DE1924431A1

DE1924431A1 - Neues Antibioticum und seine Herstellung durch Zuechtung eines Streptomyces

Info

Publication number: DE1924431A1
Application number: DE19691924431
Authority: DE
Inventors: Mancy Geb Courtillet; Leon Ninet; Homme Jean Preud
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1968-05-13
Filing date: 1969-05-13
Publication date: 1970-01-02
Also published as: CS171204B2; GB1208848A; YU34211B; NL160033C; SU544385A3; DK120813B; FR1588807A; NL6906827A; CH500280A; US3657420A; NL160033B; BE732946A; YU119269A; DE1924431C2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Antibioticum das in folgenden nit der MUnner 17 967 RP bezeichnet wird, sowie sein Herstellungsverfahren.

Das neue Antibioticum weist ein ganz besonderes Interesse nicht nur infolge seiner antibakteriellen Wirksamkeit« die es auf zu verschiedensten Kategorien gehörende Bakterien aus-Ubt, sondern auch infolge seiner sehr ausgeprägten antimitotlachen Wirkung» die es auf gewisse aaligne Tunore ausübt, auf. Diese Eigenschaften sind ganz besonders interessant, da das 17 967 RP eine starke Wirksamkeit gegen Keine (insbesondere Staphylokokkentünme) beibehält, die gegen gewisse antieanceröse Antibiotioa, wie beispielsweise Chrononyoln, Rufo-

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oroaomycin und Daunorubicln, reslstent geworden sind.

Das Antibioticum 17 967 RP wird durch Züchtung «ine· 1» folgenden vollständiger identifizierten Mikroorganlssus, der den Oenus Streptoaycee angehört und mit Streptouyoea ro 8· opu Hat us, DS 20 073 bezeichnet wird, in künstlichen Medien erzeugt. Eine Probe dieses Staues wurde in U.S. Department of Agriculture in Peoria, ill. (Vereinigte Staaten von Amerika) unter der Nunaer NRRL 3*30 hinterlegt.

Daa 17 967 RP ist in Diaethylforaaaid lös Ii oh _s in Pyridin verhKltnisagsslg lös lieh, in Aceton» Kethanol und Wasser sehr wenig löslieh und in Xther, Cyelohexan und Hexan unlöslich.

Das Antibiotic!» 17 967 RP enthllt Kohlenstoff, Wasserstoff· Sauerstoff und Stickstoff. Sein· Eleaentarsueaanensstsung 1st die folgendes

C - 61,5 % H- 5,25 % 0 - 20,0 % N- 12,5 %

Ss besitzt die la folgenden angegebenen physikalischen Eigen· schäftens

Aussehens Gelbes alkrokrlstalllnes Pulver Schmelzpunkts 290 bis 30O*C (Zers.)

Ultravlolett-SpektnuB (Bestiaaung alt einer Lösung üsit i©_sg

je Liter in Diaethylforaasiid)s

Absorptlonsaaxiaua bei 268 na e\ ^_n « JH Absorptlonsalniaua bei 285 na e] ^ * 281

909881/1S91 bad ob.^al

AbBorptionsmaximu* bei 368 tm ^Ei ce ~ ⁷⁰⁷

Dieses Spektrum 1st lh Flg. 1 wiedergegeben. Sichtbar·» Spektra» (BeatIn—mg mit einer Lösung mit 10,5 mg/1 In DlMthylfoneaald) t

Daa sichtbare Spektrum weist keine charakteristische Absorption auf.

It -arot-Spektruw (Die Bestlasnuig wurde an alt xailunbroald

▼erpresste« Produkt vorgenoenen) t

Dieses Spektrum 1st in PIg. 2 gezeigt, in der als Abszisse einerseits die Wellenllngen In Mikron (oberer Hassstab) und andererseits die Wellenzahlen In ce" (unterer Hassstab) und als Ordinate die optischen Dichten aufgetragen sind.

In der nachfolgenden Tabelle I sind die Hauptbanden der Infrarot-Absorption dieses Produkts» ausgedrückt als wellenzahlen in ca , angegeben.

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BAD ORiGiNAL

5460	st	1655	Sch	1590	ID	1175	Sch	1000	sch	660	Sch
5550	Sch	1650	sst	1575	St	1170	ro	98Ο	ssch	625	Sch
5250	Sch	1610	Sch	1550	fit	1150	St	955	m	585	m
2950	8t	1600	Sch	1525	m	1125	Sch	910	Sch	550	m
2850	m	157.5	St	1515	sch	1115	St	880	Sch	480	Sch
2690	Sch.	1515	St	1505	St	1100	Sch	855	m	465	m
2590	St	1490	Sch	1280	Sch	1075	m	805	m	450	Sch
2550	Sch	1475	Sch	1265	sst	1045	m	775	sch	400	m
2160	ssch	1455	sst	1240	R)	1055	Sch	760	sch	565	sch
1720	Sch	1440	m	1220	Sch	10S0	ra	755	m	525	in
		1420	St	1185	αϊ	1010	sch	675	m

sst » sehr etark st m stark m - mittel sch » schwach sech » sehr schwach Sch » Schulter

DrehvermSganι

Das 17 967 HP 1st optisch aktiv» in Lösung in Dimethylformamid beträgt sein Drehvermbgen: [α]^°_{β + 1Q5 +} 2⁰ (c · 0,5 #)

Dttansohiehtehromatc^raphie;

Das 17 967 RP kann durch Dünnschichtchraaiätographie nach Stahl identifiziert werden. Dar Chromatographieträgör 1st Silicagel von Merck (P 254 gebrauchsfertig odar H mit einem m/5 Phosphatpuffer auf pH 8 gepuffert) in Scheiban von 0,25 mm Dicke. Die Entwicklung wird im aufsteigenden Sinne vorgenommen.

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BAD ORiGiNAL

Das Chrooatograiw wird in ultraviolette« Licht, an Tageslicht oder durch biologische PrUfung auf «it Bazillus subtllis beinpfter Nähragerplatte geprüft·

Zn der nachfolgenden Tabelle II sind die Rf-Werte von 17 967 RP als Punktion des USsungsalttels und TrXgere angegeben.

