DE2806220A1 - Biologisch reine kultur des neuen mikroorganismus streptomyces espinosus subsp. acanthus, unter seiner verwendung hergestelltes antibiotikum acanthomycin und verfahren zur herstellung des acanthomycins - Google Patents

Description

Das erfindungsgemäße Antibiotikum Acanthomycin erhält man durch Züchten des neuen Mikroorganismus Streptomyces espinosus subsp. acanthus NRRL 11081 (DSM ) in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen. Acanthomycin und seine Baseadditionssalze besitzen die Eigenschaft, das Wachstum gram-positiver Bakterien, z.B. von Staphylococcus aureus und Streptococcus hämolyticus, zu beeinträchtigen. Folglich können Acanthomycin und seine Baseadditionssalze alleine oder in Kombination mit anderen Antibiotika unter den verschiedensten Umgebungsbedingungen das Wachstum von Bakterien von beispielsweise den erwähnten Bakterien, verhindern oder deren Anzahl vermindern.

Chemische und physikalische Eigenschaften von Acanthomycin:

Empirische Formel: (^cg_O ^Hi3g^Ni9°42^n^;

Äquivalentgewicht: 2159.

609S35/0609

Elementaranalyse:

ber.: C = 50,06 %; H = 6,48 %; N = 12,33 %', O = 31,12 %

gef.: C = 49,81 %; H= 6,47 %; N = 12,36 %; O (aus dem

Unterschied zu 100) = 31,36 %

Optische Drehung: [a]jp = -28,5° (c, 1, Dirnethylsulfoxid).

Löslichkeitsverhalten: Acanthomycin in Form der freien Säure ist in Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid löslich. In Methanol und Äthanol ist es schwach (etwa 1 bis 2 mg/ml) löslich. In Wasser, Äther und halogenierten Kohlenwasserstoff- und gesättigten Kohlenwasserstofflösungsmitteln ist es unlöslich. Die Salze des Acanthomycins, beispielsweise die Ammonium- und Natriumsalze, sind in Wasser und niedrigen Alkoholen löslich.

Titrationsergebnisse:

Äquivalentgewicht: 2159
Titrationsmittel: KOH

Lösungsmittel: Dimethylformamid/60^iges wäßriges Äthanol

(1:1).

Dünnschichtchromatographie: Auf handelsüblichem Silikagel unter Verwendung von Chloroform/Äthanol/Wasser im Volumenverhältnis 2:3:1 als Fließmittel erhält man einen R~-Wert von 0,52.

Infrarotabsorptionsspektrens Acanthomycin besitzt ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum in einem Mineralölgemisch (mineral oil mull) entsprechend Figur 1. Bei folgenden Wellenlängen (ausgedrückt in reziproken Centimetern) sind Peaks festzustellen:

	Bandenxrequenz (Wellenzahl)	stark; mittelj schwach.	Intensität
	3280	S
	3070	M
	2960	S
	2930	S
	3860	S
	2650	W
	1723	M
	1656	S, sch (sch = Schulter)
	1643	S
	1540	S
	1463	S
	1415	M
	1378	M
	1341	M
	1278	M
	1268	M
	1240	M
	1223	M
	1145	W, sch
	1187	M
	1098	W
	1065	W
	1033	W
	1002	W
	960	W
	943	W
	920	W
	847	W
	723	W
	699	M
S » M » ¥ =

80983S/0609

Acanthomycin besitzt auch ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum, wenn es in eine KBr-Tablette gepreßt ist. Bei folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in reziproken Centimetern, sind Peaks festzustellen:

Band enfr e qu en ζ	Intensität
(Wellenzahl)
3390	S, sch
3290	S
3060	M
2960	M
2930	M
2880	M
2650	W
1724	M9 sch
1652	S
1533	S
1455	M
1412	M
1385	M
1340	M
1273	M
1223	M
1183	M
1140	M, sch
1095	W
1067	W
1030	W
1000	W
960	W
920	W
875	W
737	W
698	M

80983B/0809

280622Q

Ultraviolettabsorptionsspektrum: Aeanthomycin besitzt ein charakteristisches Ultraviolettabsorptionsspektrum in Methanol entsprechend Figur 2. λ ___. in Methanol bei 262

V HlctX

(a = 16,81).

Biologische Eigenschaften von Aeanthomycin:

Aeanthomycin wurde im Rahmen eines Standardröhrchentests unter Verwendung von Nährbrühe als Medium auf seine antibakterielle Aktivität hin untersucht. Als Mindestinhibierungskonzentration gegen S. arrpv:-- wurden 50 mcg/ml, gegen S. lutea 25 mcg/ml ermitte ~ . ΤΆτι zusätzlicher Test im Rahmen eines Standardscheibi·. ^:2,7 mm)-Plattentests lieferte folgende Ergebnisse:

8 0 9 8 3 5/0609

	Konzentration an Acanthomyc in in mg/ml	Streptococcus pyogenes	Staphylococcus aureus	Bacillus cereus	Zone (mm)	Sarcina lutea
	10	4.1,5	29,5	26	Bacillus subtilis	35
	5 2,5	40 40	28,5 28	25 23	34	34 32
to OO	1,25	38,5	26,5	21	33 31,5	30
cn	0,62 0,31	36,5 34	24,5 22,5	20 17	30	rv) ro Ul -<1
O O				28 26

-1C-

Schließlich wurde Acanthomycin auch in vivo an Standardlaboratoriumsmäusen getestet. Eine mit S. pyogenes infizierte Maus wird durch Acanthomycin bei subkutaner Verabreichung be'" CD_R0 von 0,23 (0,17 bis 0,31) mg/kg geschützt. Die ClV₀ gegen S. aureus infizierte Mäuse beträgt 1 ,0 mg/kg.

Der Mikroorganismus

Zur Gewinnung des Acanthomycins bedient man sich des Mikroorganismus Streptomyces espinosus subsp. acanthus NRRL 11081 (DSM ). Eine Subkultur dieses Mikroorganismus ist auf Anfrage von der Dauersammlung der Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, erhältlich. Durch die Aushändigung des Mikroorganismus wird an einem evtl. auf die vorliegende deutsche Patentanmeldung erteilten Patent keine Lizenz begründet.

Eine aus einer Bodenprobe aus Südost-Texas isolierte Actxnomyzetenkultur wird in der US-PS 3 697 380 als Streptomyces espinosus sp. n. charakterisiert. Vier weitere Bodenisolate aus Böden in Südost-Texas zeigen dasselbe Farbmuster auf einem Ektachromfilm wie die Typuskultur. Umfangreiche Untersuchungen der Isolate haben gezeigt, daß diese dieselben Sporophoren- und Sporentypen sowie die allgemeinen Züchtungscharakteristiken der Typuskultur aufweisen. Herausragende Eigenschaften dieser Kulturen sind ihr grau-grünes Wachsen in Luft, ihre kurzen Sporophoren, die runde stachelige Sporen tragen und ihr hitzebeständiges Wachstum. Unterschiede in den Züchtungseigenschaften (vgl. die später folgenden Tabellen) und den antagonistischen Eigenschaften reichen nicht aus, diese neuen Isolate als Varietäten zu bezeichnen. Drei dieser neuen Isolate, die aus der US-PS 3 833 475 bekannt sind, besitzen die Hinterlegungsnummern NRRL 5729, NRRL 5730 und NRRL 5731. Das restliche Isolat wird im folgenden als Streptomyces espinosus

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80622Q

subsp. acanthus NRRL 11081 (DSM ) bezeichnet.

Verfahren zur Kulturcharakterisierung finden sich in dem Artikel "^Streptomyces si:effisburgensis sp*n." in J. Bacterial. ^ir _r Band. 94, Seiten 2022 bis 2026 (Λ967> und teilweise, in E.B. Shirling. und D. Gottlieb in dem Artikel "Methods for characterization of Streptomyces species'* in "Int. J. Syst. Bacterial.", Band 16, Seiten 313 bis 340 (1966). Die Kulturen werden auch auf einem· modifizierten HicRey-Tresner-Agar (vgl. R.J. Hickey und H.D. Tresner "Cobalt-containing medium for sporulation of Streptomyces species ¹^ in J. Bacteriol.", Band 64, Seiten 891 bis 892 (1952) gezüchtet. Die Modifizierung Ist derart, daß N-Z-Amine A durch Pepticase (enzymatisch^ Verdauung van Casein) ersetzt wurd-e.

Farbeigenschaften:- Luftwachstumt- grau-grün; Melaninnegativ. Das Aussehen, auf Ektachromfllnten (vgl. A. Dietz, "Ektachrome transparencies as aids in aatinomycete classification"¹ in "Ann. EF.T., Acaä-. Sci^" Band 60, Seiten 152 bis- 154 (1254-H findet sich in Tabelle I. Referenzfarbcharakteristika finden sich in den Tabellen- II und III. Die Kulturen können die grünen Farbreihen- von Tresner und Backus (vgl. ff.D. Tresner und E.J» Backus ^IFSystem of co-lor wheels for streptomycete taxonomy'* in "Applied Microbiol." Band 11^ Seiten 335 Ms 338 (1963) Ϊ eingeordnet werden»

Mikroskopische Eigenschaften: Sporophoren kurz; gestreckt bis gekrümmt, bis affenspiralig bis spiralig (RF, RA, S) im Sinne von T.G. Pridham, CJ/f. Hesseltine und R.G. Benedict "A guide far the classification of streptomycetes according to selected groups. Placement of strains in morphological sections" in "Applied Microbiol.^Ir Band 6, Seiten 52 bis 79 (1958). Sporen* meist kugelig mit zahlreichen Anzeichen einer deutlichen Bindung. Sporenober-

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fläche dornig bis stachelig im Sinne von A. Dietz und J. Mathews "Classification of Streptomyces^ spore surfaces into five groups" in "Applied Microbiol." Band 21, Seiten 527 bis 533 (1971). Einige Stacheln zeigen einen Übergang zu haarartig. Die Stacheln sind in reichlichem Maße vorhanden und zeigen eine Musterung, wenn sie an nach der Kohlereplikamethode von A. Dietz und J. Mathews "Taxonomy by carbon replication" "I. An examination of Streptomyces hygroscopicus" in "Applied Microbiol.", Band 10, Seiten 258 bis 263 (1962) beobachtet werden.

