DE2500898A1

DE2500898A1 - Verfahren zur herstellung von antibiotika

Info

Publication number: DE2500898A1
Application number: DE19752500898
Authority: DE
Inventors: Walter Daniel Celmer; Walter Patrick Cullen; John Broderick Routien; Frank Christian Sciavolino
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1974-01-09
Filing date: 1975-01-08
Publication date: 1975-07-17
Also published as: CS191924B2; AR207344A1; ATA9575A; JPS50100293A; CH596311A5; DK673174A; IE40205B1; RO63768A; SU575038A3; NL7500200A; SE7414855L; FI53983C; DK137841B; IE40205L; JPS5748198B2; CA1033674A; BE824104A; FR2256756A1; FI53983B; HU173914B

Description

1 BERLIN 33 8MÜNCHEN80

Auguste-Viktoria-StraBe65 _n n||or>Ul/C a DADTMCD PienzenaueretraBe2

Pat.-Anw. Dr. Ing. Ruschke Ur. ΚυαυΠΛΕ Ot Γ/\Ι\ I INCK Pat.-Anw Dipl-Ing

PATENTANWÄLTE Sosm

BERLIN -MÜNCHEN τ.ιλ»:089/»»»

Telegramm-Adresse: Telegramm-Adresee:

Quadratur Berlin Qudadratur München TELEX: 183786 TELEX: 522767

P 828

Pfizer Incorporated, New York, State of New York, USA Verfahren zur Herstellung von Antibiotika

Die Erfindung "bezieht sich auf die Herstellung von Antibiotika, insbesondere durch Züchten von Mikroorganismen. <

Die Rifamycine, eine Gruppe eng verwandter Antibiotika, sind von oensi u.a. beschrieben:· Farmaco, Ed. Sei. 14, 146 (1959); Antibiotics Ann. 1959/1960, 262 (1960a); Experientia 16, 412 (1960b); ii'armaco, Ed.Sei. 1_6_* 165 (1961), U-id Res. Progr. Org. Biol. Med. Cham. I_-, 557 (1964).

Die Struktur der Rifamycine ist von Prelog, V.,Pure Appl. Chem. 2.1 551 (1965b), aufgeklärt worden. Prelog prägte den Ausdruck

"Ansamycin" für diese besondere Klasse von Antibiotika mit grossen Molekülen.

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Die Erfindung betrifft ein Gemisch von Ansamycinen,-die durch eine neue Art von Mikromonospora, bezeichnet als Micromonospora lacustris sp. nov. Routien, gebildet werden. Zwei Bestandteile des Ansamycin-Gemischs sind Rifamycin S und Rifamycin SV. Zwei andere- Ansamycine sind die 3-Thiomethylderivate von Rifamycin 8 und Rifamycin SV.

Der für die Herstellung der Antibiotika gemäß der Erfindung geeignete Mikroorganismus wurde aus einer Schlammprobe von Rogers Lake, Connecticut, isoliert. Diese Kultur (Pfizer F.D. 2384-9), bezeichnet als Micromonospora lacustris sp. nov. Routien, ist in der American Type Culture Collection, Rockville, Md., hinterlegt worden und ergänzt die dortige Sammlung als typische Kultur für den Kulturtyp ATCO 21975.

Die für die Charakterisierung von M. Lacustris benutzten Identifizierungsmedien und Hinweise für deren Zusammensetzung'sind wie folgt:

1. Bentt's Agar (und 0,1 % CaCO₅) - Waksman, S.A. The Actinomycetes Vol. 2, 1961. Medium 30 auf Seite 331·

2. Emerson's Agar (und 0,1 4· CaCO^) - Waksman, 1961. Medium 28 auf Seite 331-

3. Tomatenpaste-Hafermehl-Agar (und 0,1 % CaCO^) - Waksman, 1961. Medium 34- auf Seite 332.

•4-. Glucose-Asparagin-Agar (und 0,1 % CaCO^) - Waksman, 1961,

Mittel 2 auf Seite 328.
5. · Glucose-Hefeextrakt-Agar (und 0,1 % CaCO-,) - M.J. Weinstein

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u.a. ,Antimicro"bial Agents and Che mo therapy, Seite 4-36,1968.

6. Stärke (a) - Waksman, 1961. Medium 21 auf Seite 330.

("b) - Wie vorstehend a"ber mit einem Zusatz von 1 % Hefeextrakt.

(c) - Gordon und Mihm, J. Bact. £3, 15 - 27, 1957-

(d) - Kartoffelstärke 20,0 g

Ammoniumchlorid 0,5 g

Agar 15,0 g

destilliertes Wasser 1,0 Liter

7. - Gelatine - Waksman, 1961. Medium 20 auf Seite 330.

8. Tyrosin - Waksman, 1961. Medium 11 auf Seite 329.

9. Ozapek-Saccharose - Waksman, 1961. Medium 1 auf Seite 328.

10. Kartoffelscherbe - Luedemann, G.M. und Brodsky, B:, Antimicrobial Agents and Ohemo -therapy, Seiten 47 - 52, 1965-

11. Kartoffelscheibe plus OaOO^ - Luedemann und Brodsky, 1965·

12. Karottenstücke.

13· Leitungswasser-Agar (2 °/o).

14. Pepton-Eisen-Agar - Waksman, 1961. Medium 38 auf Seite 332.

15· Difco-Magermilch.

