DE2127392A1

DE2127392A1 - Mikrobielle proteinhaltige Substanz sowie deren Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE2127392A1
Application number: DE19712127392
Authority: DE
Inventors: Taro Tokio; Ono Joji Chiba; Kudo Tutomu Kawasaki Kanagawa; Harada Yoshitugu Machida Tokio; Nagasawa (Japan). C 12h 1-02
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1970-07-03
Filing date: 1971-06-02
Publication date: 1972-01-05
Also published as: BE767789A; NO135641C; FI48752B; DE2127392B2; FR2100857A1; GB1312181A; DE2127392C3; US3855063A; FI48752C; NL155050B; NL7109065A; FR2100857B1; CA982965A; SE398513B; NO135641B

Description

Patentanwälte

5 p

Dr.-lng. R. BEETZjr. Qj₉^i_{7 Λ2}6ρ ₂. 6. 1971

8München22, Stemsdorfatr. 1t

MORINAGA MILK INDUSTRY CO., LTD., Tokio (Japan)

Kikrobielle proteinhaltige Substanz sowie deren Herstellung und Verwendung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer mikrobiellen proteinhaltigen Substanz, proteinhaltige Intrazellsubstanzen sowie deren Verwendung für menschliche Ernährung und Tierfutter«

Gegenstand der Erfindung ist insbesondere die Erzeugung einer neuen und brauchbaren iiutante von Kohlenwasserstoff assimilierender Hefe der Genus Candida sowie die aus den Zellen extrahierte intrazelluläre Substanz und deren Verwendung für i'utter, Nahrungsmittel und Medikamente.

Dabei wird gemäß der Erfindung durch Behandlung von O39-M-1-5-5 NoHe (6)

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Kohlenwasserstoff assimilierender Hefe der Genus Candida mit chemischen oder physikalischen mutagenen Ilitteln eine Graru- -negative Mutante erhalten, die gut verdaubar, leicht von
ihren Zellbestandteilen zu trennen sowie praktisch frei von Iriannan und ihrer Z ellwand-Integrität beraubt ist sowie eine Gram-positive Mutante mit geringerem Mannangehalt als der
Mutterstamm, die der Zeilwand-Integrität partiell beraubt
ist α

Die Erfindung umfaßt weiter die Züchtung einer solchen Mutante in bzw» auf einem YM-Medium oder einem Sulfitpülpeablauge, Kohlenwasserstoff oder Abfallmelasse als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Kulturmedium und die Abtrennung intrazellulärer Substanz aus den erhaltenen Zellen durch Behandlung mit chemischen oder physikalischen Mitteln, wie
alkalische Behandlung oder Behandlung mit Schallwellen»

Bisher wurden Hefezellen wegen ihres hohen Protein-
und Hucleinsäuregehalts und erhebliehen Anteils an iiährzusätzen, wie Vitaminen, für !Nahrung, Sutter und Arzneimittel verwendet. Die Züchtung besonderer Hefestämme mit Anpassung an bestimmte Medien wurde lange Zeit versucht. Derartige
Züchtungen wurden jedoch lediglieh unter dem Gesichtspunkt
einer möglichst wirtschaftlichen Herstellung von Hefezellen durch Steigerung der Wirksamkeit der Assimilation des Kohlenstoff im Kulturmedium, einer hohen Zellausbeute, Vermehrungsrate usw. unternommen, jedoch wurde die Isolierung und Entwicklung von Stämmen und Mutanten mit hohem Nährwert im Hinblick auf Verdaubarkeit und Verwendung für Nahrung oder Futter nicht durchgeführt.

In der Tat haben Hefezellen um das öytoplasma herum eine

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sehr feste Zellwand, deren Eigenart auf eine komplizierte im wesentlichen aus Polysacchariden, wie Mannan, Glucan usw., zusammengesetzte höhere Struktur zurückgeht (siehe D.Ho Itforthcote, Biochemical Journal $± (1952) 232 und P.A. Roelfsen, Biochimica et Biophysica Acta, K) (1953) 477, wie aus Versuchen folgt, bei denen Hefezellen mit Polysaccharid hydrolysierenden Enzymen beispielsweise von der Schnecke oder irgendwelchen Mikroorganismen behandelt wurden, wobei das Gefüge der Zellwand aufgespalten wird bzw. zerfällt und in eine Protoplasmastruktur übergeht, bei der das Cytoplasma oder die Zellmembran freiliegen. (Siehe S.Sugawara, Nature, 212 (1966) 92; U.S. Kobayashi u.a. Journal of Bacteriology, 88 (1964) 795; R.E. Domanski, Journal of Bacteriology, ^6. (i960) 270 und J. uonreal, Journal of Bacteriology, 9J- (1967) 241.

"iegen ihrer sehr geringen Verdaubarkeit bei Verabreichung an LIensch und Tier ist die Hefezelle im intakten Zustand jedoch als Nahrung oder ϊ-utter wenig wertvoll (siehe Journal of Japanese Society of Pood and Nutrition 23, 62 von 1970), da sich im Verdauungssaft höherer Lebewesen kein PoIysaccharid hydrolysierendes Enzym mit entsprechenden Fähigkeiten findet. Das ist der Hauptgrund für ein Zögern der nahrungsmittel- und Futtermittelindustrie hinsichtlich der Anwendung von Hefezellen.

Es wurden bereits zahlreiche Anstrengungen unternommen, die Hefezellwand zu entfernen, um die Verdaubarkeit oder Extrahierbarkeit intrazellulärer Substanz der Eefezellen zu erhöhen. Zahlreiche Aufsätze und Patentanmeldungen befassen sich mit der Anwendung von Chemikalien oder biologischen üitteln sowie einer mechanischen Zerstörung, wie mit Alkali-

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BAD QBiGINAL

oder Enzymbehandlungen, Autolyse, Plasmolyse, Schalleinwirkung, Homogenisierung usw. Diese Behandlungen und kittel sind jedoch für die industrielle Anwendung hinsichtlich der Ausführung zu kompliziert und hinsichtlich der erforderlichen Ausrüstung zu teuer.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Hefemutante.zu entwickeln, die von Mensch und Tier leichter verdaut werden kann und deren intrazelluläre Substanz besser isolierbar ist und die damit industriell besser ausnutzbar ist als herkömmliche Hefezellen.

V/eiteres Ziel der Erfindung ist eine solche Zelle, die für die industrielle Vermehrung und Züchtung geeignet und in Anbetracht einer guten Verdaubarkeit als Ausgangsmaterial für Nahrung und Futter für Mensch oder Tier anwendbar ist. Dabei ist ein besoideres Augenmerk auf eine wirksame und wirtschaftliche Herstellung unter milden Bedingungen in industriellem Maßstab gerichtet.

Als Ergebnis iieser Untersuchungen wurde eine hutante erzielt, die gut vsrdaubar ist, deren intrazelluläre Substanzen leicht isoLiert werden können und die ihrer ZeIlwand-Integrität beraubt ist, und zwar ausgehend von zahlreichen Hefestämmen dar Pamilie der Gryptococcaceen einschliessend Stämmen oder Arten, die in der lage sind, Kohlenstoff billiger Herkunft 2U assimilieren.