Züchtungseigenschaften und biochemische Eigenschaften: Die Züchtungs- bzw. Kultureigenschaften und die biochemischen Eigenschaften finden sich in Tabelle IV.

Kohlenstoffausnutzung: Das Wachstum der Kulturen auf Kohlenstoffverbindungen wird in dem von T.G. Pridham und D. Gottlieb "The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid far species determination" in J. Bacteriol.", Band ^S, Seiten 107 bis 114 (1-948) beschriebenen künstlichen Medium (vgl. Tabelle V) und in dem von Shirling und Gottlieb^ aaO_t Seiten 513 bis 340 beschriebenen künstlichen Medium {vgl. Tabelle Vl) ermittelt.

Temperatur: Wachstum bei 18°C und 55°C leidlich, bei 24°C gut und bei 28° bis 37°C stark. Bei 45°C ist das Wachstum leidlich (vegetativ) in 24 h und stark (gute Sporenbildung) in 72 h. Als Agarmedien wurden Bennetts-Medium, Czapeks-Saccharose-Medium, Maltose-trypton-Medium und modifizierte Eickey-Tresner-Medium verwendet.

Antibiotikabildungseigenschaften: S. espinosus NRRL 5729, NRRL 5730 und NRRL 5731 produzieren das Antibiotikum Lincomycin, S. espinosus subsp. acanthus NRRL 11081 (DSM produziert Acanthomycin.

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-ί

Agar-Medium

Aussehen von S^rtptotfiycoS e^iinOsus^KuiLtureii auf Ektachröm-Filmen*

Be- NiIRL 3θ9© NRRt 5729 NRRL 573Ö NRRL 5731

Stiiii-

Bennets

Czapeks
Saccharose

S R

Maltose-Trypton S

Pepton-Eisen
0,1 % Tyrosin
Casein-Stärke

S R

S R

gräu-grilii

fahlgelb-

lohfarbeii

grau-grün fahlgrau

'ill

gräu-grun

fahlgelbe lohfärten

weiß bis

fahlgrau

fanlgolb grau-grün
fahlgrau

grau-grün grau-grün grau-grün

gelb-lohfarben gelb-lphfarten gelb

bis oliv

weiß gelb

fartloö

röt

bis oliv

weiß gelb

fartlos
rot

weiß gelb

fartlos rot grau*-grün

fahlgelblOhfarten

grau-g"rün
fahlgrau

grau-grün
gelb-lohfarben

weiß
gelb-lohfarben

graü-grün
rot

fahl grau-

grau-griin grau-grün grau-grün

fahlgtfau-girun fahl grau-grün fahler au-grün

S = Oberfläche
R = Rückseite

*A.Dietz "Ektachrome transparenciös ;äs aids in actindüiycete classification" in "Ann. N.Y. Acad.Sci.", Band 60, Söite 152-154 (19&4)

NRRL 11081

grau-grün fahlgelb

grau-grün fahlgrau

graugrün ₍

fahlgelb- _, lohfarten u

weiß ' gelb

grau-grün rot

grau-grün fahlgrau-grün

ΪΪ

Agar

Bennets

Czapeks
Saccharose

Referenafarbeigeneohaften von Strefttomyces espino8UB"-Kul türen

Bestimmung

P
S

24 /

1 i/2ge

1 1/2ca

2fb

2ec

1 Ii 2ig

16C

2i_g

1 i/2ca

1 Ii
2ig

1/2ih
i/2gc

2ig

24 i/2fe

2ec

1 1/2ec

2ig
■fee

"Oolor iiarmony Manual", 3. Auögabe, NKBL 3890 NRHl $729 NlRL 5?3O MBfil 5731 NREl 11081

24 i/2ih

2ea 2ic

2ig 2£e

Maltose-Irypton

1ig

1 i/2ge

Uh

2ge 2ec 2gc 1 1/2ge 24 i/2fe 3^
Uli 24

1 i/2ge

2io

24 i/2fe

i/2ie

24 i/2ih

2ie

OO O CD NJ) NJ (O

TABELLE IJ (Fortsetzung)

	Agar	?estim-
	(modifiziert)	S
		R
co OO	Malzextrakt	S R
cn		p .
O
609	Hafermehl (ISP-3)	S

Ug

/
2i,h

2gp

Ug

1. i/2ig

"QeXpr Harmony fianual·"? 5.Ausgabe» 1948*

NRRX 573Ο ITR]RI, ?731 WiRl 11091

2gc 2ie

Ug 2fe

3ba 24
24 1/2ih

2gQ 2gQ

24 i/2ih

24 i/2ih 24

24
21e

24 1/2fe 24 1/2ih 24 i/2i'e 2ec 2eq 2eo

Anorganische S 24 ^/ZXh Π i/2ih 24 1/2ih 24
Salze-St9,??fce 3ih Uh

(JSP-4) _R

_2ca

2gq

2ec

See

24 i/2ih

2ec

II (Fortsetzung)

	Agar	Bestim-	2ih 1ec	"Color J90 NBKI	Harmony Manual"»	3.Ausgabe»	1948*
	Grlyzerin- Asparagin (ISP-5)	S R	2ge	a 2gc	24 i/2fe 2ge	2ge	24 i/2ih
8 O 9 8 3 ϊ		P			-·	-»
6090/?

ro oo ο

GO K) KJ O

TABELLE II (Fortsetzung)i

	Agar	Bestim	"HBS-Circular	MRL 5729	553"» 1955**	MRL 5731	NRRL 11081	I I
		mung	NRRL 389Ö	263gm 122m 127g 109gm	MRL 5730	122gm	122m 127g
	Bennets	S	263gm 122gm 109gm	89gm 87g 89m 90gm	263gm 122m 127g	90gm 90gm 93m	86gm 87 gm
809835		R P	89gm 87g 89m 90gm	110gm 112m	102g 1Ö5gm	HOg 112m	110g 112m
/06	Czapeks Saccharose	S	110gm 110g	112m 121m 122g 110g	110g 112m	121m 122g	94g 112gm
O IO		R	112m 121m 122g 110g	112m	94g 112gm	mmi.
		P	112m

TABELIiE II (Portsetzung)

Agar

Bestimmung

Maltose-Trypton S

OO Ca>

Hickey-Tresner (modifiziert)

R P "NBS-Circular 553"» 1955** NRRL 389Q NRRI 5729 NRRL 5730 NRRL 5731 NRRL 11081

109gm

109gm

90gm

90gm

90gm

109gm

109gm
11Og

90gm

I22gm

112m

113g

90gm 109gm

109gm 11Og

90gm

122m 127g

87gm

122gm

IO6gm

127g 90gm

122m 127g

90gm

122m 127g

91 gm 94g 106g

122m 127g

90gm

Hefeextrakt-Malzextrakt (lSP-2)

94g
90gm

122m 127g 122m 113g

90gm 91 gm 94g

122m 127g

94g

122m 127g

90gm

122m 127g

Ö8gm 94g

OO CD CO NJ KJ Q

JI (Fortsqijzujig) ϊ

Hafermehl (ISP-?)

Anorganische Salze-Stär&e (ISP-4)

Glyzerin-Asparagin (ISP-5)

mung

P S

R P

	"TOS-Ciro	mar 553",	1955**	JiRCRIi 11081
MM .3890	MRl· 5729,	URRL 5730	WBJa 5751	122gm
iO9gm	109gm	122gm	122g,m
iipg	11Qg
	94g
	ii?gm			90gm
121m	121m	90gm	90gm	nt
iQ9gm	90gm		_	122m
122m	122m	122m	122m
115g	112m
265m	113g			90gm
S9gm	90gm	90gm	90gm
9Qgm				9pgm
90gm	90gm	90gm	110g 112m	122m
109gm	265gm			127g
11Qg	94g	122gm
112m 1 1 ^p	112gm			110g
121m	90gm	94m	94m	112m
122g	94m	109gm	109gm
94m	109gm
109gm

.20- 280622Q

BEMERgUNG-EN;

S = Oberfläche R = Rückseite P = Pigment

na = glanzlos g = glänzend gm = glänzende oder matte Chipoberfläche

*E. Jacobson, V.O. G-ranville und C.E. Poss "Color harmony manual"» 3.Ausgabe (1948)» Container Corporation of America, Chicago» Illinois.

**K.I. Kelly und D.B. Judd »The ISCC-NBS method of

designating colors and a dictionary of color names" (1955)» U.S. Dept. Comm. Circ. 553.