16. ATCC-Medium 172 - ATCC-Katalog von Stämmen, 9. Auflage, Seite 172, 1970.

17. Dextrose-Nitrat-Brühe - Waksman, 1961, Medium 1 auf Seite 328.

18. Organische Nitrat-Brühe - Waksman, 1961. Medium 37 auf Seite 332.

19· Saccharose-Invertase - Levin, M. und Schoenlein, H.W., A Compilation of Culture Media, 1930. Medium 622 auf Seite 176.

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- 4 - P

20. Cellulose - Levine und Schoenlein, 1930. Medium 2511 auf Seite 823.

21. Cellulose - Jensen, H. L., Proc. Linnean Soc. N.S. Wales, . j£, 231 (1930).

22. Stickstoff-Verwertung - Weinstein u. a., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Seite 437, 1968.

23. Kohlenhydrat-Verwertung - Weinstein und andere.

M. lacustris wurde in Röhrchen oder Petrischalen mindestens im doppelten Ansatz für einige langdauernde Tests gezüchtet. Be "brütet wurde bei 28⁰C, falls es nicht anders angegeben ist. Die Ablesungen wurden in zahlreichen Intervallen bis zu 14- Tagen gemacht, wobei bei einigen Tests die Ablesungen über längere Zeitspannen hinweg vorgenommen wurden. Die Farbangaben beziehen sich auf die Farbchips in "Color Harmony Manual", 44 Auflage, 1958, veröffentlicht von der Container Corporation of America, USA, doch stammen die beschreibenden Angaben von dem Versuchsführer. Die Methoden entsprechen hauptsächlich den von M.J. Weinstein u.a. in Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 435 - ^37 (1967/ 1968) beschriebenen Methoden. Die Beschreibung von M. lacustris ATCC °1975 ist folgendermaßen:

Wie es charakteristisch für die Art Micromonospora ist, hat M. lacustris kein Luftmyzel. Es sind Sporen nur an dem Substratmyzel vorhanden, und diese haben sich in einzelner Form auf Hyphen entwickelt. Die auf Leitungswasser-Agar gebildeten Sporen sind selten, endständig, ungestielt, in der Kultur unregelmäßig angeordnet, meistens mit einer Breite von 1,1 - 1,5/um und manch-

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mal mit einer Breite von 2,0yum. Wenige eingelagerte Wölbungen werden gefunden. Auf Glucose-Hefeextrakt-Agar sind die Sporen ziemlich gleich, doch sind manchmal zahlreiche in bräunlichen Flecken in dem Myzel enthalten.

Hefeextrakt und NZ-Amin A(Sheffield Chemical Co.) führen zu einem guten Wachstum. Natriumnitrat, Asparagin und Glutaminsäure xtferden nicht gebraucht. Das Wachstum ist auf ATCC-Medium 172 bei 21, 28 und 37°C schwach bis gut, doch findet bei 4-5°C nicht gleichmäßiges Wachstum statt.

Nitratreduktion: Keine Reduktion von Nitrat zu Nitrit in 21 Tagen, und zwar weder in Dextrose-Nitrat-Brühe noch in organischer Nitratbrühe.

HpS-Bildung: (4- Tage, Bleiacetatstreifentest) -Bildung aus Pept on-Ei s en-Ag ar.

Cellulose: Kein Wachstum in irgendeinem Medium auch nach 38 Tagen. Gelatine: Wird verflüssigt.

Stärke: Keine Hydrolyse auf Medien 6a und 6b, aber gut Hydrolyse auf Medien 6c und 6d.
Saccharoseinversion: Positiv.

Magermilch: Keine Änderung nach 21 Tagen mit auftretender späteren Koagulation und teilweiser Peptonisierung. Kohlenstoff-Verwertung: Verwertet werden Glucose, Galactose, Fructose, D-Mannose, d(-)fiibose, Stärke, Saccharose, Trehalose und Xylose; nicht verwertet werden Adonit, L-Arabinose, Cellulo- I se, Dulcit, Inosit, D-Mannit, Eaffinose, Ehammose und d(-)-Sor- i

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bit; wechselnd verwertet werden Lactose und D-MeIiMose.

Weitere M. lacustris ATOO 21975 betreffende Kulturdaten sind in der nachfolgenden Tabelle enthalten.

es folgt die Tabelle:

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Medium

Wachstum

Myze!farbe

lösliches Pigment

Bennetts Agar + GaOO,
Emerson's Agar + CaCO^

Tomatenpaste-Hafermehl

+ GaOO,
ο

Glucoe-Hefeextrakt + 0aC0_:

_a=i G-lucose-Asparagin-Agar +
co GaOO₅

^ Gzapek-Saccharose-Agar

__* Tyrosin-Agar

ο Kartoffelscheine

Kartoffelscheibe + GaCO,
Gelatine

Karottenstücke
Stärke-Agar

hellorange (5 pa bis
5. pe)

orange (4 pa bis
5 ia)

orange (4 na bis

5 pa; .

gut, eben mit gewisser Rauheit hellorange (nahe 4

gut, erhöht, rauh, faltig

gut, bis ausgezeichnet, eben glatt . . .