Tabelle II

TrKger	Lttamgsaittel	Rf
P 254	Chlor of ono-Htthanol- Aoeton 78JaOJA(IrOLZVoI.)	0,6
P 25*	Chlorofora-Methanol
	87*13 (Vol./Vol.)	0,4
H. auf pH B ge puffert	Aceton-Dioxan 5Οϊ5Ο (Vol./Vol.)	0,6

Aufgrund.dieser Chromatogramrae liegt es nahe, anzunehmen, daas da» 17 967 RP eine einzige Substanz ist.

90988 1/

BAD ORtGiNAL

Das 17 967 HP 3bt auf Bakterien, die. den verschiedensten Kategorien angehören, «int antlblotische Aktivität In recht beinerkenawerteii Ormd au*. Be weist bezüglich seiner an ti bakteriellen Wirksanice It keine merkliche gekrauste Resistenz alt ChrosxMsyein, Rufoeroaonyoln und Daunorubioln auf, und besitzt nur eine schwache und nicht signifikante gekrauste Resistenz eit Aotlno*ycin.

In der nachfolgenden Tabelle ZII 1st seine bakterlostatische Wirksankalt gegenüber einer gewissen Anzahl von Keinen gezeigt. PtSr Jaden Kai* wurde nach einer dar üblicher«» weise zu dieses) Zwaok verwendeten Verdtiimungsa@thoden die kleinste Konzentration an aktiver Substanz beetiaet, die unter definierten Bedingungen Jegliche sichtbar© Entwicklung in einer geeigneten Xährboulllon verhindert. Die so bestirnten Mlniaalefi bakteriostatiechen Konzentrationen sind in pg 17 967 HP je oc« VersuehsnedlUM ausgedruckt.

BAD· ORIGINAL

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-τ-

Tabelle

III

OeprUfte Bakterienorganismen	HinUBals bakttrio- statlaoh· Konzen trationen (in /ig/co»)
Staphylococcus aureus * Stam Smith	0,005
Staphylococcus aureus - Stassi 209 P - ATCC 6558 F	0.01
Staphyloooooue aureus - Stae* 209 P
resisteot gesucht gegen Cbrcaranycin	0.003
Saftphjloooeoos «ureuft - StMn 209 P resistant gßmtaht gtg«n Rufoorosoeyaln	0,02
Staphyloeoeoae «ur«us - StMHi 209 P roelattnt gstoht gvgen Aotlnoeyoln	0.10
Saroln» lut«a - ATCC 93^1	0.01
Stpoptooooeua fseoAlls - ATCC 80*3	0.04
8tr«ptooooous pfoftn·· haonolytioue (StMM Dig 7* Institut Pasteur)	0.01
Oiplooooous pnaimonla« (StMM Til. Inetitut Pasteur)	0,005
Ntiss«ria oatarrnaliB (A 152« Institut Pasteur)	0,04
Laotobaüillus oasei - ATCC 7469	0,003
Bacillus subtllis '- ATCC 6633	0,03
Bacillus oereus - ATCC 6630	0,04
Myoobaotarlun spaoles - ATCC 607	0,50
EBCherichia coll - ATCC 9637	0,10
Shlgella dysenteriat - Shiga L (Institut Paeteur)	0,10
Salnonella paratyphi A (Laeasse, Institut Pasteur)	O.6O
Saleonella schottauelleri (paratyphi B) Pougeno (Institut Pasteur)	0,25

9 0 9 8 8 1/15 91

BAD ORiG^Al

Fortsetzung Tabelle IZI

CteprUfte Sakterienorganlsnen	Minimale bakterio- statlsohe Konsen trationen (in jig/cca)	0,15
Proteus vulgar!·		0,40
Klebsiellft pneumonia· - ATCC 10 031		0,80*
Klebslella pneunonlae - gegen Rubido mycin reslstent gemachter Staun		. 0,15
Pseudomonas aeruglnosa (Starn Bass, Institut Pasteur)		0,01
Brucella bronchiseptioa (CN 337· Wellcome Institut)		0,01
Pasteurella multocida (A 125· Institut Pasteur)

Ausser seiner bakteriostatlschen Wirkung besitst das 17 967 RP» wie gefunden wurde» «ine Antituaor-Wlrksamkeit bei Verabreichung auf suboutaneii oder intraperltonealem Wege. Diese Wirksamkeit tritt insbesondere bei Pfropf tuaoren der Maus, wie beispielsweise dem Sarkom 18O (feste Pom), den Ehrllch-Asciteetumor und de? Leukaemle L 1210 bei Dosen von 0,2 Dg/kg bis 0,005 ftg/kg auf. Bei Sarkoto I80 bei der Maus fUhrt die Verabreichung von 0,05 mg/kg und je Tag während 5 Tagen auf subcutanen Wege zu einer Gewichtsabnahee der Tunoren der behandelten Mause, gegenüber den Oewlcht der« Jenigen von Vergleichst&Xusen, von 80 %,

Die Toxlzltüt von 17 967 RP wurde hauptsächlich bei der Maus bestiont. Die letalen Dosen 50 % oder DLc₀, bestirnt bei

BAD ORIGINAL

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eubeutaner Verabreichung (s.o.) und intravenöser Verabreiohung (l.v.) sind in der nachfolgenden Tabelle IV angegeben,

Tabelle IV

Verabreichunge weg	DL₅₀ mg/k«
8.C. i.V.	1,6 0,175

Der dme Antibioticum 17 967 RP erzeugende Organismus gehurt zum Genus Streptomyces. Aue den später angegebenen Gründen muss dieser Organismus ale eine neue, »it Streptomyoes roseopullatus bezeichnete Species aufgrund der rosa Färbung seines Luft-ausgesetzten sporulierten Mycels und der reichlichen Produktion von sehr dunkelbraunem oder schwarzen löslichem Pigment, das es auf sehr vielen sowohl synthetischen als auch organischen ZUchtungsnedlen bildet, angesehen werden .

