Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia mieszaniny antybiotyków z grupy ryfamycyn na drodze hodowli drobnoustrojów Micromonspora lacustris sp. nov. Routien.Ryfamycyny, grupia scisle ze soba zwiazanych antybiotyków, zostaly opisane przez Sensi'ego i wspólpracowników w Farmaco, Ed. Sci., 14, 146(1959), Antibioties Anin., 1959/1960, 262(1960a), Experientia, 16, 412(1960b), Farmaco, Ed. Sci., 16, 165(1961) oraz Res. Progr. Biol. Med. Chem., 1, 337(1964).Budowe ryfamycyn ustalil i opisal V. Prelog w Pure Appl. Chem., 7, 551(1963b), który takze wprowadzil nazwe ansamycyny dla tej grupy wie¬ lkoczasteczkowych antybiotyków.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania mieszaniny ansamycyn przez nowy gatunek Mi- cromonospora, nazywany Micromonospora lacu¬ stris sp. nov. Routien. W sklad wytwarzanej mie¬ szaniny ansamycyn wchodza ryfamycyna S, ryfa- mycyna SV oraz ich pochodne 3-tiometylowe.Sposób wytwarzania mieszaniny antybiotyków zawierajacej ryfamycyne S, ryfamycyne SV, 3-tio- metyloryfamycyne S, 3-tiometyloryfamycyne SV i substancje antybiotyczna 32656, która w postaci krystalicznej rozpuszczona w 0,01 M roztworze HC1 w metanolu wykazuje maksima absorpcji w zakresie ultrafioletowej czesci widma przy dlu¬ gosci fali 225 mjiE l0/o= 465, 253 m\if punkt prze¬ giecia, E lO/o=280, 300 m\i E10/o=290, 414 m^i E10/o = = 150 i ma sklad elementarny: wegiel 58,19%, wo¬ dór 5,97%, azot 3,17%, siarka 3,52% i tlen 29,15% wyliczony z róznicy, a widmo w podczerwieni w tabletce KBr wykazuje charakterystyczna absorp- cje przy nastepujacych dlugosciach fal w mikro¬ nach: 2,90, 3,40, 5,75, 6,05, 6,30, 6,60, 6,80, 6,95, 7,25, 7,55, 7,95, 8,65, 9,40, 10,25, 10,55, 11,35, 12,45, i 13,20, polega na hodowaniu Micromonospora lacustris sp. nov. io Routien ATCC 2 1975 lub jego mutanta ATCC 21974 w warunkach hodowli podpowierzchniowej z napowietrzaniem, w wodnej pozywce, zawieraja¬ cej przyswajalne zródlo wegla i azotu, az do uzy¬ skania znacznej aktywnosci antybiotycznej i wy- !5 dzieleniu z pozywki jednej lub wiekszej ilosci substancji antybiotycznych, które ewentualnie pod¬ daje sie uwodornieniu w celu otrzymania odpo¬ wiedniej szesciowodoropochodnej.Drobnoustrój, wytwarzajacy antybiotyki, zostal 50 wyizolowany z próbki mulu w Rogers Lake, Con¬ necticut. Szczep ten (Pfizer F.D. 23849), nazywany Micromonospora lacustris sp. nov. Routien, zostal zdeponowany w American Type Culture Collecion, Rockville, Md. i oznaczony symbolem ATCC 21975.Do identyfikacji i sporzadzenia charakterystyki M. lacustris stosuje sie nastepujace pozywki i me¬ tody: Agar Bennetta z dodatkiem 0,1% weglanu wap¬ niowego — S. A. Waksman, The Actinomycetes, tom 2,1961, pozywka 30, strona 331. 94189Agar Emersona z dodatkiem Q,l°/o weglanu wap¬ niowego — Waksman, 1961, pozywka 28, strona 331.Agar pomidorowo^owsiany z;" dodatkiem"" ff,l0/o we¬ glanu wapnia — Waksman, 1961, pozywka 34, strona 332. * Agar glukozowo-asparaginowy z dodatkiem 0,1% Weglanu wapniowego — Waksman, 1961, pozywka 2, strona 328. * Agar z glukoza i wyciagiem drozdzowym oraz z , dodatkiem 0,1% weglanu wapniowego — M. J. Weinstein i wspólpracownicy, Antimicrobial Agents and Chemitherapy, 1968, strona 436.•-. Skrobia* ----- - (a) wedlug Waksmana, 1961, pozywka 21, strona 330, (b) jak wyzep* ale z dodatkiem 1% wyciagu droz¬ dzowego, '(c) wedlug Gordona i Mihma, J. Bact., 73, 15—27 (1957), (d) skrobia ziemniaczana 20,0 g chlorek amonowy 0,5 g agar 15,0 g woda destylowana 1,0 litr Zelatyna — Waksman, 1961, pozywka 20, strona 330.Tyrozyna — Waksman, 1961, pozywka 11, strona 329.Pozywka Czapeka z sacharoza — Waksman, 1961, pozywka 1, strona 328.Platki ziemniaczane — G. M. Luedemann i B. Brodsky, Antimicrobial Agents and Chemi¬ therapy, strona 47—52, 1965.Platki ziemniaczane z dodatkiem weglanu wap¬ niowego — Luedemann i Brodsky, 1965.Marchew. 