mäßig bis gut, eben oder erhöht und rauh

im wesentlichen kein Wachstum

im wesentlichen kein Wachstum im wesentlichen kein Wachstum gut, rauh oder 5.ϋηη, eben

gut, faltig

schwach bis mäßig, eben, dünn

kein Wachstum

im wesentlichen kein Wachstum Medien 6a und 6b, aber gutes Wachstum auf 6e und 6d hellgelb braun leicht braun

braun

rötlichorange (5 pe
bis 6 pa)

rötlichorange (nahe
5 pe)

schwach gelblichorange (nahe 3 pe)

keine s keines keines

cn CD O OO CD OO

00 (V)

oo

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Ein mutanter Stamm (Pfizer F. D. 24189), entwickelt durch Mu- " tagenbehandlung von M. lacustris ATGO 21975, wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt und mit ATCC 21974-bezeichnet. Der mutante Stamm hat eine mattere bzw. dunklere Farbe als die Mutterkultur auf Glucose-Hefe-Agar plus CaC(U und anderen Medien. Der mutante Stamm erzeugt mehr Sporen und etwas größere Sporen als die Mutterkultur. Der mutante Stamm kann im Gegensatz zu der Mutterkultur Fructose und Lactose als Kohlenstoffquellen nicht verwerten. Der mutante Stamm erzeugt geringere Mengen Rifamycin S und Rifamycin SV in den angewendeten Fermentationsmedien als die Mutterkultur.

Die Kultivierung von M. lacustris findet vorteilhafterweise in wäßrigen Nährmedien bei einer Temperatur von etwa 24 -.36⁰C und unter aeroben Unterwasserbedingungen (submerged conditions) unter Bewegen statt. Für solche Zwecke geeignete ITährmedien enthalten eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, wie z.B. Zucker, Stärke, Glycerin und Melassen, eine Quelle für organischen Stickstoff, wie z.B. Kasein, enzymatisches Spaltprodukt von Kasein, Fleischmehl, Veizengluten, Baumwolle, Saat- bzw. Keimmehl, Sogabohnenmehl und Erdnußmehl. Eine Quelle für Wuchsstoffe, wie z.B. beim Destillieren anfallende lösliche Substanzen (distiller's solubles) und/oder Hefeextrakt, sowie auch Salze, wie z.B. Natriumchlorid, Ammo niuiaac et at, Ammoniumsulfat, Kaliumphosphat und Spurenmineralien, wie z.B. Eisen, Magnesium, Zink, Kobalt und Mangan, können außerdem mit vorteilhaften Ergebnissen angewendet werden. Wenn während der Fermentation ein über-' mäßiges Schäumen auftritt, können Antischaummittel, wie z.B.

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pflanzliche öle oder Silicone, dem Fermentationsmedium zugegeben werden. Der pH-Wert des Fermentationsmediums bleibt im allgemeinen ziemlich konstant, doch kann, wenn Abweichungen auftreten, ein Puffermittel, wie z.B. OaIciurnearbonat, ebenfalls dem Medium zugegeben werden. Die Belüftimg des Mediums in Behältern für Unterwasserwachstum wird vorzugsweise bei einem Durchsatz von etwa 1/2 bis 2 Volumen freier Luft je Volumen Brühe je Minute gehalten. Das Bewegen kann mit Rührern bzw. Schüttelvorrichtungen,die auf dem Gebiet der Fermentation im allgemeinen be kannt sind, durchgeführt werden. Aseptische Bedingungen müssen natürlich während des Transports der Mikroorganismen und während des gesamten Wachstums derselben eingehalten werden.

Der Impfstoff für die Herstellung des antibiotisehen Gemischs kann durch Anwendung des Kulturmaterials von Schrägkulturen von M. lacustris auf solchen Medien, wie z.B. ATOC Medium 172, auf das oben hingewiesen worden ist, erhalten werden. Das Kulturmaterial kann zum Beimpfen von entweder Schüttelkolben oder Beimpfungstanks verwendet werden, oder die Beimpfungstanks können mit dem Inhalt der Schüttelkolben beimpft werden. Das Wachstum der Mikroorganismen erreicht im allgemeinen seinen Höhepunkt in etwa 2 oder 5 Tagen. Abwandlungen hinsichtlich der benutzten Vorrichtung, der Belüftung, dem Grad des Rührens oder Schütteins ucw. können jedoch die Geschwindigkeit beeinflussen, mit der das maximale Wachstum erreicht wird. Im allgemeinen wird die Fermentation durchgeführt, bis dem Medium eine wesentliche antimikrobielle Aktivität verliehen worden ist, wofür in den mei-j sten Fällen eine Zeitspanne von etwa 24 Stunden bis etwa 4 Ta- j

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gen ausreichend ist.

Der Prozess der Antibiotikabildung kann bequem während der Fermentation durch biologische Untersuchung der Brühe unter An Wendung eines empfindlichen Stamms von Staphylococcus aureus verfolgt werden. Es wird eine Standardplattenversuchstechnik angewendet, bei der eine Hemmzone, die eine mit der Brühe gesättigte Filterpapierscheibe umgibt, als Maß für die antibiotische Wirksamkeit genommen wird. Nachdem die Fermentationsbrühe einen bestimmten Grad antibiotischer Wirksamkeit erreicht hat und der pH-Wert im allgemeinen etwa 7₅5 - 8,5 beträgt, wird das Myzel durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt. Zahlreiche Vorrichtungsarten, -wie z.B. Filterpressen, Zentrifugen usw., können angewendet werden.