Die erfindung-3geiaäßen kutanten können nach folgendem Verfahren erhalten werden, das gekennzeichnet ist durch die folgenden schritte;

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1) eine Kohlenwasserstoff assimilierende Hefe der Genus Üandida wird mit chemischen oder physikalischen mutagenen mitteln zur Induzierung von wutanten behandelt;

2) eine die üutanten enthaltende Zellsuspension wird auf einem geeigneten festen Medium gezüchtet bzw= inkubiert zur "Bildung isolierter Kolonien;

3) Kolonien mit rauher Oberflächenschicht werden ausgewählt;

4) die Zellen der Kolonien werden zunächst mit einem optischen luikroskop untersucht zur Auswahl von runden Zellen und die runden Zellen werden Gram-angefärbt zur Auswahl einer Gram-negativen Zelle;

5) bei den Gram-negativen Zellen wird dann der Mannangehalt chemisch bestimmt zur Isolierung der mutanten Zellen mit praktisch vernachlässigbarem Liannangehalt»

Die so erhaltenen Zellen sind der Zellwand-Integrität beraubt und enthalten kein Mannan«

Auf der anderen Seite werden die Zellen der isolierten Kolonien Gram-angefärbt zur Auswahl einer Gram-positiven Zelle uiit bei elektronenmikroskopischer Untersuchung geringer "Blektronendichte" der äußeren Schicht der Zellwand. Der kannangehalt so ausgewählter Zellen wird bestimmt und eine Zelle ausgewählt, deren Mannangehalt unter ΊΟ°/ό desjenigen des i.iutterstamms liegt. Auf diese Weise wird eine Zelle mit partiell verlorener Zellwand-Integrität erhalten.

Der Grund für die Auswahl von Mutanten mit runder Porm und weitere Isolierung eines Gram-negativen btamms beruht

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auf der Erwägung der Erfinder, daß eine ihrer Zellwand-Integrität beraubte Hefezelle die Xugelforia annimmt, um ihre Oberfläche möglichst klein zu machen, da sie andernfalls den von außen wirkenden Druck nicht aushalten kanu und auf der feststellung, daß der Sitz der fixierung der primären Anfärbung mit Kristallviolett bei der ü-ram-Ani'ärbung die Zellwand ist, was bedeutet, daß die Abgabe von an der Zellwandstruktur fixiertem Kristallviolett merklich verzögert ist, wenn angefärbte Zellen nach der Anfärbung mit einem organischen Lösungsmittel gespült werden (siehe Bacteriological Review, .16, (1952) 1, Stain Technology, 40 (1965) 79 und "The Microbial World", 2„ Aufl., S-. I69, Prentice-Hall Inc., Englewood Cliffs, Έ, J. U₀ S, A.)

Weiter kann eine Mutante mit veränderter Struktur der Zellwand, die ihrer Unangreifbarkeit partiell beraubt ist, auch bei G-ram-positiver Färbung durch Beobachtung mit einem Elektronenmikroskop leicht erkannt werden. Die Zelle mit geringer "Elektronendichte⁵¹ bzw. geringen otreuvermögen (low in electron density) der äußeren Schicht der Zellwand bei elektronenmikroskopischer Beobachtung ist eine Zelle mit veränderter Wandstruktur, bei welcher der den Hauptbestandte il der Zellwand bildende Mannangehalt verringert und die ZeIlwand-Integrität teilweise verloren gegangen ist.

Das Grundprinzip der Erfindung besteht in der üintv/icklung einer solchen ilutante ,deren intrazelluläre Substanz wirksam ausgenutzt und leicht extrahiert werden kann unter Anwendung der oben beschriebenen Methode bei einer Kohlenwasserstoff assimilierende Hefe der Genus Candida zur Erzielung einer Mutante, die vollständig oder teilweise ihrer Zellwand-Integrität beraubt ist sowie in der Züchtung solcher

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Lutanten und Ausnutzung der intrazellulären Bestandteile soldier Zellen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der angefügten Abbildungen und Kurvenblätter näher erläutert. Auf diesen zeigen:

Pig. 1 mikroskopische Aufnahmen von Gram-angefärbten Zellen von In-7002, Li-7005, M-7 und Candida albicans A.T.G.G. 10259;

i'lge 2 elektronenmikroskopische Aufnahmen von Zellen von H-7OO2, M-7OO7 und H-7}

Fig. 3 die Verdauung von Zeil prolein der Gruppen A und 3 sowie von Kontroll- und ÜA-Stäintien durch gastrisches Pepsin vom Rind als Funktion der Verdauungszeit; und

Fig. 4 die Verdauung von Zellprotein der Gruppen A und ß sowie der Kontroll- und von GA-Stämme durch proteolytisches ^inzym, das vo:a Pankreas des Gelbschwanzfischs erhalten wurde, in Abhängigkeit von der Verdauungszeit ,.

Gemäß der Erfindung werden die Zellen von Kohlenwasserstoff assimilierender Hefe der Genus Candida zunächst chemischen oder physikalischen mutagenen iaitteln ausgesetzt. Als chemische mutagene mittel können H-LLethyl-i*' -nitro-H-nitrosoguanidine, salpetrige Säure, Acriflavin, 4-Kitrochinolin-i\i- -oxid und Athylmethansulfonat angewandt werden» Als physikalische niutangene Mittel kochen Bestrahlung mit UV-Licht, BestrahluUfrjit ßöntgenstrahlen oder bestrahlung mit ionisiea btrahlen in i'rage.

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Das Verfahren zur Induzierung und Isolierung einer iikutante gemäß der Erfindung kann an einem Beispiel wie folgt erläutert werden:

(1) Erzielung von Mutanten durch N-Methyl-N' -nitro-1ί-nitrosoguanidin

Nach Lodder (J. Lodder und tf.J.'v/. Kreger-Van Rij: "The Yeast" 2. Aufl., Seite 370, North-HoHand Publishing Company, Amsterdams, 1967) wurden Hefestämme der Genus Candida von japanischer Erde isoliert und Zellen von einem so isolierten Candida-Stamm, dem Stamm LI-7* wurden in YiI-Medium von pH 6 (Zusammensetzung: 0,3;'<> HaIzextrakt; 0,3'/° Hefeextrakt; 0,5$ Pepton und 1$ Glucose) eingeimpft und bis zur exponentiellen 7/achstumsphase inkubiert. Die Zellen wurden dann "geerntet" und erneut in Yu-kedium auf eine Zelldichte von 10'/ml suspendiert. Kach 6 Stunden langer Behandlung der Zellsuspension mit H-Methyl-H'-nitro-ii-nitro soguanid in (K & K Laboratories Inc., California, U. S. A.) in einer Konzentration von 40 jug/ml bei 30⁰C wurde sie mit sterilisierter Salzlösung auf das 100-fache verdünnt. Die verdünnte Suspension wurde zur Bildung isolierter Kolonien auf YIa-Agarplatten inkubiert, die durch Zusatz von 2fi Agar zu dem oben angegebenen Yii-iledium hergestellt worden waren. Kolonien mit rauher Oberfläche wurden ausgewählt, die Zellen dieser Kolonien entnommen und mit einem optischen Mikroskop untersucht zur Isolierung von etwa 200 Stämmen mit kreisförmigen bzw. runden Zellen. Die einzelnen Stämme wurden G-ram-angefärbt und es wurden 3 Gram-negative Stämme isoliert und mit Candida periphelosum U-7002, Ii-7003 und M-7004 bezeichnet.

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Die restlichen Stämme wurden nach Behandlung der Zellen mit Ü-lutaraldehyd nach dem herkömmlichen Verfahren mit Osiaiumtetroxid fixiert oder gefärbt und mit Perimental fixiert (Cell Research, _20 (I960) 28) und sie wurden dann mit dem Elektronenmikroskop nach Inoore (Journal of Biochemical Cytology 1 (1957) 225) untersucht»

10 Stämme, deren Zellwände insbesondere in der äußeren Schicht eine geringe iilektronendichte bzw» ein geringes Streuvermögen besaßen, d.iu bei denen die Schwärzung der Fotoplatte gering war, wurden abgetrennt und jeweils einzeln Stunden lang in dem oben angegebenen YJ/I-Medium bei 37⁰O weiter vermehrt und die Zellen wurden dann "geerntet" und nach Lyophilisierung wurden die darin enthaltenen Mengen an Mannan und Glucan nach WeEdrevelyan (Biochemical Journal, 63. (1956) 23) bestimmt»

Dabei wurden eine Mutante mit einem lüannangehalt unter 2 g pro 100 g trockene Zellen aufgefunden und 2 Stämme in Übereinstimmung mit diesem Kriterium isoliert und als Candida periphelosum 11-7007 und M-7008 bezeichnet.

