DE3123937A1 - Verfahren zur herstellung von l-tryptophan oder seiner derivate und dafuer verwendbare biologisch reine kulturen - Google Patents

Description

patentanwäl'te" "* *** MÜNCHEN-HAMBURG

DIPL.-OHEM. DR. HANS D. BOETERS ) RUMFORDSTRASSE AO

• BQgTgRS * RAFfAV- RUMTOHDiTH. «ο · βοοο mOnchkn 8 · . 8000 MÜNCHEN a

DIPL.-ING. VINCENZ ν. RAFFAV HAMBURG

Deutsches Patentamt

.HRZE.CHEN: A 02-25842C/KM 8000 München 2 · your reference:

UN₆ER zeichen: Asahi-P270581-1 OUR REFERENCE:

Vertreter-Nr. VNR 100

16. Juni 1981

BETRIFFT: RE:

.Anmelder: Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha, Osaka, Japan

Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan oder seiner Derivate und dafür verwendbare biologisch reine Kulturen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan oder seiner Derivate unter Verwendung von Mikroorganismen.

L-Tryptophan ist eine der essentiellen Aminosäuren, die die Körper von !Tieren bilden, und ist als Medikament, ITahrungsmittel oder als Zusatzstoff zu Tierfutter wichtig. Einige L-Tryptophanderivate wirken als Antagonisten gegen den -Metabolismus von L-Tryptophan und umfassen physiologisch aktive Substanzen, die man zur Herstellung.ίνοη Pharmaka verwenden kann, welche auf das Zentralnervensystem einwirken. LrTryptophan und seine Derivate kann man auf bekannte Weise durch Synthese, biologische ■ Methoden und viele andere Methoden herstellen. Bekannte Methoden zur Herstellung von L-Tryptophan unter Verwendung von Mikroorganismen sind beispielsweise: (1) Direkte Fermentation unter Verwendung von Zuckern zur Steigerung des L-Tryptophangehalts in einer Kultur; und (2) Zugabe von Indol oder Anthranilsäure gleichzeitig mit Zucker zu einer Kultur, wobei man den L-Tryptophangehalt in der Kultur ansteigen läßt. L-Tryptophan kann

TELEFON: COeej S3 07 ΟΙ . TELEGRAMME: BOEPATENT MONOHEN COPY

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man auch aus Indol und Serin oder aus Indol, Brem-.tr-mn > ι■.. -iwnv und Ammoniumionen unter Verwendung einer Tryptophanase (Enzym) herstellen, welche man mit einem Mikroorganismus erzeugt hat. Diese Methode unter Verwendung von Tryptophanase hat den Vorteil, daß man durch Austausch des Indols gegen andere Indolverbindungen verschiedene entsprechende L-Tryptophanderivate herstellen kann und man daher eine Reaktion.auswählen kann, die am besten dem speziellen Zweck angepaßt ist.

Es sind viele Methoden zur Herstellung von L-Tryptophan unter .Verwendung von Tryptophanase bekannt. In der JP-Patentver-• öffentlichung Serien-Nr. 46917/74 ist eine Methode beschrieben, wobei man L-Tryptophan aus Indol und Serin oder aus Indol, Brenztraubensäure und Ammoniumionen unter Verwendung . eines Mikroorganismus yom Genus.Eseherichia, Genus Proteus, Genus Pseudomonas, Genus Aerobacter oder Genus Erwinia herstellt; und in der PR-PS 1 207 437, der JP-OS 39693/72 (OPI) und der JP-Patentveröffentlichung Serien-ITr. 1836/78 ist eine . Methode beschrieben, wobei man L-Tryptophan aus Indol und Serin unter Verwendung eines Mikroorganismus vom Genus Escherichia, Genus Clav.iceps, Genus Neurospora, Genus Saccharomyces, Genus Bacillus, Genus Achromobacter oder Genus Alcaligenes herstellt. Es sind ferner verschiedene Methoden zur Herateilung von L-Tryptophanderivaten bekannt, die verschiedenen Indolverbindungen entsprechen: In der JP-Pateutveröffentlichung 3erien-Nr. 46917/74 ist eine Methode zur Herstellung von 5-Hydroxytryptophan unter Verwendung eines Mikroorganismus vom Genus Proteus, Genus Escheriphia, Genus Pseudomonas, Genus Aerobacter oder Genus Erw.inia beschrieben;. in der JP-Patentveröffentlichung Serien-Nr. 1835/78 is*t eine Methode zur Herstellung von 5-Hydroxytryptophan unter Verwendung eines Mikroorganismus vom Genus Achromobacter, Genus Escherichia, Genus Pseudomonas, Genus Alcaligenes oder Genus Proteus beschrieben; und in den JP-PatentVeröffentlichungen Serien-Nr. 5479/76 und 8400/77 ist eine Methode zur Herstellung' von 5-Hydroxytryptophan und Methoxytryptophan unter Verwendung eines Mikroorganismus vom Genus Corynebacterium oder Genus Brevibacterium Asahi-P270581-1

COPY BAD

beschrieben.

Diese Methoden, bei welchen man Mikroorganismen verwendet, weisen gegenüber den Herstellungsmethoden für !-Tryptophan oder seinen Derivaten durch chemische Synthese den Vorteil auf, daß sie nur Verbindungen der L-Form liefern, die optisc aktiv sind. Sie machen die Herstellung großer Mengen von L-Tryptophan. oder L-Iryptophanderivaten aus technischen Ausgangsstoffen möglich, wie z.B. Indolverbindungen, Serin oder

10 Brenztraubensäure.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß man mit neuen Mikroorganismen !-Tryptophan and seine Derivate in hoher Ausbeute erzeugen kann.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan bzw. einem seiner Derivate. Erfindungsgemäß läßt man eine Indolverbindung mit Serin oder mit Brenztraubensäur und/oder ihrem Salz und Ammoniumionen in Gegenwart einer KuI . tür oder einer behandelten Kultur eines Mikroorganismus vom Genus Aeromonas oder Genus Klebsiella reagieren, der L-Tryptophan oder eines seiner Derivate aus einer Indolverbindung und Serin oder aus einer Indolverbindung, Brenztraubensäure und/oder ihrem Salz und Ammaniumionen herstellen kann.

Erfindungsgemäß verwendet man Mikroorganismen vom Genus Aero monas oder Genus Klebsiella, die L-Tryptophan oder seine Derivate aus einer Indolverbindung und Serin, oder aus einer Indolverbindung, Brenztraubensäure jund/oder ihrem Salz und Ammoniumioneu herstellen.können. Bisher wurde von keinerlei Mikroorganismen vom Genus Aeromonas festgestellt, daß sie-L-Tryptophan aus Indol mit Hilfe von Tryptophanase herstelle können (s. Agricultural and Biological Chemistry, Bd. 36, S.' 2523, 1972).