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TABELLE III Farbcode für Tabelle II

S3
CS®

"Color Harmony Manual", 3.Ausgabe, 1948* Färbchiρ Farbname

a weiß

1ec hell-zitronengrau, bräunliches oder gelbliches hellgrau

1 ge zitronengrau 1ig olivgrau

1ih olivgrau

1li helles olivgrau 1 i/2ca cremefarben

1 i/2ec biskuitfärben, naturfarben, Hafermehl, Sand

1 1/2gc staubiges Gelb

1 i/2ge helles olivgrau

1 i/2ie helles Oliv

1 i/2ig olivgrau

2ca helles Elfenbein, eierschalenfarben

2ea heller Weizen, heller Mais

2ec biskuitfarben, naturfarben, Hafermehl , Sand "NBS Circular 553"» 1955** Färbchip Farbname

263gm	weiß	I	ΓΟ CO
121m	fahlgelb-grün		CD cn
122g	gräulich-gelbgrün	I	KJ
109gm	hellgrau-oliv	I
109gm	hellgrau-oliv
110g	grau-oliv
112m	hell-olivgrau
113g	olivgrau
127g	gräulich-olivgrün
110gm	grau-oliv
89gm	fahlgelb
90gm	graugelb
93m	gelbgrau
102g	mäßig grünlich-gelb
105gm	grau-grüngelb
109gm	helles Grau-oliv
106gm	hell-oliv
-	-
89gm	fahlgelb
86gm	hellgelb
90gm	graugelb

TABELLE III (Fortsetzung): "Color Harmony Manual", 3.Ausgabe, 1948* Färb chip Farbname

CD
CO
CD

2fb 2fe

2gc 2ge

2ic 2ie

2ig 2ih 21e

3ba 3ih

bambusfarben, lederfarben, strohfarben, weizenfarben

gedeckt grau

bambusfarben, chamois gedeckt lohfarben

honigfarbenes Gold, helles G-old hell-senffarben, lohfarben

schiefergrau, lohfarben dunkles, gedecktes Grau senffarben, altgold

perlfarben, Perlmutt-Ton beigegrau, mausfarben "NBS Circular 553", 1955** Farbchip Farbname

94g 122gm 90gm

94m 109gm 87gm 91gm

94g 106g 110g 112m 112m 113g

24 i/2fe helles mistelfarbenes Grau 24 i/2ih mistelfarbenes Grau

122gm

mäßig gelb

fahlgelb

hell-olivbraun

hell-olivgrau

graugelb

hell-olivbraun

hellgrau-oliv

mäßig gelb

dunkelgrau-gelb

hell-olivbraun

helloliv

grau-oliv

hell-olivgrau

hell-olivgrau

olivgrau

dunkelgelb

hell-olivbraun

olivgrau mitteigrau grau-gelbgrün grau-gelbgrün grau-olivgrün

OO O CD Ki KJ O

BEMERKUNGEN:

*E. Jacobson, W.O. Granville und CE. Poss "Color harmony manual", 3.Ausgabe (1948), Container Corporation of America? Chicago, Illinois,

**K.L. Kelly und D.B. Judd "The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names" (1955)» U.S. Dept.Comm.Circ. 553.

TABELLE IY

Züehtungs- bzw. Kulturcharakteristika und biochemische Eigenschaften von Streptomyces espinosus-Kulturen

(S = Oberfläche, R = Rückseite, P = Pigment, 0 = sonstige Eigenschaften)

	Medium	Be stim	NRRL 3890	NRRL 5729	NRRL 5730	NRRL 5731	NRRL 11081	1
		mung						ro
	Agar							1
	Pepton-Eisen	S	grau-weiß	grau-weiß bis	Spuren grau	grau-grün	grau-grün
co			bis grau-grün	grau-grün	grün-weiß	weiß	weiß
CD CO		R	gelb	gelb	gelb	gelb	gelb
CD		O	Melanin ne	Melanin ne	Melanin ne	Melanin ne	Melanin ne
CO er»			gativ	gativ	gativ	gativ	gativ
O	Oalciummalat	S	leidlich bis	Spuren grau	Spuren grau	Spuren grau	Spuren grau
CD			gut grau-grün	grün	grün	grün	grün	ro
co		R	fahlgrau	fahlgrau	fahlgrau	fahl grau	fahlgrau	co
		O	Malat geht	Malat geht	Malat geht	Malat geht	Malat geht	CD cn
			nicht in Lö	nicht in	nicht in	nicht in	nicht in
			sung	Lösung	Lösung	Lö sung	Lösung
	Glukose-	S	grau-weiß bis	grau-weiß bis	leidlich grau	leidlich grau	leidlich grau
	Asparagin		grau-gelb	Spuren grün	weiß	weiß	weiß
		R	hellgelb bis	cremefarben	cremefarben	cremefarben	cremefarben
			cremefarben

TABEIiIE IV (Portsetzung):

Medium	Be	NRRL 3890	NRRL 5729	NRRL 5730	NRRL 5731	NRRL 11081	I	4—>
	stim						ENO	)622Q
	mung						VJI
Magermilch	S	weiß an der	weiß an der	weiß an der	weiß an der	weiß an der	I
		Kante bis	Kante bis	Kante	Kante	Kante
		hell-graugrün	graugrün-r ο s a
		gelb
	R	tiefgelb bis	gelb-	gelb-	gelb-	gelb-
		gelb-lohfarben	lohfarben	lohfarben	lohfarben	lohfarben
	O	gelb bis gelb-	gelb-loh	gelb-loh-	gelb-loh-	gelb-loh-
		lohfarbenes	farben es	farbenes	farbenes	farbenes
		Pigment,	Pigment,	Pigment,	Pigment »	Pigment,
		Casein geht	Casein geht	Casein geht	Casein geht	Casein geht
		während des	während des	während des	während des	während des
		Wachsens prak	Wachsens prak	Wachsens in	Wachsens in	Wachsens in
		tisch vollstän	tisch vollstän	Lösung	Lösung	Lösung
		dig in Lösung	dig in Lösung
Tyrosin	S	gut bis stark	gut bis stark	gut graugrün	gut graugrün	gut graugrün
		graugrün	graugrün
	R	rot-lohfarben	rot-lohfarben	rο t-1ohfarb en	rot-lohfarben	rot-lohfarben
		bis rotbraun	bis rotbraun
	O	rot-lohfarben	rot-lohfarben	rot-lohfar-	rot-lohfar-	rot-lohfar-
		bis rotbrau	bis rotbrau	benes Pigment	benes Pigment	benes Pigment
		nes Pigment	nes Pigment
		Tyrosin geht	Tyrosin geht	Tyrosin geht	Tyrosin geht	Tyrosin geht
		in Lösung	in Lösung	in Lösung	in Lösung	in Lösung

TABELLE IY (Fortsetzung):

	Medium Be	R	NRRL 3890	NRRL 5729	NRRL 5730	NRRL 5731	NRRL 11081	1
	stim							CTi I
	mung
	Xanthin S		gut graugrün	gut graugrün	gut graugrün	gut graugrün	gut graugrün
		bis gut le
		diglich an
		der Peripherie
	R	fahlgelb bis	fahlgelb bis	cremefarben	cremefarben	cremefarben
		cremefarben	cremefarben
co	O	Xanthin geht	Xanthin geht	Xanthin geht	Xanthan geht	Xanthin geht
CD		nicht in Lö	nicht in Lö	nicht in Lö	nicht in Lö	nicht in Lö	OO
CO		sung	sung	sung	sung	sung	0622Q
CO CJl	Nährstärke S	gut graugrün	gut graugrün	gut graugrün	gut graugrün	gut graugrün
O	R	creme-oliv-	creme-oliv-	creme-oliv-	creme-oliv-	creme-oliv-
co		farben	farben	farben	farben	farben
CD (D	O	Stärke wird	Stärke wird	Stärke wird	Stärke wird	Stärke wird
		hydrolysiert	hydrolysiert	hydrolysiert	hydrolysiert	hydrolysiert
	Hefeextrakt- S	g.ut bis stark	gut graugrün	gut graugrün	gut graugrün	gut graugrün
	Malzextrakt	graugrün
	fahlgelb-loh-	cremegelb-	cremegelb-	cremegelb-	cremegelb-
	farben bis	lohfarben	lohfarben	lohfarben	lohfarben
	cremegelb-
	lohfarben

TABELIE IV (Fortsetzung):

Medium Be- ERRL 3890 Stimmung

WRRL 5729

NRRL 5730

Bennets

cremefarben graugrün-weiß Spuren graubis stark bis stark cremefarben graugrün graugrün

gelb bis oliv cremefarben gelb bis oliv NRRL 5731

gelb

NRRL 11081

cremefarben graugrün-weiß

gelb-orange

CD
CD
OO
CO

Czapeks Saccharose

Maltose-Trypton

Hickey-Tresner (modifiziert)

S graugrün R graugrün

S stark graugrün

R oliv bis

orange-gelb

S stark graugrün R oliv-orange

graugrün graugrün

graugrün graugrün graugrün
graugrün

graugrün graugrün

gut bis stark graugrün-weiß fahlgrau-grün graugrün-weiß graugrün

oliv bis gelb gelb-olive gelb-orange cremefarben

stark graugrün

cremefarben graugrün-weiß graugrün

tief gelb- gelb-oliv
lohfarben

stark graugrün

oliv—orange

Pepton-Hefe- S extrakt-Eisen (ISP-6)

cremefarben bis fahlrosa

Melanin negativ

fahlrosa bis graugrün

Melanin negativ

cremefarben bis fahlrosa

Melanin negativ

cremefarben
mit Spuren
graugrün bis
fahlrosa

Melanin negativ

cremefarben bis fahlrosa

Melanin negativ

K) JsJ O

TABELLE IV (Fortsetzung):

Medium

O (O OO

O Ci O

Tyrosin (ISP-7)

Bestim mung

reine Gelatine

HBHI 3890

graugrün-weiß bis graugrün

fahlgelbgrün bis lohfarben

Melanin negativ

farbloses vegetatives Wachstum bis grau-weißes Iiuf twachs turn, zur Hälfte bis vollständig verflüssigt

NERL 5729

graugrün-weiß bis graugrün

fahlgelbgrün bis graucremefarben

Melanin
negativ

farbloses vegetatives Wachstum bis grau-weißes Luftwachstum, zur Hälfte bis vollständig verflüssigt