Dieser Organisnus wurde aus einer in Brasilien entnommenen Erdprobe Isoliert. Die Isolierung erfolgte unter Anwendung der folgenden tlbliohen Methode: Die entnommene Brdprobe wird

909881 /Ulf

BAD ORIGINAL

in sterile« destillierte« Wasser suspendiert und dl« Suspension wird auf verschiedene Konzentrationen verdünnt. Kleine Mengen von Jeder Verdünnung werden auf dl· Otoerf liehe von Petrlsehalen aufgebracht, die ein geeignetes OThragarmedium enthalten. Nach einer Inkubation von einigen Tagen bei 26*C werden die Kolonien der Mikroorganismen» die man isolieren will, auf SohrSgagar versetzt, um reichlichere Kulturen zu erhalten,

Streptomyces roseopullatus, Stamm DS 20 073» bildet kurze SporenfXden, die sich an ihrem Ende unter Bildung von einigen Spiralen» im allgemeinen von einer oder stiel» einrollen. Diese SporenfMden sind auf den Luft -ausgaset stan MyeelfSden, die sie tragen, manchmal isoliert» hXuflger j®dooh unter Bildung von kurzen Trauben angeordnet. Die Sporen sind oval und weisen Abmessungen von etwa 0,4 bis O»6/O»6 bis 0,8 ρ auf.

Streptomyces roseopullatus» Stay« DS 20 073» besitzt die Eigenschaft, schwarzes Melaninpigment auf geeignetem Medium mit Tyrosin sowie auf allen organischen Medien zu produzieren. Sr bildet ausserdem ein sehr dunkelbraunes lösliches Pigment auf einer gewissen Zahl von synthetischen Agarmedlen. Die Farbe seines Luft-ausgesetzten sporullerten Mycels 1st rosa.

Die ZUohtungaoharakteristlken und die biochemischen Eigenschaf· ten von Streptomyoes roseopullatus, Stamm DS 20 073» sind in der folgenden Tabelle V angegeben. Es sind diejenigen von Kulturen, die ein gutes Entwloklungsatadlum erreicht haben» d.h. ein Alter von etwa 3 Wochen bei 26*C haben. Diese teristiken wurden auf üblicher Weise zur Bestimmung dar logischen Charakteristiken von Stemmen von Stes-#p£orjs?e©s

BAD ORIGINAL 909881/111*

BKaga und Bouillon« bestimmt, wobei dl· Kulturen auf Agarmedien auf dohrtfgagmr durchgeführt wurden. Bin· gewisse Ansahl der verwendeten Züohtungeaedien wurde nach den Rezepturen hergestellt', die In "The Aotlnomyoetes", 8.A. WAKSMAIf, Seit· 193-197« Chronlca Botanic« Company, Wal then, Hass., USA, 1950» angegeben sind. In diese« Fall« sind die Medien duroh den Buchstaben W, da« die Nummer folgt, die ihnen in "The Aotinoajoetes" gegeben wurde« bezeichnet. Sie Llteraturstellen fttr dia anderen Zttohtungensdien oder die Zusammen-Setzungen derselben sind die folgenden:

Ana. At "Hiokey and Traaner*a Agar¹¹ - T.O. FRXDHAM u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Saite 950

An». Bt K.L. JOMBS - Journal of Bacteriology, <g£, 142, 19*9

Ami. Ct "Yeast Extract Agar" - T.O. PRZOHAM u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950

Ana. Ot "Tomato Paste Oatmeal Agar" - T.O. PRXDRAM u. Mltarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950

Ana. Bt "Melanin format lon medium* - Hie Aotlnoayoetea, Band 2, Seite 333» Mr. 42, 8.A. WAKSMAIf - Ine Williams and Wllkina Company, Baltimore, 1961

Ana. Fi W.B. ORUNDY u. Mitarb., Antibiotics and Chea.,2, 401, 1952

Ana. Os "Inorganic Saite τ Starch Agar" -T.O. PRXOHAM u. Mltarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 951

Ana. Ht "Substrat 1 mit mineralischer Stickstoffquelle",

Seite 14, O.F. OAUSB u. Mitarb., Zur Klassifizierung der Aotlnomyceten, VBB Ouetav Fischer Verlag, Jena, 1958

Anm. X: Bnspriotit der Reseptur W 1, wobei 30 g Saccharose duroh 15 g Glucose ersetst sind

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bad or:g:nau

Ana. Ji Entspricht dor fieseptur V 18» wobei die Saccharose duroh kleie· Paplerflltcratreifen, die teilweise in die Flüssigkeit eintauchen, eveetst let

Am, Ks "Menu*! of Methode for Pur·· Culture Study of Bacteria" der Society of Aaerloan Bacteriologists, Geneva,

Ana. Ls "Plain gelatin* - hergestellt naoh den Angeben des

"Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of Aaerlean Bacteriologists, Geneva, N.Y.,

Ana. Ns FUr die Untersuchung der Produktion von K₂S von H.D TfOBItBR und F. DAIWA - Journal of Baoteriology, £6, 239-2%*, 1958» angegebenes Medlusi

An«. Mt HandelsObliohee Megenalletipulver» naoh den Angaben des Herstellers subereltet

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Tabelle V

co ο co co

Kiul turned ium	Entwicklungs	Vegetative·	Luft-ausgeeetzter	Lösliches	Seobachtungen
(D	grad	Myoel oder	Teil (umfasst Ge		und bioehemi-
		Unterseite	samtheit von Luft-		sehe Eigen- .
		der Kultur	ausgesetztem My		schäften
		O)	oel und Sporula-		(6)
Agar nach			tion) (*}	sehr 'dun
Rickey und	gut	sehr dunkel	grauliohrosa;	kelgelb	ovale Sporen
Tresner		gelbbraune	sehr gut entwik-	braun»	mit Abmessungen
(Ann. A)		Unterseite	kelt	nach schwäre-	von 0*4 bis
				lieh gehend	0,6/0,6 Me
					0,8 ti? die Spö-
					renYMden bilden
					Spiralen und "
					sind in Form ^:
					von kursen Trau-,
Agar nach				sehr, dunkel-	ben angeordnet
Bennett	gut	sehr dunkel	hellgrauliehro-	gelbbraun«
(Ana. B)		gelbbraune	sa; «itteleüssig	nach schwärz«
		Unterseite	entwiakelt	lieh gehend
Agar mit				sehr dunkel-	->. · ·
Hefeextrakt	gut	sehr dunkel-	grXuliohrosai	gelbbraun»	(£> ro
nach PrId-	■	gelbbraune	gut entwiokelt	fast sonwars·	4>
ham		Unterseite		braun	4>
(Ann. C)			•		CaD