(2) Erzielung von Mutanten durch Bestrahlung mit UV-Licht

Zellen von Candida lipolytica NRBL-Y-6795 wurden aus der exponentiellen Wachstuinsphase heraus gesammelt und in steriler SaI
suspendiert.

7 steriler Salzlösung mit einer Zelldichte von 10' pro 1 ml

1 ml dieser Suspension wurde in eine Petrischale mit 9 cm Durchmesser gebracht und nach 3 Minuten langer Bestrahlung mit einer UV-Lampe von 15 Watt (germicidal lamp der Toshiba Co., ltd.) in einem Abstand von 30 cm mit steriler

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- ίο -

Salzlösung auf das 100-fache verdünnt,

Die verdünnte Suspension wurde auf der oben angegebenen YII-Agarplatte zur Bildung isolierter Kolonien inkubiert» Nach dem gleichen Verfahren wie unter (1) beschrieben -wurden Kolonien mit rauher Oberfläche ausgewählt und davon weiter etwa 200 Stämme mit kreisförmigen bzw. runden Zellen, die sich als authentisch Gram-negativ zeigten, isoliert. Die einzelnen Stämme wurden nach dem oben angegebenen Verfahren von Trevelyan chemisch auf ihren Liannangehalt hin untersucht. Ein Stamm mit praktisch vernachlässigbarem Mannangehalt wurde von diesen Stämmen isoliert und als Candida lipolytica k-7OO5 bezeichnet. Dieses Verfahren der Auswahl von Stämmen mit Mannanmangel durch chemische Bestimmung ist iia !'alle eier Isolierung von Mutanten von Candida lipolytica aus Sicherheitsgründen erforderlich, da deren Liutterstamm ursprünglich ein zwischen positiv und negativ liegendes Verhalten hinsichtlich der Gram-Anfärbung zeigt, was die eindeutige Erkennung von brauchbaren Liutanten über Gram-negatives Verhalten in Frage stellt. Dieses (chemisch-analytische) Verfahren kann im Falle der Mutanten-Isolierung bei anderen Gandida-Arten weggelassen werden, da diese authentisch Gram-positive Organismen sind.

Weiter wurde unter den verbliebenen Stämmen eine !,lUtante mit vermindertem kannangehalt von weniger als 10^cß> des kutterstamms durch das unter (T) beschriebene Verfahren aufgefunden.

Eine den oben angegebenen Kriterien entsprechende Liutante wurde isoliert und mit Candida lipolytica Iä-7009 bezeichnet.

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(3) Erzeugung von Uutanten durch salpetrige Säure Zellen von Candida guilliermondii Ι3ΓΟ-1Ο62, die im

oben beschriebenen Yüi-jjxedium bis zur exponentiellen Wachstumsphase vermehrt worden waren, wurden gesammelt und in 0,1 m Acetatpuffer von pH 4,5 mit 0,05 m Hatriumnitrit auf eine

7
Zelldichte von 10 pro 1 ml suspendiert.

Nach 40 Liinuten stehenlassen bei 30°C wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt und nach dem Waschen in einer sterilisierten Lösung mit Yjo Pepton und 5^ SaCl (Gewicht pro Volumen mal 100) suspendiert und verdünnt.

Die verdünnte Suspension wurc? auf Υω-Agarplatten zur Bildung von Kolonien inkubiert. Danach wurden nach dem gleichen Verfahren wie unter (1) beschrieben, etwa 300 Stämme mit kreisförmigen Zellen von den Zellen mit rauher Oberfläche getrennt und ein ütamu einer ;iram-negativen IsIutante davon isoliert und mit Candida guilliermondii I.I-7006 bezeichnet.

(4) Gewinnung von Mutanten durch Acriflavin

Zellen von Candida guilliermondii ΙΪΌ-1062 wurden in Yl.-liedium auf eine Zelldichte von 10 pro 1 ml suspendiert, die Suspension iait Acriflavin in einer Konzentration von 4 /Ug/ml versetzt und die Ilischung 10 Stunden lang bei 30⁰G inkubiert. Die Zellen wurden gesammelt und nach dem Waschen mit einer sterilen Salzlösung mit dem 100-fachen Volumen an Salzlösung verdünnt.

Die verdünnte Suspension wurde einer Kolonie-bildung auf Yi-.-Agarplatten unterworfen. Nach dem gleichen Verfahren ■.vie unter (1) beschrieben wurde einer der mutanten Stämme mit

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einem geringeren Mannangehalt als der kutterstamm aufgefunden und mit Candida guilliermondii M-7010 bezeichnet»

Neun nach obigem Verfahren erhaltene Stämme von Hefemutanten der Genus Candida besitzen die Fähigkeit, normales' Paraffin zu assimilieren; unter diesen haben die Stämme M-7002, M-7003, M-7004, M-7005 und M-7OO6 (die nachfolgend als Gruppe A bezeichnet werden) eine rauhe Kolonieoberfläche, kreisförmige bzw. runde Zellform und sind Gram-negativ, während die Stämme M-7007, Li-7008 und M-7010 (die nachfolgend als Gruppe B bezeichnet werden) ähnlich wie wilde Stämme hinsichtlich der Kolonieoberfläche glatt und Gram-positiv sind ο Der Stamm ϊνχ-7009 erweist sich hinsichtlich der Kolonieoberf lache ähnlich wie die Stämme LI-7007, k-7008 und h-7010, er zeigt jedoch ein zwischen Gram-positiv und Gram-negativ liegendes Verhalten,

Die mikrobiologischen Eigenschaften dieser Hefemutanten der Genus Candida sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Von diesen Stämmen ■ sind die Stämme H-7002, M-7005, L-7006, LI-7007 und H-7010 nachfolgend mit ihren entsprechenden A.T.C„C.-Registriernummern aufgeführt. Von diesen Stämmen wurden Proben beim American Type Culture Collection in 7/ashington, D.C, am 24. Februar 1971 hinterlegt.

Name der Mikroorganismen AβT.C₀C,-nummer

Candida periphelosum H-7002 20314

Candida lipolytica . M-7005 20315

Candida guilliermondii M-7OO6 20316

Candida periphenlosum M-7007 20317

Candida guilliermondii M-7010 20318

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li-7002 als typisches Beispiel der obigen Gruppe A, iii-70u7 als typisches Beispiel für die Gruppe B und Candida albicans Ad¹.C.G. 10259 als typisches Beispiel für herkömmliche wilde Stämme wurden zur Erzielung isolierter Kolonien auf oben beschriebenen Y-Agarplatten 3 Tage lang bei 30 0 inkubiert ο

3s wurde gefunden, daß die Kolonieoberfläche von M-7002 rauh ist, während ϊά-7007 und Candida albicans glatte Oberflächen zeigen.

