DE3414083C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von durch lebende Zellen produzierten, nicht sekretierten Substanzen.

Die Fortschritte in der Zellbiologie führten zu der Erkenntnis, daß die Konzentration einer Anzahl biologisch aktiver Substanzen innerhalb der Zelle wesentlich größer ist als im umgebenden Medium. Diese Substanzen werden aufgrund ihrer Molekülmasse, ihrer Ladung oder aus anderen Gründen nicht leicht durch die Zellmembran transportiert oder auch von den Zellen überhaupt nicht sezerniert. Bisherige Verfahren zur Gewinnung dieser Produkte erforderten das Aufbrechen oder die Lyse der Zellmembran. Aufgrund der Zellyse wird das Medium mit Zellfragmenten sowie unerwünschten hochmolekularen Verunreinigungen kontaminiert. Da die Konzentration der nicht sekretierten Substanzen im Vergleich mit der Gesamtkonzentration der Zellbestandteile relativ klein ist, stößt die Gewinnung solcher interessierender Substanzen in zahlreichen Fällen auf große Schwierigkeiten. Unter nicht sekretierten Substanzen werden hierbei Substanzen verstanden, die innerhalb der Zelle in signifikanten, gewinnbaren Mengen produziert werden, jedoch nicht oder nur teilweise sekretiert werden.

Ein begleitendes Problem besteht in der Freisetzung von Pyrogenen, d. h. Fieber hervorrufenden Substanzen, aus den Zellen während der Zellyse. Zahlreiche zu den Prokaryonten gehörenden Bakterien und insbesondere die Gram-negativen Enterobakterien erzeugen pyrogene Endotoxine. Da diese Gram-negativen Bakterien, beispielsweise E. coli, Bazillen sowie Pseudomonas Grundbakterien darstellen, die bei der DNA-Rekombinanttechnik verwendet werden, stellen die von diesen Bakterien erzeugten pyrogenen Endotoxine ein gravierendes Problem dar. Diese pyrogenen Substanzen sind hauptsächlich Lipopolysaccharide mit Molekülmassen über 5 · 10⁴. Eine Anzahl von Enzymen und anderen nicht sekretierten interessierenden Substanzen besitzen niedrigere Molekülmassen als Pyrogene, so daß ein Verfahren zur molekularen Abtrennung von bei der Zellyse freigesetzten Verunreinigungen bei der Reinigung und Gewinnung solcher Substanzen günstig wäre.

In der US-PS 44 09 331 ist ein Verfahren zur Gewinnung von durch Zellen erzeugten Substanzen angegeben. Bei diesem Verfahren können die von den Zellen sekretierten Substanzen mit niederer Molekülmasse durch die semipermeable Membran von Mikrokapseln, in denen sich die Zellen befinden, hindurchdiffundieren und bei minimaler Kontamination im extrakapsulären Medium gewonnen werden, wobei die von den Zellen ausgeschiedenen Substanzen mit höherer Molekülmasse innerhalb der Mikrokapseln festgehalten und durch Zerstörung der Kapselmembran ohne Lyse der Zelle gewonnen werden können.

Der Erfindung liegt demgegenüber die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung von durch lebende Zellen produzierten, nicht sekretierten Substanzen anzugeben, mit dem diese Substanzen im wesentlichen frei von Verunreinigungen gewonnen werden können. Zugleich soll dieses Verfahren die im wesentlichen pyrogenfreie Gewinnung nicht sekretierter Substanzen von pyrogenerzeugenden Mikroorganismen ermöglichen. Ferner soll die Lyse der Zellmembranen eingekapselter Zellen ohne Zerstörung der Membran der umgebenden Mikrokapsel möglich sein. Weiterhin soll die Gewinnung niedermolekularer, nicht sekretierter Substanzen von genetisch modifizierten Bakterien möglich sein.

Die Aufgabe wird gemäß Anspruch 1 gelöst.

Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist gekennzeichnet durch folgende Schritte:

• (A) Einkapseln der Zellen innerhalb von Kapselmembranen mit Permeabilitätseigenschaften, die den Durchtritt der betreffenden Substanz erlauben, hochmolekulare Verunreinigungen jedoch zurückhalten,
• (B) Suspendieren der eingekapselten Zellen in einem wäßrigen Kulturmedium,
• (C) Ablaufenlassen der Stoffwechseltätigkeit der Zellen innerhalb der Kapselmembranen,
• (D) Lysieren der Zellmembranen der Zellen ohne Aufbrechen der Kapselmembranen,
• (E) Diffundierenlassen der betreffenden Substanz durch die Kapselmembranen hindurch in die extrakapsuläre Flüssigkeit hinein und
• (F) Gewinnung der betreffenden Substanz aus der extrakapulären Flüssigkeit.

Es ist im Rahmen der Erfindung auch möglich, in Schritt (C) das Zellwachstum bzw. die Mitose innerhalb der Kapseln ablaufen zu lassen, wobei in jeder Kapsel eine Zellkolonie gebildet wird, die sich vervielfacht und das Kapselvolumen im wesentlichen ausfüllt, jedoch die Kapselmembran nicht zerstört.

Der Schritt (D) der Lyse der Zellmembranen wird vorzugsweise durch Suspendieren der Kapseln in einem Detergens bzw. einem grenzflächenaktiven Mittel vorgenommen, das die Kapselmembranen nicht zerstört.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden die durch Zellen produzierten, nicht sekretierten Substanzen als Rohprodukt mit verringerter Konzentration an hochmolekularen Verunreinigungen sowie höherer spezifischer Aktivität erhalten. Das Verfahren eignet sich insbesondere zur Gewinnung nicht sekretierter niedermolekularer Substanzen, die von natürlichen oder genetisch modifizierten pyrogenerzeugenden Prokaryonten bzw. Bakterien produziert werden.