2% roztwór agaru w wodzie wodociagowej.Iron agar z peptonem — Waksman, 1961, pozyw¬ ka 38, strona 332.Mleko zbierane Difco.Pozywka ATCC 172 — ATCC Catalog of Strains, Wydanie 9, strona 172, 1970.Pozywka dekstro7.owo-azotanowa — Waksman, 1$£1, pozywka 1, strona 328.Poiywka z azotanami organicznymi — Waksman, 1961, pozywka 37, strona 332.Inwertaza sacharozy — M. Levine i H. W. Scho- enleiin, A Compiljation of Culture Media, 1930, po¬ zywka 662, strona 176.Celuloza — Levine i Schoenlein, 1930, pozywka 2511, strona 823.Celuloza — H. L. Jensen, Proc. Linnean Soc.N..S. Wales, 55, 231(1930).Przyswajanie azotanu — Weinstein i wspólpra¬ cownicy, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1968, strona 437.Przyswajanie weglowodanów — Weinstein i wspólpracownicy.M. lacustris hodowano w probówkach lub na szalkach Petriego, prowadzac przynajmniej dwie równolegle hodowle dla umozliwienia wykonywa¬ nia niektórych dluzej trwajacych testów.Jesli nie podano inaczej, inkubacje prowadzono w temperaturze 28°C. Wyniki odczytywano w róz¬ nych przedzialach czasu do 14 dni, a w niektó- 94189 • «¦• -..:¦'¦ .'-V *.• ¦. , Y; A . A - -¦ :- /?-. -tf ^F jL\F 4 - - ¦ ' rych przypadkach prowadzono hodowle dluzej.Oznaczenie barw zaczerpnieto z „Color Harrriony Manual", wydanie 4, ContainerK^- Corporation of ~ Ameficar St. Zjedn. Ameryki, 1958, lecz ich opis pochodzi od autora wynalazku. Poslugiwano sie glównie metodami, opisanymi przez M. J. Weinstei- na i wspólpracowników w Antjtnierdbial Agents and Chemotherapy, strona 435^437 1967/1968.Szczep Micromonospora ATCC:.2I975 tla sie opi- sac w nastepujacy sposób. Charakterystycznym dla Micromonospora lacustris jest brak grzybni po¬ wietrznej 7i * wystepowanie zarodników tylko na grzybni podstawowej, przy czym zlokalizowane sa one pojedynczo na strzepkach. Zarodniki, wytwa- rzane na pozywce agarowej z woda wodociagowa, sa rzadkie, przysadkowe i rozmieszczone, na spo¬ dzie hodowli, o szerokosci najczesciej 1,1—1,5 mi¬ krona, czasami 2,0 mikrony. Stwierdzono rzadkie wystepowanie laczacych zgrubien. Na pozywce a- garowej z glukoza i wyciagiem drozdzowym obser¬ wuje sie podobne zarodniki, które czasami znajdu¬ ja sie w znacznej ilosci na brazowych plamkach w grzybni.W celu uzyskania dobrego wzrostu stosuje sie wyciag drozdzowy i preparat NZ-Amine A (Shef¬ field Chemical Co). Azotan sodowy, asparagina i kwas glutaminowy nie sa przyswajane. W po¬ zywce ATCC 172 obserwuje sie wzrost ubogi do dobrego w temperaturze 21, 28 i 37°C, natomiast zly w temperaturze 45°C.Redukcja azotanów — nie obserwuje sie reduk¬ cji azotanu do azotynu w ciagu 21 dni, zarówno w pozywce, zawierajacej dekstroze i azotan, jak równiez w pozywce, zawierajacej azotan organicz- ny- Wytwarzanie siarkowodoru — po 4 dniach ho¬ dowli w pozywce peptonowo-agarowej z solami ze¬ laza (Pepton Iron Agar) wykrywa sie siarkowo¬ dór za pomoca papierków, nasyconych octanem 40 olowiu.Celuloza — brak wzrostu w kazdej pozywce, na¬ wet po 38 dniach.Zelatyna — jak uplynniana.Skrobia — brak hydrolizy w przypadku pozyw- 45 ki skrobi wedlug Waksmana, 1961, pozywka 21 i skrobi wedlug Waksmana, 1961, pozywka 21 z dodatkiem l°/o wyciagu drozdzowego, hydroliza w pozywkach skrobia wedlug Gordona i Mihma, I. Bact., 73, 15—27 (1957) i skrobia ziemniaczana, 50 chlorek amonowy, agar i woda destylowana we¬ dlug wyzej podanych proporcji.Inwersja sacharozy — wynik pozytywny.Mleko zbierane — brak zmian po 21 dniach, pózniej zachodzi koagulacja i czesciowo peptoni- 55 zacJa- Przyswajanie wegla — przyswajana jest gluko¬ za, galaktoza, fruktoza, D-mannoza, d(—)-ryboza, skrobia, sacharozatrehaloza i ksyloza; nie przy¬ swajana 1-arabinoza, adonitol, celuloza, dulcyt, ino- 60 zyt, D-mannit, rafinoza, ramnoza i