NREL 5730

NRRL 5731

NRRL 11081

graugrün

grau-cremefarben

Melanin negativ

grau-weißes Luftwachstum, vollständige Verflüssigung

graugrün

grau-cremefarben

Melanin
negativ

grau-weißes Luftwachsturn, vollständige Verflüssigung

graugrün

grau-cremefarben

Melanin negativ

graugrünweißes Luftwachstum, vollständige Verflüssigung

Nährmedium ν

weißes bis grau-weißes Luftwachsturn, ein Drittel bis vollständige Verflüssigung

weißes bis grau-weißes Luftwachstum, ein Drittel bis vollständige Verflüssigung

grau-weißes Luftwachsturn, vollständige Verflüssigung

Spuren grauweißes Luftwachstum,
vollständige Verflüssigung

grau-weißes Luftwachsturn, vollständige Verflüssigung

CD CD hO

TABELlE IV (Fortsetzung):

Medium

Bestim
mung

synthetische 0
Nitr.atbrühe

ERRL 3890

weißes bis rosa-creme farbenes Luftwachstum auf einem Oberflächenhäutchen, Wachstum durch das Medium hindurch, das Nitrat wird nicht zu Nitrit reduziert

NERL 5729

Spuren weißes
bis rosacremefarbenes
Luftwachstum
auf einem
Oberflachenhäut chen,
Wachstum durch
das Medium
hindurch, das
Nitrat wird
nicht zu Nitritreduziert

NRRL 5730

Spuren weißes Luftwachstum auf einem Oberflächenhäutchen, Wachstum durch das Medium hindurch, das Nitrat wird nicht zu Nitrit reduziert

NRRL 5731

Spuren weißes Luftwachstum auf einem Oberflächenhäutchen, Spuren Wachstum durch das Medium, das Nitrat wird nicht zu Nitrit reduziert

NRRL 11081

Spuren weißes Luftwachstum auf einem Oberflächenhäutchen, Wachstum durch das Medium hindurch, das Nitrat wird nicht zu Nitrit reduziert

Nitratnährmedium

O graugrünweißes Luftwachstum auf einem Oberfl achenhäut chen, flockiges Bodenwachstum, Nitrattest: weder Nitrat noch Nitrit vorhanden bzw. das Nitrat wird nicht zu Nitrit reduziert

graugrünweißes Luftwachstum auf
einem Oberflächenhäut-
chen, flockiges Bodenwachstum,
Nitrat wird
nicht zu
Nitrit reduziert

graugrünweißes Luftwachstum auf einem Oberflächenhäutchen, flockiges Bodenwachstum, das Nitrat wird nicht zu Nitrit reduziert

Spuren weißes Luftwachstum auf einem Oberflachenhäut c hen, kompaktes bis flockiges Bodenwachstum, Nitrat wird nicht zu Nitrit reduziert

graugrün-w e i ß e s Luftwachstum auf einem Oberfl achenhäut chen, flockiges Bodenwachstum, das Nitrat wird nicht zu NitritfO

reduziert °° O CD Ni

TABELLE IV (Fortsetzung):

	Medium	Be	IiRRL 3890	NRRL 5729	NRRL 5730	NBRL 5731	NRRL 11081	I
		stim						1 .1
		mung						O
	Lakmus-	0	cremefarbenes	rosa-lohfar-	lohfarbenes	grün-weißes	lohfarbenes	I
	milch		bis grünes	benes grau	Luftwachstum	Luftwachstum	Wachstum auf
			Luftwachstum	grünes Luft	auf einem	auf einem	einem Ober
			auf gelbem	wachstum auf	Oberflächen	Oberflächen	flächenring,
to			bis lohfar-	einem Oberflä	ring, Lakmus	ring, teil	teilweise Re
O			benem Ober	chenring,	wird redu	weise Reduk	duktion, teil
<£>			flächenring,	Lakmus wird	ziert,	tion, teil	weise Pepto-
CD			Lakmus wird	reduziert,	Peptonisie-	weise Pepto-	ni eierung,
VX			reduziert,	Peptonisie-	rung,	nisierung,	pH-Wert 7,4
*>.			Peptonisie-	rung,	pH-Wert 7,3	pH-Wert 7,1
O			rung, pH-	pH-Wert 7»3
60S			Wert 7» 3

OO O CD N> K3 CD

TABELLE V

Ausnutzung bzw. Verwertung von Kohlenstoffverbindungen durch Streptomyces espinosus-Kulturen in dem künstlichen Medium von Pridham and Gottlieb*

NREL NERL NEEL NEEL NEBL 3890 5729 5730 5731 11081

Vergleichsversuch (+)** (-)**

1. D-Xylose + +

2. L-Arabinose + +

3. Rhamnose + +

4. D-Fructose + (+)>+

5. D-Galactose + +

6. D-Glucose + +

7. D-Mannose + +

8. Maltose + +

9. Saccharose (+) (-)>0 10. Lactose + +

11 . Cellobiose + +

12. Eaffinose

13. Dextrin

14. Inulin

15. lösliche Stärke

16. Glycerin

17. Ducit

18. D-Mannit

19. D-Sorbit

20. Inosit

21. Salicin

22. Phenol

23. Kresol

24. Na-formiat

25. Na-oxalat

26. Na-tartrat

S09835/0608

-32- 280622Q

TABELLE V (Portsetzung):

	Na-sallicylat	NERL	NERL	NERL	NERL	NERL
	Na-acetat	3890	5729	5730	5731	11081
	Na-citrat	(+)**		(+)	(+)	(+)
	Na-succinat	-	-	-	—	—
Vergleichsversuch	(+)	(+)	(+)	(+)	(+)
27.	+	(+)	+	(+)	+
28.		(-)		W
29.
30.

+ = gute Ausnutzung

(+) = schlechte Ausnutzung

(-) = zweifelhafte Ausnutzung

- = kein Wachstum

*T.G-.Pridham und D.Gottlieb "The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination" in "J. Bacteriol.", Band 56, Seiten 107 bis 114 (1948).

**Ergebnisse aus verschiedenen Versuchen.

809835/0609

- 33 TABELLE VI

Ausnutzung bzw. Verwertung von Kohlenstoffverbindungen durch Streptomyces espinosus-Kultüren in dem künstlichen Medium von Shirling und Gottlieb*

NNRL NRRL NRRL NRRL NRRL 3890 5729 5730 5731 11081

Vergleichsversuch

negatives Basalmedium +** -,+**

positives Basalmedium

plus D-Grlucose + +

Kohlenstoffverbindungen

L-Arabinose

Saccharose

D-XyIöse

Inosit

D-Mannit ++ ++ ++ ++

D-Jructose ++> +,+ ++ -s-+

Rhamnose ++ ++ ++ ++

Raffinose - -

Cellulose

++ starke Ausnutzung
+ positive Ausnutzung
+ Ausnutzung zweifelhaft
- Ausnutzung negativ

* EcBοShirling und D₀ Gottlieb, "Methods for characterization of Streptomyces species" in "IntoJ = Syst„ Bacteriol,,"? Band 16, Seiten 313 bis 340 (1966)
** Ergebnisse aus verschiedenen Versuchen»

Die neue Verbindung gemäß der Erfindung bildet sich, wenn der sich ausbreitende Organismus in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen, aeroben Bedingungen wächst. Selbstverständlich können zur Herstellung begrenzter Mengen (an der erfindungsgemässen Verbindung) Oberflächenkulturen und Flaschen zum Einsatz gelangen. Der Organismus wird in einem Nährmedium mit einem Kohlenstofflieferanten, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat, und einer Stickstoffquelle, beispielsweise einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder eines eiweißartigen Materials wachsen gelassen. Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Glucose, brauner Zucker, Saccharose, G-lycerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melassen und dergleichen. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Gasein, Fischmehl, in Destillationsanlagen anfallende Feststoffe, Tierpeptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle und dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten zum Einsatz gelangen. Spurenmetalle, beispielsweise Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, brauchen dem Fermentationsmedium nicht zugesetzt zu werden, da als Bestandteile des Mediums vor seiner Sterilisation Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile zum Einsatz gelangen.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung kann bei jeder Temperatur, die das Mikroorganismuswachstum fördert, beispielsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 18° und 40°, vorzugsweise zwischen etwa 20° und 28⁰C ablaufen gelassen werden. In der Regel dauert eine optimale Gewinnung der betreffenden Verbindung etwa 3 bis 15 Tage. Das Fermentationsmedium bleibt während der Züchtung in der Regel neutral. Der End-pH-Wert hängt teilweise (sofern mitverwendet) von den vorhandenen Puffern und teilweise vom

809835/0609

.35- 280622Q

Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums ab.

Wenn die Züchtung in großen Gefäßen und Tanks vonstatten gehtf bedient man sich zur Beimpfung vorzugsweise der vegetativen Form und nicht der Sporenform des Mikroorganismus, um eine deutliche Verzögerung bei der Bildung der neuen Verbindung und die damit einhergehende unzureichende Ausnutzung der Anlage zu vermeiden. Folglich ist es zweckmäßig, (zunächst) in einer Nährbrühekultur, in einer über flüssigem N^ aufbewahrten Agarscheibe oder in einer geneigten Kultur einen vegetativen Impfstoff herzustellen, indem man die betreffende Nährbrühe und dergleichen mit einem aliquoten Teil aus einem Erdevorrat beimpft. Wenn auf diese Weise ein junger, aktiver, vegetativer Impfstoff erhalten wurde, wird dieser auf aseptischem Wege in große Gefäße oder Tanks übertragen. Das Medium, in dem der vegetative Impfstoff erzeugt wird, kann aus demselben oder einem anderen Medium, als es bei der Herstellung der erfindungsgemäßen neuen Verbindung verwendet wird, bestehen, solange der Mikroorganismus in dem betreffenden Medium nur gut wächst.