Es ist üblich und bekannt, daß verschiedene Mikroorganismen'

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Tryptophanase herstellen, die !-Tryptophan zersetzen und Indol herstellen, aber nicht alle Mikroorganismen, die Tryptophanase herstellen, können eine merkliche Menge von L-Tryptophan herstellen. Mikroorganismen, die Tryptophanase herstellen und die rationell bzw. wirksam !-Tryptophan oder eines seiner Derivate aus einer Indolverbindung und Serin oder aus einer Indolverbindung, Brenztraubensäure und/oder ihrem Salz und Ammoniumionen herstellen, müssen die nachstehenden Anforderungen erfüllen:

(1) Die in den Mikroorganismen erzeugte Tryptophanase weist eine hohe Aktivität auf; (2) die Mikroorganismen zersetzen nicht die Ausgangsstoffe, wie z.B. die Indolverbindungen, Serin und Brenztraubensäure; und (3) die,Mikroorganismen zersetzen nicht das erhaltene !-Tryptophan oder seine Derivate,

15 außer mit Hilfe der Tryptophanase.

Erfindungsgemäß isolierte man eine Anzahl von Mikroorganismen, die Tryptophanase erzeugen,aus dem Erdboden, welche auch neue Mikroorganismen vom Genus Aeromonas und Genus Klebsieila umfassen, die rationell bzw. wirksam !-Tryptophan oder seine Derivate erzeugen. Unter den Bezeichnungen Aeromonas SP. AST

'» 108-1, Aeromonas SP. AST 111-4, Klebsiella SP. AST 148-1 . und Klebsiella SP. AST 151-7 wurden diese Mikroorganismen beim Fermentation Research. Institute, the Agency of Industrial Science and Technology (I¹EEM) unter den Bezeichnungen FEEM-P 5539, 5540, 5541 bzw. 5542 am 28. Mai 1980 hinterlegt und sie tragen die ATCC-Bezeichnungen ATCG 31897, 31898, 31899 bzw. 31900 (hinterlegt am 29. Mai 1981); diese Mikroorganismen'verwendet man vorzugsweise in dem erfindungsgeraäßen Verfahren.

Die mykologischen. Eigenschaften dieser vier Mikroorganismen sind nachstehend angegeben.

(I) Aeromonas SP. AST 108-1:
(A) Morphologische Eigenschaften (Inkubation in einer

Eährbrühe bei 32 ⁰C 24 h lang): Asahi-P270581-1

BAD ORIGINAL

Gestalt: kurzes Stäbchen, einzelne Stäbchen oder ei Kette von zwei Stäbchen, mit einer Geisel oder Geiseln an einem Ende des Bakteriums Größe: 0,9 bis 1,2 pn χ 1,2 bis 2,0 JQm Beweglichkeit: vorhanden

Gramfärbung: negativ
Säurefestigkeit (acid fastness staining):

negativ

Sporen: nicht gebildet 10 Pleomorphismus:. keiner

(B) Wachstum im Medium (32 ⁰C)

. . Nährbrühe: gut, keine FUmbildung, keine Ringbildun

mit Niederschlag, trüb, keine Pigmentbildung

Nährbrühe/Agarplatten-iKultur: gut, kreisförmig, gla

Oberfläche, erhaben bzw. gesteigert, vol kommen kreisförmig, glänzend, schwache Farbe von Manilapapier (d.h. leicht brau lieh oder lederfarben), leicht viskos,

20 ■ keine Pigment bildung

Nährbrühe/Agarkeil-Kultur: gut, fadenförmig, glänze schwache Farbe von Manilapapier, keine Pigmentbildung .
Nährbrühe/Gelatinestichkultur (20 ⁰C): gutes Wachs-

'' turn im oberen Teil, schwache Färbung von

Manilapapier, geringes Wachstum im gestc chenen Teil, keine Gasbildung im gestochenen Teil, keine Verflüssigung

(C) Physiologische Eigenschaften:

Wachstumstemperatur: Wachstum bei 13 bis 37 C, kej

Wachstum bei 45 ⁰C
Wachstums-pH-Wert: 5 bis 9
Sauerstoffbedarf: wahlweise anaerob
OF-Test (Hugh Leifson's-Medium): Fermentation Gaserzeugung (Glucosemedium): Gaserzeugung

Lackmusmiloh: gutes Wachstum, Bildung eines Ringes Asahi-P270581-1

BAD ORIGINAL

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mit schwacher Farbe von Manila-Papier, Lackmus wechselte zu rosa, mit Niederschlag, keine Veränderung in der Milch

Verflüssigung von Gelatine: keine Verflüssigung

Erzeugung von Hydrogensulfid: keine Erzeugung Zersetzung von Stärke: keine Zersetzung

Reduktion von Nitrat: Erzeugung von salpetriger Säure

Catalase-Aktivität: positiv Oxidase-Aktivität: positiv Urease-Aktivität: negativ Phenylalanindeaminase-Aktivität: negativ lysindecarboxylase-Aktivität: negativ Alginiudihydrolase-Aktivität: positiv Ornithindecarboxylase-Aktivität: positiv Erzeugung von Indol: positiv Erzeugung von Ammoniak: positiv VP-Heaktion: negativ

MR-Test: positiv .

Denitrifikation: positiv Verwendung von Zitronensäure:

Koser-Medium: verwendet

Christensen-Medium: verwendet

Natriumchloridbeständigkeit: Wachstum in einer NaCl-Konzentration bis zu 5 ^

Pigmenterzeugung (King Α-Medium): keine Erzeugung

Verwendung von Stickstoffquellen: Verwendung von Ammoniumsalz und Nitrat

Verwendung von Zuckern und Erzeugung von Säure und Gas: s. d£e nachstehende Tabelle 1

^*fe:-

O I Z J Cl O /"

Tabelle 1:

Wachs- Säureer- Gasertum zeugung zeugung

D-Glukose + + +

. D-Fruktose + . + +

D-Mannose + + +

D-Gälaktose ' + + +

D-Rhamnose + + +

D-Arabinose · + + +

L-Arabinose + + +

D-Xylose + + +

Saccharose . + + +

Laktose + ' - -

Maltose + + +

Trehalose ' ' + + +

• Raffinose + + +

D-Inosit . " + - -

D-Mann it ' · ' + + +

P-Adonit · - -

D-DuIcit ' - -

D-Sorbit + + + Salizin ' . ■ +

Glycerin · + + · -

Äthanol ' . ■ — - -·-

. ■ " .

Isoliert aus: Boden eines Reisfeldes bei ÜTuji-shi, Shizuoka, Japan.

(II) Aeromonas SP. AST 111-4: _v

(A) Morphologische Eigenschaften (Inkubation in IJahrbrtihe bei 32 ⁰G 24 h lang): .

Gestalt: kurzes Stäbchen, einzelne Stäbchen oder eine

Kette von zwei oder drei Stäbchen, mit einer

Geisel oder Geiseln an einem Ende des Bak-3π teriums.