d-sorbitol; zmiennosc przyswajania wystepuje w przypadku laktozy i D-melibiozy.Dodatkowe dane hodowlane, dotyczace szczepu M. lacustris ATCC 21975, przedstawione sa w tab- es licy L94189 Tablica I Pozywka Agar Benneta z wegla¬ nem wapnia Agar Emersona z wegla¬ nem wapnia Pasta pomidorowa z ma¬ ka owsiana i weglanem wapnia Glukoza z wyciagiem drozdzowym i weglanem wapnia Agar Czapek a z sacha¬ roza Agar glukozowo-aspera- ginowy z weglanem wapnia Agar tyrozynowy Platki ziemniaczane Platki ziemniaczane z weglanem wapnia Zelatyna Marchew Agar skrobiowy Wzrost Dobry, powierzchnia plaska nieco chropowa¬ ta Dobry, powierzchnia pod¬ niesiona, chropowata, po¬ marszczona Dobry do b. dobranego, powierzchnia plaska, gladka Umiarkowany do dobre¬ go, powierzchnia plaska lub podniesiona, chropo¬ wata Prawie brak wzrostu Prawie brak wzrostu Prawie brak wzrostu Dobry, powierzchnia chropowata- lub cienka, plaska.Dobry, powierzchnia po¬ marszczona Ubogi do umiarkowane¬ go, powierzchnia plaska, cienka Brak wzrostu Prawie brak wzrostu na pozywce 6a i 6b, dobry wzrost na pozywce 6e i 6d. i Barwa grzybni Jasnopomaranczowa (blisko 4 pa) Jasnopomaranczowa (5 pa do 5 pc) Pomaranczowa (4 pa do 5 ia) Pomaranczowa (4 na do 5 pa) Czerwonawo-pomaran- czowa (5pc do 6pa) Czerwonawo-pomaran- czowa (blisko 5 pe) Bladozóltawo-pomaran- czowa (blisko 3 pe) Rozpuszczalny pigment 1 Jasnozólty Brazowy Lekkobrazowy Brazowy Brak Brak Brak .''¦.:¦¦¦¦¦¦•- Szczep mutant Pfizer F.D 24189, odkryty na drodze mutacji M. lacustris ATCC 21975, prowa¬ dzonej w zwykly sposób przy uzyciu naswietlania promieniowaniem ultrafioletowym, zostal zdepono¬ wany w American Type Culture Collection i ozna¬ czony symbolem ATCC 21974. Szczep mutant od¬ znacza sie barwa mniej wyrazna niz szczep ma¬ cierzysty, podczas hodowli, w pozywce agarowej z glukoza i wyciagiem drozdzowym, zawierajacej weglan wapniowy oraz w innych pozywkach. Mu¬ tant wytwarza wiecej zarodników, które maja rów¬ niez nieco wieksze wymiary niz pochodzace z ho¬ dowli szczepu macierzystego. W przeciwienstwie do szczepu macierzystego mutant nie przyswaja fruktozy i laktozy jako zródla wegla. Szczep mu¬ tant wytwarza mniejsze ilosci ryfamycyny S i ry- famycyny SV niz szczep macierzysty w tych sa¬ mych pozywkach.M. lacustris hoduje sie korzystnie w wodnych pozywkach, w temperaturze okolo 24—36°, w ho¬ dowli podpowierzchniowej z napowietrzaniem i podczas mieszania. W sklad pozywki wchodza przyswajalne zródla wegla, takie jak cukry, skro¬ bia, gliceryna oraz melasy i zródla organicznego azotu, takie jak kazeina, enzymatyczny wyciag kazeiny, maczka miesna, gluten, maka z ziaren bawelny, maka sojowa i maka arachidowa. Dobre wyniki daje takze stosowanie substancji wzrosto- 40 45 50 55 60 65 wyeh, takich jak rozpuszczalne pozostalosci po de¬ stylacji alkoholu i/lub wyciag drozdzowy, oraz soli, takich jak chlorek sodowy, octan amonu, siarczan amonu, fosforan potasu i sladowe ilosci zelaza, manganu, cynku, kobaltu i manganu.W przypadku^ gdy podczas fermentacji zacho¬ dzi nadmierne pienienie, dodaje sie do srodowis¬ ka srodki przeciwpienne, takie jak oleje roslin¬ ne lub silikonowe. Wartosc pH podczas fermentacji ma na ogól tendencje do utrzymywania . sie na stalym poziomie, ale w razie potrzeby mozna do¬ dawac do srodowiska substancje buforujace, ta¬ kie np. jak weglan wapniowy. Napowietrzanie ko¬ rzystnie jest prowadzic podczas hodowli podpo¬ wierzchniowej, przepuszczajac od okolo 0,5 do 2 objetosci powietrza na 1 objetosc brzeczki na mi¬ nute. Brzeczke miesza sie mieszadlem, stosowa¬ nym zwykle w przemysle farmaceutycznym. Oczy¬ wista jest koniecznosc zachowania jalowych wa¬ runków podczas przenoszenia drobnoustroju i pod¬ czas jego wzrostu.Inokulum dla wytwarzania mieszaniny antybio¬ tyków przygotowuje sie; wykorzystujac