Fortsetzung Tabelle: V

(D

(2)

(4)

(5)

(6)

CD
D
O

Agar Bit Hafer und Tomate nach Pridham

Oluoose-Pepton-

(W 6)

N«hragar

(w, sy

Tyrosinfϊefeextrakt- Afpr zur Melaninbildung (kam« S)

Ag&l⁵ Bl %

(Asm, F)

gut

mleeig

mittelmassig

fflSaelg

Il ' ΊΊΙ.ΊΜΠΪ Il |i1_L |l IllWm.llll IIIWI—Λ. .'

gelbbraune Unterseite

schwarzbraune Unteraeite

gelbbraunes vegetatives Myoelj entwickelt

sehwarzes

vegetatives

Hyoel

ungefärbtes bis gelbliches vege-

cel; massig entwickelt

weiaaliah bis hellgräoliohrosa; gut entwickelt

gräulich; massig entwickelt

keiner

dunkelbraun

schwärzt reichlich

gelbbraun

schwarz; reichlich, ganz zu
Beginn der ZUch·
tung erzeugt

keines

Bildung von He lanlnt stark positiv

LÖeiioheaohung von CaIa ium- «ftlatt positiv^

CD O CO CD OO

	(2)	O)	* '	•	(5>:	*	sehr dtmkel-	1924431	ir:	ovals Sporen
(D	mMssle	sehr dunkel~	C*)		SOfaWSFSI SlSSi-		OFSnffJSbFSIHQa	(6)		mit Abmessungen :
Agar mit Ovalbwain		oFsngsbFsuns	.cbwaohFösa-	lioh FSiohlieh		nach sohwXrs-		von 0,4 bis 0,6/
(W 12)		bis sohwars-	gelbllohgFSU)		llehbraun ge hend		0,6 bis 0,8 /Ui
		bFSMfls Unte)P-	spftrlioh ent		schwach brtun-		die SporenfHden
		seite	wickelt		. liohgrsu		bilden Spiralen"
Glueose-	gut	sohwarxbreune		sohwarsbraun			und sind in < <
Asparagin-		UnteFsslts	grlullohroea}			Fora von kur
Agar			aMeslg ent			zen TFsubsh an
(W 2)			wickelt			geordnet j Hydro
Olycerin-	gut	orangebraune				lyse von Starke:
Asperngln-		Unterseite	grlulich-weiefi		positiv
Agar			bis hellrosa-
(W 3)			grstt; sehr »Es
Stärks-	gut	gelbbraune	sig entwickelt
Mineral-		Unterseite	hellgrÄulich-
sal2-			Fosa; gut ent
Agar			wickelt
nach Prid-
ha»
(Ana. O)

	(D	(2)	O)	(*)	(5)	(6)
	Starke-	sehr mäasig	gelbliehe	weisslieh	bräunlich	Kydrolyee von
	Nitrat-		bis hell	bis grSu-		8tKrke; positiv
	Agar		bräunliche	lich-weiee;
	(W 10)		Unterseite	sehr nussig
				entwickelt
	Synthe	gut	eehr dunkel-	roaa-welss	schwarz;
	tischer		BMihftßon ibraun·	bis helleräu-	reichlich
	Agar		Unterseite	llohrosa; gut-
CD	nach		nach schwÄrz-	entwickelt
O	Oause		lichbraun ge
CD	(Ann. H)		hend
OO
CD	Synth·-	gut	dunkelgelbbrau-	grüulloh-	sehr dunkel	P
	tieoher		nea vegetati	weiss bis	braun	Afc <a\
	Agar nach		ves Myoel	sehr hellgelb-		W ■
on	Czapek			lieh-grau;
	mit			Brilssig ent
	Saccharose			wickelt
	(W 1)
	Synthe	gut	hellgelbbrau	keiner	dunkelorange-
	tischer		nes bis dun		braun
	Agar nach		kelbraunes
	Czapek		vegetatives
	nit Olu-		Mycel; sehr
	coee		gut entwik-
	(Ann. I)		kelt

co σ co oo co

	(2)	O)	<*)	•	(5)	1924431	Untersuchung von Nitriten:
(1)	mitte!massig	ziemlich gut	welsslieh?		gelbbraun	I (6) . ί	negativ im Ver
Stärke-		entwickelter	sehr massig			: S Untersuchung i	laufe der Ver
Nitrat-		Schleier;	entwickelt			von Mltrlteh:	suche, die nach
Bouillon		bräunlichgel				positiv ;	S% Stunden» 48
(W 19)		be Unterseite				I	Stunden, 8 Tagen,
	massig	an der Ober	keiner		keines	2	15 Vagen und t
Bouillon		fläche befind«			Untersuchung ί	Monat Züchtung vor
nach		Hohe und eich			von Nitriten: j	genommen wurden
Czapek		absetzende			schwach positiv i
mit		welsellche flok·			zu Beginn der I
Saccharose		kige Kultur			• Kultur» wird
(W 18)					ziemlich rasch -
	keine				negativ χ. j
Bouillon	Entwicklung				Verwertung I
nach					von Cellulose; ;
Czapek ' mit·					negativ j
Dl« Cellulose
(Ami. J)	massig	graulich-welssex Ring	J keiner	dunkelbraun	i i-
Nitrat- Nähr
bouillon
(Ana. K)
	•

