Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia akantomycyny.Akantomycyne, bedaca cennym antybiotykiem, sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie prowa¬ dzac hodowle nowego drobnoustroju Streptomyces espinosus subsp. acanthus NRRL 11081, na pozyw¬ ce wodnej w warunkach fermentacji tlenowej. An¬ tybiotyk ten oraz jego sole addycyjne z zasadami odznaczaja sie wlasciwoscia przeciwdzialania wzro¬ stowi bakterii Gram-dodatnich, np. Staphylococcus aureus i Streptococcus hemolyticus. Akantomycy¬ ne i jej sole addycyjne z zasadami mozna stoso¬ wac pojedynczo lub w mieszaninie z innymi an¬ tybiotykami w celu zapobiegania wzrostowi lub zmniejszenia liczby bakterii w róznych srodowi¬ skach.Akantomycyna ma nastepujace wlasciwosci che¬ miczne i fizyczne. Wzór empiryczny — (C9oHi39Ni9042)n, ciezar równowaznikowy — 2159, wyniki analizy elementarnej — dla podanego wzo¬ ru obliczono: C—50,06%; H—6,48%; N—12,38%; O—31,12%; znaleziono: C—49,81%; H—6,47%; N— —12,36%; O—iz róznicy) —31,36%.Kat skrecalnosci optycznej akantomycyny [a]^5 wynosi — 28,5° (c = 1, dwumetylosulfotlenek).Akantomycyna w postaci wolnego kwasu roz¬ puszcza sie w dwumetyloformamidzie i dwume- tylosulfotlenku, slabo rozpuszcza sie w metanolu i etanolu (okolo 1—2 mg/ml) i jest prawie nieroz- 2 puszczalna w wodzie, eterze, chlorowcowanych weglowodorach i nasyconych weglowodorach, sto¬ sowanych jako rozpuszczalniki.Sole akantomycyny (amonowa i sodowa) sa roz¬ puszczalne w wodzie i w nizszych alkoholach.Akantomycyna miareczkowana KOH w rozpusz¬ czalniku, stanowiacym mieszanine dwumetylofor- mamidu i 60% wodnego roztworu etanolu o wza¬ jemnym stosunku skladników 1:1, wykazuje N cie¬ zar równowaznikowy 2159. Poddawana chromato¬ grafii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym (produkcji firmy Merck and Co.,) przy uzyciu mie¬ szaniny chloroform — etanol — woda (w stosunku objetosciowym 2:3:1) wykazuje wspólczynnik Rf = 0,52.Akantomycyna ma charakterystyczne widmo ab¬ sorpcji w podczerwieni w próbkach w zawiesinie w oleju mineralnym, jak przedstawiono na ry¬ sunku na fig. 1. Piki obserwuje sie przy dlugos¬ ciach fali (wyrazonych w cm-1) podanych w tab¬ licy 1.Akantomycyna ma równiez charakterystyczne widmo absorpcyjne w podczerwieni, gdy jest spra¬ sowana w krazek z KBr. Piki obserwuje sie przy dlugosciach fal (wyrazonych w cm-1), podanych w tablicy 2.Akantomycyna ma charakterystyczne widmo ab- 30 sorpcyjne w ultrafiolecie, oznaczane w metanolu, 10 15 25 108 6053 Tablica 1 «l€iqctotliw.as6,.~w^której A 1 N^stepiija prajzki (Liczby falow) 3280 . i 3U7U 2960 2930 3860 2650 1723 1656 1643 1540 1463 1415 1378 1341 1278 1268 1240 1223 1145 1187 1098 1065 1033 1002 960 943 920 847 723 699 Intensywnosc S M S S s w M S, (przegiecie) S S s M M M M M M M W, (przegiecie) M W W W W W W W W W M Symbol S stosowany w tablicy 1 oznacza ,,slaby", M — „sredni", a symbol w — „slaby".Tablica 2 Czestotliwosc, w której wystepuja prazki (Liczby falowe) 1 3390 3290 3060 2960 2930 2880 2650 1724 1652 1533 1455 1412 1385 1340 1273 1223 | 1183 Intensywnosc 2 1 S /(przegiecie) S M M M M W M (przegiecie) S s M M M M M M M 1 1 1140 1095 1067 1030 1000 960 920 875 737 698 2 M (przegiecie) W W W w w w w w M przedstawione na rysunku na fig. 2, a wartosc imax w metanolu wynosi 262 (a = 16,81).Wlasciwosci biologiczne akantomycyny. Aktyw¬ nosc przeciwbakteryjna akantomycyny badano w typowej próbie probówkowej, stosujac jako sro¬ dowisko bulion odzywczy. Minimalne stezenie a- kantomycyny hamujace wzrost S.aureus wynosi 50 mikrogramów/ml, a S.lutea — 25 mikrogramów/ml.Dodatkowe badania na typowych krazkach o sred¬ nicy 12,7 mm daja wyniki, podane w tablicy 3.Tablica 3 Stezenie akantomycyny mg/ml 10 5 2,5 1,25 0,62 0,31 Strefa hamowania wzrostu (mm) Streptococcus pyogenes 41,5 40 40 38,5 36,5 34 Staphylococcus aureus 29,5 28,5 28 26,5 24,5 22,5 Bacillus cereus 26 . 25 23 21 20 17 Bacillus subtilis 34 33 31,5 30 28 26 Sarcina lutea 35 34 32 30 27 25 Akantomycyne badano takze in vivo na myszach 81 laboratoryjnych. Myszy, zakazone S.pyogenes, chro¬ niono przez podskórne podawanie akantomycyny stwierdzajac, ze wartosc CD50 wynosi w tym przy¬ padku 0,23 (0,17—0,31) mg/kg, a dla myszy zaka¬ zonych S.aureus wartosc CD50 wynosi 1,0 mg/kg. 05 Do wytwarzania akantomycyny stosuje sie drob¬ noustrój Streptomyces espinosuJsi subsp. acanthus NRRL 11081. Próbki hodowli tego drobnoustroju sa na zadanie ogólnodostepne ze stalej kolekcji Northern Regional Research Laboratory, U. S. De- *• partament of Agriculture, Peoria, Illinois, USA.W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 697 380 opisano kulture promieniow¬ ców, wyizolowana z próbki gleby w poludniowo- wschodnim Teksasie, okreslona jako Streptomyces «• espinosus. Cztery dalsze kultury, wyizolowane z108 605 $ gleb poludniowo-wschodniego Teksasu maja ten sam model kolorystyczny wedlug Ektachrome, co typowa hodowla. W rozszerzonych badaniach wy¬ izolowanych hodowli stwierdzono, ze maja one ten sam typ sporoforów i zarodników oraz ogólna charakterystyke taka sama, jak hodowla typowa.Wyjatkowymi cechami tych hodowli jest szaro¬ zielone zabarwienie napowietrznej czesci hodowli, krótkie sporofory z okraglymi, ciernistymi zarod¬ nikami i odpornosc na podwyzszona temperature.Róznica cech charakterystycznych hodowli (patrz tablice) i wlasciwosci antagonistyczne nie wystar¬ czaja na przyznanie tym nowym wyizolowanym hodowlom drobnoustrojów oznaczenia nowych od¬ mian. Trzy z nich opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 833 475 sa zdeponowane i dostepne pod numerami NRRL 5729, NRRL 5730 i NRRL 5731. Czwarty izolat opi¬ sano tutaj jako Streptomyces espinosus subsp. a- canthus, NRRL 11081.Do scharakteryzowania tej kultury stosowano sposoby, opisane przez A. Dietz (Dietz A. 1967, Streptomyces steffisburgensis sp. n. J. Bacteriol, 94, 2022—2026) a czesciowo przez Shirlinga i Got- tlieba (Shirling, E. B. i D. Gottlieto, 1966, Methods for Characterization of Streptomyces Species, Int.J. Syst. Bacteriol., 16, 313—340). Kulture te ho¬ dowano takze na agarze Hickey — Tresnera (Hic- key R. J. i H. D. Tresner, 1952, A cobaltcontaining medium for sporulation of Streptomyces, species, J. Bacteriol, 64: 891—892), modyfikowanym [Pep- tikaza (enzymatyczny wyciag kazeiny) podstawiony za N ¦—Z Aminy A].Opisywane kultury maja nastepujaca charakte¬ rystyke. Charakterystyka kolorystyczna hodowli: napowietrzna czesc hodowli ma barwe szarozie¬ lona i jest melaninowo — ujemna. Wyglad na Ek¬ tachrome (Dietz, A., 1954, Ektachrome transpa- rencies as aids in actinomycete classification, Ann.N. Y. Acad. Sci, 60: 152—154) podano w tablicy 4.Odnosne charakterystyki barw podano w tablicach 5 i 6. Kultury te mozna umiescic w serii kolory¬ stycznej o barwie zielonej (GN) wedlug Tresnera i Backusa (Tresner, HD., i E. J. Backus, 1963. Sy¬ stem of Color wheels for streptomycete taxonomy).Applied Microbiol. 