Asahi-P270581-1

ORIGINAL INSPECTED COP

Größe: 0,8 bis 1,0 jum χ 1,2 bis 1,8 pm. Beweglichkeit: vorhanden
Gramfärbung: negativ " .

Säurefestipkeib: negativ
Sporen: nicht gebildet
Pleomorphismus: keiner
(B-) Wachstum im Medium ( 32 ⁰O):

Nährbrühe: gut, keine Filmbildung, Ringbildung, mit

Niederschlag, trüb, keine Pigmentbilciung Nährbrühe/Agarplatten-Kultur: gut, kreisförmig, glatte . . Oberfläche, erhaben b.zw. erhöht, vollkommen

kreisförmig, glänzend, grau-weiß, leicht

viskos, ■ keine Pigmentbildung Nährbrühe/Agarkeil-Kultur: Kut, nchwach Πϋ:_:·:^;.; ■-, ·· .· -ι!"\v:nifr,

glänzend, grä.u-weiß, keine Pigmentbildung Nährbrühe/Gelatinestich-Kultur (20 ⁰G): gutes Wa.-hstutn

im oberen Teil, grau-weiß, grau im gestoche-• nen Teil, keine Gasbildung im gestochenen

Teil, keine Verflüssigung

(C) Physiologische Eigenschaften:

Wachstumstemperatur: Wachstum bei 9 bis 45 °C, kein

Wachstum bei 50 ⁰C
Wachstums-pH-Wert: 5 bis 10
Sauerstoffbedarf: wahlweise anaerob OF-Test (Hugh Leifson's-Medium): Fermentation Gaserzeugung (Glukosemedium): Gaserzeugung Lackmusmilch: gutes Wachstum, Lackmus entfärbt, Milch

koaguliert, mit Niederschlag

Verflüssigung von Gelatine: keine Verflüssigung Erzeugung von Hydrogensulfid: keine Erzeugung Zersetzung von Stärke: keine Zersetzung Reduktion von Nitrat: Erzeugung von salpetriger Säure Catalase-Aktivität: positiv
Oxidase-Aktivität: positiv
Urease-Aktivität: positiv
Phenylalanindeaminase-Aktivität: negativ Asahi~P270581-1

BAD ORIGINAL COPY

Lysindecarboxylase-Aktivität^egativ Alginindihydrolase-Aktivität: negativ Ornithindecarboxylase-Aktivität: positiv Erzeugung von Indol: positiv Erzeugung von Ammoniak: positiv VP-Reaktion: positiv MR-Test: negativ Denitrifikation: positiv Verwendung von Zitronensäure:

Koser-Medium: verwendet Cliristensen-Medium: verwendet Natriumchloridbeständigkeit: Wachstum in HaCl-Konzen-·

tration bis zu 5 $>

Pigmenterzeugung (King Α-Medium): keine Erzeugung Verwendung von" Stickstoffquellen: Verwendung von

Ammoniumsalz, Nitrat und Harnstoff Verwendung von Zuckern und Erzeugung von Säure und Gas: s. die' nachstehende !Tabelle

Tabelle 2:

Wachs- Säureer- Gasertum zeugung zeugung

D-Glukose D-Fruktöse D-Mannose D-Galaktose· D-Rhamnose D-Arabinose L-Arabinose D-Xylose Saccharose Laktose Maltose Trehalose Raffinose

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ORIGINAL INSPECTED C(

	• ·» »· ·· ..	• I 3123937
		+
D-Inosit	. . +	+
D-Mannit	+	+
D-Adonit	+	—
•D-Dulcit	-	+
D-Sorbit	+	. +
Salizin	+	+
Glycerin	+	—
Äthanol	+	von Fuji-shi,
Isoliert aus:	Boden eines Reisfeldes
	Shizuoka, Japan

Die genannten Daten geben die mykologischen Eigenschaften von Aeromonas SP. AST 108-1 und AST 11.1-4- an. Die Identifizierung gemäß Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aus-

.15 gäbe, 1974, zeigte das nachstehende Ergebnis: Die Mikroor-' ganismen ordnet man am vernünftigsten dem Genus Aeromonaa, Familie Vibrionaceae zu, weil sie jeweils ein gram-

negativer Bazillus in Form eines kürzen Stäbchens sind, wahl-• · weise anaerob sind, eine Geisel oder eine Büschelgeioel (tuft flagella) an einem Ende aufweisen, beweglich sind, eine positive Catalase-Aktivität und eine positive Oxidase-Aktivität aufweisen, und Glukose aktiv zur Bildung einer Säure und von Gas fermentieren.

Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe., beschreibt drei Mikroorganismen vom Genus Aeromonas, nämlich Aeromonas hydrophile, Aeromonas punctata und Aeromonas salmon icida. Aeromonas salmonicida unterscheidet sich von ' Aeromonas üP. AST 108-1 und AST 111-4· gemäß der Erfindung, weil Aeromonas salmonicida bei 27*°C nicht wachsen kann, während die Mikroorganismen gemäß der Erfindung bei dieser Temperatur gut wachsen; und Aeromonas hydrophile und Aeromonas punctata unterscheiden sich von den Mikroorganismen gemäß der Erfindung in vielen taxonomischen Eigenschaften, wie in der nachstehenden Tabelle 3 angegeben ist. Daher unterscheiden sich die drei Mikroorganismen vom Genus Aeromonas, Asahi-P270581-1

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bad original

I Z J J J /

die in Bergey's Manual beschrieben sind, von den neuen Miki Organismen gemäß der Erfindung, Aeromonas SP. AST 108-1
und Aeromonas SP. AST 111-4".

5 (III) Klebsiella SP. AST 148-1

(A) Morphologische Eigenschaften (Inkubation in Nährbrtihe bei 32 ⁰C 24 h lang):

Gestalt: kurze Stäbchen, ein einzelnes Stäbchen

oder eine Kette von zwei oder drei Stäbche keine Geiseln

Größe: 1,1 bis 1,3 jam σ 1,8 bis 2,0 pm

Beweglichkeit: nicht vorhanden

Gramfärbung: negativ

Säurefestigkeit: negativ 15 Sporen: nicht.gebildet

Pleomorphismus: keiner

(B) Wachstum im Medium (32 ⁰C):

Nährbrühe: gut, keine JF Umbildung, Ringbildung,

mit Niederschlag,trüb, keine Pigmentbildun Nährbrtihe/Agarplatten-Kultur: gut, kreisförmig,

glatte Oberfläche, erhaben bzw. erhöht,
■ ' vollkommen kreisförmig, glänzend, grau-wei

etwas viskos, keine Pigmentbildung
Nährbrühe/Agarkeil-Kultur: gut, fadenförmig, glän zend, grau-weiß, keine Pigmentbildung