(D	··	(2)	(5)	<*>	(5)	(6)	¹	•
Züchtung	gut	gelblich	graullch-welss	schwarz;
auf Kar		graues bis	bis rosa-grau;	reichlich
toffeln		schwärzlich-	sehr spürlioh
(W 27)		braunes ve	entwickelt
		getatives
		Myeel; sehr
		gut entwik-			Verflüssigung:
		kelt			positiv, jedoch
Reine	gut	an der Ober	keiner oder	dunkelgelb	11 flMlffffflfW ' '
Gelatine		fläche ent	graulich-weiss	braun
mit 12 %		wickeltes«	in Form von
(Ann. L)		W mtf^0w&^B NB r^# Wt^* Jp dunkelgelb	Spuren
		braunes vege			Bildung von H₂Ss
		tatives My eel			stark positiv
Agar nach	gut	schwarzes	keiner	schwarz;
Tresner		vegetatives		reichlich;
und Danga		Myoel; gut		ganz zu Be
(Anro. M)		entwickelt		ginn der Kul
			tur erzeugt

(D	(a) ,	(3)	W	(5)	I	(6)
Magermilch	gut	gut entwickel	keiner		vollständi
, - ».		ter, gelbbrau			ge Pcptoni-
bai 25°C		ner Ring			sation ohne
					Koagulation;
					pH in 1 Mon&t
					unverändert ■
bei 37°C	sehr gut	sehr gut ent	keiner		vollständige Pep-
		wickelter, dun	•		tcnisation ohne
		ks Igelbbrauner			Koagulation%
		Ring			pH in 1 Monat un
				verändert

- 20 Unter den verschiedenen 8peoiee, dl« in den Vierken

Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, (ma Willie*· and Hilkina Company, Baltimore, 1957)

The Aetinoayeatea, Band II, S.A. WAKSWW (The ViUiMa and Wllklna Company, Baltimore, 196Ί) und

Zur Klaaaifislermg dar Aotinoayoeten, O.F. OAVSB u. Mitarb. (VKB Gustav Fischer Verlag, Jana» 1958)

beschrieben sind, lat dl·Janige» alt dar Streptoejyeae roeeopullatua. Stamm DS 20 075, dia stärksten Analogien zeigt_; dia Speolaa Streptoeyoei roaaoehroaoajanea aufgrund dar Sigan80haft₉ ein dunkalbratmea löellohee Pigaent auf organlaehen Medien su bilden, ein eporuliertee Luft-auageaetstee Myeal ψολ ream Farbuns auftuwalaaa und splralige Sporophoren au bilden, atrapto-■jreaa roaeopullateuä« Staae 08 20 07^atiaait Jedoch aioht mit · dlaaar Speoiaa tlbarain» weahalb ar ale aim neue Specie« aitgeeehen wird» da streptonyeea roaaoehreaoeabaa inabaaondara auf eynthetlaohea Agar «in wsgaflrbtas vegetativaa Waohstu» ergibt, «Knrand Streptoayoee roaaopullatua» Sfr&mü 08 SO OTJ__r. unter dlaaan Bedingungen ein dunkelbraunes vegetatives ftgroel unter Produktion eines eehr dunklen braunen iöalionan Pig· ■enta bildet. Oaa gleiehe trifft bezüglich der Kulturen dlaaar beiden StleaM auf aiuoose-Agar sowie auf Agar alt Starke su, obgleich In diesen leteteren Falle dia braune Firbung von Straptoenraea roaeopullatua, Staan 08 20 07?, und seine Produktion von braunes lOsllohea Plgaent weniger ausgeprägt als in den beiden erateren Fällen lat.

Ausaerdeai weist Streptoaqreea roaeoohronogenes in gewiesen PKllen ein vegetatives Hycel auf» daa «loh rot färbt, was nieaala bei Streptoeqraes roaeopullatus beobachtet wird, und macht Milch stark alkalisch, während die Kulturen von Strepto-

90 9 881/1591

Myoes roseopullatus nach 1 Monat sowohl bei 25°C als auch bei 37⁰C keine aerkliohe pH-Änderung zeigt.

Die Fähigkeit von Streptoayoe* roeeopullatue, Staaa DS 20 07?» verschiedene Kohlenetoff quellen und Stlokstoffquellen sur OewHhrIeistung seiner Entwicklung su verwerten« wurde nach den Prinzip der Methode von PRXDHAM und OOTTLIEB (J. of Baot., 56, 107-114, 1948) beetiawflt. Der Entwicklungsgrad wurde auf den von diesen Autoren angegebenen Orundnedlun bestimmt, wobei die Oluoose durch die verschiedenen Jeweilig untersuchten Kohlenstoff quellen oder das (NH^gSO^ durch die verschiedenen jeweils untersuchten Stlokstoffquellen ersetst wurde. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle VI ausamengcatellt.

Θ09Β81/1Β91 bad or,o_1Nal

Tabelle

Vl

Geprüfte Kohlen

Ver

-

+

OeprOfte Stiele-

Ver

OT

+

-

+

-

1

+

et off quellen

wertung

-

stoffquellen

wertung

₊

+

-

D-Riboae

₊

-

NaMO,

₊

D-Xylose

+

HaHO₂

+

L-Arabinoae

+

L-Rhaanoee

(NH^)₂HPO₄

+

D-Glucose

+

Adenin

+

D-Galactoee

+

Adenosin

+

D-Pructoee

+

Urftoil

D-hannose

Harnstoff

L-Sorbose

L-Asparagln

Laotoee

+

Gluooaajiin

Maltoee

+

Olykokoll

Sacoharoee

+

Sarcosin

Trehaloae

+

DL-Alanin

Cellobiose

+

DL-Valin

Raffinoee

⁺

DL-Asparagin-
8 Sure

Dextrin

L-Glutamineäure

Inulin

L-Arginin

Stärke

*

L-Lysin

Olykogen

OL-Serin

Glycerin

+

DL-Tnreonin

Erythrit

DL-Methionin

Adonit

Taurin

Duloit

DL-Piieny !alanin

D-Marmit

L-Tyrosin

D-Sorblt

DL-Prolin

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Forteetxuog Tabelle VI

(!•prüft* Kohlen- Stoffquellen	Ver wertung	Geprüfte Stick stoff quellen	Ver wertung
HMMlt	+	L-Hydroxyprolin L-Hiatidin L-Tryptophan Betain	*

Verfahren sur Herstellung des Antibiotic«** 17 967

is weeantHohen darin» atreptcsycee roeeopullatua» ataajB se SO 073» oder seine Mutanten in einen geeigneten Me- UUm und unter geeigneten Bedingungen su suchten und das lsi Verlaufe der Sttohtung gebildete Produkt abzutrennen.