11: 335—338.Badania mikroskopowe pozwalaja stwierdzic krótkie sporofory, od prostych do kretych, od ksztaltu otwartej spirali do spiralnych (RF, RA, 10 15 20 So. 35 40 S) wedlug oznaczen, przyjetych przez Pridhama l innych [Pridham, T. G., C. W. Hesseltine, i R. G.Bededict, 1958, A gide for the classification of Streptomycetes according to selected groups. Pla- cement of strains in morphological sections. Ap¬ plied Microbiol. 6: 52—79], Zaobserwowano zarod¬ niki w wiekszosci kuliste, przy czym wiele z nich wykazuje wyrazne pokrewienstwo. Zarodniki po¬ wierzchniowe sa cierniste do dolczastych wedlug oznaczen Dietz i Mathews (Dietz A. and J. Mat- hews, 1971, Classification of Streptomyces spore surfaces into five groups, Applied Microbiol. 21: 527—533). Niektóre kolce wykazuja podobienstwo do wlosów. Kolce wystepuja obficie i mozna je obserwowac na zarodnikach, poddanych obróbce metoda replikacji weglowej, opracowanej przez Dietz i Mathews (Dietz A and J. Mathews, 1962, Taxonomy by carbon replkation. I. An examina- tion of Streptomyces hygroscopiens. Applied Mi¬ crobiol. 10: 258—263).Wlasciwosci hodowlane i biochemiczne stosowa¬ nej kultury podano w tablicy 7.Zuzywanie wegla przez opisywana hodowle oz¬ nacza sie, okreslajac jej wzrost na zwiazkach wegla w syntetycznej pozywce Pridhama i Got- tlieba (Pridham, T. G. and D. Gottlieb 1948. The utilization of carbon compounds by some Actino- mycetales as an sid for species determination.J. ^ Bacteriol. 56: 107—114), jak przedstawiono w tablicy 8 i w syntetycznej pozywce Shirlinga i Gottlieba, op. cit. 313—340, jak przedstawiono w tablicy 9.Wplyw temperatury na hodowle opisywanej kul¬ tury jest nastepujacy. W temperaturze 18°C i 55°C uzyskuje sie wzrost dosc dobry, w tempe¬ raturze 24°C dobry, a w temperaturze 28—37°C obfity. W temperaturze 45°C uzyskuje sie wzrost dosc dobry (wegetatywny) w ciagu 24 godzin i obfity godzin. Jako podloze stosuje sie agar Bennetta, agar zawierajacy sacharoze Czapka, agar malto- zowo-tryptonowy i agar Hickey-Tresnera (mody¬ fikowany).Wlasciwosc wytwarzania antybiotyku: Sjespino- sus NRRL 5729, NRRL 5730 i NRRL 5731 wytwa¬ rzaja antybiotyk linkomycyne, a S.espinosus subsp. akanthus, NRRL 11081 wytwarza akanto- mycyne.Tablica 4 Wyglad hodowli Streptomyces espinosus wedlug Ektachrome * ....... _. . . Pozywka agarowa L . i Benneta 1 i Ozna¬ czenie 2 S R NRRL 3890 3 szarozielona bladozólto- brazowa i - - ¦" NRRL 5729 4 szarozielona blado- zóltobrazowa -- - ¦- NRRL 5730 5 biala do szarozielonej blado- zóltobrazowa - NRRL 5731 6 szarozielona blado* zóltobrazowa - -;i NRRL 11681 j 7 ,| szarozielona 1 blado- zóltobrazowa 1108 605 l i Cd. tabl. 4 1 1 Cukier trzcinowy Czapeka maltozowo- tryptonowa peptonowo- zelazowa 0,l*/o tyrozyna kazeinowo- skrobiowa f 2 S R S R S R S R S R I szarozielona bladoszara szarozielona zóltobrazowa do oliwkowej biala zólta bezbarwna czerwona szarozielona bladoszaro- zielona 4 szarozielona bladoszara szarozielona zóltobrazowa do oliwkowej biala zólta bezbarwna czerwona szarozielona bladoszaro- zielona 5 szarozielona bladoszara szarozielona zólta biala zólta bezbarwna czerwona szarozielona bladoszaro- zielona 6 szarozielona bladoszara szarozielona zóltobrazowa biala zóltobrazowa szarozielona czerwona szarozielona bladoszaro- zielona 7 szarozielona bladoszara szarozielona blado- zóltobrazowa biala zólta {szarozielona czerwona szarozielona bladoszaro- zielona | Oznaczenia Stosowane W tablicy4: * Dietz A. 1954. Ektachrome transparancies as aids in S — grzybnia powierzchniowa, actinomycete classjification Ann. N. V. Acad. Sci. 60: A — grzybniapodstawowa. 152 — 154.Tablica 5 System barwnej charakterystyki hodowli Streptomyces espinosus Pozywka agarowa 1 1 Benneta Zawierajaca cukier trzcinowy Czapeka Maltozowo- tryptonowa Hickeya Tresnera (zmodyfiko¬ wana) slodowo- drozdzowa (ISP-2) . - - :¦ j A -g 9 s o S 2 1 S R P S • R P S . R P S R P S R P | Color Harmony Manual, wydanie 3, 1948 * NRRL 3890 3 a 24Vtfe lVige XVica 2fb 2ec — lii 2ig lec 2ig — lig lVfge lih 2ge 2ec 2gc i Vige — lig 2gc — 24 Vtih 2ih 21e 2gC NRRL 5729 4 a 24V«ih lge 1 V*ca 2fb 2ec — lii 2ig lec 2ig — 24 V*fe lih 2gc 1 V*ge — lig 2ec — 24 V2ih 2ih 2gc 2ie NRRL 5730 5 a 24Vaih lV2gC — 2ig 2fe — 3ba 24 V2ih 2ic — 3ba 24 Vtih 2gc — 24 Vrih 21e — NRRL 5731 6 24V*fe 2ec 1 ViWC — 2ig lec — 24 Vtfe 1 V«ie — 24 V2ih 2gc — 24 V2ih 2gc *— | NRRL 11081 7 24V2ih 2ca 2ic — 2ig 1 2fe — 24 V2ih 1 2ie — | 24 V2ih I 2ec — 1 24 Viih 1 21e — j§ Cd. tabi. | 1 1 2 | 3 4 Owsiana (ISP-3) Zawierajaca sole nieorga¬ niczne i skrobie (ISP-4) Glicerynowo- -asparaginowa Bennetta Zawierajaca cukier trzcinowy Czapeka Maltazowo- tryptonowa Hickeya Tresnera (zmodyfiko¬ wana) Slodowo- drozdzowa (ISP-2) S 1.1 P S R P S R P S R P S R P S R P S R P S R P lig 1 V2ig lec 1 Vzge 24 Vaih 3ih 2ca 2gc 2ec lig 2ih 1 ec 2ge lig 1 2fe lec 2ec 24V2ih lih 2gc 2ec a 2fe 2gu 5 24 V2f e 2ec 24 V2ih 2gc 2ec 3ba 24 V2fe 2ge NBS Circular 553, 1955** 263gm 122gm 109gm 89gm 87g 89m 90gm UOgm UOg 112m 121m 122g 110g 112m 109gm UOg 109gm 112m 113g 90gm 90gm 90gm 109gm 109gm UOg 90gm 122m 127g 122m 113g 88gm 94g 90gm 263gm 122m 127g 109gm 89gm 87g 89m 90gm HOrm 112m 112m 121m 122g UOg 112m 122gm 112m 113g 90gm 109gm 109gm UOg 90gm 122m 127g 122m 113g 90gm 91gm 94g 263gm 122m 127g 102g 105gm UOg 112m 94g 112gm 122m 127g 87gm 127g 90gm 122m 127g 88gm 94g 6 | 7 24 V2ih 2ec 24 V2ih 2ec 2ig 1 V»ig 2ge 122gm 90gm 90gm 93m UOg 112m 121m 122g 122gm 106gm 122m 127g 90gm 122m 127g 90gm 24V2fe 2tC 24 Vaih 2gc ¦ 2ec 24 Vsih 2ig i 122m 127g 86gm 87gm UOg 112m 94g 112gm 122m 127g 91gm 94g 106g 122m 127g 90gm 122m 127g 88gm 94g108 605 11 12 Cd. tabl. 5 1 1 Owsiana (ISP-3) Zawierajaca sole nieor¬ ganiczne i skrobie (ISP-4) Glicerynowo- asparaginowa (ISP-5) 2 S R P S R P S .... R P 3 109gm IlOg 121m 109gm — 122m 113g 265m 89gm 90gm 90gm 109gm IlOg 112m 113g 121m 122g 94m 109gm — 4 109gm IlOg 94g 112gm 121m 90gm — 122m 112m 113g 90gm 90gm 263gm 94g 112gm 90gm 94m 109gm - 5 122gm 90gm — 122m 90gm 90gm — 122gm 94m 109gm — 6 122gm 90gm — 122m 90gm UOg 112m — 94m 109gm — 1 7-1 122gm 90gm — 122m 90gm 90gm 122m 127g UOg 112m — S — grzybnia powierzchniowa, R — grzybnia podsta- 1948. Color Harmony Manual, wydanie 3. Container Cor- wowa, P — pigment, m — matowa, g — blyszczaca, poration of America, Chicago, Illinois. gm — skrawek grzybni powierzchniowej blyszczacy lub ** Kelly, K. L., and D. B. Judd. 1955. The ISCC-NBS matowy. methodof designating colors and a dictionary of color * Jacobson, E., W. C. Granville, and C. E. Foss. names. U. S. Dept. Comm. Circ. 553.Tablica 6 Zestaw barw stosowanych w tablicy 5 Color Harmony Manual, wyd. 3, 1948 * NBS Circular 553, 1955 ** Oznaczenie barwy skrawka grzybni 1 a lec lge lig lih lii lV2ca 11/2ec 1 Vagc | lV2ge Nazwa barwy 2 biala jasnocytrynowoszara, kit cytrynowoszara oliwkowoszara oliwkowoszara jasnooliwkowojasnobrunatna .. kremowa biszkoptowa, barwa niebielonego plót¬ na, barwa owsianki, barwa piaskowa brudnozólta jasnooliwkowoszara Oznaczenie barwy skrawka grzybni 3 263gm 121m 122g 109gm 109gm UOg 112m 113g 127g llOgm 89gm 90gm 93m 102g 105gm 109gm Nazwa barwy 4 biala bladozóltozielona szarawozóltozielona jasnoszarooliwkowa jasnoszarooliwkowa szarawooliwkowa jasnooliwkowoszara oliwkowoszara szarawooliwkowozielona szarawooliwkowa bladozólta szarawozólta zóltawoszara umiarkowanie zielonkawozólta szarawozielonkawozólta jasnoszarawooliwkowa10S 605 13 14 C. d. t a b 1. 