hodowle M. lacustris na skosach, stosujac pozywke w ro¬ dzaju opisanej poprzednio pozywki ATCC 172. Ho¬ dowle te mozna stosowac do zaszczepiania kolb na trzesawke, jak równiez fermentorów do przy¬ gotowywania inokulum. Mozna równiez hodowle7 94189 8 z kolb zaszczepiac farmentory do przygotowywa¬ nia inokulum. Maksimum wzrostu drobnoustroju osiaga sie na ogól po 2 lub 3 dniach. Na szybkosc wzrostu ma wplyw rodzaj stosowanej aparatury, napowietrzanie, szybkosc mieszania i podobne czyn¬ niki. Na ogól fermentacje prowadzi sie az do u- zyskania w brzeczce znacznej ilosci antybioty¬ ków, co nastepuje w ciagu od okolo 24 godzin do okolo 4 dni.Proces wytwarzania antybiotyków kontrolowany jest podczas fermentacji oznaczeniami biologicz¬ nymi z zastosowaniem wrazliwego szczepu Staphy- lococcus aureus. Stosuje sie standardowa metode plytkowa, w której strefy zahamowania dookola krazka bibulkowego, nasyconego brzeczka, sluza jako miara aktywnosci antybiotycznej. Po uzys¬ kaniu w brzeczce fermentacyjnej odpowiedniego poziomu aktywnosci antybiotycznej, wartosc pH wynosi zazwyczaj okolo 7,5—8,5. Grzybnie odsacza sie lub odwirowuje, stosujac rózne typy urzadzen, takie jak prasy filtracyjne, wirówki i podobne.Pozyteczna metoda analizowania mieszaniny antybiotyków, wytwarzanej przez M. lacustris, w brzeczce fermentacyjnej lub surowej albo oczysz¬ czonej mieszaninie wydzielonej z sklarowanej brzeczki jest chromatografia cienkowarstwowa na zelu krzemionkowym. Rozdzial mieszaniny na po¬ szczególne skladniki zalezy od ilosci nanoszonej próbki. W zbyt malej próbce nie mozna wykryc skladników, wystepujacych w mniejszej ilosci, na¬ tomiast przy stosowaniu zbyt duzych próbek mo¬ ze nastapic efekt przebicia i zlego rozdzialu.Do rozwijania chromatogramu cienkowarstwo¬ wego stosuje sie górna warstwe mieszaniny octa¬ nu etylu, czterowodorofuranu i wody (4:1:5).Chromatogram wywoluje sie biologicznie, pokry¬ wajac cienka warstwa agaru, zaszczepionego wra¬ zliwym szczepem Staphylococcus auereus lub in¬ nym. Chromatogramy cienkowarstwowe mozna równiez odczytywac wizualnie po rozwinieciu. An¬ tybiotyki, obecne w mieszaninie, sa intensywnie zabarwione na rózne odcienie pomaranczowe, zól¬ te i rózowe.Hyiamycyny wytwarzane przez M. lacustris, sa zwiazkami o wzorach ogólnych 1 i 2, w których R oznacza atom wodoru lub grupe tiometylowa.Glówna czesc okolo 90% mieszaniny antybio¬ tyków wytwarzanej przez M. lacustris, zidenty¬ fikowana za pomoca analizy elementarnej, spek¬ troskopii masowej i widma magnetycznego rezo¬ nansu jadrowego, stanowi 3-tiometyloryfamycyna S o wzorze ogólnym 2, w którym R oznacza grupe tiometylowa i 3-tiometyloryfamycyna SV o wzo¬ rze ogólnym 1, w którym R oznacza grupe tio¬ metylowa. Skladnikami, wystepujacymi w mniej¬ szej ilosci, stanowiacymi okolo 9% sa ryfamycy- na S o wzorze ogólnym 2, w którym R oznacza atom wodoru i ryfamycyna SV o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza atom wodoru. Mniejsze ilos¬ ci ryfamycyny S i ryfamycyny SV wytwarza szczep mutant M. lacustris ATCC 21974.Poza powyzszymi ryfamycynami, w mieszaninie antybiotyków znajduje sie okolo 0,9% nowej ansa- mycyny, zwanej substancja antybiotyczna 32656 oraz okolo 0,l°/oi wielu innych ansamycyn w ilos¬ ciach sladowych.Dane analityczne, otrzymane dla 3-tiometylory- famycyny S.Analiza elementarna: Wegiel — 61,48% Wodór — 6,70% Azot — 1,90% Siarka — 4,15% Widmo masowe i widmo magnetyczne rezonan¬ su jadrowego odpowiadaja soli sodowej 3-tiomety¬ loryfamycyny SV o wzorze sumarycznym C38H48Na012NS. W widmie w nadfiolecie, w 0,01 m roztworze chlorowodorku w metanolu wystepuja maksima absorpcji przy nastepujacych dlugosciach fali: 225, 305 oraz 440 m\i.W widmie w podczerwieni, wykonanym w brom¬ ku potasu, wystepuja pasma absorpcji przy na¬ stepujacych