Die Zttehtung von Streptoayces roaeopullatua, Staat 08 20 073» kann naoh jeder beliebigen aeroben OberflXohensüohtungsasthode oder SubaersaUchtungeaethode erfolgen» doch 1st diese letztere bus Gründen der Bequemlichkeit su bevorzugen. Man verwendet su diesem Zweok die verschiedenen Apparaturtypen· die Jetst üblicherweise in der Technik der Fermentationen verwendet werden.

Man kann insbesondere den folgenden «eg für die Durchführung der Arbeitsgänge β!nachlegent

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Strepfeorayces roseopullatus OS 20 073 -

Kultur auf Agar Kultur im Kolben unter Bewegung

Impfkultur im Fermenter Produktionekultur im Fera@ntcr

Das Fermentationsmedium soll Im wesentlichen «ine lierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstof f quelle, Mineralstoffe und gegebenenfalls Waohstmas» faktoren enthalten, wobei alle diese Bestandteile in Pom von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft» augeführt werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man Kohlehydrate» wie beispielsweise Glucose, Maltose, Dextrine, Stärke, oder andere Kohlehydratsubstanzen, wie beispielsweise Zuckeralkohole, z.B. Qlycerin oder Mannit, oder gewisse organische Säuren, wie beispielsweise Milchsäure oder Zitronensäure, verwenden. Oewlsse tierische oder pflanzliche Öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können diese verschiedenen Kohlehydratquellen mit Vorteil ersetzen oder Ihnen bei» gefügt werden.

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind ausserordentlioh verschiedenartig· Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise anorganische oder organische Ammoniumsalze, Harnstoff oder gewisse Aminosäuren,

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sein. Sie k5nn©ii auch in Form von komplexen Substanzen, öl© den Sfeiaksfe@£f h&uptsächlieli in profeidieeher Form
enthalten» zugeführt werden, »si« fosiepielewsis® In Fora w Casein, Laet&lbuHln.* aiutgin oder tieren Hydrolysat en, Sojamehl, Araohistnenl, Fischmehl, Fleischestrakten, Hefe- ©xtrakten. Distillers * Solubles und

Unter den zugefügten mineralischen stoffen körnen gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Brdalkaliphosphate oder Calcium- oder Magnesiumcarbonate

Andere führen zu den zur Entwicklung des Streptoroyces roseο-pullatus, Stan» BS 20 073» und zur Erzeugung des AntibloticuRis 17 967 RP erforderlichen Ionengleichgewicht, wie beispielsweise die Alkali- und Erdalkaliohloride und -sulfate.. Schlies8lioh wirken gewisse in speziellerer Weise als Aktivatoren der Stoffwechselreaktionen von Streptomyces roseopullatus. Es sind dies die Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- und Mangansalze.

Der pH-Wert des Fermentationsmediums sollte zu Beginn der Züchtung zwischen 6,0 und 7*8 und vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 liegen* Die zur Fermentation optimale Temperatur beträgt 25 bis 30⁰C, doch wird auch bei Temperaturen zwischen 2? und 33⁰C eine zufriedenstellende Produktion erhalten. Die Belüftung der Züchtung kann zwischen ziemlich weiten Werten variieren. Es wurde jedoch gefunden, dass Belüftungen von 0,3 bis 3 1 Luft je Liter Bouillon und je Hinute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an 17 967 RP wird nach 2- bis 8=tagiger Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhüngt.

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Aus den vorstehenden Ausführungen 1st ersichtlich, dass die zur Produktion von 17 9&Γ HP angewendeten allgemeinen Bedingungen der Züchtung von Streptomyces roseopullatus, Stamm DS 20 073, in weitem Masse variieren und jedem beson» deren Erfordernis angepasst werden können»

Das Antibioticum 17 967 RP kann aus den Pensentationsmaisohen auf folgende Weise isoliert werden:

Ss wird direkt aus Fermentationsmalschfiii mit mit Hasser ™ nicht-mischbaren Lösungsmitteln» wie Beispielsweise aliphatischen Alkoholen mit zumindest 4 Kohlenstoffatomen» Ester»» wie beispielsweise Äthylacetat, oder chlorierten Lösungsmitteln» wie beispielsweise Diohloräthan, Methylenohlorid oder Chloroformjextrahiert. Ss ist vorteilhaft, diesen Arbeitsgang bei pH 7 vorzunehmen.

Nach Filtration und Dekantieren kann das Rohprodukt aus den oben genannten organischen Lösungen durch Einengen der Lösung unter verminderte»! Druck und anschllessendes Ausfällen mit einem Kiehtlösungsmittel oder einem schlechten Lösungsmittel, wie Beispielsweise Hexan, isoliert werden.

Das rohe 17 967 RP kann nach den üblichen Nethoden, wie bei» spielsweise durch !!»kristallisation und Chromatographie an verschiedenen Adsorbentien, gereinigt werden:

Umkrlstallisation: Das 17 967 RP wird in einem guten Lösungsmittel, wie beispielsweise Dimethylformamid, gelöst, und die erhaltene Lösung wird fortschreitend mit einem geeigneten schlechten Lösungsmittel, beispielsweise einem Gemisch Methanol-Wasser 50:50 (VoI./Vol.) oder einem Gemisch Aceton-Wasser 50:50 (VoI. AoI.), verdünnt.