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BAD ORiGlNAL

Tabelle 1; Mikrobiologische Eigenschaften der üutanten

	Gruppe A	Kugel	Gruppe r>
	(M-7002 bis M-7OO6)	Zelldimensionen 5 bis 6 ^u	U-70Q7 bis Ivi-7010)
	Glucose +	Kolonieoberfläche rauh	+
	Galactose +	Wachstumstemperatur 0 bis 37⁰O	+
Assimila	Laotose	Proteingehali	_
tion von	Maltose +	; 59f°	+
organischen O-haltigen	Sucrose +		+
Verbindungen	Äthanol +	+
	n-Paraffin +	⁺
	Pepton +	+
Gebrauch	Harnstoff +
von Stick	¹KTTT fl ~\ ι
stoff-Ver	NH₄Ol +	-
bindungen	Biotin +	+
	Inosin	-
	Nicotinsäure	-
Vitamin	Pantothensäure	■ -
bedarf	Pyridoxin	-
	Thiamin	-
	p-Aminobenzoe
	säure
	Gram-Anfärbung negativ	positiv*
	Zellform	Stäbchen
3 μ
glatt
0 bis 37°ü
595*

ι k-7OO9 macht eine Ausnahme als Gram +_

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Andere Stämme der Gruppe A, andere Stämme der Gruppe B und andere herkömmliche wilde btämme, zu denen Candida Iipolytica, Candida guilliermondii und Candida utilia etc. gehören, Viaren hinsichtlich der Kolonieoberfläche ähnlich wie k-7002, k-7007 und Candida albicans.

Die kutanten der Gruppe A unter diesen Gruppen der Genus Candida zeigen einen bemerkenswerten Unterschied gegenüber herkömmlichen wilden Stämmen, wie k-7 (Kontrolle (I)), Candida guilliermondii I.j?.Oc 1062, einem authentischen Beispiel für Kohlenwasserstoff assimilierende Hefe (Kontrolle (II)) und Candida albicans A.T.C.C.10259 (Kontrolle (IH)), der darin besteht, dal? die kutanten Gram-negativ sind und kein kannan enthalten.

Oogleich die kutanten der Gruppe B einen geringeren Mannangehalt besitzen als die herkömmlichen wilden Stämme, sind sie trotzdem ähnlich wie die Kontrollstamme Gram-positiv. M-7OO9 fällt dabei aus dem Rahmen, indem er eine Zwischensteliung zv/ischen Gram-positiver und Gram-negativer Anfärbung einnimmt ο

Beweise für obige Schlußfolgerung werden nachfolgend angeführt« Die oben beschriebenen 12 Stämme und Candida Iipolytica KHKL-6795 und Candida tropicalis IAk-4147 (diese beiden Stämme werden nachfolgend abgekürzt als CA-Stämme bezeichnet), d.h. insgesamt 14 ötämme wurden durch Schütteln in einem Kulturmedium von pH 6,8 folgender Zusammensetzung« 1> normales Paraffin mit 14 bis 18 Kohlenstoffatomen} 0,5i*

_{24 42} 0,00150 lInS0₄«7H₂0: 0,01Ji

und 0,05^ Hefeextrakt 48 St inkubiert.

CaCl₂-2H₂O und 0,05^ Hefeextrakt 48 Stunden lang bei 30⁰C

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Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und ein Teil derselben Gram-angefärbt und unter ciera Mikroskop untersucht.

Mikroskopische Aufnahmen (Vergrößerung: 2000-fach) der ^% Lutanten Li-7002 und M-7OO5 als typische Beispiele und der Kontrolle (I) und Kontrolle (III) nach Gram-Anfärbung sind in !ig. 1 wiedergegeben. Violett gefärbte Zellen sind solche, an deren Zellv/and das Kristallviolett nach primärer Anfärbung fixiert warj diese werden als Gram-positiv bezeichnet, während grüngefärbte Zellen solche Zellen sind, bei denen das Kristallviolett nicht fixiert sondern durch isehandlung mit organischem Lösungsmittel eluiert v/urde und die bei der zweiten Anfärbung mit Lethylgrün reagierten; diese wurden als Gram-negativ identifiziert=

liach Fig. 1 ist es klar, daß k-7OO2 und k-7OO5 Gram- -negativ sind, während die Kontrollen (i) und (III) Gram-positiv sind. Das Verhalten von k-7OO3, M-7004 und k-7OO5 gegenüber der Gram-Anfärbung war mit demjenigen von k-7002 völlig identisch und diese kutanten wurden daher als Gram-negativ klassifiziert, M-7007, M-7008 und M-7010 sprachen dagegen auf die Anfärbung auf gleicher Weise an wie äer herkömmliche wilde ötamin und wurden daher als Grampositiv definiert. H-7009 zeigte ein Zwischenverhalten zwischen Gram-positiv und Gram- -negativ«

Nachfolgend wurden Zellen der 9 kutanten, 3 IControllstämüie und 2 GA-Stämme gesammelt und nach Waschen lyophilisiert und auf ihren Hannan- und Glucangehalt nach der oben beschriebenen Ilethode von Trevelyan geprüft (Angabe in Prozent).

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Daneben wurde auch der relative iiiannangehalt der uutanten bezogen auf einen Gehalt von 10O/0 im Kontrollstamm berechnet» Die ürgebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Aus dieser !Tabelle ist ersichtlich, daß die iiiutanten k-7002, M-7OO3, M-7004, !-I-7OO5 und IvI-7006, d.h. ötäinme der Gruppe A, bemerkenswerte Unterschiede gegenüber den Kontrollstänmen zeigen, indem sie Gram-negativ sind und praktisch keinen Mannangehalt besitzen, während H-7007, M-7008 und k-7010, d.h. Stämme der Gruppe B, Gram-positiv wie die Kontroll stamme sind, aber bezogen auf die Kontrollstänrue einen verminderten iviannangehalt von 71 »4 bis 10,7/ό besitzen.

Candida lipolytica und M-7OO9 waren die einzigen Ausnahmen, die ein intermediäres Verhalten gegenüber der Gram-Anfärbung zeigten? der Mannangehalt der Hutante lag jedoch innerhalb des Bereichs der Gruppe B.

Nach den Untersuchungen der Erfinder waren die Mannangehalte von 3 anderen herkömmlichen Stämmen, nämlich Candida parapailosis, Candida intermedia und Candida robusta, die unter den oben angegebenen Bedingungen inkubiert wurden, relativ hoch (Werts 3,0 +0,2 g/100 g trockene Zellen).

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Tabelle	2	Polysaccharidge-	kannan	relativer iiannanga- halt	I	0
		halt (g/iOOg trockene Zellen)	2,8 1		> (100)	0
G-raa-An- f ärixi ng	G-lucan	2,8 J	I	0
	7,2	3,0 ;	0
Kontrolle (I) +	7,0	0	0
Kontrolle (ll) +	6,7	0	10,7
Kontrolle (III)	6,2	0	39,3
M-7002	6_f6	0	71,4
M-7OO3	6,6	0	64,3
ivI-7004	6,3	0,3	75,2
M-7OO5	6,4	1,1	82,2
M-7006	6,2	2,0
M-7OO7 +	6,6	1,8
M-7OO8 +	6,6	2,1
M-7OO9 +	6,4	2,3
IiI-7010 +	9,1
Gandida lipolytica + WBSl-6795	9,3
Candida tropicalis + IAM-4147 "~

Aus der tabelle 2 ist ebenfalls ersichtlich, daß der auf die Kontrollstämme bezogene relative Mannangehalt der beiden GA-Stämme, der am Ende der Tabelle angegeben wird, bei 75,0 und 82,2)j liegt, obwohl die ÖA-dtämme herkömmliche wilde Stämme sind, laese Werte liegen in dem Bereich, der bei

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einigen iiutanten gemäß der Erfindung gefunden wird. Die experimentellen Ergebnisse aus denen ersichtlich ist, daß diese üA-3tämme einen geringeren Mannangehalt als andere herkömmliche wilde ütämue haben, wurden von liabeshima u.a. (Journal of Technology 48. (1970) 556 angegeben. Bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung dieser OA-Stämme zeigt sich ;jedoch, daß ihre Zellwand ein hohes Streuvermögen besitzt und schwer angreifbar ist. D.h. die günstigen Eigenschaften der Iiutanten gemä3 der Erfindung, wie sie nachfolgend angegeben werden, sind den OA-Stämmen nicht eigen.