dlugosciach fali: 2,90, 3,40, 5,25, 5,95, 6,50, 7,00, 7,25, 8,15, 8,70, 9,30, 9,45, 10,30, 10,65, 11,35, 12,50, 12,80, 13,30 oraz 13,75 \i.Ryfamycyna S Ryfamycyne S, wytwarzana przez M. lacustris, identyfikowano za pomoca analizy elementarnej i porównania widma w nadfiolecie i podczerwieni z danymi z pismiennictwa.Ryfamycyne SV, wytwarzana przez M. lacustris, identyfikowano za pomoca analizy elementarnej i porównanie widm w nadfiolecie i w podczerwie¬ ni z publikowanymi danymi.Dane analityczne otrzymane dla substancji anty¬ biotycznej 32656.Analiza elementarna: Wegiel — 58,19% Wodór — 5,97% Azot — 3,17% Siarka — 3,52% Tlen (róznica) — 29,15% Substancja ta jest slabo rozpuszczalna w wo¬ dzie i eterze naftowym, natomiast dobrze rozpusz¬ czalny w metanolu, etanolu, acetonie i octanie etylu. Widmo w nadfiolecie w 0,01 m roztworze chlorowodorku w metanolu: 225 m^ (Ej Q/ = 465), 253 m\i (punkt przegiecia, Ei 0/o = 280), 300 mji (Elo/o = 290) oraz 414 m|x (Elo/o = 150).Widmo w podczerwieni w bromku potasu: 2,90, 3,40, 5,75, 6,05, 6,30, 6,80, 6,95, 7,25, 7,55, 7,95, 8,86, 9,40, 10,25, 10,55, 11,35, 12,45 oraz 13,20 \jl.Widmo w podczerwieni ilustruje wykres, przedsta¬ wiony na fig., na którym widmo zwiazku 32656 w bromku potasu podano wykreslnie przy dlu¬ gosci fali w mikronach.Równowaga oksydacyjano-redukcyjna, istniejaca pomiedzy ryfamycyna S i ryfamycyna SV, wyste¬ puje takze pomiedzy pochodnymi 3-tiometylowymi powyzszych antybiotyków. Ryfamycyne SV mozna utleniac tlenem lub dwutlenkiem manganu do ry¬ famycyny S. Ryfamycyne S latwo sie redukuje kwasem askorbinowym do ryfamycyny SV. W po¬ dobny sposób zachodzi odpowiednio utlenienie i redukcja 3-tiometyloryfamycyny S i 3-tiometylo- ryfamycyny SV.Roztwór 3-tiometyloryfamycyny S w etanolu mozna uwodarniac w obecnosci 5% palladu na weglu aktywnym do szesciowodoro-3-tiometylory- famycyny SV. Po pochlonieciu osmiu równowazni- 40 45 50 55 609 94189 ków wodoru, odsaczeniu katalizatora i odparowa¬ niu rozpuszczalnika otrzymuje sie powyzszy zwia¬ zek. Po utlenieniu produktu uwodornienia akty¬ wowanym dwutlenkiem manganu otrzymuje sie szesciowodoro-3-tiometyloryfamycyne S. Podobnie mozna utleniac zwiazek 32656 do pochodnej szes- ciowodorowej.Uwodornienie mozna przeprowadzic przykladowo w nastepujacy sposób.Roztwór 3-tiometyloryfamycyny S w etanolu poddaje sie uwodornieniu w obecnosci 5% palladu na weglu aktywnym az do zuzycia 8 równowaz¬ ników wodoru. Po odsaczeniu katalizatora i od¬ parowaniu przesaczu otrzymuje sie szesciowodoro- -s-tiometyloryfamycyne SV, która identyfikuje sie za pomoca spektroskopii masowej. Utleniajac po¬ wyzszy zwiazek dwutlenkiem manganu otrzymuje sie szesciowodoro-3-tiometyloryfamycyne S. Wlas¬ ciwosci antybiotyczne pochodnej szesciowodoro- wej sa podobne do wlasciwosci wyjsciowego an¬ tybiotyku.Pochodna szesciowodorowa zwiazku 32656 otrzy¬ muje sie na drodze uwodornienia zwiazku 32656, w sposób podobny do opisanego poprzednio. Wlas¬ ciwosci antybiotyczne nowej pochodnej sa podob¬ ne do wlasciwosci wyjsciowego zwiazku.Poszczególne skladniki mieszaniny antybioty¬ ków wydziela sie z brzeczki fermentacyjnej, sto¬ sujac rózne sposoby postepowania, takie jak eks¬ trakcja rozpuszczalnikami, chromatografia kolum¬ nowa lub ich polaczenie. Do ekstrakcji mozna sto¬ sowac rózne rozpuszczalniki organiczne. Szczególnie korzystny jest keton metylowoizobutylowy. Eks¬ trakcje korzystnie prowadzi sie, stosujac objetosc rozpuszczalnika, równa okolo 20% objetosci brzecz¬ ki fermentacyjnej. W zaleznosci od ilosci brzeczki do ekstrakcji mozna stosowac rózne urzadzenia, takie jak rozdzielacze, zbiorniki z mieszadlem, urzadzenia mechaniczne, takie jak separatory wi¬ rówkowe.Ansamycyny korzystnie jest wydzielac w posta¬ ci zredukowanej. W tym celu do brzeczki przed saczeniem