SU575038A3 - Способ получени антибиотика - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

1

Изобретение относ тс  к области микробиологии .

Предлагаемый способ получени  антибиотика  вл етс  новым и в специальной и патентшж литературе не описан. Заключаетс  он в том, что штамм Micromonospora lacustris АТСС 21975 выращивают на среде, содержащей источники углерода , азота и минеральные соли, с последукшщм выделением антибиотического комплекса и разделением его на компоненты известными приемами.

Микроорганизм, используемый дл  получени  антибиотика, выделен из образца почвы близ озера Роджера, Коннектикут, США. Этот штамм хранитс  в Американском институте коллекили типов культур Рокквилл, Мд., под номером АТСС 21975.

Выращивают М. lacustris в водной питательной среде, температура 24-36° С, услови  аэробные, в погруженном СОСТОЯНИИ, при перемешива.ши. Питательна  среда содержит источник усваиваемого углерода, такой как сахара, крахмал, глицерин и меласса, источник органического азота - казеин, ферментативна  выт жка казеина, м сна  мука, пшенична  ю.ейковина, мука хлопкового семени, соева 1 мука и мука земл ного ореха. В качестве стимул торов роста Moiyr быть использованы

дистшш торш-ю дисперсии или дрожжевой экстракт , а также соли, например, хлорид натри , ацетат аммони , сульфат аммони , фосфат натри    следы минеральных веществ, таких как железо, магний, цинк, кобальт, марганец.

Если во врем  ферментации происходит избыточное вспенивание, то в ферментационную среду добавл ют антивсленивающие агенты, растительные маета или силиконы. рН ферментации должно оставатьс  посто нным, но если нроисходит изменение, то к среде дс авл ют буферный агент (карбокат кальци ). Азрацию среды в резервуарах дл  выращивани  в погружетюм состо нии поддерживают на уровне 1/2 до 3 объемов свободного воздуха на 1 объем бульона в минуту. Во врем  переноса микроор анизма в течение его росга поддерживают асепти«ские уоЛОВИ Т .

Ферментацию ведут от 24 ч до 4 дней. Во врем  процесса ферментации производ т биологические анализы бульона с применением штамма Staphylococcus aureiis.

Смесь антибиотиков анализируют тонкослойной хроматографией. Расщеплеш е компонентов смеси зависит от содержащихс  в ней антибиотит

ков. Мала  активность антибиотика не позвол ет обшружить второстепенные ком онентьг, больша  активность - ведет к эффекту торможени  с плохим разделением.

Антибиотики, присутствующие в антибиотической смеси, окрашиваютс  в различные оттенки оранжевого, желтого и розового цветов.

Компоненты смеси извлекают из ферментационного бульона при помощи экстракции растворител ми и хроматографкческого разделе1ш  ш колонке. Дл  экстрагаровани  антибиотиков из ооетлешюго бульона примен ют различные органические растворители. Эффективным растворителем  вл етс  метшшзобутилкетон. Экстракцию растворителем провод т, использу  объем растворител  равный 1/5 сйъема бульона, из которого извлекают смесь антибиотиков.

Анамиданы раэдел н  и изолируют в вбйстановленном состо нии. Дл  юс восстановлешг  добавл ют 2 г аокорбйшвой кислоты на I г смеси антибиотиков в бульон перед фильтрацией и перемешивают 30 мин при комнатной тешгературе.

Сепарацию и извлечение компонентов смеси антибиотиков осуществл ют с едуюащм образом. Осветвленный бульон довод т рН от 4,0 до 4,5 и экстрагируют половиной объема метилизобугалкетонд . Кетон удал ют в вакууме и замен ют промьшшенным этанолом. Раствор этанола обезжиривают повторной экстракилей нетролейным зфиром. Ансамицины восстанавливают аскорбиновой кислотой, этанол удал ют в вакууме, и остаток подвергают хроматографии на колонке из силикагел  с использованием этилацетата с увеличивающейс  концентрацией ацетона в качестве про вл ющего растворител . Фракщш с колонки подвергают тонкослойной хроматографии и биоанализу .. Ак-швные фракции комбинируют. Основт  фракци  элюируетс  и концентрируетс .