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Chromatographie einer Lösung des 1? 967 RP an verschiedenen Adsorbentiens Man verwendet vorzugsweise Kieselsäuregel·. Das 17 967 RP wird an dem Adsorbens gebunden» indem man ein« Lösung des Antibioticum in einen guten Losungemittel, wie beispielsweise Dimethylformamid, durch die Adsorptions« Ku Ie leitet oder indem man das Adsorbens und eine Lösung des Antibiotioums in einem geeigneten LÖsungsmittelgenieoh mischt, so dass man eine Aufschlämmung erhält, deren flüssige Phase ansohli©äsend eingedampft wird. Das 17 967 RP wird anschliessend mit Lösungsmitteln auf der Basis von Aceton elulert. Ausser Aceton selbst kann man Lösungsmittelgemlsohe» wie beispielsweise ein Gemisch Dime thy Iformaaiid-Aceton 50t50 (Vol./Vol.) oder ein Oemisoh Chloroform-Methanol-Aoeton 78120 t2 (Vol./Vol.) verwenden. Das angereicherte . 17 967 RP wird durch Einengen des Eluats oder wie zuvor durch Zugabe eines schlechten Lösungsmittels zu dem Eluat gewonnen.

Ss ist ersichtlich, dass die für die Extraktion, Isolierung und Reinigung des 17 967 RP angegebenen verschiedenen Methoden mehrere Male wiederholt werden können» je nach den Herste llungserfordernlssen zur Erzielung eines Produkts in der für die vorgesehenen Anwendungszwecke geeigneten Form.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschranken. Im folgenden wird die Aktivität stets durch biologische Bestimmung nach der turbldimetrlschen Methode mit Staphylococcus aureus 609 P als empfindlichem Keim bestimmt. Die Aktivitätseinheit ist ein Mikrogramm des reinen kristallisierten Produkts. Diese Aktivität ist in Einheiten je Milligramm (E/mg) für die festen Produkte und in Einheiten je Kubikzentimeter (E/ccm) für die Lösungen ausgedruckt.

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Beispiel 1

In einen 330 1-Fernenter bringt man die folgenden Bestand» teile eins

Maisquellwasser (50 £ Trockenextrakt) 5 kg teilweis· hydrolyeierte Starke 7 »5 kg

Leitungewasser ad 220 1

Der pH-Wert wird mit 450 ecm 10n-Natronlauge auf 6,85 eilige« stellt. Man sterilisiert das Medium durch 40-minÜtlges Dureta° leiten von Dampf von 122⁰C. Nach Abkühlen betragt das Voluawn der Brühe 250 1 und der pH-Wert 6,85· Man beimpft seit 200 einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenraeyerkulfcur von myces roseopullatus DS 20 073· CIe Kultur wird bei 27⁰C rend 27 Stunden unter Bewegen und unter Belüftung mit steril©!? Luft entwickelt. Sie ist dann zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet.

Die Produktionskultur wird in einem 800 1-Fernenter durchgeführt, der alt den folgenden Substanzen beschickt isti

Distillers' Solubles 7,5 kg Maisquellwasser (50 f> Trockenextrakt) 10 kg

Sojaul 10 1

Kobaltahlorid-Hexahydrat 10 g Leitungswasser ad 450 1

Der pH-Wert wird mit 1800 ecm 10n-Natronlauge auf 7,25 eingestellt. Dann setzt man 2,5 kg Calclumcarbonat zu.

Man sterilisiert das Medium durch 40-minütiges Durchleiten von Dampf von 122⁰C₀ Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Brühe

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490 1. Sie wird durch Zugabe von'5 1 einer wässrigen sterilen Lösung« die 2,5 kg Dextrose enthaltend 5 1 einer sterilen wässrigen Lösung, die 1 kg Ammoniumsulfat enthält, auf 500 aufgefüllt. Der pH-Wert des Mediums betrögt dann 7»*iO.

Man beimpft mit 40 1 der Impfkultur aus dem oben beschriebenen 350 l-^'ermenter. Die Züchtung wird I38 Stunden bei 27⁰C unter Bewegen mittels eines TurblnenrUhrers, der mit 175 ü/rain betrieben wird und unter Belüften mit einem Strom steriler Luft mit einer Rate von 20 rn^/h durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums beträgt dann 7,^0 und das Volumen der Maische ¹J-SQ 1. Die vorhandene Antibiotieummenge beträgt 27 Ξ/com.

Baispiel 2_n

450 1 der unter den Bedingungen von Baispiel 1 erhaltenen Fermentatiensmaische mit einem Gehalt von 27 ε/β em wsrden in einen Bottich gebracht, der mit einer Vorrichtung zum Bewegen ausgestattet ist. Da? pH-Wept der Maische wird mit 200 ecm Sn-Salasäurs auf 7 eingestellt. Dann setzt man kOQ Äthylacetat zu und rührt 1 Stunde. Nach dieser Zeitspanne setzt man 50 kg einer Filtrierhilfe zu und filtriert die Suspansion auf einer Filterpresse. Der Filterkuchen wird mit 100 1 Kthylacetat und dann mit lOOO 1 Wasser gewaschen. Die Gesamtheit von FiItrat und Waschflüssigkeit, die 100 1 aus ^ macht, wird dekantierte Die organische obere Phase wird gewonnen. Xhr Volumen beträgt 390 1. Die wässrige untere Phase, dsren Volumen 610 1 betrKgt, wird verworfen« Der organische Extrakt tiird mit 40 1 Wasser in einem RUhrbottich gewaechen, und der gewaschene Extrakt wird nach Abziehen der wässrigen Schicht gewonnen.