mozna dodawac kwas askorbinowy w ilosci 2 gramy na 1 gram mieszaniny antybioty¬ ków i calosc mieszac w temperaturze pokojowej w ciagu 30 minut. Mozna takze redukowac anty¬ biotyki za pomoca kwasu askorbinowego w któ¬ rymkolwiek z etapów ekstrakcji lub zatezenia.Korzystny jest nastepujacy sposób rozdzialu i wydzielania poszczególnych skladników miesza¬ niny antybiotyków. Wartosc pH brzeczki po prze¬ saczeniu doprowadza sie do 4,0—4,5 i ekstrahuje okolo 20% objetosci ketonu metylowoizobutylowe- go. Keton odparowuje sie pod zmniejszonym cis¬ nieniem, a do pozostalosci dodaje techniczny eta¬ nol. Roztwór etanolowy odtluszcza sie na drodze kilkakrotnej ekstrakcji eterem naftowym. Ansa¬ mycyny redukuje sie kwasem askorbinowym, eta¬ nol odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem, a pozostalosc rozpuszcza sie w chloroformie.Chloroform odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem, a pozostalosc chromatografuje na ko¬ lumnie z zelem krzemionkowym, stosujac do elu- acji octan etylu z wzrastajaca stopniowo iloscia acetonu. Poszczególne frakcje kontroluje sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej i ozna¬ czen biologicznych, po czym laczy w odpowiednie grupy. W pierwszych frakcjach znajduje sie sub¬ stancja 32656 lacznie ze sladami innych ansamy- cyn. Stezenie acetonu w roztworze octanu etylu podnosi sie stopniowo do 30—50%. Eluuje sie wtedy glównie frakcje, z których po zatezeniu otrzymuje sie krystaliczna 3-tiometyloryfamycyne SV. 3-tiometyloryfamycyne' SV latwo przeksztalca sie w 3-tiometyloryfamycyne S na drodze utlenia¬ nia powietrzem lub korzystniej aktywowanym *dwutlenkiem manganu, który przygotowuje sie, suszac azeotropowo dwutlenek manganu w sposób, opisany w J. Org. Chem., 34, 6, 1979 (1969). Zawie¬ sine aktywowanego dwutlenku manganu, w ilosci okolo 1 grama na gram antybiotyku, dodaje sie do roztworu antybiotyku w metanolu lub octanie etylu i calosc miesza w temperaturze pokojowej w ciagu okolo 30 minut, w którym to czasie utle- iniamie w zasadzie konczy sie. Mieszanine reakcyj¬ na saczy sie lub wiruje, a nastepnie odparowuje rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem.Produkty, otrzymane sposobem wedlug wynalaz- ku, wytwarzane przez M. lacustris, w postaci roz¬ cienczonej, surowych koncentratów oraz oczysz¬ czonych poszczególnych skladników sa przydatne do zwalczania drobnoustrojów, zwlaszcza Myco- bactarium tuborculosis, Diplococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes oraz Staphylococcus aureus, w tym takze szczepów, opornych na dzialanie in¬ nych znanych antybiotyków. Ponadto otrzymane antybiotyki sa uzyteczne jako srodki dezynfekujace przeciw tym drobnoustrojom oraz jako srodki pomocnicze dla oczyszczania hodowli mieszanych dla celów diagnostyki medycznej i badan biolo¬ gicznych.W tablicy II przedstawiono spektrum dzialania przeciwbakteryjnego niektórych nowych ansamy- 40 cyn. Próby wykonywano, przygotowujac probówki z pozywka, zawierajace stopniowo wzrastajaca ilosc czystego antybiotyku, a nastepnie zageszczajac po¬ zywke odpowiednim drobnoustrojem. Najmniejsze stezenie hamujace, podawane w tablicy 2, jest 45 najmniejszym stezeniem antybiotyku, wyrazonym w mikrogramach/ml, przy którym nie zachodzi juz wzrost drobnoustroju. Próby prowadzono w standardowych warunkach w sposób, opisany w Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 122, 1107 (1966). 