Die Dünnschichtchromatographie unter Anwendung von Silikagel ist ein geeignetes Mittel zum Analysieren des durch M. lacustris in Fermentationsmedien gebildeten Antibiotikagemischs und der Zusammensetzung von rohen und gereinigten Materialien, die aus der geklärten Fermentationsbrühe extrahiert worden sind. Die Zerlegung des Antibiotikagemischs in die Komponenten ist in erheblichem Maße von dem Gehalt des Systems an Antibiotika abhängig. Zu geringer Gehalt an Antibiotika führt dazu, daß in kleineren Anteilen vorhandene antibiotisehe Bestandteile nicht festgestellt werden; ein zu großer Gehalt an Antibiotika führt •hur langsam zu einem Ergebnis mit schlechter Zerlegung des Gemischs.

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Das entwickelnde System für die DürL^chichtchromatographie ist die o"bere Schicht, die mit Äthylacetat, Tetrahydrofuran und Wasser (4:1:5) gebildet worden ist. Eine ϊ»ί ο autographische feststellung der antibiotisehen Bestandteile kann dadurch erreicht werden, daß ein Belag aus einer dünnen"Agarschicht aufgetragen wird, in die- ein empfindlicher Stamm von Staphylococcus aureus oder andere empfindliche Organismen eingesät worden ist "bzw. sind. Die Dünnschicht chromat ogr amme können nach dem Entwickeln auch visuell geprüft werden. Die in dem Antibiotikagemisch enthaltenen Antibiotika sind alle stark gefärbt, und zwar in verschiedenen Farbtönen von Orange, Gelb und Rosa.

Die durch M. lacustris gebildeten Rifamycine sind Verbindungen der Formeln:

HO

CH_x 3	•	CH_;	,'	H \	H
OH		H
		0		^l- CH

CH_x 3

OH,

CH_xO .— ^CH_x-3 3

OH

CH_x 0 3

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•

O

^H3

9H₃

H

OK *

CH_xO
3

3

I
0

CH₇

I
O

I

H

T ti I

V

:_ CH

HO
CH,.
t>

im

CH₃COO '

OH,

1 I
b

II

S- CH,

Der Hauptteil (etwa 90 %) des durch M. lacustris gebildeten Antibiotikagemischs besteht, wie durch Elementaranalyse, massenspektrographische und NMR-Wer te nachgewiesen worden ist, aus 3-Thiomethylrifamycin S (lib) und 3-Thiomethylrifamycin SV (Ib). Der größte Anteil von den in geringen Mengen vorhandenen Be- ; standteilen (etwa 9 '#). besteht aus Eifamycin S (Ha) und Eifamycin SV (Ia). KT -.iiiere Mengen von Eifamycin S und Eifamycin

: SV werden durch den mutanten Stamm M. lacustris ATCC 21974- E^e~ ! bildet. . ' .

INSPECTED

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Außer den Rifamycinen werden eine neue als Ansamycin "bezeichnete Verbindung 32,656 (etwa 0,9 ?») und eine Reihe anderer Ansamycine in Spurenmengen, die insgesamt etwa 0,1 % des Antibiotikagemischs ausmachen, gebildet.

Das bei Rifamycin S und Rifamycin SV ermittelte Oxidations-Reduktions-Gleichgewicht liegt auch bei den 3-Thiometh'ylderivaten dieser Antibiotika vor. Rifamycin SV wird durch Luft oder Hangandioxid zu Rifamycin S oxidiert. Rifamycin S wird leicht durch Behandlung mit Ascorbinsäure zu Rifamycin SV aceduziert. Ähnliche Oxidations-Reduktions-Reaktionen sind bei 3-Th.iomethylrifamycin S und 3-Thiomethylrifamycin SV durchführbar. Durch Hydrieren von 3-Tniomethylrifamycin S in Äthanollösung in Gegenwart von 5-%-£^>alladium-auf-Kohle, bis 8 Äquivalente Wasserstoff verbraucht worden sind, Entfernen des Katalysators durch Filtrieren und Eindampfen des Filtrats wird Hexahydro- -3-thiomethylrifamycin SV erhalten. Durch Oxidation dieser Verbindung mit aktiviertem Mangandioxid werden Hexahydroderivate von 3-^liiomethylrifamycin S gebildet. In ähnlicher Weise wird durch Hydrieren der Verbindung 32,656 das betreffende Hexahydroderivat erhalt.en.

Die Bestandteile des Antibiotikagemischs können aus der Per- mentationsbruhe nach einer Reihe verschiedener Methoden erhalten werden, zu denen die Lösungsmittelextraktion und Säulenchromatographie oder Kombinationen davon gehören. Zahlreiche organische Lösungsmittel sind zum Extrahieren der Antibiotika aus der geklärten Brühe geeignet. Methylisobutylketon ist ein

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besonders wirksames Lösungsmittel. Die Lösungsmittelextraktion wird vorzugsweise unter Anwendung eines Lösungsmittelvolumens durchgeführt, das ungefähr etwa 1/5 des Volumens der Brühe entspricht, aus dem das Antibiotikagemisch gewonnen werden soll. Je nach den vorhandenen Volumen der Brühe sind verschiedene Vorrichtungsteile, wie z.B. Scheidetrichter, Rührtanks und mechanische Extraktionsvorrichtungen, wie z.B. Zentrifugalabscheider, für Extraktionszwecke nützlich.