6 1 lV2ie lV2ig 2ca 2ea 2ec 2fb 2fe 2gc 2ge 2ic 2ie 2ig 2ih 21e 3ba 3ih 24 V«fe 24 Vrih 2 jasnooliwkowa oliwkowoszara barwa jasnej kosci sloniowej lub skorupki jajka jasna barwa pszenicy lub jasna barwa kukurydzy biszkoptowa, barwa niebielonego plót¬ na, barwa owsianki, barwa piaskowa barwa bambusa, plowozólta, slomko¬ wa, barwa pszenicy szara barwa bambusa, barwa irchy jasnobrunatna miodowozlota, jasnozlota jasnomusztardowa, jasnobrunatna barwa dachówek, jasnobrunatna ciemnoszara musztardowa, barwa starego zlota perlowa, odcien muszli bezowoszara, mysia jasna barwa jemiolowoszara jemiolowoszara / 3 106gm — 89gm 86gm 90gm 87g 89m 94g 122gm 90gm 94m 109gm 1 87gm 91gm 94g 106g UOg 112m 112m 113g 88gm 94g — 113g 265m 122gm 122m 127g 4 jasnooliwkowa — bladozólta jasnozólta szarawozólta umiarkowanie zólta, bladozólta jasnooliwkowobrazowa jasnooliwkowoszara szarawozólta jasnooliwkowobrazowa jasnoszarawooliwkowa umiarkowanie zólta ciemnoszarawozólta jasnooliwkowobrazowa jasnooliwkowa szarawooliwkowa jasnooliwkowoszara jasnooliwkowoszara oliwkowoszara ciemnozólta jasnooliwkowobrazowa — oliwkowoszara umiarkowanie szara szarawozóltozielona szarawozóltozielona szarawozóltozielona * Jacobson, E., W. C. Grarwille, and C. E. Foss. 1948. ** Kelly, K. L., and D. B. Judd. 1955. The ISCC-NBS Color Harmony Manual, wydanie 3. Container Corpo- method of designating colors and a dictionary of co- ration of America, Chicago, Illinois. lor names. U. S. Dep. Comm. Circ. 553.Tablica 7 Hodowlana i biochemiczna charakterystyka hodowli Streptomyces espinosus Pozywka 1 Agar Peptonowo- zelazowy zawierajacy jablczan wapniowy Ozna¬ czenie 2 S R O S R O NRRL 3890 3 szarobiala do szarozielonej zólta melanina- ujemna dosc dobra do dobrej szaro¬ zielonej bladoszara jablczan nie rozpuszcza sie NRRL 5729 4 szarobiala do szarozielonej zólta melanina- ujemna sladowa szaro¬ zielona bladoszara jablczan nie rozpuszcza sie NRRL 5730! 5 sladowa sza- rozielonobia- la zólta melanina- ujemna sladowa sza¬ rozielona bladoszara jablczan nie rozpuszcza sie NRRL 5731 6 s zarozielono- biala zólta melanina- ujemna sladowa sza¬ rozielona bladoszara jablczan nie rdzpuszcza sie NRRL 11081 7 szarozielo- nobiala zólta melanina- ujemna sladowa sza¬ rozielona bladoszara jablczan nie rozpuszcza sie15 108 605 18 C. d. tabl. 7 1 1 glikozowo- asparaginowy z odtluszczo¬ nego mleka tyrozynowy ksantynowy skrobiowy slodowo- Bennetta 2 S R S R O S R O s R O S R O s R S 3 szarobiala do szarozóltej jasnozólta do kremowej biala na brze¬ gach do jasno- szarozielonozóltej gleboko zólta do zóltojasno- brunatnej pigment o barwie zóltej do zólto- jasnobrunatnej kazeina rozpusz¬ cza sie w czasie wzrostu calkowicie dobra do obfitej szaro¬ zielonej czerwonojasno- brunatna do czerwonobrazo- wej pigment o barwie czer- wonojasnobru- natnej do czer- wonobrazowej tyrozyna rozpuszcza sie dobra szarozielona do dobrej tylko na obrzezach bladozólta do kremowej ksantyna nie rozpuszcza sie dobra szarozielona kremowo- oliwkowa , skrobia hydrolizuje dobra do obfitej szarozielonej bladozóltojasno- brunatna do kremowo- zóltojasnobru- natnej kremowa do obfitej szarozielonej 4 szarobiala do sladowo- zóltej kremowa biala na brze¬ gach do szaro- zielonorózowego zóltojasno- brunatna pigment o bar¬ wie zóltojasno- brunatnej kazeina roz¬ puszcza sie w czasie wzrostu calkowicie dobra do obfitej szarozielonej czerwonojasno- brunatna do czerwonobrazo- wej pigment o bar¬ wie czerwono- jasnobrunatnej do czerwono- brazowej, tyro¬ zyna rozpuszcza sie dobra szarozie¬ lona bladozóltozie- lona do kremo¬ wej ksantyna nie rozpuszcza sie dobra szarozie¬ lona kremowo- oliwkowa skrobia hydro¬ lizuje dobra szarozie¬ lona kremowozólto- jasnobrunatna szarozielonobia- la do obfitej szarozielonej 5 dosc dobra szarobiala kremowa biala na brzegach zóltojasno- brunatna pigment o barwie zólto- jasnobrunat¬ nej kazeina rozpuszcza sie w czasie wzrostu dobra szaro¬ zielona czerwono- jasnobru- natna pigment o barwie czer- wonojasno- brunatnej tyrozyna rozpuszcza sie dobra sza¬ rozielona ' kremowa ksantyna nie rozpuszcza sie dobra szaro¬ zielona kremowo- oliwkowa skrobia hy¬ drolizuje dobra sza¬ rozielona kremowozól- tojasnobru- natna sladowa sza- rpkremowa 6 dosc dobra szarobiala kremowa biala na brzegach zóltojasno- brunatna pigment o barwie zólto- jasnobrunat- nej, kazeina rozpuszcza sie w czasie wzrostu dobra sza¬ rozielona czerwono ja- snobrunatna pigment o barwie czer- wonojasno- brunatnej tyrozyna roz¬ puszcza sie dobra sza¬ rozielona kremowa ksantyna nie rozpuszcza sie dobra sza¬ rozielona kremowo- oliwkowa skrobia hy¬ drolizuje dobra sza¬ rozielona kremowozól- tojasnobru- natna kremowa 7 dosc dobra szarobiala kremowa biala na brzegach zóltojasno- brunatna pigment o barwie zól- tojasnobru- natnej, kaze¬ ina rozpusz¬ cza sie w czasie wzro¬ stu dobra sza¬ rozielona czerwonoja- snobrunatna pigment o barwie czer¬ wonojasno¬ brunatnej tyrozyna roz¬ puszcza sie i dobra szaro¬ zielona kremowa ksantyna nie rozpuszcza sie dobra sza¬ rozielona kremowo- oliwkowa skrobia hy¬ drolizuje dobra sza¬ rozielona kremowozól- tojasnobru- natna szarozielono- biala108 605 17 1S C. d. t a b 1. 7 1 l [ zawierajacy cukier trzcinowy Czapeka maltozowo- tryptonowy Hickeya- Tresnera (modyfiko¬ wany) peptonowo- drozdzowo- zelazowy (ISP-6) tyrozynowy (ISP-7) Zelatyna zwykla odzywcza Bulion azotanowy syntetyczny 1 2 R~~ S R S R S R S O s R O O o o 3 zólta do oliwkowej szarozielony szarozielony obfita ' szarozielona oliwkowa do pomaranczo- wozóltej obfita szarozielona oliwkowo- pomaranczowa kremowa do bladorózowej melanina ujemna szarozielono- biala do sza¬ rozielonej bladozóltozielo- na do jasnobru- natnej melanina ujemna grzybnia wegetatywna bezbarwna do grzybni powie¬ trznej szarobia- lej, uplynnianie 1/2 do calkowi¬ tego grzybnia powietrzna szarobiala uplynnianie 1/3 do calkowitego na powierzchni blonki grzybnia powietrzna bia¬ la do kremowej, wzrost poprzez podloze, azotany nie redukuja sie do azotynów 4 kremowa do oliwkowej szarozielony szarozielony dobra do obfi¬ tej szarozielonej oliwkowa do kremowej obfita szaro¬ zielona kremowa bladorózowa do szarozielonej melanina ujemna szarozielonobia- la do szarozie¬ lonej bladozóltozie- lona do szaro- kremowej melanina ujemna | grzybnia wege¬ tatywna bez¬ barwna do grzybni po¬ wietrznej szaro- bialej, uplyn¬ nianie 1/2 do calkowitego grzybnia po¬ wietrzna biala do szarobialej uplynnianie 1/3 do calkowitego na powierzchni blonki sladowy wzrost grzybni powietrznej bia¬ lej do rózowo- kremowej, wzrost poprzez podloze, azotany nie redukuja sie do azotynów 1 5 zólta szarozielony