Zur Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindung kann man sich der verschiedensten Maßnahmen, beispielsweise einer Lösungsmittelextraktion, einer Verteilungschromatographie, einer Silikagelchromatographie, einer Flüssig/Flüssig-Verteilung in einer Graig-Vorrichtung, einer Adsorption an Kunstharzen oder einem Auskristallisieren aus Lösungsmitteln, bedienen.

Bei einem bevorzugten Verfahren zur Reindarstellung der erfindungsgemäßen Verbindung wird diese aus dem Kulturmedium durch Abtrennen des Mycels und ungelöster Feststoffe nach üblichen bekannten Verfahren, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren, und anschließende Extraktion des Antibiotikums aus dem Piltrat oder Zentrifugat

809835/0609

mit Hilfe eines geeigneten lösungsmittels für Aeanthomyein, beispielsweise einem mit Wasser nicht mischbaren Alkohol, vorzugsweise 1-Butanol» gewonnen. Der das gewünschte Antibiotikum enthaltende Lösungsmittelextrakt wird dann eingeengt und den später beschriebenen Reinigungsverfahren unterworfen.

Vor der Erläuterung geeigneter Reinigungsverfahren wird zunächst noch ein Alternatiwerfahren zur Reindarstellung der erfindungsgemäßen Verbindung geschildert. Das Aeanthomyein kann aus der Permentationsbrühe als ganzes durch Filtrieren derselben und anschließende Adsorption des Antibiotikums an ein nicht-ionisches Harz gewonnen werden. Geeignete nicht-ionische Harze sind beispielsweise nicht-ionische, makroporöse Mischpolymerisate von mit Divinylbenzol vernetztem Styrol. Nicht-ionische Harze dieses Typs werden unter den Handelsbezeichnungen Amberlite XAD-2 und ZAD-4 vertrieben und sind aus der US-PS 3 515 717 bekannt.

Zur Abtrennung des Acanthomycins aus der filtrierten Fermentationsbrühe eignen sich ferner Aktivkohle, Aluminiumtrioxid und verwandte Adsorptionsmittel.

Da Aeanthomyein eine saure Verbindung darstellt, können zur Gewinnung des Antibiotikums aus der filtrierten Permentationsbrühe Anionenaustauscher, z.B. die unter den Handelsbezeichnungen Dowex-1, Dowex 2, Dowex 21E oder Amberlite IRA-900, -IRA-904» -IR-45 vertriebenen Anionenaustauscher verwendet werden. Hierbei wird das Antibiotikum zunächst an das Harz adsorbiert und dann mit Hilfe wäßriger Lösungen anorganischer Säuren, Salze, wie Ammoniumchlorid, und Basen, wie Ammoniumhydroxid, verdünntem Natriumhydroxid und dergleichen, eluiert.

809835/0609

Nach der Gewinnung des Acanthomycins aus der Fermentationsbrühe wird das erhaltene Rohacant homy ein gereinigt, so daß man letztlich ein kristallines Reinacanthomycin erhält. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß sämtliche Rohacanthomyein enthaltende Zubereitungen einschließlich der Nährbrühe zu dem mit Antibiotika befaßten Fachmann bekannten Zwecken zum Einsatz gebracht werden können. So kann eine Rohacanthomyein enthaltende Zubereitung beispielsweise an Tiere verfüttert werden. Wenn man jedoch relativ reine Acanthomyeinzubereitungen benötigt, läßt sich das Rohaeanthomycin nach einem der geschilderten Verfahren oder offensichtlichen Äquivalenten hierzu reinigen.

Die das Rohaeanthomycin enthaltende Zubereitung wird zunächst mit einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise Äthylacetat und dergleichen, gemischt, um ein acanthomycinhaltiges Material auszufällen. Dieses Material wird durch Filtrieren isoliert und danach zwischen Wasser und einem geeigneten Lösungsmittel für Acanthomycin, beispielsweise 1-Butanol, verteilt. Danach wird die acanthomycinhaltige Lösungsmittelphase abgetrennt und mit Wasser gemischt. Der pH-Wert dieses Gemischs wird dann mit einer konzentrierten Base, z.B. Ammoniumhydroxid, auf einem basischen pH-Wert, beispielsweise etwa 7,9» eingestellt, worauf die Lösungsmittelphase von der wäßrigen Phase getrennt wird. Letztere wird dann mit einem Lösungsmittel für Acanthomycin extrahiert. Nun wird der acanthomycinhaltige Lösungsmittelextrakt auf einem geeigneten Harz, beispielsweise im Anionenaustauscher Amberlite IRA-904 in Chloridform, Chromatograph!ert. Die mit dem Anionenaustauscherharz gefüllte Chromatographiersäule wird mit wäßrigem Ammoniumchlorid eluiert.

Die bei den geschilderten chromatographischen Maßnahmen er-

809835/060

-3B-

haltenen aktiven Fraktionen werden erneut chromatographiert, um das Acanthomycin von Ammoniumchlorid zu trennen. Bei diesem chromatographischen Verfahren wird als Harz ein unter der Handelsbezeichnung Amberlite XAD-7 vertriebenes nicht-ionisches Harz verwendet. Zur Gewinnung von acanthomycinhaltigen Fraktionen bedient man sich als Eluiermittel eines Methanol/-Wasser-Gemischs. Die aktiven Fraktionen werden miteinander vereinigt, zur !Trockene eingedampft und schließlich gefriergetrocknet. Hierbei erhält man eine relativ reine Acanthomycinzubereitung .

Eine hochreine Acanthomycinzubereitung erhält man, wenn man die in der geschilderten Weise erhaltene, gefriergetrocknete Acanthomycinzubereitung unter Verwendung von DEAE-Sephadex (A-25) der Firma Pharmacia Fine Ohem., Uppsala, Schweden, chromatographiert. Die acanthomycinhaltige Zubereitung wird in Ammoniumchlorid gelöst, worauf die erhaltene Lösung über eine DEAE-Sephadex (A-25) enthaltende Säule laufengelassen wird. Die gegen B. subtilis und S. pyogenes aktiven Fraktionen werden gesammelt. Das Acanthomycin wird aus den restlichen drei Pools mit Hilfe chromatographischer Maßnahmen mit einem nicht-ionischen Harz, z.B. Amberlite XAD-7, isoliert.

Bei der Behandlung der Pools auf dem Amberlite XAD-7-Harz wird das Harz zur Acanthomycingewinnung mit einem Methanol/-Wasser-Gemisch eluiert. Das Ammoniumsalz des Acanthomycins erhält man durch Einstellen des pH-Werts dieser Fraktionen auf etwa 7»5 mit Ammoniumhydroxid.

Acanthomycin ist gegen S. aureus aktiv und kann zum Desinfizieren von mit diesen Bakterien verunreinigten, gewaschenen und gestapelten Nahrungsmittelutensilien verwendet werden. Ferner eignet es sich auch als Desinfektionsmittel für die verschiedensten mit S. aureus verunreinigten zahnmedizin!-

809835/0609

sehen und medizinischen Geräten. Ferner eignen sich Acanthomycin und seine Salze auch zum bakteriostatischen Spülen trockengereinigter Kleidungsstücke und zum Imprägnieren von Papier und Geweben. Schließlich eignen sich Acanthomycin und dessen Salze auch zur Unterdrückung des Wachstums empfindlicher Organismen "bei Plattentests und sonstigen mikrobiologischen Medien. Da Acanthomycin gegen B. subtilis aktiv ist, kann es auch bei der Lagerung von Erdölprodukten zur Bekämpfung bzw. Abtötung dieses Mikroorganismus , der bekanntlich bei der Lagerung von Erdölprodukten für eine Schleimbildung und Korrosion verantwortlich ist» verwendet werden.

Selbstverständlich ist das im vorliegenden lalle für den speziellen Mikroorganismus Streptomyces espinosus subsp. acanthus KREL 11081 (DSM ) beschriebene mikrobiologische Verfahren nicht nur mit diesem speziell hinterlegten Mikroorganismus durchführbar. Sofern irgendein anderer Mikroorganismus den detailliert geschilderten Züchtungsbzw. KuI tür eigenschaft en oder glatten Äquivalenten hierzu genügt, eignet er sich in gleicher Weise auch zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung. Ferner erstreckt sich die Erfindung auch auf Stämme oder Mutanten des detailliert beschriebenen Mikroorganismus» die man in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Bestrahlen des neuen Mikroorganismus mit Röntgenstrahlen oder UV-Strahlung, durch Stickstoffsenf (nitrogen mustard), Bakteriophageneinwirkung und dergleichen* erhält.

Da Acanthomycin eine saure Verbindung darstellt» bildet es sowohl mit anorganischen als auch organischen Basen Salze. So erhält man beispielsweise die Natrium-, Kalium-, Ammonium- oder Galciumsalze durch Neutralisieren einer Lösung von Acanthomycin in wäßrigem Methanol. Salze von Acanthomycin mit organischen Basen₅ primären, sekundären

809835/0SQi

oder tertiären Aminen, "beispielsweise Pyridin, Piperidin und dergleichen, erhält man durch Vermischen äquimolarer Mengen Acanthomycin und der gewünschten organischen Base.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nicht anders angegeben "bedeuten sämtliche Prozentangaben Gewichtsprozente und sämtliche Mengenangaben bei Lösungsmittelgemischen Volumenmengen.