Die Mehrzahl der hochmolekularen Pyrogene wie etwa Endotoxine verbleibt dabei innerhalb der Kapseln, während die niedermolekularen Substanzen rasch durch die Poren der Kapselmembranen hindurch nach außen diffundieren. Die Membranporen stellen dabei gewundene Kanäle dar, die den Durchtritt der angestrebten niedermolekularen Substanzen durch die Kapselmembranen erlauben, die unerwünschten hochmolekularen Verunreinigungen jedoch zurückhalten.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Zeichnung näher erläutert; es zeigt

Fig. 1 eine Wachstumskurve eines genetisch modifizierten, pyrogenerzeugenden Bakteriums, welches das Enzym Penicillinase produziert. Aus dem Diagramm geht hervor, daß die Einkapselung des Bakteriums seine Wachstumsgeschwindigkeit im Vergleich mit einer herkömmlichen Suspensionskultur nicht beeinträchtigt,

Fig. 2 ein Diagramm zur Abhängigkeit der Konzentration an Penicillinase von der Kultivierungsdauer, aus dem hervorgeht, daß die intrazelluläre Produktion der betreffenden Substanz unabhängig davon, ob die Zellen in einer herkömmlichen Suspensionskultur oder in einer eingekapselten Kultur kultiviert werden, im wesentlichen identisch ist,

Fig. 3 ein Diagramm zur Abhängigkeit der Konzentration an Penicillinase von der Zeit, das die Kinetik der Freisetzung der Penicillinase durch die semipermeablen Kapselmembranen nach der Lyse der Zellmembranen erläutert,

Fig. 4 ein Diagramm zur Abhängigkeit der Pyrogenkonzentration in der extrakapsulären Flüssigkeit, in der intrakapsulären Flüssigkeit sowie in einem herkömmlichen Suspensionskulturmedium nach der Lyse der Zellen und

Fig. 5 Wachstumskurven einer Eukaryonten-Zellkultur, aus denen hervorgeht, daß die Wachstumsgeschwindigkeit im Vergleich mit einer herkömmlichen Suspensionskultur durch die Einkapselung nicht beeinträchtigt wird.

Das Verfahren eignet sich für beliebige Systeme von Zellen, die eine angestrebte Substanz mit einer Molekülmasse produzieren, die niedriger ist als die Molekülmasse potentieller Verunreinigungen. Das Verfahren eignet sich besonders zur Kultivierung von Prokaryontenzellen als Quelle für entsprechende nicht sekretierte Substanzen, wobei hierfür natürlich vorkommende wie auch genetisch modifizierte Zellen gleichermaßen in Frage kommen. Prokaryontenzellen benötigen zur Zellernährung in erster Linie niedermolekulare Substanzen, die leicht durch die semipermeable Membran hindurchtransportiert werden können, was das Zellwachstum und die Mitose erleichtert und zu einer höheren Produktion an der angestrebten Substanz führt. Die Zellkolonien werden dabei sich vermehren gelassen, bis sie die Kapseln im wesentlichen ausfüllen, die Kapselmembranen jedoch noch nicht brechen.

Wie oben erwähnt, werden bei den meisten DNA-Rekombinantverfahren Gram-negative Enterobakterien als Wirtsorganismen verwendet. Viele dieser Bakterien produzieren pyrogene Endotoxine, die bei der Zellyse freigesetzt werden. Zur Gewinnung einer angestrebten, von derartigen pyrogenen Kulturen erzeugten Substanz in einer verwendbaren Form müssen die Pyrogene normalerweise abgetrennt werden. Praktisch alle derartigen Pyrogene besitzen Molekülmassen über 5 · 10⁴.

Eine semipermeable Membran mit Permeabilitätseigenschaften, die den Transport von Molekülen mit einer Geschwindigkeit erlaubt, die in reziproker Abhängigkeit zu ihrem Molekulargewicht steht, oder den Transport hochmolekularer Verunreinigungen verhindert, kann entsprechend erfindungsgemäß die Reinigung der angestrebten niedermolekularen Produkte in signifikanter Weise verbessern.

Ein weiterer, sehr vorteilhafter Aspekt des Erfindungskonzepts ist, daß die Sterilhaltung von Kulturen in sehr einfacher Weise möglich ist, wodurch wiederum die Möglichkeit einer Verunreinigung der Kultur oder des Produkts verringert ist. Da die Menge der von den Zellen produzierten Substanz nur sehr klein ist, stellen derartige Verunreinigungen der Kultur eines der Hauptprobleme im Stand der Technik dar. Durch die Einkapselung wird eine physikalische Barriere gegen jedwede Kontamination erzeugt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf eine große Vielzahl von durch Zellen produzierten Substanzen anwendbar, insbesondere solche mit relativ kleiner Molekülmasse. Beispiele für Pyrogene, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eliminiert werden können, sind etwa Endotoxine, wie sie von E. coli als Lipoproteide produziert werden. Eine Voraussetzung für die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt entsprechend darin, daß die zu gewinnende Substanz eine kleinere Molekülmasse aufweist als das Pyrogen oder andere Verunreinigungen, die ausgeschlossen werden sollen.

Die Durchführbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens hängt zum Teil davon ab, ob es gelingt, entsprechende Zellen in einer semipermeablen Membran einzukapseln, ohne daß hierdurch ihre Lebensfähigkeit ungünstig beeinflußt wird.

Im folgenden wird ein geeignetes Mikroverkapselungsverfahren im einzelnen erläutert, das erfolgreich zur Herstellung lebensfähiger Zellkulturen herangezogen wurde. Die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit einer Zellkultur verlangt, daß ausreichend Nährstoffe und Sauerstoff durch die Kapselmembranen hindurchtransportiert werden können. Die Mikrokapselmembranen schließen ferner verunreinigende Bakterien von der Kultur aus. Die Kapselmembranen müssen unter pH-Bedingungen erzeugt werden, unter denen die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigt wird. Die Größe der Mikrokapseln kann innerhalb eines sehr weiten Bereichs variieren; die besten Ergebnisse wurden mit Kapseln mit einem Durchmesser von 100 bis 1000 µm erzielt.

