SU544385A3 - Способ получени антибиотика 17.967 - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕПИЯ АНТИБИОТИКА 87.967 RP Агар Треспера коричнева- Серо-ро Суб.. Хорошее н Хйке  (А) го-желтый Субсфатньй, жс)тто-коАгар (В)Тоже рршевыш Субс1рагиьш желто-коAiap с дрожжевым экстргж- ркчневый том Пр{щхема Субстрйтиьш, желто-коОвс ный агар ричиевый с томалюй пас- - ток Пр дхема (С) ГлгокозопептоСубстратный , коричнево новьш агар (Wj) -/черньга

Вегетативньш, коричневоУмерсппое желтый, умеренно-развитый

Среднее

BereTaiiiBiabni, черный

Вегетагивньнз, беснвегннн

Умеренное желтоватьЕЙ. умерешю развитый

Умеренное

Субстратный, оранжево-ко-Серовато-желтый, ркчневый с KopirresBo- слегка розовый, чернымслабо развитый Глюкозоаспар- Хорошее Субстрзтщцй, коричневопшовьй агар «врньш ( W,j Глицер ноас- Хорошее Субстратный, коритеевопаргановьа оранжевьш (№з) но разв

Нет

Коричнево- желтый

Черный, обильный Образование мелапродуцируетс  ера- шша: положигель зу в начале культа- вое вированн 

Растворимость малата кальци ; раствор етс , но медленно

Черный достаточно обильный овый, силь- Желто-коричневый.Споры овальные, размером 0,4-0,6 и переход щий в тьи черный 0,Ъ-0.8Aii °P носцы образуют спирали и располагаютс  в виде коротких гроздьев озовато-серый, свет- Желто-коричневый, лый, развитый переходтций в черный Розовато-серый, хо- Желто-коричневый, рошо раэви1Ъ1Й почти коричневый Белый с розово-се- Темно-коричневый, рым, хорошо развитый Сероватый, умерен- Черный, обильный но развитый Серовато-розовый, Коричнево-черный умеренно развитый Серо белый с сероКоричнево- оранжевый , переход щий розовым, весьма умеренно развитый в коричнево- черный

Хорошее Субстратный, коричнево- Розово-сероватый, желтыйхорошо развитый Весьма Субстратиый, желтоватый Агар с крахмаумеренное со светло-коринневым лом и нитратом (W,o) Хорошее Субстратный, цвета красСинтетический агар Гаузе (Н) ного дерева с коричневым, переход щий в коричневочерный Синтетический То же Вегетативный оричневоагар Чапека с желтый сахарозой (Wi) Синтетический Вегетативный, коричневоагар Чапека с желтый, светлый с темноглюкозой (1) коричневым, очень хорошо развитый.

Среднее Покров достаточно хоро- Беловатый весьма шо развитый, субстратный,умеренно развитый желто-коричневый .

Бульон Чапека Умеренное Развиваетс  в виде с сахарозой (Wi g)беловатых хлопьев

на поверхности   оседает

Серо-коричневатый. Споры овальные рю слабыймером 0,4-0,6 и

0,6-0,8м, спороносцы образуют спирали и располагаютс  в виде коротких гроздьев крахмала, гидролиз продолжительный

Гидроли з крахмала положительный

Коркч ево-желты Реакци  на нитриты положительнж 

ет

НетРеакци  на нитриты

слабо положительна  8 начале культивированн , делаетс  очень быстро отрицатель .ной

Утилизаци  делкшозы отрнпдтельна 

ет

Темно-коричневый Реакци  на нитриты отрицательна  в ходе культивирование; пробы брались соответственно черлз 24 час,48 час, 8 дней, 15 дней и 1 мес. куль т вировани  Белый с серовато-бе- Коричневатый дым, умеренно ра Бело-розовый до се- Черный глубокий ровато-розового, хороию развитый Серовато-бепый со Темно-коричневый светлым сероватожелть1м , умеренно развитый Пигмент коричвенево-оранжевый

Вегетативный, черный,Нет

Агар Треснера То же

хорошо развитый и Данга (М)