Die Ansamycine werden vorzugsweise in dem reduzierten Zustand abgetrennt und isoliert. Dieses kann durch Zugabe von Ascorbinsäure zu der gesamten Brühe vor dem Filtrieren in einer Menge von etwa 2g je g Antibiotikagemisch und Rühren für etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur erreicht werden. Andererseits können die Antibiotika auch mit Ascorbinsäure in einer der Lösungsmittelbehandlungsstufen zum Isolieren und Konzentrieren reduziert werden.

Das bevorzugte Verfahren zum Abtrennen und Isolieren der Be standteile des Antibiotikagemischs verläuft folgendermaßen: Der pH-Wert der geklärten Brühe wird auf 4,0 bis 4,5 eingestellt, und dann wird mit etwa 1/5 Volumen Methylisobutylketon extrahiert. Das Keton wird im Vakuum entfernt und durch Äthanol vom technischen Reinheitsgrad ersetzt. Die Äthanollösung wird durch wiederholtes Extrahieren mit Petroläther entfettet. Die Ansa- ! mycine werden mit Ascorbinsäure reduziert, das Äthanol wird im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird auf einer Silikagel säule unter Anwendung von Äthylacetat mit steigenden Acetonkon-

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zentrationen als Entwicklungsmittel chromatographiert. Die Säulenabschnitte werden dann der Dünnschichtchromatographie und dem Bioversuch unterworfen. Die" aktiven Abschnitte werden dann entsprechend vereinigt. Die Verbindung 32,656 "befindet sich in d.en Vorab schnitten zusammen mit Spurenmengen von anderen Ansamycinen. Die Acetonko'nzentration in dem Äthylacetat-Aceton-Entwicklungsgemisch wird stufenweise auf etwa 35 - 50 % erhöht. Der Kern— oder Mittelabschnitt wird eluiert und konzentriert, und es wird kristallines 3-Thiomethylrifamycin SV erhalten.

3-Thiomethylrifamycin SV wird leicht in 3-Thiomethylrifamycin S durch Oxidation mit Luft oder vorzugsweise durch Behandlung mit aktiviertem Mangandioxid umgewandelt, welches durch azeotropes Trocknen von Mangandioxid nach der Beschreibung in J. Org. Ohem. _3fl·, Nr.6, 1979 (1969) erhalten wird. Eine Aufschlämmung von aktiviertem Mangandioxid, annähernd 1 g je g Antibiotikum, wird zu einer Lösung des Antibiotikums in Methanol oder Athylacetat gegeben, und es wird für etwa· 30 Minuten bei Eaumtemperatur gerührt, wonach dann die Oxidation praktisch beendet ist. Das Reaktionsgemisch wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren geklärt, und das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt. .

Zum Erfindungsgegenstand gehören die durch M. lacustris gebildeten antibiotisehen Produkte in verdünnten Formen, rohen Konzentraten und auch in Form der gereinigten Bestandteile davon. Alle diese neuen Produkte sind zur Bekämpfung von Mikroorganis- S men, insbesondere Mycobacterium tuberculosis, Diplococcus pneu- j

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moniae, Streptococcus pyogenes und Staphylococcus aureus, einschließlich von Stämmen, 'die gegenüber anderen bekannten Antibiotika resistent sind, geeignet. Außerdem sind sie als Desinfektionsmittel gegenüber solchen MokrοOrganismen geeignet und sind außerdem als Hilfsmittel bei der Reinigung von Mischkulturen für medizinische Diagnosen und biologische Porschungs zwecke brauchbar.

Die Tabelle I erläutert die antibiotisehen Spektren von einigen dieser neuen Ansamycine. Diese Versuche wurden durchgeführt, indem Röhrchen mit Nährbrühe mit allmählich steigenden Konzentrationen des reinen Antibiotikums hergestellt wurden und dann der angegebene spezielle Organismus in die Brühen eingeimpft wurde. Die in der Tabelle I angegebene Mindesthemmkonzentration ist die Mindestkonzentration des Antibiotikums (in Mikrogramm/Milliliter), bei der kein Wachsen des Mikroorganismus stattfand. Die Versuche wurden unter den in Proc. Soc. Exp. Biol. & Med. 122, 1107 (1966) beschriebenen standardisierten Bedingungen durchgeführt. Die Tabellen II und III erläutern die in-vivo-Aktivität dieser neuen'Antibiotika bei experimentell infizierten Mäusen.

es folgt Tabelle I:

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Tabelle I

Mindesthemmkonzentration ( /ug. /ml. )

Antibiotikum

M. tuber. H ElT 37

Streptococcus pyrogenes Staphylococcus
aureus

S. aureus (vielfach resistent)

2-Thiomethy1- rifamycin SY'	o,	015	0	,0019
3-Thi ome thy1- rifamycin S	o,	006	0	,0009
Verbindung 32,6%	1	0	,0312

0,0019 0,0019 - 0,0039

0,0004 0,0012 - 0,0039

0,0039 0,0012 - 0,0078

Tabelle II

PD_ςη,mg./kg.*

Antibiotikum

Diplo-

cocci

oral

Streptococci oral

oral Staphylo-

oubcutaneous

3-Thiomethyl- 8,0 0,22 1,1 rifamycin SV

3-Thiomethyl- 12,5 0,60 1,4 rifamycin S

Verbindung ' 1,15

32,656

0,65 0,17

* Dosis, die zu 50%igem Schutz führt.