Bei der Einkapselung der Zellen bildet eine mit den Zellen physiologisch verträgliche wasserlösliche Substanz, die wasserunlöslich gemacht werden kann, um die einzelnen Zellen oder Gruppen von Zellen herum eine formbeständige, zusammenhängende Masse bzw. "temporäre Matrix". Diese temporäre Matrix kann dann so behandelt werden, daß eine dauerhaftere semipermeable Membran um die Zelle herum abgeschieden wird, wobei zugleich die Lebensfähigkeit der Zellen gewährleistet ist. Die wasserlösliche Substanz wird, typischerweise in einer Menge von größenordnungsmäßig 0,5 bis 2%, zu einer Suspension der Zellen in einer entsprechenden Salzlösung zugegeben, worauf das resultierende Gemisch in Tröpfchen umgewandelt wird. Die erzeugten Tröpfchen werden dann zur Ausbildung der temporären Matrix wasserunlöslich gemacht und in Gelform übergeführt. Diese temporäre Matrix wird mit einer dauerhafteren Kapselmembran versehen, wobei das Kapselinnere vorzugsweise wieder verflüssigt wird, indem die Bedingungen wiederhergestellt werden, unter denen die wasserlösliche Substanz flüssig war. Der Wiederverflüssigungsschritt erlaubt den Stofftransport von Nährstoffen sowie das Zellwachstum.

Als Materialien zur Ausbildung der temporären Matrix können beliebige nichttoxische, wasserlösliche Materialien Verwendung finden, die durch Änderung der Ionenumgebung oder Ionenkonzentration in eine formbeständige Masse übergeführt werden können. Das Material sollte ferner eine Vielzahl leicht ionisierbarer anionischer Gruppen, beispielsweise Carboxylgruppen, enthalten, die durch Salzbildung mit Polymeren reagieren können, die eine Vielzahl von kationischen Gruppen enthalten. Wie aus dem folgenden hervorgeht, ermöglicht die Verwendung dieses Typs von Material die Ausbildung einer permanenten Kapselmembran mit einer wählbaren Obergrenze der Permeabilität ohne Schwierigkeiten auf den Oberflächenschichten der temporären Matrix.

Bevorzugte Materialien zur Erzeugung der temporären Matrix sind saure, wasserlösliche natürliche oder synthetische Polysaccharid-Polymere bzw. -Gummis. Derartige Materialien sind handelsüblich. Sie werden in der Regel aus pflanzlichem Material extrahiert und dienen zumeist als Lebensmittelzusätze. Bevorzugter wasserlöslicher Gummi ist Natriumalginat. Alginate im Molekülmassenbereich von 150 000 aufwärts können verwendet werden, eignen sich jedoch wegen ihrer molekularen Dimensionen und ihrer Viskosität im allgemeinen nicht zur Permeation der am Ende des Verfahrens erzeugten Kapselmembranen. Alginate mit niedrigerer Molekülmasse, beispielsweise im Bereich von 50 000 bis 80 000, lassen sich leichter durch Diffusion durch eine Membran mit ausreichender Porosität aus dem intrakapsulären Volumen entfernen und sind daher bevorzugt. Andere verwendbare Polymere sind saure Fraktionen von Guargummi, Carrageenan, Pectin, Traganthgummi oder etwa Xanthangummi.

Diese Materialien weisen glycosidisch verknüpfte Saccharidketten auf. Ihre freien Säuregruppen liegen in vielen Fällen in der Alkalimetallionenform vor, beispielsweise in der Natriumform. Beim Austausch dieser Alkalimetallionen gegen mehrwertige Ionen wie etwa von Calcium oder Aluminium werden die wasserlöslichen Polysaccharidmoleküle unter Ausbildung eines wasserunlöslichen, formbeständigen Gels "vernetzt", das durch Abtrennung der mehrwertigen Ionen durch Ionenaustausch oder Komplexbildung, etwa mit einem Chelatbildner, wieder in Lösung gebracht werden kann. Obgleich im wesentlichen jedes mehrwertige Ion, das mit dem sauren Gummi ein Salz bilden kann, für diese Verfahrensweise geeignet ist, ist die Verwendung physiologisch verträglicher Ionen wie beispielsweise von Calciumionen bevorzugt. Hierbei kann ausgenützt werden, daß derartige Ionen dazu geeignet sind, Gewebe im lebenden Zustand zu erhalten. Während andere mehrwertige Kationen verwendbar sind, ergab sich, daß Magnesiumionen bei der Gelerzeugung mit Natriumalginat unwirksam sind.

Eine typische Verfahrensweise zur Herstellung von Mikrokapseln umfaßt folgende Schritte: Zunächst werden die Zellen in einer Lösung einer Konzentration von 0,5 bis 2,5% (G/V) des ausgewählten Polymers in physiologischer Salzlösung suspendiert. Bei Verwendung von Natriumalginat liegt eine brauchbare Konzentration im Bereich von 0,6 bis 2,4% (G/V). Anschließend werden aus der die Zellen enthaltenden Polymerlösung Tröpfchen der gewünschten Größe hergestellt, die unmittelbar darauf unter Ausbildung formbeständiger Massen in die Gelform übergeführt werden, wobei die Geltröpfchen vorzugsweise, jedoch nicht zwingend, sphärische oder sphäroidale Form besitzen. Die Tröpfchenerzeugung kann nach an sich bekannten Verfahren vorgenommen werden, beispielsweise nach der nachstehend angegebenen Verfahrensweise.