Nährbrühe/Gelatinestichkultur (20 C): gutes'Wach tum im oberen Teil, grau-weiß, grau im gestochenen Teil, keine Gasbildung im gestochenen Teil, keitie Verflüssigung
(C) Physiologische Eigenschaften:

Wachstumstemperatur: Wachstum bei 9 bis 42 ⁰C,

kein Wachstum bei 45 ⁰C
Wachstums-pH-Wert: 4 bis 9
Sauerstoffbedarf: wahlweise.anaerob
OJVTest (Hugh Leifson's-Medium): Fermentation

Gaserzeugung (Glucosemedium): Gaserzeugung
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Tabelle 3

Aeromonas

Aeromonas hydrophila -pttnctata AST- AST-Taxonomiaehe Eigenschaften Hydrophila Aerogen.es Proteolytica Punctata .Caviae 108-1 111-^

Verflüssigung von Gelatine + + . + + . + -

Erzeugung von Hydrogensulfid ₊ ■ _ ₊ „„

LysindecarbQzylase-A^tivität · ' _

VP-Eeafetion +^_* + ^-* + - - -

Beständigkeit gegenüber 7,5?^- . - - + iger NaCl-Iösung

Gaserzeugung aus G/Lycerin + - .« --.'- +

Gaserzeugung aus Glucose ₊ _ _{β +} « _{+ +}

* +λ/-: Die Spezies umfaßt verschiedene Stämme, von denen einige "+"-Werte und .

einige "-"-Werte aufweisen. ·

KJ CO CO CO

Lackmustnileh: gutes Wachstum, Lackmus entfärbt, Milch koaguliert, Niederschlag, keine Peptonisie rung

Verflüssigung von Gelatine: keine Verflüssigung 5 Erzeugung von Hydrogensulfid: keine Erzeugung

Zersetzung von Stärke: keine Zersetzung

Reduktion von Nitrat: Bildung von salpetriger Säure

Catalase-Aktivität: positiv Oxidase-Aktivität: negativ Urease-Aktivität: positiv

Phenylalanindeaminase-Aktivität: negativ

lysindecarboxylase-Aktivität: positiv

Alginindihydrolase-Aktivität: negativ Ornithindecarboxylase^Aktivität: negativ Indolerzeugungr positiv -

Ammoniakerzeugung: positiv

VP-Realction: positiv

MR-Test: negativ

Denitrifikation: positiv
Verwendung von Zitronensäure:

Koser-Mediüm: verwendet

Christensen-Medium: verwendet

Natriumchloridbeständigkeit: Wachstum in NaCl mit . · einer Konzentration bis zu 4 fi

25 Pigmenterzeugung (King Α-Medium): keine Erzeugung

Verwendung von Stickstoffquellen: Verwendung von Ammoniumsalz, Nitrat und Harnstoff

Verwendung von Zuckern und Erzeugung von Säure und

Gas: s. die nachstehende Tabelle 4

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Tabelle 4·:

Waohs- Säureer- Gaser-

tum zeugung zeugung

D-Glukose + + +

D-Fruktose + + +

D-Mannose + + +

D-Galaktöse + + +

D-Rhamnose ' + + +

D-Arabinose + + + '

L-Arabinose + + ⁺

D-Xylose + +. +

Saccharose + + +

laktose + + +

Maltose + .+ ⁺

Trehalose ■ · + + ⁺

Raffinose · +. + +

D-Inosit + + ⁺

D-Mannit - + + +

D-Adonit . + + . +

D-DuIcit + + . +

D-Sorbit . + + +

Salizin . + + ⁺

Glycerin + + ⁺

Äthanol . + -

Isoliert aüs:Boden eines Reisfeldes bei Pu^i-shi, Shizuoka, Japan

(IV) KlebsiellaSP. AST 151-7

• (A) Morphologische Eigenschaften (Inkubation in Nährbrühe bei 32 ⁰G 24 h lang):

Gestalt: kurzes Stäbchen, ein einzelnes St-ibcu^n oder eine Kette von zwei oder drei Stäbchen,
Ice ine Geisel

Größe: 1,0 bis 1,2 pm χ 2,2 bis 3,0 35 Beweglichkeit: nicht vorhanden

Gramfärbung: negativ Asahi-P270581-1

BAD ORIG"¹¹

31

23937

Saurefestigkeit: negativ Sporen: nicht gebildet Pleomorphismus: keiner

(B) Wachstum im Medium (32 ⁰C):.

Nährbrühe: gut, keine Filmbildung, Bildung eines gra

weißen Ringes, Niederschlag, trüb, keine Pigmentbildung

Nährbrühe/Agarplattenkultur: gut, kreisförmig, glatt* Oberfläche, erhaben bzw. erhöht, vollkomm . kreisförmig, glänzend, grau-weiß, leicht

viskos, keine Pigmentbildung

Nährbrühe/Agarkeilfcultur: gut, leicht wellig, fadenförmig, glänzend, grau-weiß, keine Pigmen bildung

Nährbrühe/Gela't inest ichkultur (20 ⁰C): gutes Wachstu

im oberen Teil, grau-weiß, schwaches Wach turn im gestochenen Teil, keine Gasbildung im gestochenen Teil, keine Verflüssigung

(C) Physiologische Eigenschaften:

Wachstumstemperatur: Wachstum bei 13 bis 42 ⁰C, kein

Wachstum bei 45 ⁰C

Wachstums-pH-Wert: 5 bis 9

Sauerstoffbedarf: wahlweise anaerob

OP-Test (Hugh Ielfson¹s-Medium): Fermentation
Gaserzeugung (Glukosemedium): Gaserzeugung

Lackmusmilch: gutes Wachstum, lackmus entfärbt, MiIc koaguliert, Niederschlag, keine Peptonisierung

Verflüssigung von Gelatine* keine Verflüssigung
Erzeugung von Hydrogensulfid: keine Erzeugung ■

Zersetzung von Stärke: keine Zersetzung

Reduktion von Nitrat: Erzeugung von salpetriger Säui

Catalase-Aktivität: positiv

Oxidase~Aktivität: negativ 35 ' Frease-Aktivität: positiv

Phenylalanindeaminase-Aktivität: negativ

Asahi-P270581-1

. ys-.^:»·»■■·■■·■■■"■■■'■ -^:~ 3123337

lysindecarbozylase-Afctivität: positiv

Alginindihydrolase-Aktlvität: negativ

Ornithindecarboxylase-Aktivität: negativ Indolerzeugung: positiv Ammoniafcerzeugung: positiv

VP-Reaktion: positiv

MR-Test: positiv

Denitrifikation: positiv

Verwendung von Zitronensäure: Koser-Medium: verwendet

Christ.ensen-Medium: verwendet

Natriumchloridbeständigkeit: Wachstum in einer NaOl-Konzentratiou bis zu 4 %

Pigmentbildung (King Α-Medium): keine Pigmeutbildung
15 Verwendung von Stickstoffquellen:.Verwendung von Ammo-

. niumsalz, Nitrat und Harnstoff

Verwendung von Zuckern und Erzeugung von Säure und Gas: s. die nachstehende Tabelle 5

Tabelle 5:

Wachs- Säureer- Gaaertum zeugung zougung

D—Glukose D-Pruktöse D-Manuose D-Galaktosβ D-Rhamnose D-Arabinose L-Arabinose D-Kylose Saccharose Laktose Maltose Trehalose Raffinöse D-Inosit Asahi-P270581-1

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ι ^η ο q ο^r?