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Tabelle III

M. tuberculosis - Infektion bei Mäusen

tägliche Dosis

% Überleben \ mittlere tJberlebens-• dauer (Tage) *

3-Thiomethyl- 5,0 100 53,0 rifamycin SV

0,5 70 44,3

Eontrolle 0 20 37,7

* Ermittelt nach 53 Tagen nach dem Infizieren

Die Antibiotika der Erfindung können auf oralem oder parente- ralem Wege zur Behandlung von Pneumokokken-, Streptokokken-, Staphylokokken-, Tuberkulose- und anderen Antibiotika-empfindlichen Infektionen bei Tieren einschließlich Menschen angewendet werden. Im allgemeinen werden diese Antibiotika am geeignetsten in täglichen oralen Dosen von 0,5 - 1 g oder parenteralen Injektionen von 100 - 500 mg, je nach der Art und Schwere der Infektion und dem Gewicht des zu behandelnden Patienten, verabreicht.

Die Verbindungen der Erfindung können allein oder in Kombination mit pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen verabreicht werden, und eine solche Verabreichung kann in Form einer Einzeldosis oder mehrfacher Dosen erfolgen.

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Für die orale Verabreichung können Tabletten, die verschiedene Excipientien, wie z.B. Natriumzitrat, Calciumcarbonat und Dicalciumphosphat, zusammen mit verschiedenen Zerfallmitteln, wie z.B. Stärke, Alginsäure und "bestimmten komplexen Silikaten, gemeinsam mit Bindemitteln, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon, Saccharose, Gelatine und Akaziengummi, enthalten, angewendet werden. Außerdem sind häufig Gleitmittel, wie z.B. Magnesiumstarat, Natriumlaurylsulfat und Talk, für Tablettierungszwecke geeignet. Feste Materialien des gleichen Typs können außerdem als Füllstoffe in weichen und gehärteten Gelatine - kapseln verwendet werden; zu bevorzugten Materialien gehören Lactose und Polyäthylenglykole hohen Molekulargewichts. Venn wäßrige Suspensionen und/oder Elixiere für die orale Verabreichung gewünscht werden, kann der wesentliche wirksame Bestandteil darin mit zahlreichen Süß- und Geschmacksmitteln, mit färbendem Material oder Farbstoffen und gegebenenfalls Emul gierund/oder Suspendiermitteln sowie auch gemeinsam mit Verdünnungsmitteln, wie z.B. Wasser, Äthanol, Propylenglykol, Glycerin und verschiedenen Kombinationen, davon kombiniert werden.

Für die parenterale Verabreichung können Lösungen von diesen Antibiotika in Sesam- oder Erdnußöl oder in wäßrigem Propylenglykol sowie auch sterile wäßrige Lösungen von den entsprechen- ; den wasserlöslichen Alkali- oder Erdalkalisalzen verwendet wer- ■ den. Solche wäßrigen Lösungen sollen erforderlichenfalls in :

geeigneter Weise gepuffert werden, und die flüssigen Verdünnungsmittel sollen zunächst mit genügend Kochsalz oder Glucose isotonisch gemacht werden. - ' -.

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- 20 - P

Die nachfolgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Diese'Beispiele stellen nur erläuternde Ausführungsformen der Erfindung dar, und die Erfindung ist nicht auf-spezielle Einzelheiten in den Beispieⁿ \ be chränkt.

Beispiel 1

Eine sterile wäßrige Lösung mit der folgenden Zusammensetzung wird hergestellt:

g/l

Stärke	20,0
enzymatisch.es Spaltprodukt von Kasein	5,0
Hefeextrakt	5,0
Dextrose	10,0
K₂HPO₄	0,5
	4,0

Zellen von einer Schrägkultur von M-.lacustris ATCO 21975 werden in eine Reihe von 3-Liter-IFernback-Korben, die jeweils Liter dieses Mediums enthalten, eingetragen, und 3-4 Tage bei 28⁰G geschüttelt..

Etwa 1 % (v/v) des gewachsenen Impfmaterials wird in einen Fermentatoi? eingetragen, der 568 Liter von sterilem Medium mit der folgenden Zusammensetzung enthält:

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- 21 - P

	s/i
Stärke	25,0
enzymatischem; Spaltprodukt von Kasein	15,0
dl-Methionin	1,0
Ammoniumac et at	0,5
Ammoniumsulfat	0,1
K₂HPO₄	0,4
Saccharose	1,0
GaGO-, 3	4,0
Fleischmehl	10,0
FeSO₄*7 H₂P	0,02
MgSO₄*7 H₂O	0,1
ZnSO₄*7 H₂O	0,002
MnGl₂	0,002
GoGl₂* 6 H₂O	0,002

Die Temperatur wird bei etwa 3O⁰G gehalten, und die Brühe wird mit 1150 rpm gerührt und mit einem Durchsatz von 1/2 Volumen Luft je Volumen Brühe je. Minute belüftet. Nach 35 - ^5 Stunden werden 5 % (v/v) dieses gewachsenen Impfmaterials in einen jTermontator eingetragen, der 3785,4- Liter des oben beschriebenen sterilen Mediums enthält. Die Temperatur wird bei 30⁰G gehalten, es wird mit einem Durchsatz von 1/2 Volumen Luft je Vo lumen Brühe je Minute belüftet und mit 600 rpm gerührt. Sojabohnenöl wird erforderlichenfalls zugegeben, um übermäßiges Schäumen zu unterdrücken. Nach 50 - 60 Stunden werden 5 - 10 % (v/v) dieses gewachsenen Impfmaterials in einen JTermentator eingetragen, der 37854 Liter von sterilem Medium enthält, das das

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gleiche Medium ist, wie es o"ben beschrieben ist, aber kein Fleischmehl enthält. Die Temperatur wird bei 3O⁰C gehalten, es wird mit einem Durchsatz von 1/2 Volumen Luft je Volumen Brühe je Minute belüftet und mit 380 rpm gerührt. Sojabohnenöl wird erforderlichenfalls zugegeben, um ein Schäumen zu regulieren." Saccharose oder Dextrose wird in Intervallen von 24- Stunden in einer Menge von etwa 0,1 % (Gew./v) zugegeben.