Nachfolgend wurden Zellen von den Stämmen M-7002, LI-7007 und k-7 als Vertreter für die Mutanten der oben beschriebenen Gruppen A und B sowie die Kontrollstämme nach dem unter (1) beschriebenen Verfahren elektroneniuikroskopisch untersucht (Vergrößerung 20 000-fach), Die Ergebnisse sind in Fig. 2 wiedergegeben.

Beim IControllstamm und dem Stamm k-7007 wird eine deutliche Zellwand im Umfangsbereich der Zelle beobachtet, während die Dicke des Zellwandbereichs beim Stamm Äi-7002 gering und das Elektronenstreuvermö'gen schwach ist. Daraus wird deutlich, daß der Stamm k-7002 seiner Zellwand-Integrität beraubt und im Vergleich zum Kontrollstamm etwa doppelte Zellbreite besitzt. Aus elektronenmikroskopischen Beobachtungen folgt ebenfalls, daß die Stämme ii-7003, Ü-7004, k-7OO5 und ^~7ΟΟ6 in ähnlicher V/eise ihrer Zellwand-Integrität beraubt sind.

Wie bereits den obigen Ausführungen z.T. zu entnehmen ist, wurde aus den Tatsachen, daß der Bitz der primären Anfärbung durch Kristallviolett die Zellwand ist und M-7002,

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id-7003, M-7004, li-7005 und k-7006 Gram-negativ sind und daß die Hauptkomponente der Zellwand Liannan ist und die Mutanten gemäß der Erfindung kein Liannan oder weniger als die natürlichen Stämme enthalten und daß M-7002, M-7OO3, k-7Q04, k-7005 und Iii-7006 bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung eine mangelhafte Zeilwandstruktur zeigen, geschlossen, daß M-7002, ivi-7003, L-7004, li-7005 und M-7006, d.h. die Mutanten der G-ruppe A, ihrer Zellwand-Integrität beraubt sind, während id-7007, ii-7008, Iu-7009 und ii-7010, d_oh, die kutanten der Gruppe B der Zellwand-Integrität nur partiell beraubt sind.

Aus der Tatsache, daß die Verdaubarkeit und Ausnutzbarkeit der intrazellulären Substanzen der Hefezelle durch die (üblicherweise schwer angreifbare) Zellwand vermindert wird, kann wiederum geschlossen werden, daß die oben beschriebenen Liutanten gemäß der Erfindung sowohl hinsichtlich der Verdaubarkeit als auch der Ausnutzbarkeit von intrazellulärem Protein im Vergleich zu dem herkömmlichen Stamm deutlich ausgezeichnet sind.

Nachfolgend wurde die Verdaubarkeit und Extrahierbarkeit von Protein aus den Zellen bei den erfindungsgemäßen luutanten untersucht. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt:

Zunächst wurde das Zellprotein von 9 Stämmen der oben beschriebenen Liutanten der Genus Candida, 3 Kontrollstämmen und 2 GA-Stämmen auf seine Verdaubarkeit durch gastrisches Pepsin vom Rind und durch ein aus der Bauchspeicheldrüse des Gelbschwanzfisches präpariertes proteolytisehes Enzym untersucht. Dazu wurden die 14 Hefestämiüe durch Schütteln in dem oben beschriebenen normal-Paraffinmedium 48-Stunden lang bei 3O⁰G inkubiert und die durch Vermehrung entstandenen Zellen durch Zentrifugieren gesammelt, iiach Waschen und Trocknen

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wurde die Zellmasse jeweils in Salzsäure von pH 1,8 auf 1/0 Zelldichte suspendierte Zu den einzelnen Suspensionen wurden 0,5ⁱ,j (Gewicht pro Volumen) gastrisches Pepsin vom Kind (2 χ kristallisiert und lyophilisiert; 153-1370-1; hergestellt von der Sigma Chemical Company) hinzugegeben und die Laschungen bei 37°0 aufbewahrt.

Zu verschiedenen Zeiten (siehe Fig. 3) wurden Anteile der Heaktionsmischung abpipettiert und nach Zentrifugieren wurde der Stickstoffgehalt in der überstehenden Flüssigkeit nach Kjeldahl bestimmt» Die Protein-Verdauungsgeschwindigkeit (obiger Stickstoffgehalt zum Gesamtstielcstoff der ZeIlinasse vor der Verdauung; ausgedrückt in >j) wurde ebenfalls be3tiii]j..rc. Die Ergebnisse werden in S¹Ig₀ 3 gezeigt.

In Figo 3 ist län^s der Ordinate die Verdauung des intrazellulären Proteins der Hefe durch gastrisches Pepsin vom Rind in /■> und längs der Abszisse die zugehörige Vardauungszait in Stunden aufgetragen. Me erhaltenen Kurven A, B," CA und "Kontrolle" zeigen die mittleren Verdaubarkeiten der Mutanten der Gruppe A, eier liutanten der Gruppe 3, der OA-Stämme und der Konorollstäauie.

i/ie Fig. 3 zeigt, ist die Verdaubarbeit der iiircanten der u-ruppe λ ±u Lictel'stwa 2,7 Wal höher als die des bekannten wilden Stamms, wenn man die entsprechenden Jerte 24 Stunden nach üeginn der Verdauung 'miteinander vergleicht und die mittlere Verdaubarkeit der Liutanten der Gruppe B ist etwa 1,6 mal höher als diejenige des herkömmlichen wilden Stamms.

Darüber hinaus nimmt die Verdauung der mutanten gemäß

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BAD ORlGiNAL

der Erfindung sogar 20 stunden nach -deginn der Verdauung noch zu, während dia.janige des herkömmlichen Staube 10 Stranden nach Beginn der Verdauung einen konstanten Xferz erreicht = Die gemäß der Eriinduri. isolierten Hefemutanten erwiesen sich mithin als sehr leicht verdaubar«,

ITachfolgend wurde die Verdaubarkeit der ^iutantenzelien durch proteolytisches Enzym vom jj'isch geprüft, um die 7er— daubarkeit der erfindungsgeaäßen Produkte für den i'all der Yerwendung als butter für Mischkulturen nachzuweisen. Dazu vmrden die Zellen in 0,1 Ii Borat-Puffer (pH 3,0) auf Υ,'ο Zelldichte suspendiert und die Suspension mit von der Bauchspeicheldrüse eines G-elbschwanzfisches nach dem laaicowski-Verfahren ("Methods of Enzymology", Bd₀ II, Seite 8, 1, Aufl,; herausg. von S»P» Golowick und ι-ί.Ο. Kaplan, Academic Press Inc., jtfew York, 1955) hergestelltem proteolytischen Enzym sowie 0,005 u CaOl₉ ois zu einer Konsentration von Ο,ϊ'/J (Gewicht pro Yolumen) versetzt, Die i.iscrmng wurde bei 37""^ der Ysrdauung überlassen iu_Aa die 7srdaub&j.-κβit nach det: gleichen Verfahren wie bei der Untersuchung i-it gastrischem Pepsin vom Hind bestimmt. Die Ergebnisse sind in ii;, 4 wiedergegeben«

In Pig. 4 ist längs der Ordinate die Ver-aeuun_tv des 'Jiel'ezellproteins durch proteolytischas iinsym. von uer z5auci.sr.--3icheldrüse eines -ielDsohwanzfisches und l^.n^s uer Arjazisse die Verdauungsseit aufgetragen. Die 7erdauoar.:oit j.er militanten der Gruppe A, der Mutanten der Gruppe -o, isr Kontrollstämmo und der ÖA-iatäniue wird durch die Kurven A, r., Kontrolle und OA veranschaulicht, Wie man sieht, zeigen ais .,utanten der Ci-ruppen A und 'ß eine 2_f2 bzw. 1,3 mal höaere Verdaubarkeit als die iControllstämue bei der Verdauung durch Bauch-

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«AD ORiOIMAt

speicheldrüsenenzym vom G-elbschwanzfisch. D.h. die Verdaubarkeit der kutanten gemäß der Erfindung und insbesondere der Mutanten der Gruppe A ist im Vergleich zu derjenigen der Kontrollstämme merklich verbessert.