ι/ίοdo./

D-Mannit + +

D-Adonit + +

D-DuIcit ·

D-Sorbit + +

Salizin + +

Glycerin + +

Äthanol + -

Isoliert aus: Boden eines Reisfeldes bei Fuji-shi, Shizuok Japan
10

Die angegebenen Daten zeigen die mykologisehen Eigenschaften von Klebe iella SP. AST 148-1 und AST 151-7 gemäß der Erfindung. Die'Identif izierung gemäß Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, 1974, zeigte das nachstehende Ergebnis: Die Mikroorganismen gehören zur Familie Enterobaoteriaceae, weil sie ein Gram-negativer Bazillus sind, wahlweise anaerob sind, eine positive Catalase-Aktivität aufweisen, eine negative Oxidase-Aktivität aufweisen, eine Säure aus Glucose erzeugen und Salpetersäure zu salpetriger Säure reduzieren; man kann sie am vernünftigsten dem Genus Klebsiella im Tribun ΚΙ.·Ικ;μ Mn zuordnen, weil sie eine positive VP-Reaktion zeigen, eine negative Phenylalanindeaminase-Aktivität aufweisen, keine Erzeugung von Hydrogensulfid aufweisen, eine positive Iysindecarboxylase-Aktivität aufweisen, eine negative Ornitl decarboxylase-Aktivität aufweisen* eine negative Alginindhydrolase-Aktivität aufweisen und nicht beweglich sind.

Es sind keine Mikroorganismen vom Genus Klebsiella bekanni die !-Tryptophan aus Indol, Brenztraubensäure und Ammoniui ionen erzeugen; Die Tabelle 6 vergleicht die mykologischei Eigenschaften von Klebsiella SP. AST 148-1 und AST 151-7 mit jenen der· drei Bakterien vom Genus Klebsiella, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe beschrieben sind. ·

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. Tabelle 6

Taxonomische Eigenschaften

VP-Reaktion
MR-Test

Indolerzeuguug .
Urea s e-Akt iv ität

Lysindecarboxylase-Aktivitat Alginindihydrolase-Aktivität Ornitrindecarboxylase-Aktivität

Verwendung von Zitronensäure Verwendung von Malonsäure Gaserzeugung:

Glukose

Glycerin

Säureerzeugung:

Laktose

DuIc it

Mikroorganismen

AST AST Kle"bsiella Klebsieila KLebsiella 148-1 151-7 .pneutnoniae ozaenae rhinoBcleromatis

—*

* +λ/ -: s. Tabelle

Aufgrund dieser taxonomischen Daten kann man schließen, daß Klebsiella SP. AST 148-1 und AST 151-7 Mikroorganismen sind, die sich von den drei Mikroorganismen vom Genus Klebsiella unterscheiden, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, beschrieben sind.

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan und seinen Derivaten unter Verwendung von Aeromonas SP. AST 108-1, Aeromonas SP. AST 111-4, Klebeiella SP. AST 148-1 und Klebsiella SP. AST -151-7, die oben beschri« ben wurden. Die Mikroorganismen kann man auf einem üblichen synthetischen oder natürlichen Medium kultivieren. Die Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Zucker, wie z.B. Glukose Fruktose, Mannose, Saccharose, Galaktose, Xylose oder Mela3S< Zuckeralkohole, beispielsweise Glycerin oder Sorbit; oder organische Säuren, wie z.B. Essigsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Apfelsäure oder Bernsteinsäure. Diese Kohlenstoffquellen gibt man zu dem Medium im allgemeinen in einer Menge von etwa 0,1 bin 10 Gew.-/j zu.Stickstoff quellen sind beispielsweisi Ammoniumverbindungen, wie z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat oder Ammoniakwasser; und organische Stickstoffquellen, wie beispielsweise Harnstoff, Fleischextrakt, Pepton, Kaseinhydrolyr.at (ca:;n-ni nn ' aci Maiswas3er, entfettetes Sojabohnenmehl oder Proteinhydroly- . sat. Stoffe, die das Wachstum der verwendeten f"ikroor_;-,ur.' r-.-ie ;Jruern,verwendet mn η vorteilhaft und p;ibt nio zu d ■■·-. i.-Ji^a au.. Die Stoffe können anorganisch oder organisch sein. Anorganische Stoffe sind;beispielsweise Kaliummonopho3phat, Kaiiumd!phosphat, Phor.j.horaäui'i!, Kaliumchlorid, Magnesiu sulfat und Natriumchlorid, sowie Metallionen, wie z.B. Eisen Zink-, Mangan-, Kupfer-, und Calciumionen. Organische Stoffe sind beispielsweise Aminosäuren, Vitamine, organische Säuren aliphatische Säuren, sowie natürliche Stoffe, wie z.B. Pepto Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Maiswasser, Kasein und Hydro-

35 lysat von entfetteten Sojabohnen.

• Asahi-P270581-V

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1 2 3 3 3 7

Tryptophanase, die man mit den erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen hergestellt hat, betrachtet man als ein anpassungsfähiges Enzym; und man gibt L-Tryptophan vorzugsweise zum Medium zu und stellt eine Kultur der Mikroorganismen in einer Menge von etwa 0,1 bis 0,7 Gew.-$ her. Die Mikroorganismen inkubiert man in dem erhaltenen Medium bei 25 bis 37 ⁰C 16 bis 96 h lang.

Die derart hergestellte Kultur der Mikroorganismen weist ein Enzymsystem auf, das !-Tryptophan oder seine Derivate aus einer Indolverbindung und Serin oder aus einer Indolverbindung, Brenztraubensäure und/oder ihrem Salz und einem Ammoniumion erzeugt. Die Kultur kann man unmittelbar in der gewünschten enzymatischen Reaktion verwenden, oder man kann sie nach p-eeigneten Vorbehandlungen verwenden. Beispielsweise kann man die Zellen des Mikroorganismus aus der Kultur beispielsweise durch Zentrifugieren abtrennen. Die Zellen kann man ferner trocknen, mit Ultraschallwellen behandeln, autolysieren oder homogenisieren. Stattdessen kann man auch die erzeugte Tryptophanase auf übliche Weise extrahieren und reinigen. Wahlweise kann man die abgetrennten Zellen oder das Enzym als immobilisierte Zellen oder immobilisiertes Enzym verwenden, wie man sie durch ihre Polymerisation mit beispielsweise einem Acrylsäureamid-. Monomeren erhalten hat.