Ein Rohr, das eine wäßrige Lösung mehrwertiger Kationen, beispielsweise eine 1,5%ige (G/V) CaCl₂- Lösung, enthält, wird mit einem Stopfen versehen, der eine Tropfenerzeugungsvorrichtung trägt. Die Vorrichtung besteht aus einem Gehäuse mit einer oberen Lufteinlaßdüse und einem länglichen Hohlkörper, der mit gleitender Reibung im Stopfen eingepaßt ist. Eine mit einer Schrittpumpe ausgerüstete 10-ml-Spritze ist oberhalb des Gehäuses vorgesehen, wobei eine Nadel, beispielsweise eine mit Polytetrafluorethylen beschichtete Nadel von 0,25 mm Durchmesser, durch die gesamte Länge des Gehäuses hindurchgeht. Das Innere des Gehäues ist so ausgebildet, daß die Spitze der Nadel einer konstanten laminaren Luftströmung ausgesetzt ist, so daß die Vorrichtung als Zerstäuber wirkt. Die Luft entweicht durch eine Öffnung im Stopfen aus dem Rohr. Bei Betätigung der Schrittpumpe werden schrittweise aus der Spritze, die mit der das einzukapselnde Material enthaltenden Lösung gefüllt ist, Lösungströpfchen herausgedrückt, die an der Nadelspitze erscheinen. Die Lösungströpfchen werden jeweils vom Luftstrom abgerissen und fallen etwa 2,5 cm tief in die CaCl₂- Lösung, in der sie durch Aufnahme von Calciumionen unmittelbar in den Gelzustand übergehen. Der Abstand zwischen der Nadelspitze und der Oberfläche der CaCl₂-Lösung ist bei diesem speziellen Beispiel groß genug, daß die Natriumalginat-Zellsuspension die physikalisch günstigste Form anzunehmen vermag, nämlich die Form einer Kugel, d. h. maximales Volumen bei minimaler Oberfläche.

Diese Verfahrensweise führt zu einer Art Vernetzung des Gels und zur Bildung einer hochviskosen, formbeständigen, zu Schutzzwecken dienenden temporären Matrix, die das suspendierte Gewebe bzw. die suspendierten Zellen und das entsprechende Medium enthält. Die einzelnen Matrixkügelchen sammeln sich in der Lösung als separate Phase an und können beispielsweise durch Absaugen abgetrennt werden.

Im nächsten Schritt wird eine semipermeable Membran auf der Oberfläche der temporären Matrix durch "Vernetzung" von Oberflächenschichten aufgebracht. Dies kann dadurch erfolgen, daß die in Gelform übergeführte temporäre Matrix einer wäßrigen Lösung eines Polymers ausgesetzt wird, das kationische Gruppen enthält, die mit den anionischen funktionellen Gruppen in den Gelmolekülen reagieren können. Polymere, die säurereaktive Gruppen wie etwa freie Imino- oder Aminogruppen enthalten, sind hierbei bevorzugt. So wird beispielsweise ein Polysaccharidgummi durch Wechselwirkung (Bildung von Salzbindungen) zwischen den Carboxylgruppen und den Imino- oder Aminogruppen vernetzt. Die Permeabilität kann hierbei innerhalb bestimmter Grenzen durch Auswahl der Molekülmasse des eingesetzten vernetzenden Polymers sowie durch Einstellung der Konzentration der Polymerlösung und die Dauer der Exposition eingestellt bzw. gesteuert werden. Eine Lösung eines Polymers mit niederer Molekülmasse penetriert innerhalb einer gegebenen Zeitdauer weiter in die temporären Kapseln hinein, als dies bei einem Polymer mit hoher Molekülmasse der Fall ist. Der Penetrationsgrad des Vernetzungsmittels läßt sich mit der resultierenden Permeabilität korrelieren. Allgemein gilt, daß die Porengröße um so größer ist, je höher die Molekülmasse und je kleiner die Eindringtiefe sind. Allgemein sind Polymere mit einer Molekülmasse im Bereich von 3000 bis 100 000 oder auch darüber je nach Dauer der Reaktion, der Konzentration der Polymerlösung und dem angestrebten Permeabilitätsgrad verwendbar. Bei Verwendung von Polylysin mit einer mittleren Molekülmasse von etwa 35 000 lassen sich günstige Ergebnisse bei einer Reaktionsdauer von 2 min unter Rühren und Verwendung einer physiologischen Salzlösung erzielen, die 0,0167% Polylysin enthält. Hierbei werden Kapselmembranen mit einer Obergrenze der Permeabilität erhalten, die einer Molekülmasse von etwa 100 000 entspricht. Optimale Reaktionsbedingungen, die sich zur Kontrolle bzw. Einstellung der Permeabilität in einem gegebenen System eignen, sind aufgrund der obigen Leitlinien leicht empirisch zu ermitteln. Nach diesem Verfahren kann die Obergrenze der Permeabilität der Kapselmembranen auf einen gewünschten Wert eingestellt werden.

Beispiele für geeignete vernetzende Polymere sind Proteine und Polypeptide natürlichen oder synthetischen Ursprungs mit freien Amino- oder Iminogruppen, Polyethylenamine, Polyethylenimine sowie etwa Polyvinylamine. Polylysin wurde sowohl in der D- als auch in der L-Form erfolgreich eingesetzt. Ferner sind auch Proteine wie Polyarginin, Polycitrullin und Polyornithin verwendbar. Polymere mit höherer positiver Ladungsdichte wie beispielsweise Polyvinylamin haften stark an den anionischen Gruppen der Gelmoleküle unter Ausbildung stabiler Assoziatmoleküle, weshalb entsprechende Kapselmembranen schwieriger aufzubrechen sind.

Zur weiteren Einstellung der Porengröße kann eine zusätzliche Beschichtung mit einem kationischen Polymer oder einem Gummi herangezogen werden. Diese zusätzliche Beschichtung kann aus dem gleichen Polymer bestehen, das auch zur Erzeugung der temporären Matrix herangezogen wurde; hierfür können jedoch auch beliebige andere geeignete Polymere herangezogen werden, beispielsweise die oben beschriebenen Polymeren. Auf Mikrokapseln aus Natriumalginat/Poly-L- Lysin konnte z. B. günstig eine Polyvinylaminbeschichtung aufgebracht werden.

Durch Behandlung mit einer verdünnten Gellösung werden freie Aminogruppen auf der Kapseloberfläche gebunden und blockiert, die sonst zu einer Verklumpung der Kapsel führen könnten.