Beispiel

Teil A: Fermentation

Ein Streptomyces espinosus subsp. acanthus NREl 11081 (DSM ) enthaltender geneigter Agar dient zum Beimpfen einer Reihe von 500 ml-fassenden Erlenmeyer-Kolben, von denen jeder 100 ml eines aus den folgenden Bestandteilen bestehenden sterilen Vorsaatmediums enthält:

Glucosemonohydrat 26 g/l

industriell hergestelltes Baumwollsaatmehl 25 g/l

mit Leitungswasser aufgefüllt auf 1 1

Der pH-Wert des Vorsaatmediums vor der Sterilisation beträgt 7 > 2. Der Vorsaatimpfstoff wird auf einem mit 250 üpm laufenden Drehrüttler einer Hubhöhe von 6,4 cm 3 Tage lang bei einer Temperatur von 28⁰C wachsen gelassen.

300 ml des in der geschilderten Weise zubereiteten Vorsaatimpfstoffs werden zum Beimpfen eines 20 1 eines sterilen Saatmediums mit den folgenden Bestandteilen*verwendet:

* enthaltenden Tanks

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Glucosemonohydrat 25 g/l

industriell hergestelltes Baumwollsaatmehl 25 g/l

Leitungswasser Rest.

Das beimpfte Saatmedium wird bei einer {Temperatur von 28⁰C 2 Tage lang unter Bewegen mit einer Geschwindigkeit von 400 Upm und unter Belüften mit 10 Standardlitern pro Minute bei einem Rückdruck von O_s7O3 kg/cm (Manometerdruck) inkubiert.

Nach der 2-tägigen Inkubation wird das Saatmedium zum Beimpfen eines 250 1 fassenden Eermentationstanks (5 1 Saatimpf stoff /100 1 Fermentationsmedium) mit einem sterilen Fermentationsmedium mit folgenden Bestandteilen verwendet ϊ

Handelsübliche (lösliche) Destillationsrückstände 40 g/l

NaCl · 5 g/l

NaNO₃ 10 g/l synthetisches Entschäumungsmittel 2 ml/l

mit Leitungswasser aufgefüllt Rest pH-Wert (Torsterilisation); 7*0

Der Permentationstank wird bei einer Temperatur von 28⁰C unter Bewegen mit einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 200 Upm und unter Belüften mit 150 Standardlitern pro Mi= nute bei einem Rückdruck τοη O₉703 kg/cm (Manometerdruck) inkubiert ο Die Ernte erfolgt in der Regel nach 3~ bis 12=tägiger Fermentation.

Die fermentation läßt sich mit Hilfe eines Scheiben-Plattentests unter Yerwendung von B„ subtilis als Testorganismus und entionisiertem Wasser als Yerdünnungsmittel verfolgen« Hierbei wird ein Einheitsvolumen (0?08 ml) einer

soe

die zu testende Substanz enthaltenden Lösung auf eine 12,7 mm-Papierscheibe aufgebracht. Die Papierscheibe wird danach auf eine Agarplatte (auf der der Testorganismus angesät ist) gelegt» worauf die Agarplatte 16 bis 18 h lang bei einer Temperatur von 32° bis 37⁰C inkubiert wird. Eine biologische Einheit (BTJ) wird als diejenige Konzentration des .Antibiotikums definiert, die unter Standardversuchsbedingungen eine 20 mm-Inhibierungszone liefert. So ist beispielsweise die Stärke einer Fermentationsbrühe, die zur Erzeugung einer 20 mm-Inhibierungszone auf 1:100 verdünnt ist, 100 BU/ml.

Teil B: Rückgewinnung

Die gesamte in der geschilderten Weise erhaltene Fermentationsbrühe (etwa 5000 l) wird durch Zugabe von 6n wäßriger Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,75 eingestellt. Danach wird die auf den angegebenen pH-Wert eingestellte "Vollbrühe" mit Hilfe eines FiIterhilfsmittels (Diatomeenerde) filtriert. Hierauf wird der Mycelkuchen mit 1000 Wasser gewaschen. Der gewaschene Filterkuchen wird verworfen. Die wäßrige Waschflüssigkeit wird mit dem klaren Filtrat vereinigt, worauf die erhaltene Lösung (5750 1) mit 1600 1 1-Butanol extrahiert wird. Die gebrauchte Brühe wird verworfen. Der Butanolextrakt wird auf ein Volumen von etwa 8 1 (4»5 kg) eingeengt. Dieses Material wird als Zubereitung ADA-117A bezeichnet.

Teil C: Reinigung Nr.1 Fällung:

Ein Liter der in der geschilderten Weise im Rückgewinnungsabschnitt isolierten Zubereitung ADA-117A wird unter Rühren in 10 1 Äthylacetat gegossen, worauf das Gemisch bei Raumtemperatur 1 h lang gerührt wird. Das hierbei ausgefallene acanthomycinhaltige Material wird durch Filtrieren isoliert und in der im folgenden beschriebenen

809835/0609

Weise weiterbehandelt.

Nr.2 Verteilung:

Der Niederschlag wird zwischen 2,5 1 Wasser und 2,5 1 1-Butanol verteilt. Die Butanolphase (ADA-31C) wird mit 7 1 Wasser gemischt, worauf der pH-Wert dieser Mischung mit konzentriertem Ammoniumhydroxid auf 7>9 eingestellt wird. Die beiden Phasen werden voneinander getrennt und als Butanol-Phase-1 und wäßrige-Phase-1 bezeichnet. Die wäßrige-Phase-1 wird danach dreimal mit jeweils 2,5 1 1-Butanol extrahiert, wobei der pH-Wert jeweils mit Ammoniumhydroxid auf 7,9 eingestellt wird. Die drei Butanolextrakte (Butanol-Phase-2, Butanol-Phase-3 und Butanol-Phase-4) werden mit der Butanol-Phase-1 vereinigt. Der vereinigte Extrakt wird als ADA-31D bezeichnet.

Eine Untersuchung der biologischen Aktivitäten liefert folgende Ergebnisse:

	S.pyo- B. genes	cereus	Zone	(mm)	S.lutea
Zuberei tung	36 36	18 16	S.aureus	B.subtilis	27 27
ADA-31C ADA-31D		20 24	23 26,5

Die die größte biologische Aktivität aufweisende Zubereitung ADA-31D wird wie folgt weiterbehandelt:

Nr.3 Chromatographie auf Amberlite IRA-904:

Die Säule wird unter Verwendung von 2 1 Amerlite IRA-904 Anionenaustauscher in Chloridform hergestellt.

809835/0609

Der in der geschilderten Weise hergestellte Butanolextrakt ADA-31D wird mit der Hälfte seines Volumens Methanol und der Hälfte seines Volumens Wasser gemischt, worauf die erhaltene Mischung mit einer Geschwindigkeit von 50 bis 70 ml/min durch die Säule fließengelassen wird. Der Säulenablauf wird in drei gleichen Fraktionen, die mit Ablauf 1, Ablauf 2 und Ablauf 3 bezeichnet werden und sich als biologisch inaktiv erwiesen haben, gesammelt.

Danach wird die Säule mit 6 1 Wasser gewaschen. Dieses Eluat, das als wäßriges Eluat bezeichnet wird, hat sich ebenfalls als biologisch inaktiv erwiesen.

Nun wird die Säule mit 2^igem wässrigem Ammoniumchlorid eluiert. Es werden Fraktionen von 20 ml aufgefangen, zu 5OO ml-Fraktionen vereinigt und dann getestet. Hierbei werden folgende Ergebnisse erhalten:

Zone (mm)

Fraktion S.pyogenes B.cereus S.aureus B.subitlis S.lutea Nr.

1	0	0	0	0	0
2	0	0	0	0	0
3	35	17	25	26,5	25
4	39	21	27,5	30	29
5	40	22	28,5	31	30
6	39	21	28	29,5	29,5
7	39	20,5	27,5	29,5	28,5
8	38	20	27	29	28,5
9	37	20	27	28,5	28,5
10	—	18	25	28	28
11	-	16,5	24	27,5	27,5
12	—	16	23	26,5	26,5
13	-	15,5	23	25,5	25
14	—	15,5	22,5	24,5	24,5
VJl	-	Spuren	21	22,5	23
16	—	0	18	18	17
17	—	0	0	0	0
18	_	_		_	—

809835/0609

Die Fraktionen Mr. 3 bis 18 werden miteinander vereinigt und mit 6n wäßriger Salzsäure auf einen pH-Wert von 5»5 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird als Ausgangsmaterial für die im folgenden beschriebenen chromatographischen Maßnahmen verwendet.

Nr.4 Amberlite XAD-7-Chromatographie.

Trennung des Acanthomycins von Ammoniumchlorid.

Die Säule wird unter Verwendung von 2 1 Amberlite XAD-7-Harz hergestellt.

Die in der geschilderten Weise erhaltene Lösung, die Acanthomycin in Mischung mit Ammoniumchlorid enthält, (8 1, pH-Wert 5»5) wird mit einer Geschwindigkeit von 80 bis 100 ml/min über die Säule laufengelassen. Der Ablauf wird in zwei gleichen Fraktionen aufgefangen, die mit Ablauf 1 und Ablauf 2 bezeichnet werden.

Danach wird die Säule mit 4 1 Wasser (Fließgeschwindigkeit: 80 bis 100 ml/min) gewaschen. Es werden vier gleiche Fraktionen, die mit wäßriger Ablauf 1,2, 3 und 4 bezeichnet werden, aufgefangen.