25.

Die Zellen mit einem Tryptophanasegehalt, die behandeinen Zellen oder die immobilisierten Zellen, die man derart erhalten hat, sowie die gereinigte Tryptophanase oder die immoMliaierte Tryptophanase verwendet man als Katalysator für eine ensymatische Reaktion in einer Reaktionsflüssigkeit, die eine Indolverbindung und Serin, oder eine Indolverbindung, Brenztraubensäure und/oder ihr Salz und Ammoniumionen enthält, zur Herstellung von L-Tryptophan oder seinen Derivaten. Zusätzlich zur Indolverbindung, dem Serin, der Brenztraubensäure und/oder ihrem Salz und den Ammoniumionen, die man als Substrat verwendet, enthält die Reaktionsflüssigkeit vorzugsweise Äthylendi-Asahl-P270581-1

ORIGINAL

amintetraeasigsäure und Pyridoxa!phosphat, wodurch man eine höhere Ausbeute an L-Tryptophan oder seinen Derivaten erzielt. Es besteht keine spezielle Begrenzung bezüglich der verwendeten Substratmenge, und im allgemeinen beträgt sie 0,1 bis 10 Gew.-io. Die enzymatische Reaktion führt man im allgemeinen . bei einem pH-Wert, im Bereich von 5 bis 11 und bei einer Temperatur von 10 bis 60 ⁰C durch. Beispiele für die Indolverbindung, die man dem Reaktionssystem zusetzt, sind Indol, 5-Hydroxyindol, 5-Chlorindol, 5-Bromindol, 5-Aminoindol, 5-Methoxyindol, 5-Methoiy-2-methylindol und 2-MethyIindol.

Das !-Tryptophan oder seine Derivate, die man in der Reaktionsflüssigkeit hergestellt hat, kann man auf übliche Weise iso-r lieren, beispielsweise durch Adsorption an einem Ionenaustauscherharz oder Aktivkohle. Das L-Tryptophan'oder seine Derivate kann man durch Hochd-ruck-Plüssig-Chromatographie oder Dünnschichtchromatographie an Siliciumdioxidgel qualitativ und quantitativ bestimmen.

Die Erfindung betrifft also ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan oder einem seiner^ Derivate, wobei man eine Indolverbindung mit Serin, oder mit Brenztraubensäure und Ammoniumionen in Gegenwart einer Kultur oder einer behandelten Kultur eines Mikroorganismus vom Genus Aeromonas oder Genus Klebsiella umsetzt, der L-Tryptophan oder eines seiner Derivate aus einer Indolverbindung und Serin, oder aus einer Indolverbindung, Brenztraubensäure und/oder ihrem Salz und Ammoniumionen erzeugen: kann-,

Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert: Beispiel 1:

5 ml eines Mediums mit dem Ansatz gemäß Tabelle 7 setzte man in Pfoberöhrchen mit einem Durchmesser von 18 mm ein und sterilisierte bei 120 ⁰O 10 min lang. In jedes der sterili-Asahi-P270581-1

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123937

sierten Medien impfte man eine SchlingenfUllung (loopful) Aeromonas SP. AST 108-1 ein und kultivierte bei 32 ⁰C 20 ti lang unter Schütteln. 5 ml der derart gekeimten Kultur übertrug man in. ein Fermentationsmedium, das man durch Sterilisieren von 100 ml eines Mediums (dem gleichen wie in Tabelle 7) bei 120 ⁰C 10 min lang in einem 500-ml-Schüttelkolben hergestellt hatte, und führte die Fermentation bei 32 ⁰C 20 h lang unter Schütteln durch. Nach Beendigung der Fermentation zentrifugierte man 2 1 der Kultur, gewann die Mikroorganismuszellen und suspendierte die Zellen in 180 ml einer Reaktionsflüssigkeit mit einem pH-Wert von 9,0, die aus 2 g Natriumpyruvat, 2 g Ammoniumacetat, 1.0 mg Pyridoxalphoaphat, 200 mg Äthylendiamintetraessigsäure und 100 ml Wasser bestand. Die Suspension teilte man in 6 gleiche Mengen. 30 ml ,jo'H;!· Suspension mischte man mit 600 mg Indolverbindung , wie in Tabelle 8 gezeigt, erwärmte jede Mischung bei 32 ⁰O 72 h · unter Schütteln und bewirkte eine enzymatische Reaktion. Nach Beendigung der Reaktion gab man 30 ml Methanol zu jeder Reaktionsmischung unter heftigem Rühren und zentrifugierte die Mischung. Die erhaltenen überstehenden Flüssigkeiten unterwarf man der Hochdruck-Flüssig-Chromatographie; die L-Tryptophanderivate, die den eingesetzten Indolverbindungen entsprachen, erzeugte man in den Mengen, die in der nachstehenden Tabelle 8 gezeigt sind.

Tabelle 7: ■ ·

Pepton ...

30 K-nseuilivdrolysate

Hefeextrakt Maiswasser L-Tryptophan

KH₂PO, 35 MgSO₄.7H₂O FeSO₄.7H₂O Asahi-P270581-1

0,5

0,2

0,05

0,05

0,003

COPY BAD ORIGINAL

MnSO₄.4H₂O pH-Wert

0,003

Tabelle 8:

Ind olverb ind ung	erzeugte L-Tryptophan- derivate	Menge
Indol	L-Tryptophan	10,3
5-Hydroxyind ol	5-Hydroxytryptophan	2,9
5-Chlorindol	5-Chlortryptophan	0,9
5-Bromindol	5-Bromtryptophan	0,7
5-Aminoindol	5-Aminotryptophan	1,1
5-Methoxyindol	5-Methoxytrypt öpha n	0,6

Zu dem Reaktionsprodukt, das man unter Verwendung von Indol erhalten hatte, gab man Natriumhydroxid (Ätznatron) zu, brachte den pH-Wert auf 10, führte die Mischung durch eine Säule eines stark sauren Ionenaustauscherharzes, die mit Ammoniumionen beladen war, und eluierte das adsorbierte L-Tryptophan mit 2 η Ammoniakwasser. Das Eluat engte man ein, und bildete rohe I-Tryptophankristalle, die man mit Aceton wusch und trocknete, und man erhielt 185 mg I-Tryptophankristalle.

