichen Arbeitsweise Tabletten der folgenden Zusammensetzung hers

18 631 R.Po 0,250 g

StSrke 0*150 g

kolloidale Kieselsäure OfOTO g

Hagnesiumstearat 0,030 g

909 8 387 1537

Claims

P a t e η t a n s p r ti ehe

1. Antibioticum 18 631 R.P. mit folgenden Merkmalen:

Weisses kristallines Pulver saurer Art (Neutraläquivalent « 695)» F « 806°C» leichtlöslich in Dimethyleulfoxyd> löslich in verdünnten starken Basen, Methanol« Äthanol, Aceton« Dioxan, Chloroform, Dimethylformamid und Kthylacetat, wenig lös· lieh oder nicht löslich in Wasser« wässrigen Nat rlumbicarbonat· lösungen, verdünnten starken Säuren« Tetrachlorkohlenstoff, Acetonitril und Hexans

Strukturformel

OH

909838/1537

-69 - 190755Θ

Blementarzusammensetzung (berechnet für C - βθ,29 £ H * 5,35 Ji O » 25,24 # N « 4,02 %

Cl - 5*09 # ·

Ultraviolett-Spektrumr Absorptionsmaxiraa bei 275 nm (e] ^_m » 444) 307 nm (s] ^_m = 201) (Schulter)

337 nm (E₁ ¹ J_n - 4₃4)

Antibakterielle Wirksamkeit, insbesondere gegen Gram Keime.

2ο Verfahren sur Herstellung des Produkts nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man "Straptomyces hygroscopicus DS 9 751" (NRRL 3418) oder seine Mutanten .aerob in einem geeigneten üblichen Medium und unter den Üblichen Bedingungen für diese Art von Kultur züohtet und das im Verlauf® der Züchtung gebildete Antibioticum abtrennt und reinigt.

3_e Verfahren= zur Herstellung des Produkts nach Anspruch 1„ dadurch gekennzeichnet, dass man "Straptomyses albocinerescens DS 21 647" (NRRL 3419) oder sein© Mutanten aerob in einem geeigneten üblichen Medium und unter den üblichen Bedingungen für diese Art von Kultur züchtet und dann das im Verlaufe der Züchtung gebildete Antibioticum abtrennt und reinigt.

909838/1537

4_O Verfahren zur Herstellung des Produkts nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet» dass man "Streptomyces roseochromogenesp var. oscltans" (NRRL 3504) oder seine Mutanten in einem geeigneten Üblichen Medium und unter den Üblichen Bedingungen für diese Art von Kultur züchtet und dann das im Verlaufe der Züchtung gebildete Antibioticum abtrennt und reinigt.

5ο Medizinische Zusammensetzungen» gekennzeichnet duroh einen Gehalt einer wirksamen Menge an Antibioticum 18 631 R.Po» zusammen mit einem pharmazeutischen Exeipiens und gegebenenfalls einem anderen Antibioticum.

909838/15 37

-W-

L e e r s e i t e