Die CA-Stäuune erweisen sich bei diesen Prüfungen hinsichtlich der Verdaubarkeit jeweils als den Kontrollstämmen vergleichbare Obgleich also die GA-Stämme wie Tabelle 2 zeigt, einen etwas geringeren Liannangehalt als die Kontroll stamme haben, sind sie doch den xiutanten gemäß der Erfindung hinsichtlich der Verdaubarkeit des Zellproteins merklich unterlegen. Diese CA-Stamme wurden keiner mutationsinduzierenden Behandlung gemäß der Erfindung unterworfen und zeigten ein hohes ötreuvermögen der peripheren Bereiche der Zelle bei Beobachtung im. Elektronenmikroskop.

Danach kann angenommen werden, daü die geringe Angreifbarkeit der Zellwand bei diesen OA-ötäimnen nicht verlorengegangen ist. Bei den iiutanten gemäß der Erfindung ist dagegen abweichend von den Kontroll- und CA-Stämmen das Zellprotein in leicht verdaubarem Zustand, da diese Mutanten gemäß der Erfindung nicht nur keinen oder einen verminderten Mannangehalt besitzen, sondern ihr Cytoplasma oder ihre Zellmembran dem umgebenden Medium direkt ausgesetzt ist, während die Zellwand-Integrität vollständig oder teilweise verloren gegangen ist.

Anschließend wurde die Extrahierbarkeit der intrazellulären Substanzen dieser Mutanten, der Kontrollstamme und der GA-Stäiame durch chemische Reagenzien oder physikalische Ilittel bestimmt, um Vorrichtungen zur Extraktion und Isolierung intrazellulärer Substanz festlegen zu können.

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ü -.JA*? .-., BAD ORIGINAL

!Tabelle 3 t Extraktion von Protein aus den Zellen

	io extrahiertes durch Alkali- lö sung	Protein durch Schall oszillationen
Hefestämme	49,5	79,3
M-7002	51,2	72,5
M-7OO3	50,0	69,9
M-7OO4	49,5	73,2
M-7OO5	49,9	75,2
ii-7006	49,5	69,3
Li- 7 OO 7	35,2	60,0
M-7OO8	28,6	45,5
M-7OO9	34,0	52,2
M-7010	23,6	22,6
Kontrolle (i)	25,2	27,2
Kontrolle (II)	24,8	25,4
Kontrolle (III)	25,6	29,3
Candida lipolytica iniRI-6795	23,5	25,9
Candida tronicalis IAM-4147

In gleicher Weise wie für die Untersuchungen gemäß Fig« und 4 wurden 9 Stämme der oben beschriebenen Mutanten, 3 Kontrollstämme und 2 CA-Stämme in normal-Paraffinmedium gezüchtet bzw. vermehrt. Die Zellen wurden dann gesammelt und in 0,05 η Natronlauge auf 1$ Zelldichte suspendiert und 2 ötunden lang auf 50⁰C erwärmt; nach dem Zentrifugieren wurde der Stickstoffgehalt im überstehenden Anteil nach Kjeldahl bestimmt und die Extraktionsrate (f°) über das Verhältnis der

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durch Natronlauge extrahierten Stickstoffmengen zum Gesamtstickstoff der Zelle vor der Behandlung berechnet» Die Ergebnisse sind in Spalte 2 der 'fabeile 3 wiedergegeben,.

Zellen der oben beschriebenen 3 Gruppen wurden weiter in einer sterilisierten Salzlösung auf 5°/° Zelldichte suspendiert und es wurden dann 5 ml Portionen dieser Suspensionen mit einem 10 kHz (10 KC) Schall-Disintegrator 5 Minuten lang behandelt bzw« zerrissen und anschließend zentrifugiert, wonach der Stickstoffgehalt in der überstehenden Fraktion bestimmt wurde. Die Extraktionsrate {°/o) wurde in gleicher Weise wie oben .angegeben berechnet, Die Ergebnisse sind in Spalte 3 der !Tabelle 3 wiedergegeben«

Aus Tabelle 3 ist klar ersichtlich, daß die gemäß der Erfindung erzielten Mutanten im Vergleich zu den Kontrollstämiiien eine merklich höhere Proteinextraktionsrate sowohl bei Verwendung von Alkalilösung als auch bei Schalleinwirkung aufweisen und daß die Proteinextraktionsrate ähnlich wie bei der Verdaubarkeitsprüfung mit Enzymen in Abhängigkeit von der Abnahme des Mannangehalts zunimmt. Die OA-Stämme bleiben dagegen trotz ihres geringeren Mannangehalts hinsichtlich der Proteinextraktionsrate in ähnlichen Bereichen wie die herkömmlichen Stämme»

Wie anhand der zu Fig. 3 und 4 führenden Untersuchungen bereits beschrieben wurde, ist es ebenfalls klar, daß die gemäß der Erfindung erhaltenen Mutanten nicht nur durch einen mangelnden Mannangehalt hervorstechen, sondern auch durch genetisch fehlerhafte Zellwandstrukturen, was im Vergleich zu den Kontroll- und GA-Stämmen zu einer bemerkenswerten Verbesserung der Proteinextraktion durch Alkalibehandlung oder

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Schalleinwirkung führt»

Darüber hinaus sind die Mutanten gemäß der Erfindung den herkömmlichen wilden Stämmen hinsichtlich der üxtrahierbarkeit intrazellulärer Substanzen bei Harnstoffbehandlung, Autolyse, mechanischem Mahlvorgang oder G-efrier- und Auftaubehandlungen überlegen.

Aus der Tatsache, daß die Stämme k-7002, M-7003, 11-7004, M-7OO5 und M-7OO6 unter den erfindungsgemäß isolierten Hefemutanten der Genus Candida Gram-negativ sind, während sich alle herkömmlichen Hefestämme unabhängig von Wachstumsbedingungen und Wachstumsphase als Gram-positiv erweisen (unter der berechtigten Annahme, daß die Gram-Anfärbung ein iJittel zur Unterscheidung der Beschaffenheit von Zellwänden ist), sowie aus der elektronenmikroskopischen Beobachtung und den experimentellen Ergebnissen bei der Prüfung der Verdaubarkeit durch Enzyme und aus der hohen Proteinextraktionsrate kann geschlossen werden, daß sich diese erfindungsgemäßen Hefemutanten der Genus Candida von herkömmlichen Arten in positiver Weise unterscheiden und durch mangelnde Zellwand-Integrität auszeichnen, wobei Oytoplasma oder Zellmembran freiliegen«

Von den 4 übrigen Mutanten sind die Stämme 11-7007, M-7008 und M-7010 ähnlieh wie die herkömmlichen Hefestämme bei Inkubation unter gleichen Bedingungen Gram-positiv und der Stamm M-7OO9 nimmt eine Zwischenstellung zwischen Grampositiv und Gram-negativ ein, jedoch ist ihr Mannangehalt im Vergleich zu den Kontrollstämmen der Genus Candida auf 70 - 10$ vermindert. Aus der Tatsache, daß die Werte von Proteinverdauungs- oder Extraktionsrate bei diesen Mutanten

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in einem mittleren bereich zwischen derjenigen der ihrer Zellwand-Integrität beraubten Mutanten und derjenigen der Kontrollstämme liegen, kann geschlossen werden, daß diese 4 Mutanten ihrer Zellwand-Integrität partiell beraubt sind.