25 Beispiel 2;

Aeromonas SP. AST 108-1 fermentierte man wie in Beispiel 1 und erhielt 2 1 einer Kultur. Die Kultur zentrifugierte man," gewann die Mikroorganismuszellen und suspendierte die Zellen in 180 ml einer Reaktionsflüssigkeit mit einem pH-Wert von 9,0, die aus 1,5 g L-Serin, 10 mg Pyridoxalphosphat, ?00 mg Äthylendiamintetraessigsäure und 100 ml Wasser bestand. Die Suspension teilte man in 6 gleiche Mengen. 30 ml jeder Suspension mischte man mit 600 mg einer der Indolverbindungen, die in Tabelle 9 angegeben sind, erwärmte jede Mischung bei 32 ⁰C 72 h lang unter Schütteln und bewirkte eine enzymatische Asahi-P270581-1

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10

Reaktion. Fach Beendigung der Reaktion behandelte man die Reaktionsprodukte wie in Beispiel 1 und unterwarf sie der Hochdruck-Flüssig-Chromatographie; man erzeugte X-Tryptophanderivate entsprechend den verwendeten Indolverbindungen in den Mengen, die in Tabelle 9 angegeben sind.

Tabelle 9:

Indolverbindung	erzeugte L-Tryptophan- derivate	Menge (g/l)
Indol	L-Tryptophan	11 ,8
5-Hydroxyindol	5-Hydroxytryptophan .	2,5
5-Chlorindol	5-Chlortryptophan	1,1
5-Bromindol	5-Bromtryptophan '	1,3
5-Aminoindol	5-Aminotxyptophan	1,2
5-Meth.oxy indol	5~Methoxytryptophan	0,8
Beispiel 3:

Aeromonaa SP. AST 111-4- fermentierte man wie in Beispiel 1 und erhielt 4 1 einer Kultur. Die Kultur zentrifugierte man. und gewann die Mikroorganismuszellen, von denen man die Hälfte in 180 ml einer Reaktionsflüssigkeit mit einem pH-Wert von 9,0 suspendierte, die aus 2 g Natriumpyruvat, 2 g Ammoniumacetat, 10 mg Pyridoxalphosphat, 200 mg ethylendiamintetraessigsäure und 100 ml Wasser bestand. Die andere Hälfte suspendierte man in 180 ml einer Reaktionsflüssigkeit mit einem pH-Wert von 9,0, die aus 1,5 g L-Serin, 10 mg Pyridoxa!phosphat, 200 mg ÄthylendiamintetraesB^;ig3äure und 100 ml Wasser bestand. Jede der beiden Reaktionsflüssigkeiten teilte mn η i η 6 ^l niir.·.· -U-:ν..·> η wie in Beispiel 1 und 2 und mischte sie mit je 600 mg einer der Indolverbindungen, die in der nachstehenden Tabelle 10 angegeben sind ; jede Mischung erwärmte man bei 32 C 72 h lang unter Schütteln und bewirkte eine enzymatische Reaktion.

Nach Beendigung der Reaktion behandelte man die Reaktionsprodukte wie in Beispiel 1 und unterwarf sie einer Hochdruck-Flussig-Chromatographie; man erzeugte L-Tryptophanderivate entsprechend den Indolverbindungen in den Mengen, die in Ta-Asahi-P270581-1

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belle 10 angegeben sind. Tabelle 10:

Menge der erzeugten I-Tryptophanderivate (g/l)

Indolverbindung	pyruvathaltige s	L-serinhaltiges
	System	System
Indol	14,4	17,2
5-Hydroxyindol	1,9	2,4
5-Chlorindol	1,1	1,4 ·
5-Bromindol	1,0	1,0
5-Aminoindol·	1,5	1,6
5-Me thoxy ind öl	1,2	1,5
Beispiel 4:

5" ml eines Mediums mit dem Ansatz wie in Tabelle 7 setzte man in Pro.beröhrchen mit einem Durchmesser von 18 mm ein

20' .und sterilisierte bei 120 ⁰C 10 min lang. In jedes der sterilisierten Medien impfte man eine Schiingenfüllung der Mikroorganismen gemäß Tabelle 11 ein und kultivierte bei 32 ⁰C 20 h lang unter Schütteln. 5 ml jeder gekeimten Kultur überführte man in ein Permentationsmedium, das man durch Sterilisieren von 100 ml eines Mediums (dem gleichen wie in Tabelle 7) bei 120 °C 10 min lang in einem 500-ml-Schüttelkolben erhalten hatte; die Fermentation führte man bei 32 ⁰C 20 h lang unter Schütteln durch. .Nach Beendigung der Fermentation zentrifugierte man 1 1 der Kultur und gewann die Zellen jedes Mikro-Organismus; die Zellen suspendierte man in 200 ml eines Reaktionsmediums mit dem Ansatz gemäß Tabelle 12 und erwärmte jede Suspension bei 32 ⁰C 48 h lang unter Schütteln und bewirkte eine enzymatisch^ Reaktion. Nach Beendigung der Reaktion mischte man 10 ml jeder Suspension mit 10 ml Methanol unter heftigem Rühren und zentrifugierte die Mischung. Die Analyse der erhaltenen überstehenden Flüssigkeiten durch Hochdruck-Flüssig-Chromatographie zeigte, daß man L-Trypto-Asahi-P270581-1

ORIGINALINSPECTED ^cöp

phan in den Reaktionsflüssigkeiten in den Mengen erzeugt' hatte, die in Tabelle 11 angegeben sind.

Tabelle 11: Mikroorganismus

Klebsiella SP. AST 148-1 Klebsiella SP. AST 151-7

Tabelle 12:

Indol Natriumpyruvat Ammoniumac e t at Pyridoxalphosphat Äthylendiamintetraessigsäure Wasser pH-Wert

Beispiel 5:

erzeugtes !-Tryptophan (g/l)

11,2 13,4

20 g

20 g

20 g

100 mg

2 g 1 1 9,0

Wie in Beispiel 4 fermentierte man die Mikroorganismen gemäß Tabelle 13 auf einem Medium mit dem Ansatz gemäß Tabelle 7. 1 1 jeder Kultur zentrifugierte man, gewann die ZeHlon jedes Mikroorganismus und suspendierte sie in 200 ml einer Reaktionsflüssigkeit mit einem pH-Wert τοη 9,0, die aus 2 g Indol, 3 g L-Serin, 10 mg Pyridoxalphosphat, 200 mg A* thy lend iamintetraessigsäure und 100 ml Wasser bestand. Jede Suspension <■--wärmte man bei32° C 36 h lang unter Schütteln und bewirkte eine enzymatisch^ Reaktion. Nach Beendigung der Reaktion mischte man 10 ml jeder Suspension mit 10 ml Methanol unter heftigem Rühren und zentrifugierte die Mischung. Die Analyse der erhaltenen überstehenden Flüssigkeiten mit Hochdruck-Flüssig-Chromatographie zeigte, daß man L-Tryptophan in den Reaktionsflüssigkeiten in den Mengen erzeugt hatte, die in Asahi-P270581-1

COPY

BAD ORIGINAL

Tabelle 13 gezeigt sind.
Tabelle 13:

Mikroorganismus erzeugtes L-Tryptophan (g/l)