Хорошо развитьшНет -//-

венчик

Очень хорошо развитыйНет

Очень

венчик, коричнево-желхорошее тый

Образование Hj S. положительно

Полна  пептониздци  без коагул ции, рН не мен етс  в течение мес ца

Полна  пептоанзацн  без коагул ции , рН не мевс етс  в течение

мес ца

Антибиотик 17.967 RP растворим в диметилформамиде , мало растворим в пиридине, ацетоне, метаноле и воде, нерастворим в эфире, циклогексане и гексане. Антибиотик 17.967 RP содержит углерод, водород , кислород и азот. Его элементарный состав,%: С - 61,5; Н - 5,25; О - 20,0; N-12,5. Антибиотик представл ет собой микрокристаллический желтый порошок. Точка плавлени  290-300° С (сразложешем). УФ - спектр. (раствор в диметилформамиде , концентраци 10,5 кг/лJ Максимум поглощени  при 268 нм, Минимум поглощени  при 285 нмЕ}%, Максимум поглощени  при 368 нм В растворе дйметилфор мамида его оптическое вращение равно а ° -1-103 ° (,5). Способ получени  антибиотика П.967 RP состоит в культивировании Streptomyces roseopullatos DS штамм 20.073 или его мутантов на среде в соответствующих услови х и выделении образовав35 40 45 50 |55 60 шегос  в процессе культивировани  продукта. Культивирование осуществл ют любым методом аэробного культивировани , поверхностного или глубинного, но предпочитают глубинное. Среда дл  ферментации должна содержать источники ассимилируемых азота и углерода, минеральные вещества и иногда факторы роста, причем все эти компоненты ввод т в виде отдельных веществ или в виде сложных смесей. В качестве источника ассимилируемого углерода используют такие соединени  углерода как глюкоза , мальтоза, декетрин, крахмал или другие органические вещества, например, спирты, глицерин, манонитол или органические кислоты (молочную, лимонную). Некоторые животные и растительные жиры, например, свиной жир или соевое масло, могут заменить эти источники углерода или дополнить их. Источниками ассимилируемого азота могут быть минеральные или органические соли аммони , мочевина, некоторые аминокислоты, а также сложные вещества, содержащие азот, главным образом, в белковой форме: казеин, лактальбумин, глютен и их гидролизаты, соева , арахисова , рыбна  мука, дрожжевой, м сной зкстракты, кукуруза, растворимые мелассы. Добавл ют также минеральные вещества, которые обладают буферным или нейтрализующим действием , например фосфаты щелочньк или щелочноземельных металлов И7ш карбонаты кальци  н магни .

Хлориды и сульфаты щелочных и щелочноземельных металлов обеспетивают ионное равновесие , необходимое дл  развити  Streptomyces roseopullatus штамм DS 20.073 и образовани  антибиотика.

Соли цинка, меди, кобальта, марганца действуют как активаторы.

рН ферментационной среды в начале культивировани  должно быть в пределах 6,0-7,8, предпочтительно 6,5 - 7,5. Температура ферментации 25-30° С. Аэраци  0,3-3 л воздуха на 1 л бульона в 1 мин. Максимальный выход антибиотика 17.967 RP получают через 2-8 дней купьтивировани .

Антибиотик п.961 RP выдел ют из сусла растворител ми , несмещивашщимис  с водой, такими как алифатические спирты, например этилацетат, хлорированные растворители, например дихлорэтан , хлористый метилен или хлороформ.

После фильтровани  и декантации сырой продукт выдел ют из органических растворов концентрированием зтих растворов при пониженном давлении и последующим высаждением каким-либо растгворителем, совсем нераствор ющим вещество или плохо его раствор ющим, например гексаном. Гр зный антибиотик очищают перекристаллизацией или хроматографией на различных адсорбентах. Методы экстракции, выделени  и очистки антибиотика могут быть повторены многократно с целью выделени  этого продукта в форме, пригодной к употреблению.