Антибиотеческие продукты можно получать при помощи М. lacustris в разбавленной форме, в виде неочищенных концентратов, а также очищенных компонентов. Все они могут быть использованы дл  борьбы с микроорганизмами, такими как Mucobacteriuh) tuberculosis, Dipiococcus streptococcus, pyogenes и Staphytococcus, включа  штаммы, которые устойчивы к другим известным антибиотикам. Их можно примен ть в качестве дезинфицирующих веществ, дл  ошстки смешанных культур, .дл  медищгаской диагностики и биологических исследований.

Антибиотик ВОДЯТ животным и люд м через рот или парэнгеральным путем дл  лечени  пневмококковых , стрептококковых, туберкулезных и других инфекций, чувствительных к антибиотикам . Дозировка при приеме внутрь через рот 0,5-1,0 г в день, при парэнтеральной инъекции 100-500 мг в зависимости от типа и остроты инфекщш и веса.

Он может примен тьс  в виде таблеток, содержащих различные наполнители, например, цитрат

«атри , карбонат кальод  и вторичный фосфат калыХи , вместе с дезинтегрирующими веществами , такими как крахьил, альгинова  кислота, и некоторыми комплексными силикатами и св зыБающими агентами, например, поливинилпирролвдоном , сахарозой, желатином и смолой акации. Примен ют также смазывающие агенты, такие как стеарат мапш , лаурил сульфат натри  и тальк.

Д   введени  в рот могут быть использованы водные суспензии или злексиры, в которых основной активный ингредиент комбинируетс  с различными подслащающими или ароматизирующими агентами, окрашивающим веществом или красителем .

Дл  парэнтерального введени  изготавливают растворы антибиотика в кунжутном масле или масле земл ного ореха.

Пример. Готов т стерильную водную среду; имеНицую с ейу1ощий состав, г/л; 0 Крахмал20,0

Ферментативна  выт  оса казеина5,0

Дрожжевой экстракт5,0

Декстроза10,0

5КгНРОч0,5

СаСОз4,0

Клетки из М. lacustris АТСС 21975 перенос т в даз литровые колбы Фернбака, кажда  из которых содержит 1 л среды, и встр хива0 ют в течение 3-4 дней при 28° С.

Около 1% (об./об.) выращенного инокулума перенос т в ферментер с 45000 ft стерильной водной среды описанной вьпле. Поддерживают температуру 30° С, аэраци  1/2 объема воздуха на объем

5 бульона в минуту и перемещивание со скоростью 600 об/мин. При вспенивании добавл ют соевое масло дл  регулировани  избыточного вспенивани . Через 50-60 ч 5-10% объема этого инокулума перенос т в ферментер с 45000л стерильной. водной среды выщеописанного состава, но без м сной муки. Температуру поддерживают 30° С аэраци  со скоростью 1/2 объема воздуха на 1 объем жидкой среды в 1 мин и перемецшваьше со скоростью 380 об/мин.

5Дл  регулировани  вспенивани  добавл ют

соевое масло. Сахарозу или декстрозу добавл ют

через интервалы в 24 ч до уровн  0,1% вес/объем.

Через 90-120 ч ферментационный бульон

фильтруют, и рН довод т до 4,0-4,5 в присутсгаии

5-10% метилизобутилкетона. Затем бульон экстрагируют 11250 л метилизобутилкетона.Экстракт растворител  концентрируют в вакууме до 1/10-1/20 объема, и рН довод т до 5,5-6,5 аммиаком или раствором Кз НЮ4.

55

Растворитель ( 9 л) удал ют в вакууме и замен ют этанолом. Раствор этанола концентрируют в вакууме до 90л, которые обезжиривают повторной экстракцией петролейным эфиром. К этанольному paciBopy добавл ют аскорбиновую

во кислоту (2 г на 1 г смеси антибиотиков), и раст5 вор перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Этанольный раствор концентрируют в вакууме при поддержании рН 6-7 до жидкого сиропа, которьй затем беретс  в хлороформ .g Раствор в хлорочгор концентрируют до сиропа , последний затем хррматографируют ка силикагельной колонке и про вл ют этилацетатом, со-, держащим увеличивающиес  на 5% количества аце-JQ тона. Фракции с колонки подвергают тонкослой6 ной хроматографни и биоанализу н соответственно комбинируют, л ормулаизо ретени  Способ получени  антибиотика, отличающий с и тем, что штамм Micromonospora lacustris АТСС 21975 вьфащивают на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с послед5тощим выделением антибиотического комплекса и разделением его на компоненты иэвестньпл приемами.