Schließlich wird die Säule mit einem 70:30 Volumengemisch Methanol/Wasser eluiert. Es werden Fraktionen von 20 ml aufgefangen. Eine Untersuchung zeigt folgende Ergebnisse:

809835/060

Zone (nun)

Fraktion Nr.	S.pyo-	S.aureus	B.cereus	B.sub-	S.lutea
	genes			tilis
Ausgangsmaterial	35	24,5	19	27,5	26
Ablauf 1	0	0	0	0	o
Ablauf 2	0	0	0	0	η
wäßriger Ab
lauf 1	0	0	0	0	0
wäßriger Ab
lauf 2	0	0	0	0	ο
wäßriger Ab
lauf 3	0	0	0	0	0
wäßriger Ab
lauf 4	0	0	0	0	0
Methanol/Wasser
10	0	0	0	0	0
20	0	0	0	0	0
80	0	0	0	0	0
90	42	29	23,5	35,5	37
100	40	28,5	24	33	35
110	30	19,5	Spuren	22,5	•24
120	24	Spuren	0	17,5	17
130	21,5	0	0	Spuren	Spuren
140	18	0	0	0	0
150	15,5	0	0	0	0
160	16	0	0	0	0
170	15	0	0	0	0
■ 180	Spuren	0	0	0	0
190	0	0	0	0	0
200	0	0	0	0	0

250

809835/0609

Die Fraktionen Nr. 85 Ms 125 werden miteinander vereinigt, worauf die erhaltene Lösung bis zum Erhalt einer wäßrigen lösung eingeengt und danach gefriergetrocknet wird. Hierbei erhält man eine 3>7 g Acanthomycin enthaltende Zubereitung ADA-34·1.

Unter Verwendung von 5»5 1 der in Teil B erhaltenen Zubereitung ADA-117A als Ausgangsmaterial und unter Durchführung des geschilderten Reinigungsverfahrens (Fällung, Verteilung, IRA-904-Chromatographie und XAD-7-Chromatographie) erhält man insgesamt 21,71 g Material hochaktiven Acanthomycins (Zubereitung ADA-113.4).

Das in der geschilderten Weise erhaltene hochreine Acanthomycin wird in der im folgenden geschilderten Weise mittels DEAE-Sephadex-Chromatographie noch weiter gereinigt .

5 DEAE-Sephadex-Chromatographie:

800 g DEAE-Sephadex (A-25) werden in einer 0*05n Ammoniumchloridlösung, deren pH-Wert mit Ammoniumhydroxid auf 8,5 eingestellt ist, aufgeschlämmt. Danach wird das Gemisch 12 h lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Schließlich wird das gequollene Harz in eine Säule gegossen, worauf diese mit 25 1 Lösungsmittel gewaschen wird.

20 g der in der geschilderten Weise erhaltenen Zubereitung ADA-113.4 werden in 200 ml des 0,05n Ammoniumchloridlösungsmittels eines pH-Werts von 8,5 gelöst, ivorauf die erhaltene Lösung auf die Säule aufgegeben wird« Das Eluieren der Säule erfolgt mit demselben Lösungsmittel» Die aufgefangenen Fraktionen werden hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität gegen B. subtilis und S₀ pyogenes getestet, wobei folgende Ergebnisse erhalten werden;

809835/060

28Q622Q

- 46 -

Zone (mm) fraktion. Nr. Volumen (1) B.subtilis S.pyogenes

1	2,0	0	5	0
2	2,0	0	5	0
■7.	8,5	0		0
4	12,0	0	5	0
5	4,0	0	5	0
6	4,0	0		0
7	3,0	0		0
S	12,0	0		0
9	4,0	15		24
10	3,5	17		28
11	9,0	20		28
12	7,5	21		28,5
13	8,5	21		30
14	6,0	23		30,5
15	9,0	22,		31,5
16	4,0	22,		31,5
17	3,0	21		30,5
18	12,0	20,		30,5
19	4,0	20,	30
20	4,0	20	30
21	12,0	20	30
22	9,0	20	31
23	3,0	21	31
24	12,0	19	29,5
25	4,0	19	29,5
26	4,0	18	29,5
27	9,0	19	29
28	12,0	-	-
29	4,0	18	28
30	4,0	18	27,5
31	12,0	17	28
32	12,0	17	27

809835/0609 _O.-.:S!NAL inspected

Zone (mm) Fraktion Fr. Volumen (1) B.subtilis S.pyogenes

33	12,0	17,5	26
34	12,0	17	26
35	10,0	17	25
36	12,0	17	25
37	7,0	15	24
38	12,0	15	23,5
39	12,0	Spuren	23,5
40	12,0	0	24
41	7,0	0	25
42	12,0	0	-
43	12,0	0	_

Es werden folgende Pools gebildet:

Pool I: Fraktionen ITr. 9 "bis Nr. 12

Pool II: Fraktionen Nr.13 bis Nr. 20

.PoolIII: Fraktionen Nr.21 bis Nr. 43

etwa 24 1 etwa 50,5 1 etwa 214 1

Das Acanthomycin wird aus den gebildeten Pools in der im folgenden geschilderten Weise durch Amberlite XAD-7-Chr omat ο graphi e g e r e ini gt:

A) Isolierung des Acanthomycins aus Pool I. Amberlite XAD-7-Chromatographie.

Zur Herstellung der Säule wird 1 1 Amberlite XAD-7 verwendet. Der pH-Wert des Pool I wird mit 6n wäßriger Salzsäure auf 3,0 eingestellt» worauf der Pool I mit einer Fließgeschwindigkeit von 25 ml/min über die Säule fließengelassen wird» Der Säulenablauf hat sich als biologisch inaktiv erwiesen und wird verworfen. Danach

wird die Säule mit 3 1 Wasser gewaschen. Die wäßrige Waschflüsaigkeit ist ebenfalls Mologisch inaktiv, weswegen sie verworfen wird. Schließlich wird die Säule mit einem 70:30 Volumengemisch Methanol/Wasser eluiert. Es werden 20 mlfassende Fraktionen aufgefangen. Eine Untersuchung dieser Fraktionen liefert folgende Ergebnisse:

Zone (mm)

Fraktion Nr.	B.subtilis	S.pyogenes
10	0	0
20	0	0
30	0	0
40	0	0
50	20,5	23,5
60	25	29,5
70	26	32,5
SO	27	34
90	26,5	34,5
100	26	34,5
110	25,5	33,5
120	25,5	32
130	24	31
140	23	31
150	21,5	28,5
160	20	27,5
170	18	24,5
180	16	22
190	0	18
200	0	16
210	0	0

400 0 0

809835/0609

Die Fraktionen Nr. 46 "bis 200 werden miteinander vereinigt, mit Aimoniumhydroxid auf einen pH-Wert von 7»5 eingestellt und "bis zum Erhalt einer wäßrigen Lösung eingeengt. Letztere wird gefriergetrocknet, wobei man die Zubereitung ADA-44.1» 550 mgCAcantkomycinammoniumsalz) erhält.

B) Isolierung von Acanthomycin aus Pool II. Amberlite XAD-7-Ohromatographie.

Zur Herstellung der Säule werden 2 1 Amberlite XAD-7 verwendet. Der pH-Wert des Pool II wird mit 6n wäßriger Salzsäure auf 3,0 eingestellt. Hierbei bildet sich ein Niederschlag, der abfiltriert und getrocknet wird (ADA-45). Dieses Material liefert in der folgenden beschriebenen Weise kristallines Acanthomycin. Das Filtrat wird mit einer Geschwindigkeit von 50 ml/min über die Säule laufengelassen. Der Säulenablauf hat sich als biologisch inaktiv erwiesen und wird verworfen. Danach wird die Säule mit 6 1 Wasser gewaschen. Auch die wäßrige Waschflüssigkeit ist biologisch inaktiv und wird verworfen. Nun wird die Säule nochmals mit 6 1 Wasser gewaschen. Auch diese wäßrige Waschflüssigkeit ist biologisch inaktiv und wird verworfen. Schließlich wird die Säule mit einem 70:30 Volumengemisch Methanol/Wasser eluiert. Es werden 20 ml fassende Fraktionen aufgefangen. Eine Untersuchung derselben liefert folgende Ergebnisse:

	Zone	(mm)
Fraktion Nr.	B.subtilis	S.pyogenes
10	0	0
20	0	0
140	0	Spuren
150	0	15
160	0	16
170	0	16

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Zone (mm)

Fraktion ITr.	B.subtilis	S.pyogenes
180	0	18
190	16	22
200	19	25
210	22	29
220	24	33,5
230	27	33,5
240	27,5	36
250	28,5	38
260	28	37,5
270	28	38,5
280	27	34,5
290	27	53,5
300	26	33
310	25,5	32
320	24	51
530	23,5	29
340	25	29,5
350	22	29
360	21	29
370	20,5	27,5
380	21	28
590	20	27
400	19,5	26
410	19,5	26
420	19	25
450	19	24
440	18	25
450	17	25,5
460	17	23
470	17	25
480	16	22

809835/0609

Danach, wird die Säule mit Methanol-O,05n Ammoniumliydroxid eluiert. Es werden 20 ml Fraktionen aufgefangen. Eine Untersuchung derselben liefert folgende Ergebnisse:

	Zone	(mm)
Fraktion Nr.	B.subtilis	S.pyogenes
10	15,5	21,5
20	15	21
30	15	21
40	16	20,5
50	16	19,5
60	15	17,5
70	15	19
80	15	20,5
90	17	23,5
100	20	27,5
110	25	33
120	26	34,5
150	20	25,5
140	0	Spuren

Es werden folgende Kombinationen zubereitet:

I: Fraktionen Nr. (Methanol/Wasser: 70:30) 190 bis 219 II: Fraktionen Nr. (Methanol/Wasser:70:30) 220 bis 399 III: Fraktionen Nr. (Methanol/Wasser:70:30) 440 bis 483

IV: Fraktionen Nr. (Methanol/O₉O5n NH,OH:

70:30) ⁴ 100 bis 140

Die vereinigten Lösungen werden zur Trockene eingeengt, wobei folgende Zubereitungen erhalten werden?