In diesem Stadium der Einkapselung weisen die gewonnenen Kapseln eine semipermeable Membran auf, die eine in Gelform übergeführte Lösung des Polymers, ein mit dem betreffenden Zelltyp verträgliches Kulturmedium sowie eine oder mehrere Zellen umgibt. Da der Stofftransport innerhalb der Kapsel und durch die Kapselmembran hindurch beschleunigt werden soll, ist es bevorzugt, das Gel im Kapselinneren wieder zur wasserlöslichen Form zu verflüssigen. Dies kann durch Wiederherstellung der Bedingungen erfolgen, unter denen das Gel flüssig ist, beispielsweise durch Abtrennung der Calciumionen oder anderer mehrwertiger Kationen aus dem inneren Gel. Das Medium in der Kapsel kann in einfacher Weise dadurch wieder verflüssigt werden, daß die Kapseln in phosphatgepufferte Salzlösung eingebracht werden, die Alkalimetallionen und Wasserstoffionen enthält. Die Calciumionen bzw. andere mehrwertige Ionen werden hierbei innerhalb des Gels gegen einwertige Ionen ausgetauscht, wenn die Kapseln unter Rühren in eine solche Lösung eingetaucht werden. Für den gleichen Zweck können auch Lösungen von Natriumcitrat verwendet werden, das zur Maskierung der zweiwertigen Ionen dient.

Die wie oben eingekapselten Zellkulturen können in einem Kulturmedium suspendiert werden, das speziell so zusammengesetzt ist, daß es alle Anforderungen der jeweils verwendeten Zellen erfüllt und die Zellen darin normalen Stoffwechsel zeigen. Die Bestandteile solcher Medien, die üblicherweise zur Förderung des Wachstums der Zellen herangezogen werden, besitzen typischerweise relativ niederer Molekülmasse und diffundieren leicht durch die Kapselmembranen hindurch in die Mikroumgebung der Zellen, wo sie durch die Zellmembranen permeieren. Die Stoffwechselprodukte der Zellen, die in das intrakapsuläre Medium hinein sekretiert werden, diffundieren ebenfalls, wenn ihre Molekülmasse unter der Obergrenze der Permeabilität der Kapselmembranen liegt, hindurch und sammeln sich im extrakapsulären Medium an.

Die eingekapselten Zellen können unter Bedingungen der Temperatur, des pH-Werts und der Ionenumgebung kultiviert werden, die gleich sind wie bei herkömmlichen Kulturen. Die Wachstumsrate der Kultur wird dabei durch die Mikroverkapselung nicht verschlechtert. Durch die Zellkultivierung füllen sich dabei die Kapseln mit Zellen aus, was jedoch nicht zu einem Bruch der Kapselmembran führt.

Lyse der Zellen

Nach dem Wachsen der Kultur ist die Hauptmenge der angestrebten nicht sekretierten Substanz noch in den Zellen enthalten. Zur Gewinnung dieser Substanz werden die Zellen aus dem zum Wachstum verwendeten Kulturmedium entfernt, worauf die Zellmembranen ohne Zerstörung der Kapselmembranen lysiert werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Durchführung der Zellyse besteht im Suspendieren der Zellen in einem Detergens bzw. grenzflächenaktiven Mittel, das die Zellmembranen nicht aufbricht, jedoch zur Lyse der Zellmembranen führt. Hierfür wurden eine Reihe von Detergentien erfolgreich eingesetzt, beispielsweise Natriumdodecylsulfat, Natriumdesoxycholat sowie nichtionische Detergentien, jedoch ist die Verwendung von Guanidinhydrochlorid bei Prokaryontenzellen bevorzugt. Überraschenderweise führen Detergentien, die zum Aufbrechen ionischer Wechselwirkungen führen, wie beispielsweise Natriumdodecylsulfat, Natriumdesoxycholat und Guanidinhydrochlorid, nicht zur Zerstörung der Mikrokapselmembranen und sind daher zur Anwendung bei Prokaryontenzellen bevorzugt.

Gemäß einer typischen Verfahrensweise werden die Kapseln durch Absaugen vom Kulturmedium getrennt, mit gepufferter Salzlösung gewaschen und mit einem gleichen Volumen beispielsweise einer 4M Guanidinhydrochloridlösung gemischt. Die erhaltene Suspension wird dann mit 2M Guanidinhydrochloridlösung verdünnt, bis die Kapseln etwa ¹/₁₀ des gesamten Flüssigkeitsvolumens ausmachen. Anschließend wird die Suspension bei 37°C inkubiert, worauf das Produkt aus dem Überstand gewonnen wird.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert, aus denen die besondere Effektivität des erfindungsgemäßen Verfahrens hervorgeht.

Beispiel 1

Das Beispiel erläutert die Effektivität des erfindungsgemäßen Verfahrens bei Prokaryontenzellen unter Vergleich des Einkapselungsverfahrens mit der üblichen Standard-Kultivierungstechnik, d. h. monodispersen Suspensionen, bei genetisch modifizierten Bakterien. In diesem Beispiel wurde ein Stamm von E. coli verwendet, der durch Einführung eines Penicillinase produzierenden Plasmids modifiziert war. Dieses entsprechend ampicillinresistente Bakterium steht beispielhaft für genetisch modifizierte Zellen, die erfindungsgemäß günstig kultiviert werden können. Das eingesetzte Bakterium produziert ein pyrogenes Lipopolysaccharid, d. h. ein Endotoxin, mit einer mittleren Molekülmasse von mehr als etwa 5 · 10⁴. Dieses Endotoxin stellt das Hauptproblem bei der Reinigung von Produkten dar, die in vivo verwendet werden sollen. Lediglich etwa 20% der Penicillinase werden von den Zellen sekretiert, während der Rest innerhalb der Zelle zurückgehalten wird. Die vom eingeführten Plasmid produzierte Penicillinase besitzt eine Molekülmasse von etwa 3 · 10⁴.

Der erste Verfahrensschritt bestand in der Einkapselung der Zellen. Eine Kultur des Bakteriums, die gefroren aufbewahrt worden war, wurde über Nacht in Standard-Luria-Nährlösung (LB) inkubiert. Die LB-Nährlösung enthielt 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Natriumchlorid und 25 mg/l Ampicillin. Das Medium wurde durch Lösen der obigen Bestandteile und Sterilisation des Gemischs durch Filtration durch ein 0,22-µm- Filter hergestellt. Dieses Medium fördert das Wachstum der Zellen, während andere, nicht ampicillinresistente Stämme eliminiert werden.