szarozielony szarozielo- nobiala zólta szarozielo- nobiala gleboka zól- tojasnobru- natna kremowa do bladorózowej melanina ujemna szarozielona szarokremo- wa melanina ujemna grzybnia po¬ wietrzna sza¬ robiala, uplynnianie calkowite grzybnia po¬ wietrzna sza¬ robiala, uplynnianie calkowite na powierz¬ chni blonki sladowy wzrost grzy¬ bni powietrz¬ nej bialej, wzrost po¬ przez podlo¬ ze, azotany nie redukuja sie do azoty¬ nów | 1 6 1 zólta szarozielony szarozielony bladoszaro- zielona zólto- oliwkówa szarozielona zóltooliwko¬ wa kremowa ze sladami sza- f rozielonej do bladorózowej melanina ujemna szarozielona szarokremo- wa melanina ujemna grzybnia po¬ wietrzna sza¬ robiala, uplynnianie calkowite grzybnia po¬ wietrzna sla¬ dowa szaro- 1 biala, uplyn¬ nianie calko¬ wite na powierz¬ chni blonki sladowy wzrost bialej grzybni po¬ wietrznej, wzrost po¬ przez podlo¬ ze, azotany nie redukuja sie do azoty¬ nów 1 1 7 zóltopoma- ranczowa szarozielony szarozielony szarozielono- biala zóltopoma- ranczowa obfita sza¬ rozielona oliwkowopo- maranczowa kremowa do bladorózowej melanina ujemna szarozielona szarokremo- wa melanina ujemna grzybnia po¬ wietrzna sza- rozielonobia- la, uplynnia¬ nie calkowite grzybnia po¬ wietrzna sza¬ robiala, u- plynnianie calkowite na powierz¬ chni blonki sladowy wzrost bialej grzybni po¬ wietrznej, wzrost po¬ przez podlo¬ ze, azotany nie redukuja sie do azo- 1 tynów108 605 19 20 C. d. tabl. 7 1 ' * azotanowy odzywczy mleko lakmusowe 2 | 3 O O na powierzchni blonki grzybnia powietrzna sza- rozielonobiala na dnie grzybnia klaczkowata, próba azotano¬ wa ani azotany ani azotyny nie wystepuja w podlozu lub azo¬ tany nie redu¬ kuja sie do azo¬ tynów grzybnia po¬ wietrzna o bar¬ wie kremowej do zielonej wzrasta na grzybni powie¬ rzchniowej 0 ksztalcie pier¬ scienia o barwie zóltej do jasno- brunatnej, lak¬ mus redukuje sie, zachodzi peptynizacja pH=7,3 4 na powierzchni blonki grzybnia powietrzna sza- rozielonobiala, na dnie grzyb¬ nia klaczkowa¬ ta, azotany nie redukuja sie do azotynów grzybnia po¬ wietrzna o bar¬ wie rózowoja- snobrunatnej do szarozielonej wzrasta na grzybni po¬ wierzchniowej o ksztalcie pier¬ scienia, lakmus redukuje sie, zachodzi pepto- nizacja, pH=7,3 5 na powierz¬ chni blonki grzybnia po¬ wietrzna sza- rozielono- biala, na dnie grzyb¬ nia klaczko¬ wata, azota¬ ny nie redu¬ kuja sie do azotynów na pierscie¬ niach grzyb¬ ni powierz¬ chniowej wzrasta grzy¬ bnia po¬ wietrzna 0 barwie ja- snobrunatnej, lakmus re¬ dukuje sie, zachodzi pep- tonizacja, pH=7,3 6 na powierz¬ chni blonki sladowa grzybnia po¬ wietrzna bia¬ la, na dnie grzybnia zbi¬ ta do klacz- kowatej, azo¬ tany nie re¬ dukuja sie do azotynów na pierscie¬ niach grzyb¬ ni powierz¬ chniowej wzrasta grzybnia po¬ wietrzna sza- robiala, cze¬ sciowa re¬ dukcja, cze¬ sciowa pep- tonizacja, pH=7,l 7 na powierz¬ chni blonki grzybnia po¬ wietrzna sza- rozielonobia- la, na dnie grzybnia klaczkowata, azotany nie redukuja sie do azotynów na pierscie¬ niach grzyb¬ ni powierz¬ chniowej wzrasta grzy¬ bnia po¬ wietrzna ja- snobrunatna, czesciowa re¬ dukcja, cze¬ sciowa pep- tonizacja, PH=7,4 S — grzybnia powierzchniowa P — pigment R — grzybnia podstawowa O — inne cechy charakterystyczne Tablica 8 Wykorzystywanie zwiazków wegla przez Streptomyces espinosus w czasie hodowli na syntetycznej pozywce Pridhama i Gottlieba * 1 Próba porów¬ nawcza 1. D-ksyloza 2. L-arabinoza 3. ramnoza 4. D-fruktoza 5. D-galaktoza 6. D-glikoza 7. D-mannoza 8. maltoza 9. sacharoza 10. laktoza 11. cellobioza 12. rafinoza 13. dekstryna . 14. inulina 15. skrobia roz- i puszczalna ¦16. gliceryna NRRL 3890 2 (+ )** + + + + + + + + (+) + + (+) + (+), (—) + + NRRL 5729 3 (—) ** + + + (+ ), + + + + + (-), <+) + + (-) + <-) + + NRRL 5730 4 /(+) + + + + + + + + < + ) + + (+) + (+) + + NRRL 5731 5 (+ ) + + + + + + + ..+ (¦+) ,+ .+ (+ ) + (+) + .+ NRRL 11081 6 ( + ) + + + + + + +. . + <¦+ + + ( + ) + ( + ) + +108 605 21 22 Dalszy ciag tablicy 8 1 17. ducitol 18. D-mannit 19. D-sorbit 20. inozyt 21. salicina 22. fenol 23. krezol 24. mrówczan sodowy 25. szczawian sodowy 26. winian so¬ dowy 27. salicylan sodowy 28. octan sodowy 29. cytrynian sodowy 30. bursztynian 2 (+), <—) + .+, <—) + (+) (+), <—) — (+), - (+,<—) (+), <(-) — <+) .'¦+ <¦+,- <—) 3 (—) *+ (-) (+ ) <+ ) (-) •— (—), — (+ ), (-) (-), - «— ( +) ¦(+) (-) ( ^ <+) + + + + <+) — <+) <+) <+) i— <+) + <+) 1 » (+) .+ + + (+) (+) (+) (+) (+) — (+) (+) (+) .6 <+) + + ¦ . + (+) (+) — (+) (+) (+) — (+) + (+) + = dobre wykorzystanie * Pridham, T. G.t and D. Gottlieb. 1948. The utili- (+) = zle wykorzystanie zation of carbon compounds by some Actinomycetales (—) = watpliwe wykorzystanie as an aid for species determination. J. Bacteriol. 56: — — =f brak wzrostu 107 — 114.** Wyniki z innych badan, Tablica 9 Wykorzystanie zwiazków wegla przez Streptomyces espinosus w hodowli na syn¬ tetycznej pozywce wedlug Shirlinga i Gottlieba * Próba kontrolna Pozywka pod¬ stawowa nie za* wierajaca zwiazków wegla Pozywka pod¬ stawowa zawie¬ rajaca D-glikoze Zwiazki wegla L-arabinoza sacharoza D-ksyloza inozyt D-mannit D-fruktoza ramnoza rafinoza celuloza NRRL 3890 ±** + ±, ++ — ++ ++ ++ ++ + + — +, ++ NRRL 5729 - ±** + ±, + ±, - ±, + + ±, + + + ± + + + — ±, — NRRL 5730 ± + ± — ++ ++ + + ++ + + — + NRRL 5731 . ± ~ + ± — ++ ++ ++ + + ++ — + " NRRL 11081 ± + - — '+'+ ++ ++ ' -h + + '+ — + ++= silnewykorzystanie * Shirling, E. B. and D. Gottlieb.. 1966. Methods for += dodatkowe wykorzystanie characterization of Streptomyces species. Int. J. Syst. ±= watpliwe wykorzystanie Bacteriol. 1*: 313—140. .-?= brakwykorzystania. •• Wyniki z innych badan.108 605 23 24 Sposobem wedlug wynalazku nowy zwiazek wy¬ twarza sie, hodujac wytwarzajacy go organizm w wodnej pozywce w hodowli podpowierzchniowej w warunkach fermentacji tlenowej. Zrozumiale jest takze, ze do wytwarzania ograniczonej ilosci tego zwiazku stosuje sie hodowle powierzchniowa i hodowle, prowadzona w kolbach. Organizm ho¬ duje sie na pozywce, zawierajacej zródlo wegla, np. przyswajalne weglowodany, i zródlo azotu, np. zwiazek, zawierajacy przyswajalny azot lub ma¬ terial proteinowy. Do korzystnych zródel wegla nalezy glikoza, cukier brunatny, sacharoza, glice¬ ryna, skrobia, krochmal zbozowy, laktoza, dek¬ stryny, melasa i tym podobne. Korzystne zródlo azotu stanowi wyciag namokowy kukurydzy, droz¬ dze, autolizowane drozdze browarniane ze staly¬ mi skladnikami mleka, maka sojowa, maka z na¬ sion bawelny, maka z kukurydzy, mleko w prosz¬ ku, wyciag pankreatynowy kazeiny, maczka ryb¬ na, stale pozostalosci gorzelniane, wyciagi pepto¬ nu zwierzecego, odpadki miesa i kosci itd. Ko¬ rzystnie stosuje sie rózne polaczenia tych zródel wegla i azotu. Nie ma potrzeby dodawania do sro¬ dowiska fermentacji sladowych ilosci metali, np. cynku, magnezu, manganu, kobaltu, zelaza i po¬ dobnych metali, gdyz jako skladniki tego srodowi¬ ska przed jego sterylizacja stosuje sie wode wodo¬ ciagowa i substancje nieoczyszczone.Proces wedlug wynalazku