Nach 90 - 120 Stunden wird die Fermentationsbrühe filtriert und der pH-Wert auf 4,0 - 4-, 5 in Gegenwart von 5 - 10 % Methylisobutylketon eingestellt. Die Brühe wird dann mit 9464· Liter Methylisobutylketon mit einem Pokbielniak-Extraktor und Zentrifugalabscheider extrahiert. Der Lösungsmittelextrakt wird im Vakuum auf 1/10 - 1/20 Volumen konzentriert, und der pH-Wert wird mit Ammoniak oder 10%iger KpHPO^-Lösung auf 5>5 -"6,5 eingestellt.

Das Lösungsmittel (etwa 7j6-0 Liter) wird im Vakuum entfernt und durch Äthanol mittlerer Qualität (3A-Äthanol) ersetzt. Die Äthanollösüng wird im Vakuum bis zu etwa 76 Litern konzentriert, die durch wiederholtes Extrahieren mit Petroläther entfettet werden. Zu der äthanolischen Lösung wird Ascorbinsäure (etwa 2 g/g Antibiotikagemisch) gegeben, und die Lösung wird für etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die äthanolische Lösung wird im Vakuum konzentriert, wobei der pH-Wert erforder-■lichenfalls bei 6-7 gehalten wird, bis ein dünner Sirup erhalten wird, der dann in Chloroform aufgenommen wird.

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Die Gill or of ormlö sting wird zu einem Sirup konzentriert, der dann auf einer Silikagelsäule chromatographiert und mit Äthylacetat, das Aceton in zunehmenden 5-%-Anteilen enthält, entwickelt wird. Die Säulenabschnitte werden dann der Dünnschichtchromatographie und dem Bioversuch unterworfen, und die entsprechenden Abschnitte werden vereinigt. Die Vorabschnitte enthalten die Verbindung 32,656 und Spurenmengen von Rifamycin S, Rifamycin SV und anderen Ansamycinen. Das Eluat des Kernab Schnitts wird dann konzentriert, und es wird kristallines 3- -Thiomethylrifamycin SV erhalten.

Beispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wird mit M. lacustris ATCG 21974 anstelle von ATCO 21975 wiederholt. Vergleichbare Ergebnisse werden erhalten mit der Ausnahme jedoch, daß bei der Fermentation kleinere Mengen Rifamycin S und Rifamycin SV gebildet werden.

Beispiel 3

Eine trockne feste pharmazeutische Zubereitung wird durch Vermischen der folgenden Materialien in den nachfolgend angegebenen Gewichtsteilen hergestellt:

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3-Thiomethylrifamycin SV 50

Natriumzitrat 25

Alginsäure 10

Polyvinylpyrrolidon 10

Magnesiumstearat 5

Nach dem gründlichen Vermischen der trocknen Masse werden '.Tabletten aus dem erhaltenen Gemisch gestanzt, wobei jede Ta blette eine solche Größe hat, daß sie 500 mg von dem wirksamen Bestandteil enthält. Andere Tabletten, die 250, 100 und 50 mg von dem.wirksamen Bestandteil enthalten, werden unter Anwendung der geeigneten Menge 3-Thiomethylrifamycin SV in jedem Fall in entsprechender Weise hergestellt.

Beispiel 4

Ampullen werden hergestellt, die abgewogene Mengen von dem sterilen Natriumsalz von 3-Thiomethylrifamycin SV enthalten. Diese Ampullen werden für die parenterale Anwendung mit sterilem Wasser oder 5%iger Dextroselösung auf 100 oder 200 mg/ml eingestellt.

Beispiel 5

Analysenwerte

3-Thiomethylrifamycin S

Kohlenstoff 61,48

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Wasserstoff 6,70

Stickstoff ' 1,90

Schwefel 4,15

Die Hassenspektrogramm- und NMR-Werte stimmen mit dem Natriumsalz von 3-Thiomethylrifamycin SV (C^gH^gHaO.oNS) überein. UV-Absorptionsmaxima in 0,01 M HGl in Methanollösung treten auf bei 225, 305 und 440 nyum.

Ein KBr-Pellet zeigt eine charakteristische Absorption in dem Infrarotbereich bei den folgenden Wellenlängen in /um: 2,90, 3,40, 5,25, 5,95, 6,50, 7,00, 7,25, 7,55, 8,15, 8,70, 9,30, 9,45, 10,30, 10,65, 11,35, 12,50, 12,80, 13,30 und 13,75-

Hifamycin S

Die Identifizierung von Rifamycin S, das von M. lacustris gebildet worden ist, wurde durch Elementaranalyse und Vergleiche mit veröffentlichten IR- und UV-Absorptionsspektren vorgenommen.