50 W tablicy III i IV podane sa dane, dotyczace aktywnosci in vivo u doswiadczalnie zakazonych myszy. Symbol PD50 w tablicy III oznacza ilosc antybiotyku, chroniaca 50% badanych myszy.Tablica II Najmniejsze stezenie hamujace w ^ig/ml Antybio¬ tyk 3-tiome- tylory- famycy | na SV M.tu- berc.H RV 37 0,015 Strepto¬ coccus pyogenes 0,0019 Staphy¬ lococcus aureus 0,0019 S.aureus (oporny) 0,0019—0,003911 94189 12 c.d. tablicy II Antybio¬ tyk 3-tiome- tylory- famycy- na S Zwiazek 32656 M.tu- berc.HRV 37 0,006 0,1 Strepto- coccus pyogens 0,0009 0,0312 Staphy- lococcus aureus 0,0004 0,0039 S.aureus (oporny) 0,0012—0,0039 0,0012—0,0078 J Tablica III PD50 w mg/kg Antybiotyk 3-tiomety- loryfamy- cyna SV 3-tiomety- loryfamy- cyna S Zwiazek 32656 Diplo- cocci-do- ustnie 8,0 12,5 Strepto- cocci-do- ustnie 0,22 0,60 Staphylococci doustnie 1.1 1,4 1,15 podskór¬ nie 0,65 • 0,17 Tablica IV Myszy zakazone M. tiiberculosis 3-tiometylb- ryfamycy- na SV Kontrola Dawka dzienna ,0 0,5 0 Ilosc prze¬ zytych , w.%*) 100 70 Przecielny czas prze¬ zycia w dniach*) 53 • 44,3 37,7 *) po 53 dniach od zakazenia.Antybiotyki, wytwarzane sposobem wedlug wy¬ nalazku, mozna podawac doustnie lub pozajelito- wo w leczeniu zwierzat i ludzi, zakazonych drob¬ noustrojami Mycobacterium tuberculosis, Diplo- coccus pneumoniae, Streptococcus, Staphylococcus i innymi wrazliwymi na dzialanie antybiotyków.Na ogól korzystnie jest podawac powyzsze anty¬ biotyki w dawce dziennej 0,5—1 g przy podawaniu doustnym lub 100—500 mg przy podawaniu iniek- cyjnym, w zaleznosci od rodzaju i stopnia zakaze¬ nia oraz wagi ciala pacjenta.Wytworzone zwiazki mozna podawac same lub w polaczeniu z dopuszczalnymi w farmacji nos¬ nikami, w postaci dawek pojedynczych lub wielo¬ krotnych.Do podawania doustnego przygotowuje sie ta¬ bletki, które moga zawierac rózne rozcienczalniki, takie jak cytrynian sodowy, weglan wapniowy lub fosforan dwuwapniowy, srodki rozpraszajace, ta¬ kie jak skrobia, kwas alginowy i rózne kompleksy krzemianowe oraz srodki wiazace, takie jak poli- winylopirolidon, sacharoza, zelatyna lub guma arabska.Ponadto tabletki moga zawierac lubrykanty, ta¬ kie jak stearynian magnezu, laurylosiarczan sodo¬ wy lub talk. Stalymi kompozycjami podobnego typu mozna równiez napelniac miekkie lub twarde kapsulki zelatynowe. W tym przypadku korzyst¬ nie jest stosowac laktoze i glikole polietylenowe o wysokim ciezarze czasteczkowym. W przypadku wodnych zawiesin i/lub eliksirów do stosowania doustnego, skladnik aktywny miesza sie z rózny¬ mi substancjami zapachowymi i slodzacymi, sub¬ stancjami barwnymi lub barwnikami, oraz w ra¬ zie potrzeby z czynnikami, ulatwiajacymi powsta¬ wanie emulsji i zawiesin, jak równiez z rozpusz¬ czalnikami, takimi jak woda, etanol, glikol pro¬ pylenowy, gliceryna i rózne ich mieszaniny.Do stosowania pozajelitowego przygotowuje sie roztwory nowych antybiotyków w oleju sezamo¬ wym, oleju arachidowym lub wodnym roztworze glikolu propylenowego. W przypadku soli metali alkalicznych i ziem alkalicznych rozpuszczalnych w wodzie, mozna przygotowac jalowe roztwory wodne. W razie potrzeby roztwory wodne korzyst¬ nie buforuje sie oraz przygotowuje w postaci izo- tonicznej za pomoca chlorku sodowego lub glu¬ kozy.Ponizej podano przykladowo receptury kompo¬ zycji farmaceutycznych, zawierajacych otrzymane antybiotyki.Stala kompozycje, farmaceutyczna otrzymuje sie, mieszajac ze soba nastepujace skladniki w poniz¬ szych proporcjach: < 3-tiometyloryfamycyna SV 50 Cytrynian sodowy 25 Kwas alginowy 10 Poliwinylopirolidon 10 Stearynian magnezu 5 Po dokladnym wymieszaniu suchej kompozycji sporzadza sie tabletki, zawierajace po 500 mg skladnika aktywnego. W podobny sposób, stosujac odpowiednia ilosc 3-tiometyloryfamycyny SV, spo¬ rzadza sie tabletki, zawierajace 250, 100 lub 50 mg skladnika aktywnego.Przygotowuje sie fiolki, zawierajace odwazone ilosci jalowej soli sodowej 3-tiometyloryfamycyny SV. Do stosowania pozajelitowego zawartosc fiolki rozpuszcza sie w jalowej wodzie lub 5% roztworze glukozy do stezenia 100 lub 200 mg/ml.Ponizsze przyklady ilustruja dokladniej sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. Sporzadza sie jalowy wodny roztwór