Пример. В ферментер емкостью 350 л загружают 5 кг кукурузы (50%-ный сухой экстракт ); 7,5 кг крахмала (частично гидролизованного ) водопроводную воду добавл ют до 220 л, рН довод т до 6,85 450 мл 0 Н соды. Среду стерлиэуют барбатированием пара температуры 122° С в течение 40 мин. После охлаждени  объем бульона 250 л И рН6,85. Затем засеивают 200 мл культивированного в колбе Эрлекмейера с перемешиванием Streptomyces roseopullatos щтамм DS 20.073

Культура развиваетс  при перемехиивании и аэрации стерильным воздухом при 27° С в течение 27 час. После этого она становитс  пригодной дл  засеивани  с целью получени  антибиотика.

Получение антибиотика производ т в ферментере емкостью 800 л, загруженном следующими веществами:

Растворимые мелассы, кг7,5

Кукуруза ( сухой экстракт), кг 10

Соевое масло, л.10

Хлорид кобальта гексагидрат, гШ

Водопроводна  вода добавл етс  до, л 450

рН доводитс  до 7,25 с помощью 1800 мл 10 Нсодыузатем добавл ют 2,5 кг карбоната кальци .

Стерлизуют среду барботированием пара температуры 122° С в течение 40 мин. После охлаждени  объем бульона около 490 л. Его довод т до 500 л

добавлением 5 л стерильного водного раствора, содержащего 2,5 кг церелозы и 5 л стерильного водного раствора, содержащего 1 кг сульфата аммони . рН среды тогда становитс  7,10.

Затем засевают 40 л инокул та, полученного в ферментере на 350 л как описано вьпие. Культивирование провод т при 27° С в течение 138 ч при перемеишвашж с помощью турбины, делающей 175 об/мни и аэрации пропусканием стерильного возпуха со скоростью 20 м- час, рН среды становит. с  7,40. а объем сусла 450 л. Количество антибиотика 27 ед/см.

При мер 2. 450 л сусла дл  ферментации, полученного в услови х примера и имеющего титр 27 едУсм, помещают в чан, спабжепньп перемешивающим устройством. рН сусла довод т до 7200 см 5 Н сол ной кислотой. Добавл ют затем 400 л этилацетата н перемепшвают 1 час. Затем добавл ют 50 кт вспомогательного агента дл  фильтровани  и суспензию фильтруют на фильтре под давлением. Осадок промывают 00 п этилацетата , а затем 100 л воды. Фильтрат и промывные воды, объе.м которых 1000 ;i, декантируютс . ОргаШ1ческую фазу отдел ют, ее объем 390 л. Нижний водный слой, объем которого 610 л, отбрасьпзают. органический экстракт промывают 100 л воды м промытый экстракт отдел ют от волною сло .

Промытьш орган 1ческий экстракт конпентрируют при пониженном давле}П1м (70 мм Н д) при 27°С по объема 3 л.

Концентрат разбавл ют 30 л гексзна. Антибиотик высаживают, отдел ют фильтрованием, промывают гексаном и сушаг при40 С при пониженном давлении (5 мм Нд). Получают таким образом 3 1 г гр з}гого 17.967 RP, имеюи1его активность 244 ед/мг

П р и м е р 3. 47 г продукта, полученного, как описано в примере 2. раствор ют при перемешивашш в 1 л диметилформамида. Полученный раство

фильтруют. Затем медлепно добавл ют при перемешивании в течение 4 час 1,5 л смеси метанол-вода (50-50 об.%), чтобы вызвать кристаллиэащiю 17.967 RP. Кристаллы фильт 5уют, промывают смесью 0.3 л метанол-вода (50-50 об.%) и 0,2 л ацетона, затем высушивают в течение 15 час при50°С в вакууме (5 мм Нд). Получают 8,7 г кристаллического продукта, имеющего активность 600 ед/мг.