mozna prowadzic w dowolnej temperaturze, zapewniajacej zadowalaja¬ ce wzrastanie drobnoustroju, np. w temperaturze 18—40°C, korzystnie 20—28°C. Na ogól optymalne wytwarzanie zwiazku uzyskuje sie w ciagu 3—15 dni. Podczas fermentacji odczyn pozywki pozosta¬ je zwykle obojetny. Ostatecznie wartosc pH zalezy czesciowo od ewentualnej zawartosci substancji buforowych, a czesciowo od poczatkowej wartosci pH pozywki hodowli.Gdy hodowle prowadzi sie w duzyioh naczyniach i zbiornikach, do szczepienia hodowli korzystnie stosuje sie wegetatywna, a nie zarodnikowa po¬ stac drobnoustroju, aby uniknac zdecydowanego zahamowania wytwarzania nowego zwiazku i to¬ warzyszacego temu malo wydajnego wykorzysty¬ wania urzadzen. W zwiazku z tym, pozadane jest wytwarzanie inokuluni w postaci wegetatywnej w pozywce hodowli bulionowej przez zaszczepianie tej hodowli bulionowej podwielokrotna iloscia próbki gleby, tamponem /^garowroi, przechowywanym nad cieklym azotem lub hodowla na skosie agarowym.Gdy uzyska sie w ten sposób swieze, aktywne we¬ getatywnie inokuluni, przenosi sie je w warun¬ kach aseptycznycl; do duzego naczynia lub zbior¬ nika. Pozywka, w której wytwarza sie wegeta¬ tywne inokulum moze byó taka sama lub TÓzna od uzywanej do wytwarzania nowego zwiazku, otrzy¬ mywanego sposobem wailug wynalazku tak dlu¬ go, dopóki uzysku e sie iobre wzrastanie drobno¬ ustroju.Nowy zwiazek, wytwarzany sposobem wedlug wynalazku, mozna wydzielac i oczyszczac róznymi sposobami, np. pracz ekstrakcje rozpuszczalnikiem, chromatografie na, bibule, chromatografie na zelu krzemionkowym, *ozdzte* ciecz — ciecz w apara^ 20 25 cie Craiga, adsorpcje na zywicach i krystalizacje z rozpuszczalników.Korzystnie zwiazek, wytwarzany sposobem we¬ dlug wynalazku, wyosobnia sie z hodowli przez 5 oddzielenie w znany sposób grzybni i nierozpusz¬ czalnych substancji stalych, np. przez odsaczenie lub odwirowanie. Antybiotyk wyosobnia sie z prze¬ saczu lub odwirowanej brzeczki przez ekstrakcje odpowiednim rozpuszczalnikiem, rozpuszczajacym 19 akantomycyne, np. alkoholami, nie mieszajacymi sie z woda, korzystnie butanolem-1. Ekstrakt w rozpuszczalniku, zawierajacy antybiotyk, zateza sie, a nastepnie oczy$zcza, jak opisano dalej.Przed ujawnieniem sposobów oczyszczania, nale- ^ zy najpierw ujawnic alternatywne sposoby odzy¬ skiwania antybiotyku. Akantomycyne mozna wy¬ osobniac z calosci brzeczki fermentacyjnej przez jej przesaczenie, a nastepnie adsorpcje antybiotyku na zywicy niejonowej. Do odpowiednich niejono¬ wych zywic naleza niejonowe makroporowate ko¬ polimery styrenu, sieciowane dwuwinylobenzenem.Niejonowe zywice tego typu, wprowadzane na ry¬ nek pod nazwami handlowymi Amberlite XAD-2 i XAD-4, omówiono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 515 717.Do wyosobniania akantomycyny z przesaczonej brzeczki fermentacyjnej mozna ponadto stosowac wegiel aktywny, tlenek glinu i podobne adsorben- Poniewaz akantomycyna jest zwiazkiem o cha¬ rakterze kwasnym, do wyosobniania antybiotyku z przesaczonej brzeczki fermentacyjnej mozna sto¬ sowac anionowe zywice jonowymienne, takie jak 35 sulfonowane kopolimery styrenu i dwuwinyloben- zenu typu np. Dowex-l, Dowex-2, i Dowex-21K (produkcji Dow Chemical Co., St. Zjedn. Amery¬ ki), lub aminowane kopolimery styrenu i dwuwi¬ nylobenzenu typu Amiberlite IRA-900, IRA-904 i 40 IR-45 (produkcji Rohm and Haas Co., St. Zjedn.Ameryki). Antybiotyk adsorbuje sie na zywicy, a nastepnie eluuje, stosujac wodny roztwór kwa¬ sów nieorganicznych, soli takich jak chlorek amo¬ nowy i zasad takich, jak wodorotlenek amonowy, 45 rozcienczony wodorotlenek sodowy i podobne.Po odzyskaniu akantomycyny z brzeczki fermen¬ tacyjnej, odzyskany produkt poddaje sie zabiegom oczyszczajacym, prowadzacym do uzyskania o- czyszczonego, krystalicznego preparatu aikantomy- 60 cyny. Nalezy jednak stwierdzic, ze do wielu ce¬ lów mozna stosowac dowolne surowe preparaty, zawierajace akantomycyne z brzeczka fermenta¬ cyjna wlacznie. Na przyklad, takie surowe prepa¬ raty moga byc stosowane jako karma dla zwie- 55 rzat. Gdy pozadane sa stosunkowo czyste prepara¬ ty akantomycyny, mozna je otrzymywac przez o- czyszczanie surowych preparatów, jak opisano da¬ lej.Surowy preparat akantomycyny miesza sie naj- 60 pierw z odpowiednim rozpuszczalnikiem np. octa¬ nem etylu lub podobnym, aby wytracic osad, za¬ wierajacy akantomycyne. Osad ten odsacza sie i nastepnie wytrzasa z woda i rozpuszczalnikiem, rozpuszczajacym akantomycyne, np. takim jak bu- W tanol-l, Oddziela sie faze rozpuszczalnika, zawis-108 605 25 rajaca akantomycyne i nastepnie miesza z woda.Wartosc pH mieszaniny doprowadza sie do warto¬ sci, odpowiadajacej odczynowi zasadowemu, np. do okolo 7,9, dodajac stezona zasade, np. wodorotle¬ nek amonowy. Otrzymane fazy, rozpuszczalnikowa i wodna, rozdziela sie, a nastepnie faze wodna ekstrahuje rozpuszczalnikiem, rozpuszczajacym a- kantomycyne. Ekstrakt rozpuszczalnikowy, zawie¬ rajacy akantomycyne, poddaje sie nastepnie chro¬ matografii na odpowiedniej zywicy, np. na anio- nowymiennej zywicy typu Amberlite IRA-904 (sul¬ fonowany kopolimer styrenu i dwuwinylobenze- nu) w postaci chlorkowej. Zywica ta jest wytwa¬ rzana przez firme Rohm and Haas Company, St.Zjedn. Ameryki* Kolumne chromatograficzna z zywica eluu;'e sie wodnym roztworem chlorku a- monowego.Uzyskane w wyniku przeprowadzanego rozdzialu chromatograficznego frakcje, wykazujace aktyw¬ nosc antybiotyczna poddaje sie nastepnie ponow¬ nie chromatografii, w celu oddzielenia akantomy¬ cyny bd rozdzial prowadzi sie na zywicy niejonowej, zna¬ nej pod nazwa Amberlite XAD-7, produkcji firmy Rohm and Haas Co. Zywice te eluuje sie miesza¬ nina metanol — woda, otrzymujac frakcje, zawie¬ rajace akantomycyne. Frakcje, wykazujace aktyw¬ nosc antybiotyczna, laczy sie i zateza do usunie¬ cia metanolu, a nastepnie wymraza, otrzymujac stosunkowo czysty preparat akantomycyny.Preparaty akantomycyny o wysokiej czystosci mozna otrzymac, poddajac preparaty, otrzymane jak opisano poprzednio przez wymrazanie, chro¬ matografii przy uzyciu jonitu, otrzymywanego przez chemiczna modyfikacje dekstranu typu DEAE-Sephadex (A-25), dostarczanego przez Phar¬ macia Fine Ghem., Uppsala, Szwecja, Preparat, za¬ wierajacy akantomycyne, rozpuszcza sie w chlor¬ ku amonowymi i roztwór ten przepuszcza prteez ko¬ lumne, zawierajaca DEAE-Sephadex (A-25). Zbie¬ ra sie frakcje, wykazujace aktywnosc wobec B. subtilis i Sjpyogenes. Akamtomycyne wyd'ziela sie z trzech odebranych frakcji, stosujac chromatogra¬ fie na zywicy niejonowej, np. Amberlicie XAD-7.Podczas przerobu frakcji na zywicy Amberlite XAD-7, zywice eluuje sie mieszanina metanol-wo- da, otrzymujac akantomycyne. Sól amonowa akan- tomycyny sporzadza sie przez doprowadzenie war¬ tosci pH otrzymywanych frakcji wodorotlenkiem amonowym do 7,5.Akantomycyna wykazuje aktywnosc wobec S. aureus i moze byc stosowana do dezynfekcji zmy¬ wanych i gromadzonych naczyn i sztucców, za¬ nieczyszczonych tymi bakteriami. Moze ona byc takze