1 ml der Suspension wurde 3 min zentrifugiert, wobei ein kleines Bakterienpellet erhalten wurde. Die Bakterien wurden in 0,2 ml 0,15 M Natriumchloridlösung resuspendiert und gründlich in 20 ml einer 1,6%igen (G/V) Lösung von Natriumalginat eingemischt. Die temporäre Matrix wurde dann dadurch hergestellt, daß das Alginat-Bakterien-Gemisch durch eine Tropfenerzeugungsvorrichtung (wie oben beschrieben) hindurchgedrückt wurde, und die resultierenden flüssigen Mikrokügelchen mit einer 1,2%igen (G/V) CaCl₂-Lösung zur Gelbildung des Alginats in Kontakt gebracht wurden. Die temporäre Matrix wurde dann wiederholt mit einer 0,15 M Natriumchloridlösung gewaschen und dann zur Ausbildung der Kapselmembranen 6 min in eine Lösung von Poly-L-lysin (Molekülmasse 6,5 · 10⁴) einer Konzentration von 0,5 g/l eingebracht. Die erhaltenen Kapseln wurden dann in einer 0,2%igen (G/V) CaCl₂-Lösung, einer 0,014%igen (G/V) CHES- Pufferlösung (N-Cyclohexylaminoethansulfonsäure) mit pH 7,4 und anschließend einer 0,2%igen (G/V) CaCl₂-Lösung gewaschen. Eine zweite Beschichtung von Polyvinylamin (PVA) wurde durch Einbringen der Kapseln in eine 0,6%ige (G/V) Lösung von PVA in Salzlösung während 5 min erzeugt. Die erhaltenen Kapseln wurden dann zweimal mit Salzlösung gewaschen und anschließend 4 min in eine 0,06%ige (G/V) Natriumalginat/Salzlösung eingebracht. Nach zwei zusätzlichen Waschvorgängen mit Salzlösung wurden die Kapseln zweimal mit 55 mM Natriumcitrat- Salzlösung gewaschen, wobei der erste Waschvorgang 16 min und der zweite Waschvorgang 6 min dauerten. Nach zwei zusätzlichen Waschvorgängen mit Salzlösung wurden die Kapseln in frischer LB-Nährlösung resuspendiert, der Natriumcitrat zu einer Endkonzentration von 10 mM zugesetzt worden war, um die Rückumwandlung des Alginats in ein Gel zu verhindern. Die Zellen wurden dann vor der Gewinnung 24 h bei 37°C inkubiert.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 1 zusammengefaßt, in der die Wachstumsrate bei eingekapselten Zellen mit der Wachstumsrate von Zellen in einer herkömmlichen Suspensionskultur verglichen ist. Proben von beiden Kulturen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen, wobei die Konzentration jeweils durch Messung der Absorption bei 550 nm ermittelt wurde. Wie Fig. 1 zeigt, waren die erhaltenen Wachstumsraten praktisch identisch, woraus hervorgeht, daß die Einkapselung die Lebensfähigkeit der Zellen nicht negativ beeinflußt. Die Kapseln besaßen eine mittlere Größe von etwa 800 µm, wobei jede Kapsel bis zu etwa 10⁵ Zellen enthielt.

Nach dem Wachstum der Zellkultur wurden die Kapseln durch Absaugen vom LB-Nährmedium getrennt und wiederholt mit steriler, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Nach Messung des Volumens der Kapseln wurde eine gleiche Menge 4M Guanidinhydrochloridlösung in PBS zugesetzt. Die resultierende Suspension wurde dann mit 2M Guanidinhydrochloridlösung verdünnt, bis das Kapselvolumen etwa 10% des Flüssigkeitsvolumens ausmachte. Die Kapseln wurden danach in einer Kulturflasche bei 37°C inkubiert, wobei zu verschiedenen Zeitpunkten Proben des Überstands und Proben der Kapseln entnommen wurden. Zu jedem Zeitpunkt wurden 3 ml der suspendierten Kapsellösung aus der Kultur herauspipettiert. Der Überstand wurde als Probe abgezogen, während die Kapseln mit einem gleichen Volumen frischer 2M Guanidinhydrochloridlösung versetzt wurden. Die Kapselmembran wurde unter Verwendung eines 7-ml-Homogenisators aufgebrochen. Mit einer Tischzentrifuge wurden dann die Kapselmembranen und die Zellmembranfragmente abzentrifugiert; der resultierende Überstand wurde als intrakapsuläres Probenmaterial angesehen.

Jede Probe wurde auf ihre Enzymkonzentration sowie ihre Endotoxinkonzentration geprüft. Zur Bestimmung der Enzymkonzentration wurden die Proben mit Wasser auf ein Volumen von 1 ml verdünnt und mit 1 ml einer 1%igen Gelatinelösung in Wasser versetzt. Das Gelatine-Proben-Gemisch wurde anschließend zu 5 ml Phosphatpufferlösung pH 6,5 mit 2 mg/l Penicillin G zugegeben und 30 min bei 30°C inkubiert. 10 ml eines Gemischs von 0,017 N Jodlösung, 0,6 M Kaliumjodid und 1,75 M Natriumacetatlösung pH 4,0 wurden zu dem erhaltenen Gemisch zugegeben, worauf nochmals 10 min inkubiert wurde. Die resultierende gefärbte Lösung wurde dann mit 0,017 N Natriumthiosulfatlösung titriert, bis die Farbe vollständig verschwand. Der Test beruht auf der Reaktion zwischen Penicillosäure und freiem Jod. Die in der Probe vorhandene Penicillinase reagiert mit dem zugesetzten Penicillin unter Bildung von Penicillosäure, die ihrerseits mit freiem Jod reagiert, wobei Jod aus der Lösung verbraucht wird. Das Natriumthiosulfat reagiert ebenfalls mit freiem Jod, so daß die Menge an zur Entfärbung verbrauchtem Thiosulfat ein Maß für die Menge an in der Lösung vorliegender Penicillosäure und damit indirekt ein Maß für die Penicillinaseaktivität darstellt. Je weniger Thiosulfat zur Entfärbung der Lösung gebraucht wird, desto höher war die Penicillinaseaktivität in der ursprünglichen Lösung. Die Penicillinaseaktivität wird durch die Einheiten an Penicillin gemessen, das pro Zeiteinheit in Penicillosäure umgewandelt wird.