Is Aeanthomycin (Zubereitung ADA-46,3) 70 mg Hi Acanthomycin (Zubereitung ADA-46«4) 450 mg Ills Acanthomycin (Zubereitung ADA-46.5) 50 mg

IV: Acanthomycinammoniumsalz

(Zubereitung ADA-46.6) 250 mg

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Wie bereits erwähnt» wird ein beim Ansäuern des Pool II gebildeter Niederschlag abfiltriert und mit Zubereitung ADA-45 bezeichnet. Beim Verreiben dieses Materials mit Methanol und anschließendem Eindampfen der methanolischen lösung zur Trockene erhält man einen kristallinen Rückstand. Dieser wird mit Ä'ther verrieben, wobei man farbloses kristallines Acanthomycin erhält. Dieses wird abfiltriert und getrocknet, wobei man 420 mg Zubereitung ADA-46.1 erhält.

C) Isolierung des Acanthomycin aus Pool III. Amberlite XAD-7-Chromatographie.

Zur Herstellung der Säule werden 3 1 Amberlite XAD-7 verwendet .

Der pH-Wert des Ausgangsmaterials, nämlich von Pool III, wird mit 6n wäßriger Salzsäure auf 3>0 eingestellt, worauf die Lösung mit einer Fließgeschwindigkeit von 75 ml/min über die Säule laufengelassen wird. Der Säulenablauf hat sich als biologisch inaktiv erwiesen und wird verworfen. Danach wird die Säule mit 9 1 Wasser gewaschen. Die wäßrige Waschflüssigkeit hat sich ebenfalls als biologisch inaktiv erwiesen und wird verworfen. Das Eluieren der Säule erfolgt mit einem 70:30 Volumengemisch Methanol/Wasser. Es werden 20 ml fassende Fraktionen gesammelt. Eine Untersuchung derselben liefert folgende Ergebnisse:

	Zone (mm)	.pyogenes
Fraktion Nr.	B.subtilis S	0
10	0	0
20	0	0
120	0	18
130	0	20
140	0

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	Zone	5	(mm)
Fraktion Wr.	B.subitlis		S.pyogenes
150	Spuren		23
160	16		27
170	17		30
180	19		31,5
190	21		33,5
200	22		34
210	24		35
220	25,		36,5
230	26		37
240	27	■ 5	38
250	27		39
260	27		38
270	27		39
280	27		39
290	27		39
300	27		39
310	27		38
320	28		37,5
330	27.		37
340	27	.5	37
350	26		37,5
360	26		37
370	25	.5	37
380	24		36
390	24	,5	36
400	24	34,5
420	24	34
440	23	33
460	22,	32
480	22	32
500	22	31.5
520	21,	31
540	21	30
560	20,	31

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	Zone	(mm)
Fraktion Nr.	B.subtilis	S.pyogenes
5faO	21	31
600	21	30,5
620	21	31
640	21	30
660	20,5	31
6bO	21	31
700	21	31
720	21	31,5
740	21	51
760	21	31
7&0	20,5	30,5
800	20	30,5
820	19,5	30
840	19,5	30
860	19	29,5
880	18	29
900	18	28
920	18	28
940	18	28

Danach wird die Säule mit Methanol/0,05n Ammoniumhydroxid eluiert. Es werden 20 ml Fraktionen aufgefangen und untersucht. Dabei werden folgende Ergebnisse erhalten:

	Zone	(mm)	pyogenes
Fraktion Nr.	B.subtilis	S.	29
10	19		28,5
20	18		28
30	18		28
40	18		27
50	18

809835/0609

	Zone	(mm)	.pyogenes
Fraktion Wr.	B.subtilis S	26
60	17	26
70	16	26
80	16	26
90	16	26
100	16,5	25,5
110	16	31
120	22	38
130	28	41
HO	30,5	38
150	28	28,5
160	17,5	20,5
170	O	20,5
180	O	20,5
190	O	20
200	O	18 17,5 17 17 18 16,5 16
220 240. 260 280 300 320 340	O O O O O O O	16,5
360	O	17
380	O	17,5
400	O	16
420	O	0
440	O

500 0 0

Schließlich werden folgende Kombinationen zubereitet:

Pool IA: Fraktionen Nr. 170 bis 400 (Methanol/Wasser: 70:30)

Pool HA: Fraktionen Nr. 401 bis 950 (Methanol/Wasser: 70:30) und Nr. 10 bis 100 (Methanol/O,05n DII)

809835/0609

— pb —

Pool IIIA: Fraktionen Hr. 115 Ms 170 (Methanol/O,05η NH,OH).

Pool IA wird zur Trockene eingeengt. Der hierbei erhaltene Verdampfungsrückstand wird mit 50 ml Methanol verrieben. Bas hierbei gebildete farblose unlösliche kristalline Acanthomycin wird durch Abfiltrieren isoliert und dann getrocknet, wobei man 210 mg Zubereitung ADA-49.1 erhält. Das Filtrat wird mit einem Gemisch aus Äther und einer Mischung aus isomeren Hexanen (1:1) gemischt, wobei man weitere 500 mg amorphes Acanthomycin (ADA-49.2) erhält.

Der Pool HA liefert in entsprechender Weise kristallines Acanthomycin (Zubereitung ADA-49.3) in einer Menge von 220 mg und amorphes Acanthomycin (Zubereitung ADA-49.4) in einer Menge von 300 mg.

Der Pool IHA wird bis zum Erhalt einer wäßrigen Lösung eingeengt und danach gefriergetrocknet, wobei man 800 ml Acanthomycinammoniumsalz (Zubereitung ADA-49.5) erhält.

809835/0609

eerse i

Claims (6)

1. Henkel, Kern, Feiler & HänzeS Patentanwälte

   Möhlstraße 37 D-SOOD München SO

   ΪΗΕ UPJOHN -COMPANY*

   TeJ.: 089/982085-87

   Kalamazoo, Mich., V.St.A. Telex: O529JB02hnldd

   Telegramme: ellipsoid

   CIiSE 3315

   PAf ElTAKSPRÜdE

   Gegen Staphylococcus aureus wirksames Antibiotikum Acantliomycin, das in im wesentlichen reiner Form .gek-ennist durch::

   a5 die -empirische ^Formel

   Ts) die folgende Elementaranalyset C β ^81 %; ■ H = 6^-47 %} m - 12,36'^ und 0 {aus der Differenz zu 100) 31,36 96;

   c) eine optische Drehung ΐ«3^ von -28,5° (c_} 1₃ Dimethylsulfoxid);

   d) eine Löslichkeit in Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, seine schwache Löslichkeit (etwa Ibis2 mg/ml) in Methanol und Äthanol und seine relative Unlöslichkeit in Wasser, Äther, halogenierten Kohlenwasserstofflösungsmitteln und gesättigten Kohlenwasserstofflösungsmitteln und die Löslichkeit seiner Salze, z.B. Ammonium- und Natriumsalze, in Wasser und niedrigen Alkoholen;

   -Z-Ö09835/0G03

   ORIGINAL INSPECTED

   e) ein Äquivalentgewicht von 2159;

   f) ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum (in Lösung) in einem Miiaeralölgemisch (entsprechend Fig. 1) und

   g) ein charakteristisches UV-Absorptionsspektrum (in Methanol) entsprechend Flg. 2-,

   sowie seine Baseadditionssalze.
2. 2. AmmoniumsaTz des Acanthomycins gemäß Anspruch 1,
3. 3. Verfahren zur Herstellung von Acanthomycin, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptoayces -esplnosus subsp* acanthus NRRL 11081 (DSM ) und Mutanten hiervon ranter aeroben Bedingungen in einem -wässrigen Nähr-Idzw. Fermentationsmedium so lange züchtet., bis das Fermentationsmedium eine merkliche Antibiotikumaktivität erhalten hat und daß man das gebildete Acanthomycin ,reindarstellt,
4. 4. Biologisch reine Kultur des neuen Mikroorganismus Streptomyces espinosus subsp. acanthus NSRL 11081 (DSM }, -die bei der Sichtung In einem assimilierbaren Xohlenstoff- und Stickstofflieferanten sowie anorganische Substanzen enthaltenden wäßrigen Hährmedlum eine relnflarstellbare bzw. gewinnbare Menge des Antibiotikums xicarithomycln liefert.
5. 5. Verfahren zur Reindarstellung von Acanthomycin nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man

   a) eine Acanthomycin enthaltende Fermentationsbrühe klar filtriert;

   b) zur Gewinnung von Rohacanthomycin die erhaltene klare Brühe mit einem Lösungsmittel für Acanthomycin extrahiert;

   SG9835/QGQ3

   c) das Rohacanthomycin zur Bildung eines acanthomycinhaltigen Niederschlags mit Äthylaeetat in Berührung

   d.) deir erhaltenen Niederschlag zur Fildung einer

   acanthomycinhaltigen Butanolphase zwischen Wasser und "E-Butano! verteilt;

   e} die Butanolphase zur Gewinnung von acanthomycinhaltigen Fraktionen auf e-inenr Änionenaustauseher ehromatorgraphiert und

   f) die erhaltenen Fraktionen zur Darstellung von Reinacanthomycin auf einem nicht-ionischen, makroporösen Mischpolymerisat von mit einem Divinylbenzolharz vernetztem Styrol, chromatographiert.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Anionenaustauscherharz Amberlite IRA-904 in CMaridform verwendet.

   T. Verfahren nacii Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, ctaß man als nicht-ionisches Harz Amberlite XAD-? verwendet*