Rifamycin SV

Die Identifizierung von Rifamycin SV, das von M. lacustris" gebildet vjorden ist, wurde durch Element ar analyse und Verglei ehe mit veröffentlichten IR- .und UV-AbSorptionsspektren vor genommen.

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Verbindung 32,656

Kohlenstoff 58,19 %

Wasserstoff 5,97 %

Stickstoff 3,17 %

Schwefel 3 ,52 %

Sauerstoff (gemäß Differenz) 29,15 %

Die Verbindung ist schwach löslich in Wasser und Petroläther und leicht löslich in Methanol, Äthanol, Aceton und Äthylacetat.

OV-Absorptionsmaxima in 0,01 M HCl in Methanollösung treten auf "bei 225, 253 (Beugung), 3C0- und 414 nyum mit E^aj-Werten von 465, 280, 290 und 150. In KBr-Pellets · (Infrarotspektrum ist in der Zeichnung angegeben,) liegt die charakteristische Absorption in dem Infrarotbereich bei den folgenden Wellenlängen in /um: 2,90, 3,40, 5,75, 6,05, 6,3-0, 6,60, 6,80, 6,95, 7,25, 7,55, 7,95, 8,65, 9,40, 10,25, 10,55, 11,35, 12,45 und 13,20.

Beispiel 6

Durch Hydrieren von 3-Th.iomethylrifamycin S in Äthanollösung : in Gegenwart von 5-/^£a.lladium-auf-Kohle, bis 8 Äquivalente j Wasserstoff verbraucht werden, Entfernen des Katalysators durch

j Filtrieren und Eindampfen des Piltrats wird Hexahydro-3-thiοι ' " "

j methylrifamycin SV erhalten, daß durch die mit dem Massenspek-

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trometer erhaltenen Werte identifiziert worden ist. Durch Oxidation dieser Verbindung mit aktiviertem Mangandioxid wird Hexahydro-3~thiomethylrifamycin S erhalten. Die anti"biotisehen Eigenschaften dieser Hexahydroderi^Trete sind mit denen der Stammverbindungen vergleichbar.

Beispiel 7

Das Hexahydroderivat von der Verbindung 52,656 mit antibiotischer Wirksamkeit, die mit der der Stammverbindung vergleich-" bar ist, wird durch Hydrierung der Verbindung 32,656 nach dem Verfahren des Beispiels 6 hergestellt.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums, durch Züchten eines Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß Micromonospora lacustris sp. nov. Routien unter aeroben Unterwasserbedingungen in einem wäßrigen Nährmedium gezüchtet wird, das eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthält, bis eine wesentliche antibiotische Wirksamkeit erhalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Verbindungen Rifamycin S, Rifamycin SV, 3-Thiomethylrif amycin S und 3-Thiomethylrif amycin SV aus dem Antibiotikagemisch abgetrennt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem erhaltenen Antibiotikagemisch eine antibiotische Sub stanz Verbindung 32,656 abgetrennt wird, die in kristalliner Form, gelöst in 0,01 M HOl in Methanol, Absorptionsmaxima in dem ultravioletten Lichtbereich des Spektrums bei 225, 253 (Beugung), 300 und 414 nyum mit E^-Werten von 465, 280, 290 und 150 zeigt, eine durchschnittliche Zusammensetzung von 58,19 Gew.-% Kohlenstoff, 5,97 Gew.-% Wasserstoff, 3,17 Gew.-% Stickstoff", 3,52 Gew.-% Schwefel und 29,15 Gew.-% Sauerstoff (gemäß Differenz-) hat und in KBr-Pellets charakteristische Absorption in dem Infrarotbereich bei den folgenden Wellenlängen in /um zeigt: 2,90, 3,40, 5>75t 6,05, ; 6,30, 6,60, 6,80, 6,95, 7,25, 7,55, 7,95, 8,65, 9,40, 10,25, ; ' 10,55, 11,35, 12,45 und 13,20.

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4. Verfahren nach Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum zu dem Hexahydroderivat hydriert wird.

5· 3-Thiomethylrifamycin S.

6. 3-Thiomethylrifamycin SV.

7· Hexahydro-3-thiomethylrifamycin S.

8o Hexahydro-3-thiomethylrif amycin SV".

9« Antibiotische Substanz Verbindung 32,656, die in kristalliner Form, gelöst in 0,01 M HOl in Methanol, Absorptionsmaxima in dem ultravioletten Lichtbereich des Spektrums bei 225, 253 (Beugung), 300 und 414 m/um mit E^-Werten von 465, 280, 290 und 150 zeigt, eine durchschnittliche Zusammensetzung von 58,19 Gew.-% Kohlenstoff, 5,97 Gew.-% Wasserstoff, 3,17 Gew.-% Stickstoff, 3,52 Gew.-% Schwefel und 29,15 Gew.- -°/o Sauerstoff (gemäß Differenz) hat und in KBr-Pellets charäkterische Absorption in dem Infrarotberei'ch bei den folgenden Wellenlängen-in /um zeigt: 2,90, 3,4-0, 5,75, 6,05, 6,30/6,60, 6,80, 6,95, 7,25, 7,55, 7,95, 8,65, 9,4-0, 10,2*5, 10,55, 11,35, 12,45 und 13,20.

10. Hexahydroderivat von der Verbindung des Anspruchs 9·

Dr.Ve/Za -

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