Die Endotoxinkonzentration wurde durch Einbringen von 100 ml Endotoxinlösung, verdünnt mit sterilem Wasser, in ein steriles Proberohr und Zusatz eines gleichen Volumens Limulus-Ameobocytek- Lysat (LAL) in Wasser ermittelt. Das Proberohr wird 1 h bei 37°C inkubiert und auf die Bildung von Koagulat geprüft. Wenn ein Koagulat gebildet wird, das seine Lage beim Umdrehen des Rohrs nicht ändert, ist dies ein positiver Hinweis auf das Vorliegen eines Endotoxins. Die Probe wird dann zur Erzielung eines numerischen Werts in einer Verdünnungsreihe verdünnt.

In Fig. 2 ist die gesamte Penicillinaseaktivität in Abhängigkeit von der Zeit für eine eingekapselte Kultur sowie eine herkömmliche Suspensionskultur dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß die gesamte Penicillinaseaktivität bei beiden Kulturen praktisch identisch ist, woraus hervorgeht, daß die Einkapselung die Penicillinaseproduktion nicht beeinträchtigt.

Fig. 3 erläutert die Diffusionsgeschwindigkeit der Penicillinase durch die semipermeablen Kapselmembranen. Zu diesen Messungen wurden die Kapseln zum Zeitpunkt Null in 2M Guanidinhydrochloridlösung eingebracht, worauf die intrakapsuläre sowie die extrakapsuläre Flüssigkeit zu verschiedenen Zeitpunkten auf ihre Penicillinaseaktivität geprüft wurden. Fig. 3 zeigt, daß die anfängliche Penicillinasekonzentration im Überstand gering ist, die Penicillinase jedoch durch die Poren in der semipermeablen Wand hindurchdiffundiert und mit der Zeit im extrakapsulären Medium erscheint. Die intrakapsuläre Konzentration der Penicillinase wird entsprechend mit fortlaufender Zeit verringert, was den stattfindenden Übergang der Penicillinase durch die Kapselmembran erweist.

Fig. 4 veranschaulicht, insbesondere zusammen mit Fig. 3, die Effektivität des erfindungsgemäßen Verfahrens, da die Ergebnisse zeigen, daß eine Barriere gegen den Pyrogentransport vorliegt, während der Übergang des Enzyms durch die Kapselmembranen möglich ist. Die Ergebnisse von Fig. 4 zeigen, daß die extrakapsuläre Konzentration an Endotoxin um mindestens eine Größenordnung kleiner ist als die intrakapsuläre Konzentration. Aus diesen Zahlenwerten geht hervor, daß die Kapselmembranen den Durchtritt des Endotoxins behindern, während sie den freien Übergang der Penicillinase erlauben, wodurch die Gewinnung der Penicillinase aus der Kultur erleichtert wird. Fig. 4 zeigt ferner, daß der Überstand von herkömmlichen Kulturen eine etwa 100fach höhere Endotoxinkonzentration als die extrakapsuläre Flüssigkeit im erfindungsgemäßen Fall aufweist.

Beispiel 2

Das Beispiel erläutert, daß sich das erfindungsgemäße Verfahren sowohl für eukaryotische als auch für prokaryotische Zellen günstig eignet. Bei diesen Versuchen wurde eine Friend'sche erythroleukämische Zellinie verwendet, die von erythroleukämischen Mäusen gewonnen wurde und in Suspensionskultur leicht wächst. In diesen Zellen läßt sich durch Behandlung mit Dimethylsulfoxid (DMSO) die Produktion von Hämoglobin induzieren. Das produzierte Hämoglobin besitzt eine Molekülmasse von etwa 6,3 · 10⁴ und wird bis zur Zellyse im wesentlichen in der Zelle zurückgehalten.

Bei den Versuchen wurde die Lebensfähigkeit der Zellen und die Leichtigkeit der Hämoglobinreinigung bei den eingekapselten Zellen mit den Verhältnissen bei entsprechenden Suspensionskulturen verglichen. Eine Kultur der Zellen wurde 5 min zentrifugiert; das resultierende Pellet wurde in einer 1,2%igen (G/V) Natriumchloridlösung resuspendiert. Durch Hindurchdrücken des Alginat-Zellen-Gemischs durch eine Tropfenerzeugungsvorrichtung (wie oben beschrieben) und Inkontaktbringen der resultierenden flüssigen Mikrokügelchen mit einer 1,02%igen (G/V) CaCl₂-Lösung zur Gelbildung des Alginats wurde eine temporäre Matrix erzeugt. Die temporäre Matrix wurde zweimal gewaschen, wobei zunächst 5 mM CHES-Puffer pH 7,5 in 75 mM CaCl₂-Lösung und anschließend beim zweiten Waschvorgang 75 mM CaCl₂- Lösung verwendet wurden. Durch Zugabe einer 0,05%igen (G/V) Lösung von Poly-L-lysin (Molekülmasse 42 600) in 0,15 M NaCl und 3 min Rühren wurden die permanenten Kapselmembranen erzeugt. Die resultierenden Kapseln wurden dreimal gewaschen, wobei zunächst 5 mM CHES-Puffer pH 7,5 in 75 mM CaCl₂-Lösung, dann 75 mM CaCl₂-Lösung und schließlich 0,15 M NaCl-Lösung verwendet wurden. Im Anschluß daran wurden die Kapseln 4 min mit 0,03%iger (G/V) Natriumalginatlösung in Salzlösung inkubiert und darauf zweimal mit dem Kulturmedium gewaschen, das 10% (G/V) Kälberfetalserum (FCS) und Antibiotika enthielt. Die Mikrokapseln wurden dann mit dem Kulturmedium in Gewebekulturflaschen gegeben und in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ bei 37°C inkubiert.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 5 zusammengestellt, aus der die Wachstumsrate der eingekapselten Zellen im Vergleich zur Wachstumsrate entsprechender Zellen in einer herkömmlichen Suspensionskultur hervorgeht. Von den Kulturen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Proben entnommen, in denen die Zellzahl ermittelt wurde. Die Zelldichte der Kulturen war praktisch identisch, was zeigt, daß die Einkapselung das Zellwachstum nicht beeinträchtigt.