Claims (1)

1. П р и м е р 4. 8,4 г продукта, полученного по примеру 3, раствор ют при перемешивании в 250 м диметилформам1 да. Получепньп раствор нанос т на хроматографическую колонку, содержащую 120 г силикагел  Мерка, пропитанного смесью д 1метилформамид-ацетон (50-50 об.л). Силикагель промывают 500 мл смеси диметилформамида-ацетон (50-50 об.%). К фрак1ши. окрашемпой в желтый цвет (прибдизителы о 500 мл, содержащей 17.967 RP), добавл ют 5(Ю м.п смеси метанол-вода (50-50 об.,), котора  выз1,1иает кристаллизацию 17.967 RP. Кристаллы фильтруют, промывают 150 мл смеси метанол-вола (50 5{))и 100 мл .-. .,.., V . i 41 A ацетона. Проду1ст высуцхивают в ujjeHne 15 час, при 50°С в вакууме (5 мм Н д). Таким образом получают 5,74 г 17.967 RP, имеющей активность 80 еп/мт. Г р и м е р 5, 21,7 г продукта, полученного по примеру 4, раствор ют при перемешивашта в 600 мл диметилформамида. Раствор фильтруют, затем медле1шо в течение 4 час при ме; ленном перемешивашш прибавл ют 1200 мл смеси ацетон-вода (50-50 об.%), чтобы вызвать кристаллизащ ю 17.967 RP, Полученные кристалль фильтруют, промывают 200 ми смеси ацетон-вода (50-50 об.%) и 200 мл ацетона, йысушивают в Te4etffle 15 час при 50° С в вакууме (5 мм Н д), затем в течение 8 час при 50°С при 0,5 мм Нд. Получают 18,2 г 17,967 RP (чистого), имеющего акдавиость 1000 еа/Кгг. (При мер 6. 20 г продукта, полученного по примеру 2, и имеющего акттзность 195 ед/мг, раствор ют в смеси ацетон-диоксаи-вода (10-3-1 об.%) Полу еша с раствор фильтруют дл  отделени  6,5 г икрасгворимого осадка. К раствору добавл ют 200 г снликагел  Мерка и упаривают досуха на роторе, получа  17.967 RP, нанесенный на силикагель . Готов т колонку из кг силикагел  Мерка с хлороформа ( 51 см) и помещают нанесенный на силикагель 17.967 RP на эту колонку. Элюирование провод т последовательно с помощью следующих растворителей; хлороформ-метанол-ацетон (78-20-2 об.%) 4л, ацетон 4 л. Элюагы концентрируютс  до объема (Ю мл. Так как в ходе кош :ен1рирова ш  17.967 RP высаживаетс , добавл шг 50 мл дамеишформамида, чтобы растворить этот осадок и сконцентрировать снова до 50 мл. Уедлен5ю добавл ют в течение 1 час 30 м  воды, чтобы вызвать кристал/шзацию 17.967 RP. нсталлы фильтруют, промывают 20 мй да о5ссаш и высушивают в resefffle 15 час при SO°C в вакууме (5 мм Нд). Получают ,17 г 5 Ошщенного 17.967 RP, имеющего активность 925 , Антибиотик 11.967 RP обладает антибактериальной активностью по отнощению к бактери м различных видов. Он не про вл ет заметной перекрестной резистенции с хромомицином, руфохромомицином и фунорубиданом и обнаруживает незначительную перекрестную резистенцию с актиномидином . Антибиотик обладает также бактериостатической активностью по отнощению к некоторым возбудител м инфекции. Кроме бактериостатической активности антибиотик обладает антиопухолевой активностью при введении его под кожу или внутрибрющинно . Эту активность определ ют на опухол х , привитых мышам, таких как ; саркома 180 (тве55да  форма), асцидные клетки Эрлиха и лейкеми  L 1210, при дозах в пределах 0,2 - 0,005 мг/кг. При саркоме 180 у мыщей подкожное введение дозы 0,05 мг/кг в день в течение 5 дней вызывает уменьщение веса опухолей по отнощению к весу опухолей у контрольных животных на 80%. Токсичность антибиотика определ ют на мыщах при введении им дозы вещества подкожно, внутрибрюшинно , внутривенно или перорально в течение 5 дней подр д. ЛДйо, определенные дл  подкожного введени  15,000 мг/кг, внутрибрющинного 0 ,055 мг/кг, внутривенного -0,150-0,175 мг/кг. Формула изобретени  Способ получени  антибиотика, отличающийс  тем, что щтамм Streptomyces roseopul atos DS 20.073 (N-RRL 3430) культивируют в эробньгх услови х на питательной среде, содержаей источник углерода, азота, минеральные соли, с оследующим выделе шем и очисткой целевого продукта известными приемами.