Unter den herkömmlichen Hefestam^en der Genus Candida haben die Ga-Stämme Candida iipolytica und Candida tropicalis einen etwas geringeren Iviannangehalt als die Kontrollstäuime und Candida Iipolytica nimmt eine Zwischenstellung zwischen Gram-IOsitiv und Gram-negativ ein. Diese CA-btamme haben jedoch eine bemerkenswert geringere Proteinverdaubarkeit und -extrahierbarkeit als die Mutanten gemäß der Erfindung und unterscheiden sich mithin recht deutlich von diesen.

Die wie oben beschrieben isolierten Hefemutanten der Genus Candida gemäß der Erfindung sind mithin iiutanten, die der Zeilwand-Integrität beraubt, Gram-negativ und praktisch mannanfrei oder aber Gram-positiv sind und einen partiell verringerten Liannangehalt besitzen und im Gegensatz zu den üblicnen bekannten wilden Hefestämmen durch abbauendes Enzym gut verdaubar sind und deren intrazelluläres Protein durch unterschiedliche Behandlungen sehr leicht extrahiert werden kann.

Bei Verwendung von Hefezellen für menschliche Nahrung und !futter für Haustiere oder Fische bilden die Hefemutanten der Genus Candida gemäß der Erfindung mithin sehr gut verdaubare Produkte und es ist damit möglich, Nährmittel von hohem Nährwert und nährende Medikamente zu erzeugen. Im Falle einer industriellen Isolierung und Abtrennung intrazellulärer Substanzen von der Hefe können daher die Kosten für die An-

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lage und die Betriebskosten vermindert werden, wenn tiefemutanten gemäß der Erfindung zum Einsatz kommen und es kann weiter ein Abbau und eine Denaturierung des Produktes weitgehend gehemmt werden, da die Isolierung und Abtrennung der intrazellulären Substanzen und Autolyse unter milden Bedin-* gungen durchgeführt werden kann. Auch im Hinblick auf die Extraktion und Ausnutzung biologisch wirksamer Substanzen, wie Enzyme, kann das erfindungsgemäße Verfahren im Vergleich zu den üblichen Methoden mit bemerkenswerten Vorteil angewandt werden.

Beispiel 1

20 1 Kulturmedium (pH 5,5) mit folgender gewichtsmäßiger Zusammensetzung» 1$ normal Paraffin mit 14 bis 18 Kohlenstoffatomen; 0,57° HH_4-OIj 0,7$ KH₂PO₄; 0,001$ SeSO₄₁-TH₂O; O,O25b MgS0₄°7H₂0; 0,001$ 3JtUaSO₄-TH₂Oj 0,01$ CaCl₂.2H₂0 und 0,05$ Hefeextrakt wurden sterilisiert. Uach Einimpfen der Mutante M-T002 wurde die Mischung 24 Stunden lang unter Belüftung bei 3O⁰G inkubiert. Danach wurde dieses Kulturmedium zu 500 1 sterilisiertem Kulturmedium der oben beschriebenen Art hinzugegeben mit weiterer 48 stündiger Inkubation bei 30⁰G unter Belüftung und Einstellung des pH-7/ertes«, Danach wurden die Zellen mit einem Zentrifugiertrockner gesammelt und 2,5 kg trockene Hefezellen von hoher Verdaubarkeit erzielt. 2 kg der trockenen Zellmasse wurden abgenommen und mit 12 kg Weizenmehl versetzt. Nach dem Durchkneten wurde die Uischung mit 6 kg weißem Fischmehl gemischt zur Erzielung "von Fischfutter.

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Beispiel 2

20 1 Kulturmedium (pH 6,0) mit 5$ (als Kohlehydratkonzentration) Gärmelasse (molasses for fermentation), O,25^c/° (MH_4-)₂S0₄» 0,5°/öKH₂P0₄; 0,02'/£ MgSO₄ ⁰7H₂O und 0,04?'° Hefeextrakt (gewichtsmäßige Zusammensetzung) wurden nach dem Aufkochen filtriert und sterilisiert» Danach wurde die liutante ia-7005 eingeimpft und 24 Stunden lang bei 30⁰G präinkubiert» Diese liischung wurde dann zu 500 1 des oben beschriebenen sterilisierten Kulturmediums hinzugegeben und es folgte eine Inkubation unter Belüftung, die 36 Stunden bei 3O⁰G und 12 stunden bei 40⁰G durchgeführt wurde. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und nach Waschen mit Wasser in einem Trommeltrockner getrocknet zur Erzielung von 3 kg trockener Hefezellen₀

üine 2 kg Portion wurde davon entnommen und mit 20 kg 0,1 η UaOH versetzt und nach 2 stunden langem Stehenlassen bei 50 0 zentrifugiert. Die überstehende Fraktion wurde zur Ausfällung von Protein mit HGl versetzt, wobei der pH-Wert auf 4_}8 eingestellt wurde. Das ausgefällte Protein wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und mit einem kleinen Sprühtrockner getrocknet zur Erzielung von 500 g trockenem Zellprotein. 50 kg Wasser und 1 kg Glucose wurden zu den 500 g Protein hinzugegebene Die Liischung wurde mit Lactobacillus acidophilus geimpft und 30 Stunden lang bei 37⁰G zur bildung von Liilchsäure vergoren. Abschließend wurden Zucker und G-eschmacicsstoffe in geeigneter iienge hinzugegeben und ein schmackhaftes und nährendes hochproteinhaltiges Getränk erhalten.

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Beispiel 3

Die Mutante LI-7006 wurde in 20 1 Kulturmedium (pH 6,0) mit folgender gewichtsmäßiger Zusammensetzung: 4> (als Kohlehydratkonzentration) von Sulfit befreiter 3ulfitpülpeliquor; 0,2$ (IH₄)₂ÖO₄; 0,1^KH₂PO₄; 0,25yi> KgSO₄^H₂O und 0,3^ö Hefeextrakt eingeimpft. Fach 48-stündiger Inkubation bei 3O⁰O wurde die Flüssigkeit zu 500 1 des oben beschriebenen sterilisierten Kulturmediums hinzugefügt und unter Belüftung 48 Stunden lang bei 30 G inkubiert« Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und nach Y/aschen mit Wasser in einem Trommeltrockner getrocknet zur Erzielung von 2,5 kg trockener Hefezellen, die dann mit einem Kahlwerk pulverisiert wurden zur Erzielung eines Hährmedikaments mit hohem Protein- und Vitamingehalt sowie guter Verdaubarkeit.

Beispiel 4

20 1 Kulturmedium (pH 6,0) mit folgender gewichtsmäßiger Zusammensetzung! 1$ normal Paraffin .mit 14 bis 18 Kohlenstoffatomen; 0,57° M₄Ol; 0,7^ KH₂PO₄; 0,001?έ FeS0₄°7H₂0; 0,02yö MgSO₄°7H₂O; 0,001-0 ^nSO^HgO; 0,01^ OaGl₂-2H₃O und 0,05^ Hefeextrakt wurden sterilisiert. Diese Flüssigkeit wurde mit der Iviutante L^r-7010 geimpft und 24 stunden lang unter belüftung bei 30⁰G inkubiert. Anschließend wurde die iiischung zu 500 1 des oben beschriebenen sterilisierten Kulturmediums hinzugegeben und es folgte eine v/eitere 48 stünüige Inkubation bei 3O⁰G unter Belüftung, wobei der pH-7/ert kontrolliert wurde. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt und nach V/aschen mit Wasser bei 50⁰G getrocknet zur Erzielung von 2,8 kg trockener Hefezellen hoher Verdaubarkeit. 1 kg wurde davon entnommen und mit 3 kg Getreide-

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Schrotmehl; 4,8 kg Reiskleie; 1 kg Sojamehl; 50 g Salz und 50 g Galciumcarbonat gemischt zur Erzielung einer Futter-Mischung für Rindvieh.