Durch Behandlung mit DMSO wurde dann in den Kulturen die Hämoglobinproduktion induziert. Kulturen mit einer Zelldichte von 8 · 10⁵ Zellen/ml wurden 48 h mit 1% DMSO im Kulturmedium und dann noch 24 h mit 1,5%iger DMSO-Lösung und schließlich 24 h mit 2%iger DMSO-Lösung inkubiert. Die Kulturen wurden dann mit 0,15 M NaCl- Lösung gewaschen und im fünffachen Volumen eines zur Lyse dienenden Puffers resuspendiert, der 50 mM Tris, pH 7,0, 25 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM β-Mercaptoethanol und 0,3% (G/V) Triton-100 enthielt. Die Kulturen wurden dann zweimal 10 min bei 4°C inkubiert, wobei vor und nach ihrer Inkubationsperiode vorsichtig umgeschüttelt wurde. Die Kulturen wurden dann bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung (RZB-Wert) von 10 000 10 min bei 4°C zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit gewonnen wurde. Der Hämoglobingehalt wurde spektrophotometrisch bei 414 nm ermittelt; der Gesamtgehalt an Protein wurde nach dem Standard-Lowry-Verfahren bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt.

Die in der Tabelle zusammengefaßten Daten erläutern die Effektivität des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Menge des in der Suspension sowie in den eingekapselten Kulturen erzeugten Hämoglobins ist etwa gleich, während jedoch das Verhältnis von Hämoglobinkonzentration zu Proteinkonzentration (Verhältnis A/B) bei der eingekapselten Kultur mehr als dreifach höher ist als das Verhältnis A/B für die Suspensionskultur. Das Verhältnis A/B stellt dabei ein Maß für die spezifische Hämoglobinaktivität des Überstands dar. Die Ergebnisse zeigen, daß die Mikrokapseln Proteine mit hoher Molekülmasse, Lipide, Polysaccharide und Nucleinsäuren zurückhalten und dadurch zu einer höheren spezifischen Aktivität der angestrebten Substanz führen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist am günstigsten anwendbar, wenn die nicht sekretierte, angestrebte Substanz eine relativ kleine Molekülmasse besitzt; das Verfahren eignet sich jedoch auch für beliebige andere Systeme, bei denen eine im wesentlichen nicht sekretierte Substanz sowie eine Verunreinigung mit höherer Molekülmasse vorliegen, da die Erfindungskonzeption breit anwendbar ist.

Claims (6)

1. Verfahren zur Gewinnung von durch lebende Zellen produzierten, nicht sekretierten Substanzen, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

• (A) Einkapseln der Zellen in Kapselmembranen mit Permeabilitätseigenschaften, die den Durchtritt der betreffenden Substanz erlauben, hochmolekulare Verunreinigungen jedoch zurückhalten,
• (B) Suspendieren der eingekapselten Zellen in einem wäßrigen Kulturmedium,
• (C) Ablaufenlassen der Stoffwechseltätigkeit der Zellen innerhalb der Kapselmembranen,
• (D) Lysieren der Zellmembranen der Zellen ohne Bruch der Kapselmembranen,
• (E) Diffundierenlassen der betreffenden Substanz durch die Kapselmembranen hindurch in die extrakapsuläre Flüssigkeit hinein und
• (F) Gewinnung der betreffenden Substanz aus der extrakapsulären Flüssigkeit.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Einkapselung der Zellen in Schritt (A) durch Ausbildung von Kapselmembranen durch Reaktion zwischen mehreren kationischen Gruppen an Polymerketten und mehreren anionischen Gruppen an einem wasserlöslichen Polymer unter Ausbildung einer wasserunlöslichen, durch Salzbindung gebundenen Matrix vorgenommen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Einkapselung der Zellen in Schritt (A) durch folgende Schritte vorgenommen wird:

• (a) Suspendieren der Zellen in einem wäßrigen, physiologisch mit ihnen verträglichen Medium, das ein wasserlösliches Polymer mit mehreren anionischen Gruppen enthält,
• (b) Herstellung von Tröpfchen aus der Suspension, welche die Zellen enthalten,
• (c) Überführung der Tröpfchen in den Gelzustand durch Inkontaktbringen mit einer Lösung mehrwertiger, physiologisch verträglicher Kationen unter Erhalt einer diskreten, formstabilen, wasserunlöslichen temporären Matrix und
• (d) Vernetzung von Oberflächenschichten der temporären Matrix zu einer semipermeablen Kapselmembran um die Tröpfchen herum durch Inkontaktbringen mit einem Polymer, das mehrere kationische Gruppen enthält, die gegenüber den anionischen Gruppen reaktiv sind.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch den zusätzlichen Schritt des Ablaufenlassens der Mitose der Zellen innerhalb der Kapselmembranen unter Erhalt entsprechender Zellkolonien, die das Volumen innerhalb der Kapselmembranen im wesentlichen ausfüllen, ohne hierbei die Kapselmembranen zu zerstören.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Lysieren der Zellmembranen in Schritt (D) durch Suspendieren der eingekapselten Zellen in einem grenzflächenaktiven Mittel vorgenommen wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß zum Lysieren der Zellmembranen in Schritt (D) eine wäßrige Lösung von nichtionischen grenzflächenaktiven Mitteln, Guanidinhydrochlorid, Natriumdodecylsulfat und/oder Natriumdesoxycholat verwendet wird.