pozywki o nastepujacym skladzie: g/litr Skrobia 20,0 Enzymatyczny wyciag kazeiny 5,0 Wyciag drozdzowy 5,0 Dekstroza 10,0 Fosforan dwupotasowy 0,5 Weglan wapniowy 4,0 Komórki z hodowli na skosach M. lacustris ATCC 21975 przenosi sie do serii kolb Fernbacha, z których kazda zawiera 1 litr pozywki o poda¬ nym powyzej skladzie i kolby wstrzasa sie w cia¬ gu 3—4 dni w temperaturze 28°C.13 94189 14 Okolo l°/o (objetosc na objetosc) inokulum wzro¬ stowego przenosi sie do fermentorów, zawieraja¬ cych okolo 568 litrów jalowej pozywki o naste- Skrobia Enzymatyczny wyciag kazeiny dl-metionina Octan amonu Siarczan amonu K2HP04 Sacharoza CaC03 Maczka miesna FeS04-7H20 MgS04-7H20 ZnS04-7H20 MnCl2 CoCl2-6H20 g/litr ,0 ,0 1,0 0,5 0,1 0,4 1,0 4,0 ,0 0,02 0,1 0,002 0,002 0,002 Hodowle prowadzi sie w temperaturze okolo °C, podczas mieszania z szybkoscia 1150 obro¬ tów na minute i napowietrzania w ilosci 0,5 ob¬ jetosci powietrza na 2 objetosc brzeczki na mi¬ nute. Po uplywie 35—45 godzin do fermentora, zawierajacego 3785 litrów jalowej pozywki o po¬ danym powyzej skladzie, przenosi sie 5°/o objetos¬ ciowych inokulum wzrostowego. Hodowle prowadzi sie w temperaturze 30°C, podczas mieszania z szybkoscia 600 obrotów na minute i napowietrza¬ nia w ilosci 0,5 objetosci powietrza na 1 objetosc brzeczki na minute. W razie potrzeby dodaje sie olej sojowy w celu likwidacji nadmiernego pie¬ nienia.Po uplywie 50—60 godzin 5—10% objetoscio¬ wych powyzszego inokulum wzrostowego przenosi Fie do fermentatora, zawierajacego 37854 litrów jalo¬ wej pozywki, o skladzie podanym powyzej, ale nie zawierajacej maczki miesnej. Hodowle prowadzi sie w temperaturze 30°C, podczas mieszania z szybkoscia 380 obrotów na minute i napowietrza¬ nia w ilosci 0,5 objetosci powietrza na 1 objetosc brzeczki na minute. W razie potrzeby dla likwi¬ dacji pienienia dodaje sie olej sojowy. Co 24 go¬ dziny dodaje sie sacharoze lub dekstroze, utrzy¬ mujac poziom okolo 0,l°/o wagowych na objetosc.Po uplywie 90—120 godzin brzeczke fermentacyj¬ na saczy sie, dodaje 5—10% ketonu metylowoizo- butylowego i pH doprowadza do wartosci 4,0—4,5.Nastepnie brzeczke ekstrahuje sie 9463 litrami ke¬ tonu metylowoizobutylowego, stosujac ekstraktor Podbielniaka i separator. Ekstrakt zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem od 1/10—1/20 objetosci i doprowadza pH do wartosci 5,5—6,5 za pomoca amoniaku lub 10% roztworu fosforanu dwupotaso- wego.Pozostala ilosc rozpuszczalnika (okolo 900 litrów) odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem i za¬ stepuje etanolem. Roztwór etanolowy zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 75 litrów, a nastepnie odtluszcza za pomoca kil¬ kakrotnej ekstrakcji eterem naftowym. Do roz¬ tworu etanolowego dodaje sie kwas askorbinowy w ilosci 2 g na 1 gram mieszaniny antybiotyków i calosc miesza w temperaturze pokojowej w cia¬ gu okolo 30 minut. Roztwór zateza sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem, utrzymujac wartosc pH w gra¬ nicach 6—7. Otrzymany rzadki syrop wlewa sie do chloroformu.Roztwór chloroformowy zageszcza sie do kon¬ systencji syropu i poddaje chromatografii na ko¬ lumnie z zelem krzemionkowym, stosujac do elu- acji octan etylu, zawierajacy poczatkowo 5%^ a na¬ stepnie zwiekszajaca sie ilosc acetonu. Kolejne frakcje bada sie, stosujac chromatografie cienko¬ warstwowa i oznaczenia biologiczne. Pierwsze frakcje zawieraja zwiazek 32656 oraz sladowe ilosci ryfamycyny S, ryfamycyny SV i innych ansamycyn. Po zatezeniu srodkowych frakcji otrzy¬ muje sie krystaliczna 3-tiometyloryfamycyne SV.Przyklad II. Powtarza sie postepowanie z przykladu I, stosujac M. lacustris ATCC 21974 zamiast ATCC 21975. Otrzymuje sie podobne wy¬ niki, z tym ze wytwarzane sa mniejsze ilosci ry¬ famycyny S i ryfamycyny SV. PL PL PL PL