stosowana do dezynfekcji róznych narzedzi dentystycznych i medycznych, zanieczyszczonych S.aureus. Wreszcie akantomycyne i jej sole moz¬ na stosowac jako bakteriostatyczne kapiele plu¬ czace pranej odziezy, do impregnowania papieru i tkanin, a takze do zapobiegania wzrostowi wraz¬ liwych na jej dzialanie organizmów na plytkach do prób i innych pozywkach mikrobiologicznych.Poniewaz akantomycyna wykazuje aktywnosc wo¬ bec B.subtilis, mo-ze ona byc stosowana do zwal¬ czania tego drobnoustroju w przechowywanych produktach naftowych, gdyz wiadomo, ze wywo¬ luje on zamulanie i korozje podczas przechowy¬ wania tych produktów.B Poniewaz akantomycyna jest zwiazkiem o cha¬ rakterze kwasnym, tworzy ona sole zarówno z za¬ sadami nieorganicznymi, jak i organicznymi. Na przyklad, przez zobojetnianie metanolowo-wodne- go roztworu akantomycyny mozna otrzymac sól *• sodowa, potasowa, amonowa, wapniowa i podob¬ ne. Sole akantomycyny z zasadami organicznymi (pierwszorzedowymi, drugorzedowymi i trzeciorze¬ dowymi aminami), np. z pirydyna, piperydyna i podobnymi mozna wytwarzac przez mieszanie rów- w nomolowych ilosci akantomycyny i pozadanej za¬ sady organicznej.Sposób wedlug wynalazku jest blizej wyjasnio¬ ny w nastepujacych przykladach, nie stanowiacych jego ograniczenia. W przykladach tych, o ile nie * podano inaczej, wszystkie procenty wyrazono jako procenty wagowe, a wszystkie proporcje miesza¬ nin rozpuszczalników sa podane w stosunku ob¬ jetosciowym.'Przyklad I. Fermentacja. Skosem agarowym ** Streptomyces espinosus subsp. akanthus NRRL lifiar zaszczepial sie szereg kolb Erlenmeyera, z których kazda zawiera 100 ml wyjalowionej po¬ zywki przedposiewowej o nastepujacym skladzie: monohydrat glikozy 25 g/litr Pharmamedia* 25 g/litr woda wodociagowa do objetosci 1 litra * Pharmamedia jest to maka z nasion bawelny, wy¬ twarzana na skale przemyslowa przez firme Traders Oil Mili Company, Ford Worth, Texas, St. Zjedn. Amery¬ ki. 39 Wartosc pH pozywki przedposiewowej przed wy¬ jalowieniem wynosi 7,2. Inokulum przedposiewowe hoduje sie w ciagu 3 dni w temperaturze 28°C na wstrzasarce obrotowej typu Gump. pracujacej przy ^ predkosci 250 obrotów/mipule i o skoku 7,35 cm.Inokulum przedposiewowe (300 ml), otrzymane jak opisano poprzednio, stosuje sie do zaszczepie¬ nia zbiornika, posiewowego, zawierajacego 20 li¬ trów wyjalowionej pozywki posiawawej o naste- 49 pujacym skladzie: monohydrat glikozy 25 g/litr Pharmamedia 25 g/litr woda wodociagowa do pelnej objetosci.Zaszczepiona pozywke posiewowa inkubuje sie w ciagu 2 dni w temperaturze 28°C, mieszajac ja z predkoscia 400 obrotów/minute i napowietrzajac z szybkoscia 10 Nlitrów/minute przy przeciwcis- nieniu 1,7 kg/cmf. Po inkubacji w ciagu 2 dni po¬ zywka posiewowa szczepi sie wyjalowiona pozyw¬ ke fermentacyjna (ilosc inokulum posiewowego wynosi 5 litrów na 100 litrów pozywki fermenta¬ cyjnej, znajdujaca sie w fermentatorze o pojemno¬ sci 250 litrów. Pozywka fermentacyjna ma naste¬ pujacy sklad: stale pozostalosci gorzelniane* 40 g/litr NaCl 5 g/litr NaNOs 10 g/litr * stale pozostalosci gorzelniane, dostarczane przez flr- ¦gm me Brown — Forman pistUler* Corp., P.O,BQX 1080.** LouisyiUe, KY 4Q2Q1,2T 108 605 28 Ucon** 2 ml/litr woda wodociagowa do pelnej objetosci pH (przed wyjalowieniem) 7,0 ** syntetyczny srodek przeciwpieniacy, dostarczany przez firme Union Carbide, N.Y., N.Y.Fermentator inkubuje sie w temperaturze 28°C, mieszajac jego zawartosc z predkoscia 200 obro¬ tów/minute i napowietrzajac z szybkoscia 150 Nli- trów/minute przy przeciwcisnieniu 1,7 kg/cm*.Zbiór odbywa sie zwykle po 3—12 dniach fermen¬ tacji.. Fermentacje mozna kontrolowac za pomoca pró¬ by na plytce w ksztalcie krazka, stosujac jako te¬ stowy drobnoustrój B.subtilis, a jako rozcienczal¬ nik wode pozbawiona jonów. Jednostkowa obje¬ tosc (0,08 ml) roztworu, zawierajacego badana sub¬ stancje, umieszcza sie na krazku bibuly o sredni¬ cy 12,7 mm, który z kolei umieszcza sie na plytce agarowej z posiewem testowego drobnoustroju. Na¬ stepnie plytke agarowa inkubuje sie w tempera¬ turze 32—37°C w ciagu 16—18 godzin. Jednostke biologiczna (BU) okresla sie jako stezenie anty¬ biotyku, dajace w warunkach znormalizowanej próby strefe hamowania wzrostu, wynoszaca 20 mm. Tak wiec, jesli np. dla uzyskania strefy ha¬ mowania wzrostu 20 mm nalezy brzeczke fermen¬ tacyjna rozcienczyc w stosunku 1 : 100, moc ta¬ kiej brzeczki wynosi 100 BU/ml.Odzyskiwanie. Calosc brzeczki fermentacyjnej (okolo 5000 litrów), otrzymanej jak opisano po¬ przednio, doprowadza sie dodatkiem 6 N wodnego roztworu kwasu solnego do pH = 2,75, po czym saczy z zastosowaniem ,srodków wspomagajacych saczenie (ziemi okrzemkowej). Placek osadu grzyb¬ ni przemywa sie 1000 1 wody i po przemyciu od¬ rzuca. Ciecz z przemycia laczy sie z klarownym przesaczem i otrzymany roztwór (5750 litrów) eks¬ trahuje sie 1600 litrami butanolu-1. Wyczerpana brzeczke odrzuca sie, a ekstrakt butanolowy za- teza sie do objetosci okolo 8 litrów (4,5 kg). Tak otrzymany material oznaczono jako preparat ADA — 117A.Oczyszczanie. (1) Wytracanie. Jeden litr prepa¬ ratu ADA — 117A, wydzielony jak opisano po¬ przednio, wlewa sie, mieszajac, do 10 1 octanu etylu. Mieszanine poddaje sie w ciagu jednej go¬ dziny mieszaniu w temperaturze pokojowej. Wy¬ tracony material, zawierajacy akantomycyne, wy¬ dziela sie przez odsaczanie i poddaje obróbce, o- pisanej dalej. (2) Rozdzielanie. Osad rozdziela sie pomiedzy 2,5 litra wody i 2,5 litTa butanolu-1. Faze butano- lowa (ADA-31C) miesza sie z 7 litrami wody. War¬ tosc pH mieszaniny doprowadza sie do 7,9, doda¬ jac stezony wodorotlenek amonowy. Rozdziela sie dwie fazy i oznacza jako faze butanolowa-1 i faze wodna-1. Faze wodna-1 ekstrahuje sie nastepnie trzykrotnie 2,5-litrowymi porcjami butanolu-1, za¬ wsze przy wartosci pH = 7,9, nastawionej dodat¬ kiem wodorotlenku amonowego. Trzy ekstrakty butanolowe, oznaczone jako faza butanolowa-2, fa¬ za butanolowa-3 i faza butanolowa-4 laczy sie z; faza butanolowa-1 i polaczone ekstrakty oznacza sie jako ADA-31D.Badanie aktywnosci biologicznej otrzymanych preparatów daje wyniki, przedstawione w tabli- • cy L0.Tablica 10 Preparat ADA-31C ADA-31D v Strefa inhibitowania wzrostu (mm) S.pyo- genes 36 36 1 B.ce- reus 18 16 ¦S.au- Ireus 20 24 B. \sub- tilis 23 26,5 S.lu- tea 27 ' 27 , Preparat ADA-31D, wykazujacy wieksza aktyw¬ nosc biologiczna, poddaje sie nastepujacej obrób- ** ce. . (3) Chromatografia na zywicy Amberlite IRA- -904. Sporzadza sie kolumne, zawierajaca 2 litry anionowej zywicy jonowymiennej Amberlite IRA- t9;04 w postaci chlorkowej (produkcji firmy Rohm 25 and Haas).. Ekstrakt butanolowy (ADA-31D), otrzymany jak opisano poprzednio, miesza sie z metanolem w ilo¬ sci, stanowiacej polowe objetosci ekstraktu i rów¬ na objetosci metanolu iloscia wody, po czym roz- ^ twór przepuszcza sie przez kolumne z szybkoscia 5C—70 ml/minute. Wyczerpany roztwór zbiera sie w trzech równych frakcjach, oznaczonych jako wyczerpany roztwór 1, wyczerpany roztwór 2 i wyczerpany roztwór 3, stwierdzajac, ze sa one poz- * bawione aktywnosci biologicznej.Kolumne przemywa sie 6 litrami wody. Eluat ten, oznaczany jako frakcja wodna, równiez nie odznacza sie aktywnoscia biologiczna.Nastepnie kolumne eluuje sie 2P/o wodnym roz- • tworem chlorku amonowego. Zbiera sie frakcje po 20 ml, laczy we frakcje po 500 ml i bada.Wyniki podano w tablicy 11, w której wartosci liczbowe okreslaja strefe hamowania wzrostu w mm.. 49 Tablica 11 JYak- cjanr 1 . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 S,py- oge- mes 2 0 0 35 39 40 39 39 38 37 B.ce- freus 3 0 0 17 21 22 21 20,5 20 20 18 16,5 16 S.aureus 4 0 0 25 27,5 28,5 28 27,5 27 27 25 24 23 B.sub¬ tilis 5 0 .0 26,5 30 31 29,5 29,5 29 28,5 28 27,5 26,5 S.lutea 6 0 ¦° 25 29 - 30 29,5 28,5 28,5 28,5 28 27,5 .26,5108 605 30 h 1 ¦ -13 - 14 -15 16 17 18 2 _ — — _. — — 3 15,5 15,5 slady 0 0 — Dalszy ciag tablicy 11 ¦ ' 4 23 22,5 21 18 0 — 5 25,5 24,5 22,5 18 0 — 6 | 25 24,5 ¦¦ ¦ 23 l 17 0 — Dalszy ciag tablicy Iz Frakcje 3—18 laczy sie, doprowadza ich pH do wartosci 5,5 dodatkiem 6N kwasu solnego i o- trzymany roztwór stosuje jako material wyjscio¬ wy do chromatografii, opisanej dalej. (4) Chromatografia na zywicy Amberlite XAD-7.Oddzielanie akantomycyny od chlorku amonowe¬ go. Sporzadza sie kolumne, zawierajaca 2 litry zywicy Amberlite XAD-7, produkcji firmy Rohm and Haas.Roztwór, otrzymany jak opisano poprzednio, za¬ wierajacy akantomycyne w mieszaninie z chlor¬ kiem amonowym (8 litrów, pH = 5,5) przepusz¬ cza sie przez kolumne z szybkoscia 80—100 ml/raii- nute. Wyczerpany roztwór zbiera sie w dwóch równych frakcjach, oznaczonych jako wyczerpany roztwór 1 i wyczerpany roztwór 2.Kolumne przemywa sie 4 litrami wody (szyb¬ kosc podawania 80—100 ml/minute). Zbiera sie cztery frakcje o równej objetosci, oznaczane od¬ powiednio ' jako frakcja wodna —1, —2, —3 i —4.Nastepnie kolumne eluuje sie mieszanina me- tanol-woda (stosunek objetosciowy 70 : 30). Zbie¬ ra sie frakcje po 20 ml. Wyniki przeprowadzonych prób przedstawia tablica 12, w której liczby oz¬ naczaja strefe inhibitowania wzrostu w mm.Tablica 12 Frakcja 1 Material wyjsciowy Wyczerpany roztwór 1 Wyczerpany roztwór 2 frakcja wodna 1 frakcja • wodna 2 frakcja wodna 3 frakcja wodna 4 Mieszanina metanol- -woda •: ¦ . 10 ¦ . 20 i ¦¦¦¦'¦' • S.pyo- genes 2 35 0 0 0 0 0 0 0 0 • ;S.au- reus 3 24,5 0 0 0 0 ¦0 0 0 0 • | B.ce- Jreus 4 19 V 0 0 0 0 0 0 0 t 1 B' ..su-b- tilis 5 27,5 0 0 0 0 0 0 0 0^ i* Is.lu- 1 tea 6 26 ° 0 0 0 0 0 0 0 • 1 10 IB 20 i* r5 r4t 50 1 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 250 2 0 42 40 30 24 21,5 18 15,5 16 15 slady 0 0 0 3 0 29 28,5 19,5 slady 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 4 0 23,5 24 slady 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 « 0 £5,5 33 22,5 17,5 slady 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 37 35 24 17 slady 0 0 0 0 0 0 0 0 Frakcje 85—125 laczy sie, otrzymany roztwór zateza sie do uzyskania roztworu wodnego i wy- mraza, otrzymujac 3,7 g preparatu ADA-34.1, za¬ wierajacego akantomycyne.Stosujac jako material wyjsciowy 5,5 litra pre¬ paratu ADA-117A, otrzymanego jak opisano po¬ przednio i poddajac go opisanemu poprzednio pro¬ cesowi oczyszczania (stracanie, rozdzial, chromato¬ grafia na zywicy IRA-904 i XAD-7), otrzymuje sie 21,71 g materialu o duzej aktywnosci akanto¬ mycyny (preparat ADA-113.4).Akantomycyne o wysokim stopniu czystosci, o- trzymana jak opisano poprzednio, oczyszcza sie na drodze chromatografii na DEAE-Sephadex, jak opisano dalej. (5) Chromatografia na DEAE-Sephadex. Sporza¬ dza sie zawiesine z 800 g DEAE-Sephadex (A-25) produkcji firmy Pharmacia Fine Chem., Uppsala, Sweden, w 0,05 roztworze chlorku amonowego do¬ prowadza jej pH do wartosci 8,5 dodatkiem wo¬ dorotlenku amonowego i pozostawia do odstania w ciagu 12 godzin w temperaturze pokojowej. Spe- czniona zywice wylewa sie nastepnie do kolum¬ ny i kolumne przemywa sie 25 1 rozpuszczalni¬ ka.Wyjsciowy produkt ADA-113.4 (20 g), otrzymany jak opisano poprzednio, rozpuszcza sie w 200 ml 0,05 N roztworu chlorku amonowego (pH = 8,5) i roztwór ten podaje sie na wierzcholek kolumny.Nastepnie kolumne eluuje sie tym samym roz¬ puszczalnikiem. Odbierane frakcje bada sie pod katem aktywnosci biologicznej wobec B..subtdlis i S.pyogenes, otrzymujac wyniki, podane w tab¬ licy 13.Tablica 13 60 60 Frakcja nr 1 1 .2 | Objetosc (1) 2 2,0 2,0 Strefa hamowania wzrostu (mm) B.subtilis 3 0 0 Sjpyogenes 4 0 0 |H mm a 1 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 •¦33 34 35 1 36 37 38* 39 40 41 ' 42 43 1 2 8,5 12,0 4,0 4,0 3,0 12,0 4,0 3,5 9,0 7,5 8,5 6,0 9,0 4,0 3,0 12,0 4,0 4,0 12,0 9,0 3,0 12,0 4,0 4,0 9,0 12,0 4,0 4,0 12,0 12,0 12,0 12,0 10,0 12,0, 7,0 12,0 12,0 12,0 7,0 12,0 12,0 Dalszy ciag tablicy 13 1 3 | 4 | 0 0 0 0 0 0 15 17 20 21 21 23 22,5 22,5 21 20,5 20,5 20 20 20 21 19 19 18 * 19 — 18 18 17 17 17,5 17 17 17 15 15 slady 0 i 0 0 0 0 0 0 0 o 0 24 28 28 28,5 30 30,5 31,5 31,5 30,5 30,5 • 30 30 30 31 31 29,5 29,5 29,5 29 — 28 27,5 28 27 26 26 25 25 24 23,5 23,5 24 25 — — \ 10 15 20 30 S5 41 Frakcje laczy sie w nastepujace pule: Pula I — frakcje 9-^12 (objetosc okolo 24 litrów) Pula II — frakcje 13—20 (objetosc okolo 50,5 litra) Pula III — frakcje 21—43 (objetosc okolo 214 litrów) Z puli tych wyodrebnia sie akantomycyne przez chromatografie na zywicy Amberlite XAD-7, jak opisano dalej.(A) Wyodrebnianie akantomycyny z Puli I. Chro¬ matografia na zywicy Amberlite XAD-7.Z 1 litra zywicy Amberlite XAD-7 sporzadza sie kolumne, doprowadza pH Puli I do wartosci 3,0 dodatkiem 6N wodnego roztworu kwasu sol¬ nego i przepuszcza przez kolumne z szybkoscia 25 ml/minute. Stwierdza sie, ze wyczerpany roz¬ twór jest pozbawiony aktywnosci biologicznej i odrzuca sie go. Kolumne przemywa sie nastepnie 55 3 litrami wody. Wodny roztwór, pochodzacy 1 przemywania kolumny, równiez jest odrzucany, gdyz jest pozbawiony aktywnosci biologicznej.Wreszcie kolumne eluuje sie mieszanina metanol- -woda o sto? iinku objetosciowym skladników 70 : 30 i zbiera frskcje po 20 ml kazda. Wyniki aktyw¬ nosci biologicznej tych frakcji przedstawiono w tablicy 14.Tablica 14 Frakcja nr 10 20 30 40 . 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 400 Strefa hamowania wzrostu (mm)| B.subtilis 0 0 0 0 20,5 25 26 27 ¦ 26,5 26 25,5 25,5 24 23 21,5 20 18 16 0 0 0 S.pyogenes 0 0 0 0 23,5 • 29,5 32,5 34 34,5 34,5 33,5 32 31 31 28,5 27,5 24,5 22 18 16 0 o 1 o 1 Frakcje 46—200 laczy sie, doprowadza ich pH do wartosci 7,5 dodatkiem wodorotlenku amono¬ wego, zateza do uzyskania roztworu wodnego i wymraza, otrzymujac 550 mg preparatu ADA-44.1 (sól amonowa akantomycyny).