■ Klebsieila SP. AST 148-1 15,4

'Klebsieila SP. AST 151-7 16,2

Beispiel 6:

10

Wie in Beispiel 4 fermentierte man Klebsiella SP. AST 151-7 auf einem Medium mit dem Ansatz gemäß Tabelle 7.4 1 der Kultur ■zentrifugierte man und gewann die. Mikroorganismuszellen. Die Hälfte der Zellen suspendierte man in einer Reaktionsflüssig-'■ keit, die Natriumpyruvat und Ammoniumacetat wie in Beispiel 4 enthielt, und mischte"sie mit den Indolverbindungen gemäß Tabelle 14. Die andere Hälfte·der Zellen suspendierte man in einer Reaktionsflüssigkeit, die L-Serin wie in Beispiel 5 enthielt, und mischte sie mit den Indolverbindungen gemäß Tabelle 14. Jede Mischung unterwarf man danach einer ensymatischen Reaktion bei 32 ⁰C 72 h läng unter Schütteln. Nach Beendigung der Reaktion unterwarf man die Reaktionsmicchungen der Hochdruck-Flüssig-Chromatographie; man erzeugte L-Irypto— phanderivate entsprechend den verwendeten Indolverbindungen in· den Mengen, die in Tabelle 14 angegeben sind.

Tabelle 14:

30 Indölverbindung

5-Hydroxyindol 5-Chlorindol 5-Bromindol 35 5-Aminoindol

5-Methoxyindol Asahi-P270581-1

Menge der erzeugten L-Iryptophanderivate (g/l)

pyruvathaltiges	L-serinhaltiges
System	System
1,8	2,4
1,1	1,3
1,2	1,3
0,9	1,2
0,8	1,0

copy" bad original

- .28—-:.	• 3	W ,9
* 5-Metboxy-2-methylindol	κ** O	,3
2-Methylindol	1

0,9 1,4

Die Offenbarung umfaßt auch den korrespondierenden englischen Text.

Asahi-P270581-1

ORIGINAL INSPECTED COPY

Claims (13)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von !-Tryptophan oder ein-π: seiner Derivate, dadurch ge-kennzeichnet, daß man eine Indolverbindung· mit Serin oder mit Brer.straubensäure und/oder ihrem Salz und Ammoniumionen in Gegenwart einer Kultur oder einer behandelten Kultur eines MLkrc.:,r^nnio-. mu3 vom Genus Aeromonas oder Genus Klebsieila umsetzt, ·\βν L-Tryptophan oder eines seiner Derivate aus einer Indolverbindung und Serin oder aus einer Indolverbindung, Brenztraubensäure und/oder ihrem Salz und Ammoniumionen erzeugen kann.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus vom Genus Aeromonas verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus_;vom Genus Klebsieila verwendet.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Indol, 5-Hydroxyindol, 5-Chlorindol, 5-Bromindol, 5-Aminoindol, 5-Methoxyindol, 5-Methoxy-2-raethylindol oder 2-Methylindol als Indolverbindung verwendet.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus verwendet, άαη man au3 der aus Aeromonas SP. AST 108-1 (mit der FERM-Eeze:c>-

Asahi-P270581-1

BAD ORfGiNAL

nung FERM-P 5539, und der ATCC-Bezeichnung ATCC 318^r;7), Aeromonas SP. AST 111-4 (mit der PERM-Beseiohnung PERM-P ^4O. und der ATCC-Bezeichnung ATCC 31898), Klebsiella"SP.AoT 148-1 (mit der PERM-Bezeichnung PERM-P 5541 und der ATCC-Bezeichnung ATCC 31899) und Klebsiella SP. AST 151-7 (mit der PERM-Bezeichnung PERM-P 5542 und der ATCC-Bezeichnung ATCC 31900) bestehenden Gruppe ausgewählt hat.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Aeromonas SP. AST 108-1 (PERM-P 5539, ATCC 31897) verwendet..

7. Verfahren.nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Aeromonas SP. AST 111-4 (PERM-P 5540, ATCC 31898) verwendet.

15 . "

■

8. Verfahren nach Anspruch 5,' dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Klebsiella SP. AST 148-1 (PERM-P 5541, ATCC 31899) verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Klebsiella SP. AST 151-7 (FERM-P 5542, ATCC 31900) verwendet. .

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch c;ekennzeichnet_? daß man die Reaktion bei einer Temperatur von

25 bis 37 ⁰C 16 bis 96 h lang durchführt.

11. Biologisch reine Kultur eines Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß der'Mikroorganismus Aeromonas SP. AST 108-1 (PERM-P 5539, ATCC 31897) ist und !-Tryptophan oder eines seiner Derivate aus einer Indolverbindung und Serin oder aus einer Indolverbindung, Brenztraubensäure und/oder ihrem Salz und Ammoniumionen mit dem Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche herstellen kann, wobei er aüGiiuli-rUii·!: j Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und gegebenenfalls organische oder anorganische Stoffe verwendet, die das Wachstum der Kultur fördern.

Asahi-P270581-1 ORIGINAL INSPECTED *

BAD ORIGINAL

12. Biologisch reine Kultur eines Mikroorganismus, ckicuir. "·
gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Aeromonaa CP. .. T
111-4 (FERM-P 5540 , ATCC 31898) ist und L-Tryptophmi ml··?· ein Derivat davon aus einer Indolverbindung und Serin oder ■ aus einer Indolverbindung, Brenζtrautensäure und/oder ihrem Salz und Ammoniumionen durch das Verfahren gemäß einem der - vorhergehenden Ansprüche herstellen kann, wobei er assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und·gegebenenfalls organische oder anorganische Stoffe verwendet, die das

10 Waschstum der Kultur fördern.

13. Biologisch reine Kultur eines Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Klebsieila CP. Λ^Τ 148-1 (PERM-P 5541, ATCC 31899) ist und !-Tryptophan od c

ein Derivat davon aus. einer Indölverbindung und Serin oder aus einer Indölverbindung, Brenztraubensäure und/oder Lhrom Salz und Ammoniumionen durch das Verfahren gemäß einerr: der vorhergehenden Ansprüche herstellen kann, wobei er assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff quellen und gegebenenia L. r, organische oder anorganische Stoffe verwendet, die das V/acüstum der Kultur fördern.

14· Biologisch reine. Kultur eines Mikroorganismus, daduren gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Kleböiella :'T. AiVE 151-7 (FERM-P 5542, ATCC 31900) ist und Ϊ,-Tryptophni; od'-r

ein Derivat davon aus einer Indolverbindung und Serü. <.ii"i· ' .aus einer Indolverbindung, Brenztraubensäure und/oder ii:rem Salz und Ammoniumionen durch das Verfahren gemäß einem dor vorhergehenden Ansprüche herstellen kann, wobei er assirnilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und gegebenenfalls organische oder anorganische Stoffe verwendet, die das Wachstum der Kultur fördern.

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