Beispiel 5

20 1 Kulturmedium (pH 6,0) mit folgender gewichtsmäßiger Zusammensetzung: 5$ (als Kohlehydratkonzentration) ^amelassen; 0,25^ (KH₄^)₂SO₄; O,55& KE₂PO₄; 0,02°/ό MgSO₄^H₂O und 0,04/ü Kefeextrakt wurden nach Aufkochen filtriert und sterilisiert. Die Uutante M-7OO7 wurde darein eingeimpft und unter Belüftung 24 Stunden lang bei 30⁰G inkubiert. Die erhaltene Mischung wurde zu 500 1 des oben beschriebenen sterilisierten Kulturmediuias hinzugegeben und es folgte eine Inkubation unter Belüftung bei 30°0 (36 Stunden) und dann bei 40⁰G (12 Stunden). Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und nach Wäschern mit Wasser in einem irommeltrockner getrocknet zur Erzielung von 3 kg trockener Hefezellen.

2 kg wurden davoiv. entnommen und mit 20 kg 0,1 η lüaOH versetzt und 2 Stunden lang bei 50⁰G stehen gelassen und dann zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde zur Ausfällung von Protein mit 1 η HGl versetzt, wobei der pH-Wert auf 4,8 eingestellt wurde; das Protein wurde dann durch Zentrifugieren abgetrennt und mit einem kleinen Sprühtrockner getrocknet zur Erzielung von 500g trockenem intrazellulären Hefeprotein.

50 kg Wasser und 1 kg Glucose wurden zu den 500g Protein hinzugefügt. Die Flüssigkeit wurde durch 30 stunden langes Inkubieren mit Lactobacillus acidophilus bei 37⁰G einer lüilchsäuregärung unterworfen und dann mit Zucker und Ge-

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schmacksstoffen versetzt zur Erzielung eines schmackhaften nährenölen proteinreichen Getränks»

1 kg der gemäß Beispiel 3 erhaltenen Hefezellen wurden mit 5 kg Weizenmehl» 40 g Salz» 20 g Honig und 2 kg Wasser und weiter mit 3 _t5 kg Gluten» 300 g eßbarem Öl und Geschmacksstoffen versetzt* 3>ie Mischung wurde in einem Ofen 30 Minuten Ib^ b&i^tßÖ' G .ggfoücte-Qn zur Erzielung einer knusprigen .

Imbiß-Biät mit einer abgeglichenen Aminosäurezusammensetzung.

Beispiel 7

4 kg nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 hergestellte trockene Hefezellen wurden zu 20 kg 0,5 η WaOH hinzugegeben, 2 Stunden lang bei 5O⁰G stehengelassen und dann zur Abtrennung der intrazellulären Substanzen enthaltenden überstehenden flüssigkeit zentrifugiert. Zwei kg 0aGl2«2H₂° Und 0,2 kg Oa(OH)₂ wurden in 15 kg Wasser von 90⁰G suspendiert und dann mit der obigen überstehenden Flüssigkeit unter Rühren versetzt. Nach 30 Minuten Stehenlassen wurde der Miederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und dann in Wasser suspendiert und der pH-Wert mit 6 η HGl auf etwa 7 eingestellt. Der liederschlag wurde zentrifugiert zur Erzielung eines flockenähnlichen und fleischähnlich texturierten Nahrungsmittels.

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ORIGINAL INSPECTED

Claims

Pat entans prUche

1. J Verfahren zur Herstellung einer mikrobielien proteinhalti^en Substanz, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte

a) idutation von x-uhlenwasserstoff assimilierender Hefe der ü-enus Candida durch chemische oder physikalische Kiu tag en e iiittel;

b) Einimpfen einer α ie Mutanten enthaltenden Suspension auf ein festes liulturmediuia und Inkubation zur Jildung von Kolonien;

c) Auswahl von mutanten Stämmen, die vollständig oder teilweise ihrer Zellwand-Integrität beraubt sind von den Zellen dieser ^olonien durch Grain-Anfärbung und mikroskopische Prüfung}

d) Vermehrung dieser ausgewählten mutanten Stämme in einem xaiiturmedium und

e) Gewinnung der vermehrten Zellmasse, aus der gfso die intrazelluläre Substanz extrahiert wirdo

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß von den Kolonien solcho uit rauher Oberfläche und von den Zeilen Uieser Kolonien solche uit runder ϊοπη ausgewählt v/erden, von denen dann nacn ü-ram-Anfärbung die G-ram-negativen, ihrer Zellwand-Integrität vollständig beraubten und praktisch mannanfreien Zellen ausgewählt und gezüchtet v/erden.

3o Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

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BAD ORlölNAL

die Zellen der auf festem ^„ediua gezüchteten Kolonien liangefärbt und die J-ran-^-ösitiven Zellen uiO jerin^ä:.. .Jlctronenstreuvermögen der äuiL-eren Zone der Z-ellv/and elektronenmikroskopisch ausgewählt werden, deren —annangeLalt unter 70^o desjenigen des unter den gleichen Bedingungen imiubierten Liutt erst amis lie^t unü d3üs die ausgev/ählten G-ran-bositiven iautanten Stämme gezüchtet und die veraehrte Zellmasse "geerntet" wird»

4o Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als chemisches mutagenes i*ittel ϊί-ϊϋethyl-i."•-nitro-ι·ϊ-nitrosoguanidin verwendet und als Lutante der Stamm .1.T₀ ¹J₀G₀ So« 20,314, Candida peri~ohelosum i.x-7002 ausgewählt ~/irdo

5o Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeicanot, daß als physikalisches mutagenes Littel jäestrahlun^· mi'o UV-Licht verwendet wird und als iiutante der Stamm A.'T₀O=,O₀ „c, 20,315, Candida lipolytica k-7005 ausgewählt v/ird«.

60 Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, aaüals chemisches mutagenes l.Iittel salpetrige Säure verwendet wird und als laut ante der Stamm AoT.CC ±.o_o 20,316, Candida guilliermondii 1..-7OO6 ausgewählt wird.

7ο Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, damals chemisches mutagenes i-ittel xi-Lieth^rl-^i''-nitro-!,"-nitroso guanidin verwendet und als iiutante der Stamm A. T.0.0. -.0. 20,317, Candida periphelosum Ii-7OO7 ausgewählt wird»

β« Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als chemisches mutagenes kittei Acriflavin verwendet unu als Lutante der Stamm A.2.0.C. Ho. 2Ü,31ö, Candida guilliermondii ii-7010 ausgewählt wird.

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BAD CRiGSiML

3Γ

21., 27 392.7 . 9.8.1971

9« JBr<iteiniialtlge intrazelluläre Substanz» beetehend aus öurch jphemieche oder pliysikaj-ische Mittel auö der gemäß inepruoli 1' erhältlichen Zelliaeu33e abgfetremiteia Material«

10. Ve-'/wenäung der nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erhaltenen proteinhaltigen Substanz als Hahrungsquelle für Mensch und Tier, insbesondere als Pischfutter, für Uährimbisse, Hährmedi-Iramente, proteinreiche Getränke und fleischähnliche Speisen.

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ORlQiNAt