(B) Wydzielanie akantomycyny z Puli II. Chro¬ matografia na zywicy Amberlite XAD-7 Przygotowuje sie kolumne z 2 litrów zywicy Amberlite XAD-7 i doprowadza pH Puli II do wartosci 3,0 dodatkiem 6N wodnego roztworu kwa¬ su solnego. Wytracony osad odsacza sie i suszy (preparat ADA-45). Stanowi on krystaliczna akan¬ tomycyne, jak opisano dalej. Przesacz przepuszcza sie przez kolumne z szybkoscia 50 ml/minute. Wy¬ czerpany roztwór odrzuca sie, gdyz jest on poz¬ bawiony aktywnosci biologicznej. Nastepnie kolum¬ ne przemywa sie 6 litrami wody. Wode z prze¬ mycia równiez odrzuca sie, gdyz nie posiada ona aktywnosci biologicznej. Wreszcie kolumne eluuje sie mieszanina metanol-woda o stosunku objetos¬ ciowym skladników 70 : 30, zbierajac frakcje po 20 ml. Czynnosc biologiczna zebranych frakcji przedstawiono w tablicy 15.M Tablica 15 *— Frakcja nr 10 20 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 Strefa hamowania wzrostu (mm) B.subtilis 0 0 0 . 0 0 0 0 16 19 22 24 27 27,5 28,5 28 28 27 27 26 25,5 24 23,5 23 22 i 21 20,5 21 20 19,5 19,5 19 19 18 17 17 17 16 S.pyogenes 0 0 slady ¦ 15 16 16 18 22 25 29 33,5 33,5 36 38 37,5 38,5 34,5 33,5 33 32 31 29 29,5 29 29 27,5 28 27 26 26 25 24 23 23,5 23 23 22 Nastepnie kolumne eluuje sie mieszanina meta¬ nol — 0,05 N roztwór wodorotlenku amonowego, zbierajac frakcje po 20 ml. Wyniki czynnosci bio¬ logicznej tych frakcji podano w tablicy 16.Zebrane frakcje laczy sie w roztwory I, II, III i IV w nastepujacy sposób: Roztwór I frakcje (metanol — woda 70 : 30) 190— —219 Roztwór II frakcje (metanol — woda 70 : 30) 220— —399 Roztwór III frakcje (metanol — woda 70 : 30) 440—483 Roztwór IV frakcje (metanol — 0,05N NH40H 70: 30) 100—140 Otrzymane roztwory odparowuje sie do sucha, otrzymujac: z Roztworu I — akantomycyne, preparat ADA-46.3 70 mg 08 6Ó5 34 Tablica 16 Frakcja nr 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 Strefa hamowania wzrostu (mm) B.subtilis 15,5 15 15 16 16 15 15 15 17 20 25 26 20 0 3-pyogenes 21,5 21 21 ' 20,5 19,5 17,5 19 20,5 23,5 27,5 33 34,5 25,5 slady 25 z Roztworu II — akantomycyne, preparat ADA-46,4 450 mg z Roztworu III — akantomycyne, preparat ADA- -46.5 50 mg z Roztworu IV — sól amonowa akantomycyny, 30 preparat ADA-46.6 250 mg Jak wspomniano poprzednio, osad powstaly po zakwaszeniu Puli II odsacza sie i zachowuje jako preparat ADA-45. Roztarcie go z metanolem i na¬ stepnie odparowanie roztworu metanolowego do M sucha daje krystaliczna pozostalosc. Roztarcie tej pozostalosci z eterem daje bezbarwna, krystalicz¬ na akantomycyne, która odsacza sie i suszy, o- trzymujac 420 mg preparatu, oznaczonego jako ADA-46.1. 40 (C) Wydzielanie akantomycyny z Puli III. Chro¬ matografia na zywicy Amberlite XAD-7.Przygotowuje sie kolumne z 3 litrów zywicy Am¬ berlite XAD-7. Wartosc pH Puli III, stanowiacej material wyjsciowy, doprowadza sie do 3,0 dodat¬ kiem 6N wodnego roztworu kwasu solnego i prze¬ puszcza otrzymany roztwór przez kolumne z szyb¬ koscia 75 ml/minute. Zuzyty roztwór odrzuca sie, gdyz jest on pozbawiony aktywnosci biologicznej.Kolumne przemywa sie 9 litrami wody, a ciecz wodna z przemycia równiez odrzuca sie, gdyz nie wykazuje ona czynnosci biologicznej. Kolumne elu¬ uje sie mieszanina metanol — woda o stosunku objetosciowym skladników 70 : 30 i zbiera frakcje po 20 ml. Wyniki prób aktywnosci biologicznej tych frakcji podano w tablicy 17.Nastepnie kolumne eluuje sie mieszanina meta¬ nol — 0,05 N wodorotlenek amonowy, zbiera¬ jac frakcje po 20 ml i badajac ich aktywnosc bio* 60 logiczna. Otrzymane wyniki przedstawiono w tab¬ licy 18.Zebrane frakcje laczy sie w nastepujace pule; Pula IA: frakcje 170^00 (metanol — woda 70 ; 30) W Pula IIA: frakcje 401—950 (metanol — woda 70 ;35 Tablica 17 108 605 Frakcja nr Strefa hamowania wzrostu (mm) 10 20 B.subtilis S-Pyogenes 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 * 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 420 440 460 480 500 520 540 560 . 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900 920 940 0 0 0 slady 16 17 19 21 22 24 25,5 26 27 27 27 27 27 27 27 27 28 27,5 27 26 26 25 24 24 24 24 23 22,5 22 22 21,5 21 20,5 21 21 21 21 20,5 21 21 21 21 21 20,5 20 19,5 19,5 19 18 18 18 18 0 0 0 23 27 30 31,5 33,5 34 35 36,5 37 38 39 38 39 39 39 39 38 37,5 37 37 37,5 37 37 36 36 34,5 34 33 32 32 31,5 31 30 31 31 30,5 31 30 31 31 31 31,5 31 31 30,5 30,5 30 30 29,5 29 28 28 28 10 13 20 35 40 45 Tablica 18 53 Frakcja nr 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 500 ¦ Strefa hamowania wzrostu (mm) B.subtilis 19 18 18 18 18 17 16 16 16 16,5 16 22 28 30,5 28 17,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.pyogenes 29 28,5 28 28 27 26 26 26 26 26 25,5 31 38 41 - 38 28,5 : 20,5 : 20,5 20,5 20 18 17,5 17 17 18 16,5 16 16,5 17 17,5 16 0 0 30) i frakcje 10—100 (metanol — 0,05 N NH4OH) Pula IIIA: frakcje 115—170 (metanol — 0,05 N NH4OH) Pule IA odparowuje sie do sucha i otrzymana pozostalosc rozciera w 50 ml metanolu. Po odsa¬ czeniu i wysuszeniu otrzymuje sie bezbarwna, nie¬ rozpuszczalna krystaliczna akantomycyne (prepa¬ rat ADA-49.1, 210 mg). Przesacz miesza sie z mie¬ szanina eter — Skellysolve B (mieszanina izome¬ rycznych heksanów) o stosunku skladników 1 : 1, otrzymujac dodatkowo 500 mg bezpostaciowej a- kantomycyny (preparat ADA-49.2).Z Puli IIA podobnie otrzymuje sie 220 mg kry¬ stalicznej akantomycyny (preparat ADA-49.3) i 30Ó mg bezpostaciowej akantomycyny (preparat ADA- -49.4).Pule IIIA zateza sie do uzyskania wodnego roz¬ tworu i nastepnie wynaraza, otrzymujac 300 mg soli amonowej akantomycyny (preparat ADA-49.5).108 605 37 38 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania akantomycyny, znamien¬ ny tym, ze prowadzi sie hodowle Streptomyces espinosus subsp. acanthus NRRL 11081 na wodnej pozywce fermentacyjnej w warunkach tlenowych do uzyskania w pozywce znacznej aktywnosci an- tybiotycznej, po czym wyosabnia sie akantomycy- ne. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze akantomycyne wyosabnia sie, przesaczajac brzecz¬ ke fermentacyjna, zawierajaca akantomycyne do uzyskania klarownej brzeczki, która ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem akantomycyny i na otrzymany surowy preparat akantomycyny dziala sie octa¬ nem etylu, wytracajac osad, zawierajacy akanto- 15 mycyne i osad ten wytrzasa sie z woda i butano- lem-1, po czym faze butanolowa, zawierajaca a- kantomycyne, poddaje sie chromatografii na anio¬ nowej zywicy jonowymiennej, zbierajac frakcje, za¬ wierajace akantomycyne i frakcje te poddaje sie chromatografii na zywicy, stanowiacej niejonowy, makroporowaty kopolimer styrenu usieciowanego dwuwinylobenzenem. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze jako anionowa zywice jonowymienna stosuje sie sulfonowany kopolimer styrenu i dwuwinylobenze- nu typu Amberlite IRA-904 w postaci chlorkowej. ny tym, ze prowadzi sie hodowle Streptomyces 4. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze jako anionowa zywice jonowymienna stosuje sie makroporowaty kopolimer styrenu i dwuwinylo- benzenu typu Amberlite XAD-7, FIG. I MMMM I T i i i i—i—i i—i—r i r i i i i i i i i 360G 3000 2600 1800 1600 1400 1200 1000 000 700 LICZBA FALOWA""1108 605 26 r 20 h « 15 O z: < , GQ io cc o oo CD < FIG. Z zoo 220 240 DLUGOSC FALI 260 Inm) 280 300 DN-3, z. 829/80 Cena 45 zl PL PL PL PL PL