9 0 9 8 8 1/15 9 1

Der gewaschene organische Extrakt wird unter* vermindertem Druck {70 mm Hg) bei 27^eC auf ein Volumen von 3 1 eingeengt. Das Konzentrat wird mit 30 1 Hexan verdünnt. Das Antibioticum fällt aus. Es wird durch Filtrieren isoliert<, mit Hexan gewaschen und im Trockenschrank unter vermindertem Druck (5 a» Hg) bei 40°C getrocknet. Man erhält so 31 g rohes 17 967 RP mit einem Gehalt von 244 E/»g,

Beispiel 3

47 g eines wie in Beispiel 2 beschrieben erhaltenen Produkts werden unter Bewegen in 1 1 Dimethylformamid gelöst. Die erhaltene Lösung wird durch Filtrieren geklärt. Man setzt langsam innerhalb von 4 Stunden unter Bewegen 1,5 1 eines Gemische Methanol-Wasser (50:50 Volumina) zu, um die Kristallisation des 17 967 RP zu bewirken. Die Kristalle werden abfiltriert und «it 0,3 1 des Methanol-Wasser-Gemisohs (50:50 Volumina) und 0,2 1 Aceton gewaschen. Die Kristalle werden 15 Stunden bei 50°C unter vermindertem Druck (5 mm Hg) getrocknet, Man erhält 8,7 g kristallisiertes Produkt mit einem Gehalt von 600 E/mg.

Beispiel 4

8,4 g des gemSss Beispiel 3 erhaltenen Produkts werden unter Bewegen in 250 com Dimethylformamid gelöst. Die erhaltene Lösung wird an einer Säule chromatographiert, die 120 g mit einem Gemisch Dimethylformamid-Aceton (50:50 Volumina} imprägniertes Merck Silicagel enthält. Das Sllicagel wird mit 500 com des Gemische Dimethylformamid-Aceton (50:50 Volumina) gewaschen. Zu dar gelbgefärbten Fraktion (etwa 500 die das 17 967 RP enthalten) setzt man 500 ecm eines Gemische

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Methanol-Wasser (50:50 Volumina) zu, was die Kristallisation des 17 967 RP bewirkt. Die Kristalle werden abfiltriert und mit 150 oom des Oetnieohs Methanol-Wasser (50:50 Volumina) und mit 100 ecm Aceton gewaschen. Das Produkt wird 15 Stunden bei 50⁰C unter vermindertem Druck (5 nun Hg) getrocknet. Man erhält so 5»74 g Antibioticum I7 967 RP mit einem Gehalt von 880 E/mg.

Beispiel 5

21,7 g gemäss Beispiel 4 erhaltenes Produkt werden unter Rühren in 600 ccBi Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird durch Filtrieren geklärt. Man setzt langsam Innerhalb von 4 Stunden unter langsamem Rühren 1S00 ecm eines Gemische Aceton-Wasser (5Ot5O Volumina) zu, üb? die Kristallisation des 17 967 RP zu bewirken. Die erhaltenen Kristalle werden abfiltriert, mit 200 com des Gemische Aceten-W&sser (305 50 Volumina) und SOO ecm Aoeton gewaschen und dann 15 Stunden bei 50⁰G unter vermindertem Druck (5 mm Hg) und ansohliessend 8 Stunden bei 50"C unter 0*5 mm Hg getrocknet. Man erhält 18,2 g reines 17 967 RP mit einem Gehalt von 1000 E/rng»

Beispiel 6

20 g gemäss Beispiel 2 erhaltenes Produkt mit einem Gehalt von 195 E/mg werden in einem Gemisch Aoeton-Dioxan-Wasser (100:1 Volumina) gelöst .Die erhaltene Lösung wird filtriert, um 6,5 g an unlöslichem Material zu entfernen. Man setzt dann zu der Lösung 200 g Merck Sllicagel zu und engt auf einem Drehverdampfer zur Trockne ein, um das 17 967 RP» gebunden am SllioagelfZU erhalten« Man stellt eine Säule mit 1 kg Merck

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Silieagel in Chloroform (H · 51 cm, D - 7 cm) her und bringt das an das Silicagel gebundene 17 967 HP oben auf diese Sau-, Ie auf t Sie Blutlon erfolgt nacheinander mit den folgenden Lösungsmittelnj

1. Chloroform-Methanol-Aoeton (78:20s2 Volumina) 4 1 2· Aceton 4 1

Die Eluate werden auf ein Volumen von 100 ecm eingeengt. Da das 17 967 RP im Verlaufe des Einengens ausfällt, setzt man 50 com Dimethylformamid zu dem Xonsentrat zu, um den Nieder» schlag wieder zu lösen» und engt erneut auf 50 ecm ein. Man setzt langsam innerhalb von 1 Stunde 20 ecm Wasser zu» um die Kristallisation des 17 96*7 RP zu bewirken. Die Kristalle, werden abfiltriert, mit 20 ecm Dioxan gewaschen und 15 Stunden bei 50°C unter vermindertem Druck (5 mm Hg) getrocknet. Man erhält 1,17 S gereinigtes 17 967 RP mit einem Gehalt von 925 E/mg.

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Claims

Patentansprüche

gelbes mikrokristallines Pulver, F * 290 - 300⁰C (Unterzersetzung), löslich In Dimethylformamid und verhältnismassig löslich in PyrIdin, sehr wenig löslich In Wasser» Aceton und Methanol und unlöslich in Äther, Cyclohexan und Hexan;

Elementarzusammensetzung:

C- 61,5 # H « 5,25 56 0-20,0Ji N m 12,5 %

Drehvermögen:

⁰ « + 103 * 2° (o * 0,5 # in Dimethylformamid)

UV*Spektrüm (Bestimmung mit einer Lösung mit 10,5 »g/l
in Dimethylformamid):

1 35

Absorptionsmaximum bei 268 nm E₁ £_m » 377

• et *' ■

Absorptionsrainimum bei 285 nm ^E1 cm ^{s 2}^¹

Absorptlonsmaximum bei 368 nm E₁ ^_n «= 707
2. Verfahren zur Herstellung des Produkts nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces roseopullatus, Stamm DS 20 073, (NRRL 3^30), oder seine Mutanten aerob in

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einen Üblichen Medium und unter den üblichen Bedingungen für diese Apt von Kultur züchtet und das im Verlaufe der Züchtung gebildete Antibioticum 17 967 BP abtrennt und reinigt.

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